The Construction of pCAMBIA 1303-Stilbene Syntase Recombinant DNA Preventive for Rotten Root Disease of Oil Palm
KONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pCAMBIA 1303STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA
SAWIT
EMBI LILIS
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
EMBI LILIS. Konstruksi DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase
Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan
TETTY CHAIDAMSARI.
Kelapa sawit merupakan komoditas perkebunan yang penting di Indonesia.
Namun usaha peningkatan produksi kelapa sawit memiliki hambatan. Salah satu
hambatan itu adalah adanya penyakit busuk akar yang disebabkan oleh
Ganoderma spp. Pendekatan baru untuk memperoleh kelapa sawit yang tahan
terhadap serangan Ganoderma adalah dengan menyisipkan gen penghasil zat
yang berfungsi sebagai antijamur. Salah satu gen penghasil zat antijamur adalah
gen stilbena sintase yang berasal dari anggur (Vitis vinifera). Tujuan penelitian ini
adalah mengklon gen stilbena sintase pada vektor ekspresi pCAMBIA 1303
diantara promotor CaMV 35S. Gen stilbena sintase diklon terlebih dahulu ke
dalam vektor ekspresi pCAMBIA 1303, kemudian ditransformasikan ke
Eschericia coli XL-1 Blue dan selanjutnya dimasukkan kedalam Agrobacterium
tumefaciens. Hasil penelitian membuktikan bahwa gen stilbena sintase telah
berhasil diklon ke dalam vektor pCAMBIA 1303. Hasil ini ditunjukkan oleh
terbentuknya dua pita pada gel elektroforesis masing-masing berukuran 12000 bp
(plasmid pCAMBIA 1303) dan 1500 bp (gen stilbena sintase) setelah dipotong
dengan enzim Spe1 dan Nco1.
ABSTRACT
EMBI LILIS. The Construction of pCAMBIA 1303-Stilbene Syntase
Recombinant DNA Preventive for Rotten Root Disease of Oil Palm. Under the
direction of I MADE ARTIKA and TETTY CHAIDAMSARI.
An oil palm is one of the important estate commodities in Indonesia.
Nevertheless the effort to increase its productivity has many hindrances. One of
them is rotten root disease caused by Ganoderma spp. New approach to get
resistence oil palm toward Ganoderma attack is to insert gene produces substance
played role as an antifungi. One of genes that produces antifungi is stilbene
syntase gene derived from grapes (Vitis vinifera). The purpose of this research is
to cloning stilbene syntase gene on to pCAMBIA 1303 expression vector between
35S CaMV promoter. Stilbene syntase gene was cloned on to pCAMBIA 1303
expression vector then to be transformed on to Escherichia coli XL-1 Blue and the
last to be inserted on to Agrobacterium tumefaciens. The result of this research
shows stilbene syntase gene was successful to be cloned to pCAMBIA 1303. This
result was showed by two band sized 12000 bp (pCAMBIA 1303 plasmid) and
1500 bp (stilbene syntase gene) in agarose gel after have been restricted with SpeI
and NcoI enzyme.
KONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pCAMBIA 1303STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA
SAWIT
EMBI LILIS
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul
Nama
NIM
: Konstruksi DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase
Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit
: Embi Lilis
: G84052166
Disetujui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc.
Ketua
Dr. Tetty Chaidamsari,M.Si.
Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 11 Mei 1986 dari pasangan H.
Marjuk dan Hj. Nurjanah. Penulis merupakan anak keempat dari empat
bersaudara.
Pendidikan penulis dimulai dari SDN Karang Anyar Sukaresmi Cianjur
hingga lulus tahun 1999. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan ke SMPN 1
Sukaresmi Cianjur dan lulus tahun 2002. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA
Negeri 1 Sukaresmi Cianjur dan melanjutkan pendikannya ke Institut Pertanian
Bogor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam kegiatan-kegiatan
organisasi kemahasiswaan diantaranya penulis aktif di Lembaga Dakwah Fakultas
MIPA (Serum G) dan CREBs. Penulis juga aktif mengikuti beberapa acara
kepanitiaan di IPB seperti politic expose 2006/2007 dan masa pengenalan
departemen Biokimia 2007/2008. Penulis melakukan Praktik Lapangan di PT
Gizindo Primanusantara Padalarang, Bandung.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan ridhaNya sehingga
penulis dapat menyelesaikan Karya Ilmiah ini. Penelitian ini dilaksanakan pada
bulan Februari sampai dengan Juli 2009 di Laboratorium Biologi Molekuler Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Penelitian ini berjudul Konstruksi
DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase Pencegah Busuk Akar
Kelapa Sawit.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah
membantu penyusunan Karya Ilmiah ini terutama kepada Ibu Dr. Tetty
Chaidamsari, M.Si dan Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc, selaku
pembimbing, Teh Herti, dan Teh Nina serta seluruh staf Laboratorium Biologi
Molekular. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Tri, Nunung,
Saeli, Jimy, Wiwin, Mba Ratna, Yoanita, Dwi dan teman-teman Biokimia 42 atas
motivasinya. Tak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Ibu, Bapak, Aa,
Teteh, atas doa dan kasih sayang yang selalu menyertai. Semoga Karya Ilmiah ini
dapat bermanfaat.
Bogor, Oktober 2009
Embi Lilis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ........................................................................ vi
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... vi
PENDAHULUAN ............................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit ...............................................................................................
Stilbena Sintase .........................................................................................
Vektor Pengklonan pGEM-T Easy .............................................................
Vektor Ekspresi pCambia 1303. ..................................................................
Rekombinasi DNA.........................................................................................
Polimerase Chain Reaction (PCR) .............................................................
Elektroforesis Gel Agarosa untuk Analisis Fragmen................................. .
1
2
2
3
3
4
5
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan..........................................................................................
Metode......................................................................................................
5
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Purifikasi dan Pengujian Produk PCR (stilbena sintase) ..............................
Kloning Gen Stilbena Sintase ke pGEM-T Easy........................................
Urutan Nukleotida Gen Stilbena Sintase.......................................................
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam Vektor Ekspresi
pCAMBIA 1303......................................................................................
Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase ke dalam
Agrobacterium tumefaciens......................................................................
8
8
9
10
12
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 13
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 14
LAMPIRAN .................................................................................................... 15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq) ......................................................... 1
2
Kelapa sawit yang terkena penyakit busuk akar............................................ 2
3
Profil vektor pengklonan pGEM-T easy ....................................................... 2
2
Hasil purifikasi gen stilbena sintase sebagai produk PCR ............................. 8
5
Koloni biru putih hasil transformsi pGEM-T Easy ke
Escherichia coli XL-1 Blue ......................................................................... 9
6
Hasil PCR koloni gen stilbena sintase ......................................................... 9
7
Hasil pemotongan pGEMT-Easy dan STS menggunakan
enzim restriksi Spe 1 dan Nco1................................................................... 10
8
Hasil pemotongan pCAMBIA 1303 dengan enzim Nco1 dan Spe1.............. 11
9
Hasil purifikasi pCAMBIA 1303................................................................ 11
10 Hasil transformasi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena sintase
ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue ........................................................ 12
11 Hasil pemotongan pCAMBIA 1303-STS dengan enzim Spe1
dan Nco1.................................................................................................... 12
12 Hasil transformasi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-STS ke
Agrobacterium tumefaciens........................................................................ 13
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian ........................................................................................ 16
2 Prosedur elektroforesis gel agarosa .............................................................. 17
3 Komposisi larutan sediaan............................................................................. 18
4 Prosedur kerja isolasi plasmid dengan kit dari Qiagen .................................. 20
5 Elektroforegram hasil sekuensing.................................................................. 21
6 Hasil analisis BLASTX fragmen gen stilbena sintase ................................... 22
7 Peta restriksi pCAMBIA 1303 .................................................................... 24
KONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pCAMBIA 1303STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA
SAWIT
EMBI LILIS
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
EMBI LILIS. Konstruksi DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase
Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan
TETTY CHAIDAMSARI.
Kelapa sawit merupakan komoditas perkebunan yang penting di Indonesia.
Namun usaha peningkatan produksi kelapa sawit memiliki hambatan. Salah satu
hambatan itu adalah adanya penyakit busuk akar yang disebabkan oleh
Ganoderma spp. Pendekatan baru untuk memperoleh kelapa sawit yang tahan
terhadap serangan Ganoderma adalah dengan menyisipkan gen penghasil zat
yang berfungsi sebagai antijamur. Salah satu gen penghasil zat antijamur adalah
gen stilbena sintase yang berasal dari anggur (Vitis vinifera). Tujuan penelitian ini
adalah mengklon gen stilbena sintase pada vektor ekspresi pCAMBIA 1303
diantara promotor CaMV 35S. Gen stilbena sintase diklon terlebih dahulu ke
dalam vektor ekspresi pCAMBIA 1303, kemudian ditransformasikan ke
Eschericia coli XL-1 Blue dan selanjutnya dimasukkan kedalam Agrobacterium
tumefaciens. Hasil penelitian membuktikan bahwa gen stilbena sintase telah
berhasil diklon ke dalam vektor pCAMBIA 1303. Hasil ini ditunjukkan oleh
terbentuknya dua pita pada gel elektroforesis masing-masing berukuran 12000 bp
(plasmid pCAMBIA 1303) dan 1500 bp (gen stilbena sintase) setelah dipotong
dengan enzim Spe1 dan Nco1.
ABSTRACT
EMBI LILIS. The Construction of pCAMBIA 1303-Stilbene Syntase
Recombinant DNA Preventive for Rotten Root Disease of Oil Palm. Under the
direction of I MADE ARTIKA and TETTY CHAIDAMSARI.
An oil palm is one of the important estate commodities in Indonesia.
Nevertheless the effort to increase its productivity has many hindrances. One of
them is rotten root disease caused by Ganoderma spp. New approach to get
resistence oil palm toward Ganoderma attack is to insert gene produces substance
played role as an antifungi. One of genes that produces antifungi is stilbene
syntase gene derived from grapes (Vitis vinifera). The purpose of this research is
to cloning stilbene syntase gene on to pCAMBIA 1303 expression vector between
35S CaMV promoter. Stilbene syntase gene was cloned on to pCAMBIA 1303
expression vector then to be transformed on to Escherichia coli XL-1 Blue and the
last to be inserted on to Agrobacterium tumefaciens. The result of this research
shows stilbene syntase gene was successful to be cloned to pCAMBIA 1303. This
result was showed by two band sized 12000 bp (pCAMBIA 1303 plasmid) and
1500 bp (stilbene syntase gene) in agarose gel after have been restricted with SpeI
and NcoI enzyme.
KONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pCAMBIA 1303STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA
SAWIT
EMBI LILIS
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul
Nama
NIM
: Konstruksi DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase
Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit
: Embi Lilis
: G84052166
Disetujui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc.
Ketua
Dr. Tetty Chaidamsari,M.Si.
Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 11 Mei 1986 dari pasangan H.
Marjuk dan Hj. Nurjanah. Penulis merupakan anak keempat dari empat
bersaudara.
Pendidikan penulis dimulai dari SDN Karang Anyar Sukaresmi Cianjur
hingga lulus tahun 1999. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan ke SMPN 1
Sukaresmi Cianjur dan lulus tahun 2002. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA
Negeri 1 Sukaresmi Cianjur dan melanjutkan pendikannya ke Institut Pertanian
Bogor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam kegiatan-kegiatan
organisasi kemahasiswaan diantaranya penulis aktif di Lembaga Dakwah Fakultas
MIPA (Serum G) dan CREBs. Penulis juga aktif mengikuti beberapa acara
kepanitiaan di IPB seperti politic expose 2006/2007 dan masa pengenalan
departemen Biokimia 2007/2008. Penulis melakukan Praktik Lapangan di PT
Gizindo Primanusantara Padalarang, Bandung.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan ridhaNya sehingga
penulis dapat menyelesaikan Karya Ilmiah ini. Penelitian ini dilaksanakan pada
bulan Februari sampai dengan Juli 2009 di Laboratorium Biologi Molekuler Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Penelitian ini berjudul Konstruksi
DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase Pencegah Busuk Akar
Kelapa Sawit.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah
membantu penyusunan Karya Ilmiah ini terutama kepada Ibu Dr. Tetty
Chaidamsari, M.Si dan Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc, selaku
pembimbing, Teh Herti, dan Teh Nina serta seluruh staf Laboratorium Biologi
Molekular. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Tri, Nunung,
Saeli, Jimy, Wiwin, Mba Ratna, Yoanita, Dwi dan teman-teman Biokimia 42 atas
motivasinya. Tak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Ibu, Bapak, Aa,
Teteh, atas doa dan kasih sayang yang selalu menyertai. Semoga Karya Ilmiah ini
dapat bermanfaat.
Bogor, Oktober 2009
Embi Lilis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ........................................................................ vi
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... vi
PENDAHULUAN ............................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit ...............................................................................................
Stilbena Sintase .........................................................................................
Vektor Pengklonan pGEM-T Easy .............................................................
Vektor Ekspresi pCambia 1303. ..................................................................
Rekombinasi DNA.........................................................................................
Polimerase Chain Reaction (PCR) .............................................................
Elektroforesis Gel Agarosa untuk Analisis Fragmen................................. .
1
2
2
3
3
4
5
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan..........................................................................................
Metode......................................................................................................
5
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Purifikasi dan Pengujian Produk PCR (stilbena sintase) ..............................
Kloning Gen Stilbena Sintase ke pGEM-T Easy........................................
Urutan Nukleotida Gen Stilbena Sintase.......................................................
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam Vektor Ekspresi
pCAMBIA 1303......................................................................................
Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase ke dalam
Agrobacterium tumefaciens......................................................................
8
8
9
10
12
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 13
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 14
LAMPIRAN .................................................................................................... 15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq) ......................................................... 1
2
Kelapa sawit yang terkena penyakit busuk akar............................................ 2
3
Profil vektor pengklonan pGEM-T easy ....................................................... 2
2
Hasil purifikasi gen stilbena sintase sebagai produk PCR ............................. 8
5
Koloni biru putih hasil transformsi pGEM-T Easy ke
Escherichia coli XL-1 Blue ......................................................................... 9
6
Hasil PCR koloni gen stilbena sintase ......................................................... 9
7
Hasil pemotongan pGEMT-Easy dan STS menggunakan
enzim restriksi Spe 1 dan Nco1................................................................... 10
8
Hasil pemotongan pCAMBIA 1303 dengan enzim Nco1 dan Spe1.............. 11
9
Hasil purifikasi pCAMBIA 1303................................................................ 11
10 Hasil transformasi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena sintase
ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue ........................................................ 12
11 Hasil pemotongan pCAMBIA 1303-STS dengan enzim Spe1
dan Nco1.................................................................................................... 12
12 Hasil transformasi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-STS ke
Agrobacterium tumefaciens........................................................................ 13
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian ........................................................................................ 16
2 Prosedur elektroforesis gel agarosa .............................................................. 17
3 Komposisi larutan sediaan............................................................................. 18
4 Prosedur kerja isolasi plasmid dengan kit dari Qiagen .................................. 20
5 Elektroforegram hasil sekuensing.................................................................. 21
6 Hasil analisis BLASTX fragmen gen stilbena sintase ................................... 22
7 Peta restriksi pCAMBIA 1303 .................................................................... 24
PENDAHULUAN
Kelapa sawit merupakan tanaman
komoditas perkebunan yang penting di
Indonesia dan masih memiliki prospek
pengembangan
yang
cukup
bagus.
Komoditas kelapa sawit, baik berupa bahan
mentah maupun hasil olahannya, menduduki
peringkat ketiga penyumbang devisa
nonmigas terbesar bagi Indonesia setelah
karet dan kopi (Lubis , 1992). Akan tetapi,
usaha peningkatan produksi kelapa sawit
memiliki hambatan yang diakibatkan oleh
hama dan penyakit, antara lain disebabkan
oleh cendawan patogenik Ganoderma spp.
Cendawan ini menyebabkan penyakit busuk
akar. Penyakit busuk akar merupakan
penyakit pada kelapa sawit yang sulit
ditanggulangi (Lubis 1992).
Pendekatan yang umum dilakukan
dalam pengendalian penyakit tersebut adalah
dengan cara mekanis, kimia dan hayati. Cara
mekanis dilakukan dengan membersihkan
sumber infeksi sebelum tanam dan
menghindari pelukaan pada batang dan akar,
namun ternyata pendekatan ini dianggap
kurang ekonomis karena masih banyak
generasi tanaman baru yang terkena infeksi
Ganoderma
spp.
Pendekatan
kimia
menggunakan
fungisida,
diantaranya
fungisida Tridemorph atau Triadimenol 50
ppm dan Bayfidan 10 ppm. Fungisida ini
dapat membunuh miselium Ganoderma
secara in vitro namun pemberian fungisida
pada perkebunan kelapa sawit ternyata sulit
dilakukan karena areal kelapa sawit yang
luas dan menimbulkan dampak negatif
terhadap lingkungan. Cara hayati dilakukan
dengan
menggunakan
biofungisida
Trichoderma dan Penicilium namun daya
bunuh biofungisida relatif lebih lama
dibandingkan dengan senyawa kimia yang
biasa digunakan sebagai fungisida (Lubis
1992).
Solusi yang paling tepat untuk
pengendalian penyakit ini adalah melalui
program pemuliaan tanaman dengan
menemukan gen-gen yang tahan terhadap
Ganoderma baik yang berasal dari interspesies maupun antar-spesies tetapi hingga
saat ini tanaman tersebut belum pernah ada.
Oleh karena itu, diperlukan pendekatan baru
untuk memperoleh kelapa sawit yang tahan
terhadap serangan Ganoderma. Upaya yang
dilakukan adalah dengan menyisipkan gen
penghasil zat yang berfungsi sebagai anti
jamur salah satunya adalah gen stilbena
sintase (STS) yang berasal dari anggur (Vitis
vinifera).
Tujuan Penelitian ini adalah
mengklon gen stilbena sintase (STS) ke
dalam vektor ekspresi pCAMBIA 1303
diantara promotor CAMP 35S. Hipotesis
dari penelitian ini adalah gen stilbena sintase
(STS) yang berasal dari anggur dapat diklon
ke dalam vektor pCAMBIA 1303.
Pendekatan bioteknologi melalui transfer
gen stilbena sintase (STS) diharapkan
mampu menghasilkan bibit transgenik
kelapa sawit yang toleran terhadap
Ganoderma spp.
TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit
Kelapa sawit (Elaeis guineensis
Jacq) berasal dari Afrika. Tanaman ini
dikenal di Indonesia sejak tahun 1848,
namun baru ditanam secara komersial pada
tahun 1911. Elaeis berasal dari kata Elaion
(bahasa Yunani) yang berarti minyak,
sedangkan guineensis berasal dari Guinea
yaitu nama pantai barat Afrika, dan Jacq
adalah nama penemu kelapa sawit yaitu
Jacquis. Kelapa sawit termasuk divisi
trancheophyta, kelas monocotyledoneae,
ordo cocoideae, famili palmae, spesies
Elaeis guineensis Jacq (Gambar 1).
Upaya peningkatan produksi kelapa
sawit memiliki beberapa hambatan. Salah
satu hambatan untuk meningkatkan produksi
kelapa sawit adalah adanya gangguan
penyakit yang disebabkan oleh Ganoderma
spp. Ganoderma adalah jamur yang
menyebabkan penyakit busuk akar. Penyakit
ini sampai saat ini belum dapat dikendalikan
dengan baik.
Gambar 1 Kelapa sawit (Elaeis guineensis
Jacq).
stilbena
sintase
yang
mengatalisis
pembentukan stilbena hidroksi yang berasal
dari malonil CoA dan p-Coumaroyl CoA.
Tanaman tembakau, tomat, alfafa dan
varietas anggur rentan yang disisipi gen
tersebut terbukti resisten terhadap berbagai
patogen jamur (Hain et al. 1993).
Gambar 2
Kelapa sawit yang terkena
penyakit busuk akar.
Gejala awal penyakit ini adalah
pelepah daun yang berada di pucuk
berwarna pucat seperti kekurangan hara
kemudian daun mengalami nekrosis yang
dimulai dari daun tua ke daun yang lebih
muda, pelepah daun akan patah dan
menggantung. Selain itu, pelepah daun muda
tidak membuka dan terkumpul lebih banyak
dari biasanya. (Gambar 2). Umumnya 6-12
bulan setelah gejala terakhir tanaman akan
mati. Infeksi terjadi karena kontak akar yang
sakit (Lubis 1992).
Stilbena Sintase
Stilbena sintase merupakan gen
yang
berperan
sebagai
pengendali
resveratrol.
Resveratrol
merupakan
pitoaleksin yang paling lama dan intensif
diteliti
dalam
hubungannya
dengan
mekanisme ketahanan suatu tanaman
terhadap
serangan
jamur
patogen.
Resveratrol (trans 3,4,5-trihidroksistilbena)
merupakan pitoaleksin dengan berat molekul
rendah dan bersifat nonprotein yang
terbentuk bila tanaman terinduksi oleh
patogen. Pitoaleksin merupakan metabolit
sekunder yang bersifat antimikrobial
(Ingham 1973).
Beberapa
varietas
tanaman
diketahui memiliki kandungan resveratrol
tinggi secara alami, seperti anggur, kacang
tanah dan pinus. Kandungan resveratrol di
daun anggur sebesar 400 µg g-1 per berat
segar. Konsentrasi sebesar ini menyebabkan
tanaman anggur resisten terhadap serangan
jamur (Sbaghi et al. 1995).
Biosintesis stilbena (resveratrol)
dapat berlangsung bila tersedia enzim
Vektor Pengklonan pGEM-T Easy
Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3)
merupakan plasmid sirkular terbuka,
memiliki dua buah origin of replication dan
gen ketahanan terhadap ampisilin (Amp).
Plasmid ini mengandung multy cloning site.
Karena memiliki kelebihan timin yang
menggantung di ujung terbuka plasmid ( T
overhang), plasmid ini sering dipakai
sebagai vektor untuk produk PCR yang
selalu memiliki kelebihan adenin pada
ujungnya tanpa memerlukan tahapan
pemotongan terlebih dahulu.
Plasmid
pGEM-T Easy juga termasuk plasmid high
copy number yang cocok untuk menyimpan
gen insert dalam suatu inang (Kendrew &
Lawrence 1994). Selain itu, pGEM-T Easy
merupakan vektor yang berukuran kecil
yaitu 3015 bp. Ukuran tersebut relatif kecil
sehingga vektor dapat membawa DNA
target cukup banyak dan memudahkan
preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar.
Vektor berukuran kecil lebih mudah
dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih
mudah dimurnikan karena cenderung tidak
rapuh
dibandingkan
dengan
vektor
berukuran besar ( Sambrook et al. 1991).
Gambar
3
Profil vektor pengklonan
pGEM-T Easy.
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
DNA vektor adalah molekul DNA
yang dapat bereplikasi secara mandiri dan
dapat digunakan sebagai pembawa molekul
DNA lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel. DNA yang
sering digunakan adalah plasmid bakteri.
Plasmid
adalah
bahan
genetik
ekstrakromosom yang diwariskan secara
tetap. Ciri-ciri plasmid antara lain berukuran
kecil dan hanya mengandung beberapa gen,
membawa informasi genetik, terlepas dari
DNA kromosom atau kadang-kadang dapat
berintegrasi dengan DNA kromosom, dan
dapat diisolasi dengan mudah dari sel
bakteri. Ciri lain plasmid adalah mempunyai
situs untuk memulai replikasi yang disebut
ORI (origin of replication) (Nicholl 1994)
Plasmid
pCAMBIA
1303
merupakan plasmid yang dikonstruksi
sebagai vektor DNA dalam metode
transformasi langsung dan menggunakan
Agrobacterium
tumefaciens.
Plasmid
pCAMBIA 1303 mengandung promotor
CaMV 35S (cauliflower mosaic virus).
Promotor ini berhubungan dengan urutan
yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid.
Hal ini memungkinkan pembuatan klon
langsung ke dalam T-DNA plasmid.
Tersedianya promotor aktif yang kuat sangat
diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada
tanaman baik monokotil maupun dikotil.
Beberapa hasil penelitian menyatakan
bahwa
CaMV35S
adalah
promotor
konstitutif yang aktif pada sel tanaman
monokotil akan tetapi kekuatannya sedikit
menurun pada sel tumbuhan dikotil dan
tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira & Citovsky 2002). Selain itu,
pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA. Gen
gusA ( -glucuronidase) dalam plasmid
pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen
reporter
untuk
memonitor
proses
transformasi dan introduksi gen yang
direkayasa (Tzfira & Citovsky 2002).
Rekombinasi DNA
Rekombinasi
DNA
adalah
pembentukan kombinasi baru dari materi
pembawa informasi genetik. Rekombinasi
dilakukan dengan melakukan penyisipan
molekul asam nukleat yang dikerjakan di
luar sel ke suatu vektor dan dibawa masuk
ke dalam sel inang. Rekombinasi DNA
memerlukan adanya vektor dan enzimenzim. Enzim yang umum digunakan adalah
enzim nuklease, ligase, polimerase dan
enzim modifikasi (Brown 1991).
Enzim nuklease adalah enzim yang
mendegradasi DNA dengan memecah ikatan
fosfodiester yang menghubungkan satu
nukleotida dengan nukleotida lainnya pada
urutan DNA. Enzim nuklease terdiri atas
endonuklease
dan
eksonuklease.
Eksonuklease memecah nukleotida satu per
satu dari ujung rantai DNA sementara
endonuklease memecah ikatan fosfodiester
di tengah-tengah pada rantai DNA. Salah
satu
contoh
endonuklease
adalah
endonuklease
restriksi.
Endonuklease
restriksi merupakan enzim bakteri yang
memotong DNA utas ganda hanya pada
tempat pengenalan spesifik. Aktivitas enzim
restriksi dipengaruhi oleh kemurnian DNA,
buffer, dan temperatur. Enzim restriksi
membutuhkan NaCl, Mg2+, dan terkadang
ditriotreitol (DDT) sebagai pereduksi. Sifat
hasil pemotongan DNA oleh enzim nuklease
ini ada dua yaitu (1) ujung tumpul (blunt
end) terjadi karena enzim membuat
potongan utas ganda yang sederhana pada
pertengahan urutan pengenal dan (2) ujung
lengket (sticky end) terjadi karena enzim
restriksi menghasilkan potongan berbentuk
zig zag atau dengan belok tajam melalui dua
atau empat nukleoitida. Salah satu contoh
endonuklease restriksi adalah Spe1 dan Nco1
(Brown 1991). Situs pemotongan enzim
Spe1 adalah di antara basa AC pada urutan
basa ACTAGT sedangkan situs pemotongan
enzim Nco1 adalah di antara basa CC pada
urutan CCATGG. Sifat hasil pemotongan
dari kedua ujung ini adalah ujung lengket.
Enzim kedua dari kelompok enzim
manipulasi DNA adalah enzim ligase.
Enzim ligase berfungsi menyambungkan
utas DNA. Penyambungan DNA terjadi jika
nukleotida yang satu mempunyai gugus 5’
fosfat dan nukleotida yang lain terdiri atas
gugus 3’ hidroksil. Ujung lengket yang
komplementer
jauh
lebih
efisien
dibandingkan dengan ujung tumpul pada
proses ligasi karena ujung-ujung lengket
yang cocok dapat saling berpasangan dengan
ikatan hidrogen (Brown 1991).
Enzim yang ketiga adalah enzim
polimerase. Menurut Brown (1991) enzim
polimerase adalah enzim yang dapat
mensintesis DNA baru. Enzim polimerase
ini dibagi menjadi tiga jenis, yaitu
polimerase DNA 1, polimerase klenow, dan
polimerase transkriptase reversi. Polimerase
DNA 1 melekat pada untaian DNA tunggal
yang pendek dan mensintesis DNA baru
sekaligus mendegradasi DNA yang ada.
Enzim
polimerase
klenow
dapat
mensisntesis DNA komplementer hanya
pada cetakan DNA tunggal. Jenis enzim
yang ketiga yaitu polimerase transkriptase
reversi dapat membentuk untaian DNA
dengan menggunakan RNA sebagai cetakan.
Enzim yang keempat adalah enzim
modifikasi. Enzim modifikasi adalah enzim
yang
dapat
menambahkan
dan
menghilangkan gugus kimia. Salah satu
contoh enzim ini adalah calf intestinal
alkaline phosphatase (CIAP). Enzim ini
mengatalisis pemindahan gugus 5’ fosfat
dari DNA . Pemindahan gugus 5’ fosfat
bertujuan
mencegah
terjadinya
penyambungan intramolekul (Kendrew &
Lawrence 1994).
Tahap-Tahap Rekombinasi DNA
Secara umum rekombinasi DNA
dilakukan sebanyak 6 tahap. Tahap pertama
merupakan tahap isolasi fragmen DNA dan
DNA vektor, masing-masing DNA dapat
diisolasi dari bakteri. Setelah diisolasi,
fragmen DNA dan DNA vektor dipotong
dengan enzim restriksi yang sama. Tahap
selanjutnya adalah penggabungan fragmen
DNA dengan DNA vektor. Tahap ini
biasanya disebut tahap ligasi. Penggabungan
DNA ini biasanya dibantu oleh enzim ligase.
Hasil tahap ligasi adalah terbentuknya DNA
rekombinan (fragmen DNA dengan DNA
vektor).
Tahap ketiga dari rekombinasi
DNA adalah transformasi DNA rekombinan
ke bakteri. Transformasi adalah proses
memasukkan DNA asing ke dalam sel inang.
Tahap keempat adalah seleksi sel inang yang
telah mengalami transformasi dan telah
mengandung DNA rekombinan. Inang yang
telah mengalami transformasi dan telah
mengandung DNA rekombinan dapat
diseleksi
berdasarkan
gen
penanda
(selectable marker) yang dibawa oleh
plasmid. Gen penanda yang biasa digunakan
adalah gen yang tahan terhadap antibiotik
tertentu.
Tahap
selanjutnya
adalah
transformasi ke sel target. Tahap terakhir
dari rekombinasi DNA adalah meneliti gen
yang diklon. Kegiatan ini ditekankan pada
cara mendapatkan informasi mengenai
lokasi gen, struktur gen, cara gen
ditranskripsi, dan produk translasi yang
dikode oleh gen (Brown 1991).
Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Teknik PCR merupakan salah satu
komponen
utama
teknologi
DNA
rekombinan dan pertama kali ditemukan
oleh Kary B. Mulis pada tahun 1983. Teknik
ini merupakan amplifikasi in vitro sejumlah
sekuens DNA dengan menggunakan 2
oligonukleotida sebagai primer yang
berhibridisasi secara berlawanan pada sisi
daerah target utas DNA yang diinginkan
(Old & Primrose 1994). PCR mampu
mengamplifikasi secara selektif sekuens
DNA spesifik dengan faktor 106, hal inilah
yang membuat penggunaan teknik PCR
semakin meluas disamping kesederhanaan
metodenya (Saiki 1989).
Reaksi PCR adalah tiruan dari
proses replikasi DNA, yaitu dengan adanya
pembukaan rantai DNA utas ganda,
penempatan primer, dan perpanjanagan
rantai DNA baru oleh DNA polimerase dari
arah 5’ ke 3’, hanya saja pada teknik PCR
tidak menggunakan enzim ligase dan primer
RNA. Secara ringkas, teknik PCR dilakukan
dengan cara mencampurkan sampel DNA
dengan
primer
oligonukleotida,
deoksiribonukleotida trifosfat,
enzim
termostabil Taq DNA polimerase dalam
larutan yang sesuai, kemudian menaikkan
dan menurunkan suhu campuran secara
berulang selama beberapa jam sampai
diperoleh jumlah sekuen DNA yang
diinginkan.
Satu siklus pada teknik PCR terdiri
atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing
dan ekstensi. Denaturasi dilakukan pada
suhu 90-95 oC, sehingga terjadi pemisahan
utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal
DNA yang menjadi cetakan (template)
tempat penempelan primer dan tempat kerja
DNA
polimerase.
Selanjutnya suhu
diturunkan untuk penempelan primer
oligonukleotida
pada
sekuen
yang
komplementer pada molekul DNA cetakan.
Tahap ini disebut annealing. Suhu annealing
tiap sekuen DNA sifatnya spesifik dan
merupakan penentu utama keberhasilan
suatu reaksi PCR. Tahap terakhir adalah
tahap ekstensi yang dilakukan pada suhu 72
o
C. Suhu ini merupakan suhu optimum
untuk kerja enzim Taq DNA polimerase.
Sintesis DNA komplemen dengan DNA
cetakan terjadi pada rahap ekstensi. Ketiga
tahap tersebut disusun berulang kali dalam
mesin PCR, umumnya antara 25-40 siklus,
bergantung pada jumlah DNA yang
diinginkan
Primer
oligonukleotida
yang
digunakan dalam teknik PCR harus
memenuhi beberapa syarat, antara lain
memiliki susunan basa yang acak, sehingga
tidak terjadi polipurin atau polipirimidin,
memiliki jumlah purin dan pirimidin yang
seimbang, memiliki titik leleh saling
mendekati satu sama lain, dan sedikit
mungkin memiliki basa yang komplementer.
Panjang primer yang umum digunakan
berkisar 20-30 basa (Saiki 1989).
Elektroforesis Gel Agarosa untuk Analisis
Fragmen
Elektroforesis
merupakan
pergerakan zat bermuatan listrik akibat
adanya pengaruh medan listrik. Molekul
DNA termasuk senyawa bermuatan negatif.
Sifat ini menjadikan molekul DNA yang
ditempatkan pada medan listrik akan
bermigrasi menuju kutub positif. Kecepatan
migrasi molekul DNA tergantung pada
konsentrasi gel yang digunakan, ukuran
molekul yang dianalisis, serta tegangan
listrik yang diberikan. Salah satu gel yang
dapat digunakan pada elektroforesis adalah
gel agarosa. Agarosa digunakan untuk
memisahkan,
mengidentifikasi,
dan
memurnikan
fragmen-fragmen
DNA
(Sambrook et al.1989).
Mobilitas fragmen DNA pada gel
elektroforesis sangat dipengaruhi oleh
komposisi dan kelarutan ion buffer
elektroforesis. Jika konsentrasi ion-ion
sangat sedikit maka konduktifitas listrik
sangat kecil dan migrasi DNA menjadi
lambat. Konsentrasi ion yang berlebih akan
mengakibatkan gel mencair dan DNA
terdenaturasi. Selain buffer elektroforesis,
teknik elektroforesis DNA juga memerlukan
loading buffer. Buffer ini berfungsi
meningkatkan densitas sampel sehingga
fragmen tersebut berada di dasar well dan
tidak menyebar. Fungsi lainnya adalah
memberi warna pada fragmen DNA
sehingga mempermudah pengamatan proses
elektroforesis. Buffer ini dapat juga
membantu pergerakan sampel ke anoda.
Ukuran fragmen DNA hasil pemotongan
dengan endonuklease restriksi dapat
ditentukan dengan memakai penanda DNA
(marker). Penanda DNA adalah fragmen
DNA yang telah diketahui ukurannya
(Sambrook et al.1989).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada
penelitian ini adalah tabung mikro 500 µL,
pipet mikro, alumunium foil, parafilm,
sarung tangan, cawan petri, Erlenmeyer,
gelas piala, sudip, peralatan elektroforesis,
gel doc, sentrifus, ose, stirer, laminar air
flow cabinet, inkubator bergoyang, autoklaf,
penangas air, mesin PCR, penangas air
bergoyang, dan lemari es.
Bahan-bahan
yang
digunakan
adalah E. coli galur XL1-Blue, gen stilbena
sintase, plasmid pGEM-T Easy, pCAMBIA
1303, Agrobacterium tumefacians galur
AGL-0, enzim restriksi Nco1 dan Spe1, kit
elusi dari Invitrogen, kit ligasi dari promega,
kit isolasi plasmid dari Roche, kit elusi dari
Qiagen, es batu, TBE 0.5x, EtBr, loading
dye, marker 1 Kb plus, media luria bertani
(LB) yang terdiri atas tripton, ekstrak kamir
dan NaCl, media luria bertani agar (LA)
yang terdiri atas tripton, ekstrak kamir, NaCl
dan agar , KOH 10 N, HCl 5M, bufer ligasi,
T4 ligase, glukosa, Ampisilin 100 mg/L,
IPTG 0.1 mM, X-Gal 40 mg/L, kanamisin
100000 mg/L, rifampisin 25000 mg/L,
EDTA, dNTP, primer M13 F, primer M13
R, Taq polimerase, MW, Mg2+ dan buffer.
Metode Penelitian
Purifikasi Produk PCR (Stilbena Sintase)
Penelitian
ini
dimulai
dari
purifikasi terhadap produk PCR yang
didapatkan. Purifikasi ini menggunakan high
pure plasmid isolation kit dari Invitrogen.
Fragmen dipotong dari gel menggunakan
pisau skalpel, kemudian ditimbang dan
dilarutkan dengan buffer GS1. Penimbangan
dilakukan untuk menentukan banyaknya
buffer GS1 yang harus ditambahkan.
Perbandingan antara sampel dan buffer GS1
adalah
1:3.
Selanjutnya,
campuran
diinkubasi pada suhu 50 oC selama 15 menit,
setiap 3 menit larutan dikocok dengan
membolak-balikan tabung secara perlahan
dan setelah larut campuran dikocok setiap 5
menit. Larutan kemudian ditransfer ke
dalam kolom, lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 12000 rpm selama 2 menit pada
suhu 25oC.
Tahap selanjutnya adalah sebanyak
500 µL buffer GS1 ditambahkan ke dalam
kolom dan diinkubasi selama 1 menit,
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 2 menit. Sampel yang
berada di dalam kolom kemudian ditambah
dengan 700 µL W9 dan diinkubasi selama 5
menit, sampel selanjutnya disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 12000 rpm
selama 2 menit untuk menghilangkan sisa
etanol. Setelah itu, 30 µL buffer TE yang
sudah dipanaskan (65-70oC) dimasukkan ke
dalam sampel, kemudian diinkubasi selama
1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 3 menit. Hasil purifikasi
kemudian diuji dengan elektroforesis gel
agarosa 1% sebanyak 2 µL.
Kloning Gen Stilbena Sintase (STS) ke
dalam Plasmid pGEM-T Easy
Kloning gen diawali dengan ligasi
gen STS dengan pGEM-T Easy. Ligasi
dilakukan dengan menggunakan kit dari
Promega. Sebanyak 5 µL buffer ligase
dicampurkan dengan 0.5 µL plasmid pGEMT Easy , 1 µL T4 Ligase dan 3.5 µL gen
stilbena sintase. Kemudian campuran
diinkubasi pada suhu 25 oC selama 1 jam
atau pada suhu 4 oC selama satu malam.
Hasil ligasi selanjutnya ditransformasikan ke
E.coli XL1-Blue
Transformasi gen hasil ligasi ke
bakteri E.coli XL1-Blue menggunakan
metode heat shock. Sebanyak 10 µ L hasil
ligasi dimasukkan ke dalam 200 µL sel
kompeten dan dikocok perlahan sampai
campuran merata. Selanjutnya, campuran
diinkubasi di dalam es selama 30 menit,
kemudian diinkubasi pada suhu 42 oC
selama 50 detik. Tabung yang telah
diinkubasi pada suhu 42 oC kemudian
diinkubasi di dalam es selama 10 menit.
Larutan kemudian ditambah dengan 800 µL
LB glukosa dan dikocok menggunakan
inkubator bergoyang dengan kecepatan 150
rpm pada suhu 37 oC selama 90 menit.
Selanjutnya, larutan diambil dan disebar ke
media luria bertani agar (LA) ditambah
ampisilin 100 ppm, isopropil tiogalaktosida
(IPTG) 0.1 mM dan X-Gal 40 mg/L.
Selanjutnya dilakukan seleksi putih biru
untuk membedakan sel yang mengandung
plasmid rekombinan dengan sel yang tidak
mengandung plasmid rekombinan.
Konfirmasi Koloni Transforman yang
Membawa Fragmen Sisipan
Konfirmasi koloni transforman
dilakukan dengan teknik PCR koloni. PCR
koloni dilakukan menggunakan mesin PCR
(Biometra T-Personal). Proses ini diawali
oleh pemecahan sel dengan pemanasan 96
o
C selama 5 menit, kemudian suhu turun
menjadi 50 oC dan berlangsung selama 90
detik, suhu naik kembali menjadi 96 oC
selama 90 detik, lalu 90 detik selanjutnya
pada suhu 45 oC, 1 menit pada suhu 96 oC
dan 40 oC selama 1 menit. Setelah
pemanasan pada proses lisis, campuran PCR
(buffer, MW, dNTPs, primer universal M13
F, M13 R dan Taq polimerase) ditambahkan
pada setiap sampel. Proses PCR dilanjutkan
kembali dengan suhu 94 oC selama 30 detik,
55 oC selama 1 menit, dan 2 menit pada 72
o
C selama 30 siklus dan selanjutnya 72 oC
selama 5 menit. Hasil PCR koloni
diverifikasi pada gel agarosa. Koloni terpilih
kemudian dikultur dalam medium LB cair
yang mengandung ampisilin dan diinkubasi
pada inkubator bergoyang suhu 37 oC
dengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya
dilakukan isolasi plasmid menggunakan
High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche)
dari kultur bakteri yang tumbuh. Hasil
isolasi plasmid selanjutnya diverifikasi
kembali pada gel agarosa dan dilakukan
sekuensing.
Sekuensing Fragmen Terklon
Pengurutan
basa
(sekuensing)
fragmen gen terklon dilakukan di Lembaga
Molekuler Eijkman Jakarta menggunakan
primer universal M13 F dan M13 R. Hasil
sekuen fragen selanjutnya dianalisis dengan
program bioinformatika.
Isolasi DNA Plasmid
Prosedur
yang
digunakan
mengikuti prosedur High Pure Plasmid
Isolation Kit dari Roche. Isolasi DNA
plasmid dilakukan terhadap koloni yang
berdasarkan hasil PCR koloni diketahui
mengandung plasmid terinsersi fragmen
yang diinginkan. Koloni tersebut dikulturkan
dalam media luria bertani (LB) yang
mengandung ampisilin kemudian diinkubasi
selama 16 jam pada suhu 37 oC dengan
pengocokan 150 rpm . DNA plasmid yang
diperoleh dielektroforesis dengan gel
agarosa 1% untuk melihat kemurniannya.
Sebanyak 3-4 mL kultur sel
Escherichia coli diransfer ke dalam tabung
mikro dan disentrifugasi dengan kecepatan
8000 rpm pada suhu 25 oC selama 2 menit.
Pellet
yang
dihasilkan
kemudian
diresuspensikan dengan suspension buffer
250 µL dan ditambahkan lysis buffer
selanjutnya diaduk 6-8 kali. Campuran
kemudian diinkubasi selama 5 menit pada
suhu ruang dan ditambah dengan 350 µ L
binding buffer dan diaduk 3-4 kali,
campuran diinkubasi kembali didalam es
selam 5 menit. Selanjutnya, campuran
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm
selama 10 menit pada suhu 25 oC,
supernatan kemudian ditransfer ke kolom
dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan
13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC.
Cairan di bawah kolom dibuang dan
ditambah dengan 500 µL wash buffer 1.
Selanjutnya, larutan disentrifugasi dengan
kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada
suhu 25 oC, cairan di bawah kolom dibuang
dan ditambah dengan wash buffer 2. Larutan
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC,
cairan di bawah kolom dibuang selanjutnya
disentrifugasi kembali. Sebanyak 30 µL
elution buffer selanjutnya ditambahkan ke
dalam kolom dan disentrifugasi dengan
kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada
suhu 25 o C, hasil purifikasi kemudian diuji
dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Pemotongan
pGEM-T
Easy
dan
Pemurnian Gen Stilbena Sintase
Plasmid pGEM-T Easy yang
mengandung gen stilbena sintase dipotong
menggunakan enzim restriksi Spe1 dan
Nco1. Sebanyak 49 µL DNA plasmid
rekombinan dicampur dengan 7 µL dH2O, 7
µL buffer 2 SpeI, 7 µL enzim SpeI dan 7 µL
enzim NcoI . Campuran diinkubasi selama 1
jam pada suhu 37 oC dan kemudian
dielektroforesis menggunakan gel agarosa
0.6%. Setelah elektroforesis selesai, gel
diletakkan pada gel doc. Selanjutnya
fragmen yang berukuran 1500 bp dipotong
menggunakan skalpel untuk dipurifikasi.
Kloning Gen Stilbena Sintase dengan
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
Sebelum diligasi dengan gen
stilbena sintase, plasmid pCAMBIA 1303
dipotong terlebih dahulu dengan enzim
restriksi Spe1 dan Nco1. Pemotongan ini
dilakukan pada suhu 37 oC selama 1 jam.
Ligasi dilakukan menggunakan T4 ligase
dan buffer ligase dari Promega. Sebanyak 5
µL gen stilbena sintase yang telah
dipurifikasi dicampur dengan buffer ligase
sebanyak 10 µL, 3 µL plasmid pCAMBIA
1303 dan 2 µL T4 ligase di dalam tabung
mikro 500 µL . Selanjutnya, tabung ditutup
dengan parafilm, diaduk menggunakan alat
spin kira-kira 1 menit, kemudian diinkubasi
pada suhu 4 oC selama 16 jam.
Transformasi gen stilbena sintase
ke dalam bakteri E.coli XL1-Blue
menggunakan metode heat shock. Sebanyak
10 µL hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200
µL sel kompeten dan dikocok perlahan
sampai campuran merata. Selanjutnya,
campuran diinkubasi di dalam es selama 30
menit, kemudian diinkubasi pada suhu 42 oC
selama 50 detik. Campuran kemudian
diinkubasi di dalam es selama 10 menit,
ditambah dengan 800 µL LB glukosa dan
dikocok menggunakan inkubator bergoyang
dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC
selama 90 menit. Selanjutnya, campuran
disebar ke media LA dengan penambahan
kanamisin 25 mg/L kemudian diinkubasi
selama 1 malam.
Seleksi DNA Rekombinan
Setelah diinkubasi semalam, koloni
yang terbentuk diambil dengan tusuk gigi
dan diberi nomor kemudian dimasukkan ke
dalam media LA untuk dibuat duplikatnya
dan juga koloni tersebut dikulturkan dalam
media LB yang mengandung kanamisin 25
mg/L. Selanjutnya dikocok pada kecepatan
150 rpm selama 1 malam. Hasil kultur
selanjutnya diisolasi menggunakan kit dari
Qiagen dan ditransformasikan ke dalam
Agrobacterium setelah dilakukan analisis
restriksi menggunakan enzim Spe1 dan
Nco1.
Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena
Sintase
ke dalam Agrobacterium
tumefaciens
Transformasi pCAMBIA 1303stilbena sintase ke dalam Agrobacterium
tumefaciens menggunakan metode heat
shock. Sebanyak 10 µL DNA plasmid
ditambahkan ke dalam 500 µL sel kompeten
Agrobacterium strain AGL-0. Kemudian
diinkubasi didalam es selama 15 menit.
Selanjutnya, campuran diinkubasi selama 5
menit di nitrogen cair lalu 5 menit pada suhu
37 oC. Campuran kemudian ditambah
dengan 1 mL YEP dan diinkubasi selama 3
jam pada suhu 28 oC. Selanjutnya, campuran
disentrifugasi 3 menit dengan kecepatan
6000 rpm pada suhu 25 o C. Supernatan
dibuang dan 200 µL dicampur dengan pellet.
Campuran kemudian disebar ke media LA
yang mengandung rifampisin 50 mg/L dan
kanamisin 25 mg/L lalu diinkubasi pada
suhu 28 oC selama 2 malam dalam keadaan
gelap sambil dikocok dengan kecepatan 150
rpm.
Seleksi DNA Rekombinan
Setelah
DNA
rekombinan
pCAMBIA
1303-stilbena
sintase
ditransformasikan
ke
Agrobacterium
tumefaciens diinkubasi 2 malam, koloni
yang terbentuk diambil dengan tusuk gigi.
Kemudian koloni tersebut diberi nomor.
Selanjutnya, koloni dimasukkan ke dalam
media LA untuk dibuat duplikatnya dan juga
koloni tersebut dikulturkan dalam media LB
yang mengandung kanamisin 25 mg/L dan
rifampisin 50 mg/L. Selanjutnya koloni
dalam media LB diinkubasi pada suhu 28 oC
sambil dikocok pada kecepatan 150 rpm
selama 2 malam kemudian dilakukan isolasi
plasmid.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Purifikasi dan Pengujian Produk PCR
(Stilbena Sintase)
Purifikasi ini menggunakan high
pure plasmid isolation kit dari Invitrogen.
Percobaan dilakukan sesuai dengan prosedur
yang terdapat dalam metode. Purifikasi
bertujuan memurnikan produk PCR yang
diperoleh dari pengotor yang mungkin ada
pada produk PCR. Hasil purifikasi kemudian
diuji dengan elektroforesis gel agarosa.
Hasil elektroforesis menunjukkan
adanya satu fragmen hasil purifikasi.
Fragmen tersebut berukuran sekitar 1500 bp
dan fragmen ini diperkirakan merupakan gen
stilbena sintase yang diinginkan (Gambar 4).
Pengujian dengan elektroforesis gel agarosa
dilakukan untuk mengetahui kualitas dan
kuantitas gen stilbena sintase yang akan
diligasi dengan vektor pGEM-T Easy. Hasil
purifikasi ini selanjutnya dimasukkan ke
dalam vektor pengklonan pGEM-T Easy
5000 bp
1500 bp
1000 bp
M
Gambar 4
Hasil purifikasi gen stilbena
sintase, M= marker, fragmen
berukuran 1500 bp = Gen
stilbena sintase.
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam
Vektor pGEM-T Easy
Tahapan kloning terdiri atas ligasi,
transformasi dan seleksi. Ligasi dilakukan
dengan menggabungkan fregmen gen
stilbena sintase, plasmid pGEM-T Easy
sebagai vektor, buffer dan T4 DNA ligase.
Produk ligasi kemudian ditransformasikan
ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue
kompeten. Produk ligasi pada tahap ini
adalah stilbena sintase yang sudah disisipkan
pada vektor pGEM-T Easy.
Transformasi ke Escherichia coli
dilakukan untuk memperbanyak DNA
plasmid
rekombinan.
Transformasi
dilakukan menggunakan metode heat shock
yaitu dengan pemberian kejut panas pada
suhu 42 oC selama 50 detik. Prinsip dari
proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu
dari 0 oC ke 42 oC terhadap sel yang telah
diberi perlakuan CaCl2. Perlakuan CaCl2 ini
dilakukan dalam pembuatan sel kompeten.
Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas
membran sel sehingga pada saat terjadi
lonjakan suhu membran menjadi tidak
selektif terhadap molekul asing dan produk
ligasi dapat masuk ke dalam sel. Sel
kemudian dikultur dalam media tumbuh LB
dengan penambahan glukosa selama 1.5 jam
untuk memperbanyak jumlah sel dan
memberi kesempatan kepada sel untuk
mengekspresikan marka seleksi dari plasmid
yang dibawanya. Setelah itu sel disebar pada
media seleksi LA, IPTG, dan X-Gal
kemudian diinkubasi selama 16 jam pada
suhu
37 o C. Penambahan IPTG dalam
media seleksi berfungsi sebagai penginduksi
ekspresi gen sedangkan X-Gal berfungsi
sebagai substrat.
Hasil transformasi ke Escherichia
coli menunjukkan terbentuknya koloni putih
dan biru (Gambar 5). Koloni putih
merupakan koloni yang diperkirakan
mengandung fragmen gen sisipan (gen
stilbena sintase) sedangkan koloni biru
diperkirakan merupakan koloni yang tidak
mengandung
fragmen
gen
sisipan.
Terbentuknya koloni putih biru ini
disebabkan adanya marka seleksi pada
vektor pGEM-T Easy. Marka seleksi
biasanya berupa gen yang membawa sifat
re
SAWIT
EMBI LILIS
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
EMBI LILIS. Konstruksi DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase
Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan
TETTY CHAIDAMSARI.
Kelapa sawit merupakan komoditas perkebunan yang penting di Indonesia.
Namun usaha peningkatan produksi kelapa sawit memiliki hambatan. Salah satu
hambatan itu adalah adanya penyakit busuk akar yang disebabkan oleh
Ganoderma spp. Pendekatan baru untuk memperoleh kelapa sawit yang tahan
terhadap serangan Ganoderma adalah dengan menyisipkan gen penghasil zat
yang berfungsi sebagai antijamur. Salah satu gen penghasil zat antijamur adalah
gen stilbena sintase yang berasal dari anggur (Vitis vinifera). Tujuan penelitian ini
adalah mengklon gen stilbena sintase pada vektor ekspresi pCAMBIA 1303
diantara promotor CaMV 35S. Gen stilbena sintase diklon terlebih dahulu ke
dalam vektor ekspresi pCAMBIA 1303, kemudian ditransformasikan ke
Eschericia coli XL-1 Blue dan selanjutnya dimasukkan kedalam Agrobacterium
tumefaciens. Hasil penelitian membuktikan bahwa gen stilbena sintase telah
berhasil diklon ke dalam vektor pCAMBIA 1303. Hasil ini ditunjukkan oleh
terbentuknya dua pita pada gel elektroforesis masing-masing berukuran 12000 bp
(plasmid pCAMBIA 1303) dan 1500 bp (gen stilbena sintase) setelah dipotong
dengan enzim Spe1 dan Nco1.
ABSTRACT
EMBI LILIS. The Construction of pCAMBIA 1303-Stilbene Syntase
Recombinant DNA Preventive for Rotten Root Disease of Oil Palm. Under the
direction of I MADE ARTIKA and TETTY CHAIDAMSARI.
An oil palm is one of the important estate commodities in Indonesia.
Nevertheless the effort to increase its productivity has many hindrances. One of
them is rotten root disease caused by Ganoderma spp. New approach to get
resistence oil palm toward Ganoderma attack is to insert gene produces substance
played role as an antifungi. One of genes that produces antifungi is stilbene
syntase gene derived from grapes (Vitis vinifera). The purpose of this research is
to cloning stilbene syntase gene on to pCAMBIA 1303 expression vector between
35S CaMV promoter. Stilbene syntase gene was cloned on to pCAMBIA 1303
expression vector then to be transformed on to Escherichia coli XL-1 Blue and the
last to be inserted on to Agrobacterium tumefaciens. The result of this research
shows stilbene syntase gene was successful to be cloned to pCAMBIA 1303. This
result was showed by two band sized 12000 bp (pCAMBIA 1303 plasmid) and
1500 bp (stilbene syntase gene) in agarose gel after have been restricted with SpeI
and NcoI enzyme.
KONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pCAMBIA 1303STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA
SAWIT
EMBI LILIS
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul
Nama
NIM
: Konstruksi DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase
Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit
: Embi Lilis
: G84052166
Disetujui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc.
Ketua
Dr. Tetty Chaidamsari,M.Si.
Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 11 Mei 1986 dari pasangan H.
Marjuk dan Hj. Nurjanah. Penulis merupakan anak keempat dari empat
bersaudara.
Pendidikan penulis dimulai dari SDN Karang Anyar Sukaresmi Cianjur
hingga lulus tahun 1999. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan ke SMPN 1
Sukaresmi Cianjur dan lulus tahun 2002. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA
Negeri 1 Sukaresmi Cianjur dan melanjutkan pendikannya ke Institut Pertanian
Bogor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam kegiatan-kegiatan
organisasi kemahasiswaan diantaranya penulis aktif di Lembaga Dakwah Fakultas
MIPA (Serum G) dan CREBs. Penulis juga aktif mengikuti beberapa acara
kepanitiaan di IPB seperti politic expose 2006/2007 dan masa pengenalan
departemen Biokimia 2007/2008. Penulis melakukan Praktik Lapangan di PT
Gizindo Primanusantara Padalarang, Bandung.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan ridhaNya sehingga
penulis dapat menyelesaikan Karya Ilmiah ini. Penelitian ini dilaksanakan pada
bulan Februari sampai dengan Juli 2009 di Laboratorium Biologi Molekuler Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Penelitian ini berjudul Konstruksi
DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase Pencegah Busuk Akar
Kelapa Sawit.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah
membantu penyusunan Karya Ilmiah ini terutama kepada Ibu Dr. Tetty
Chaidamsari, M.Si dan Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc, selaku
pembimbing, Teh Herti, dan Teh Nina serta seluruh staf Laboratorium Biologi
Molekular. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Tri, Nunung,
Saeli, Jimy, Wiwin, Mba Ratna, Yoanita, Dwi dan teman-teman Biokimia 42 atas
motivasinya. Tak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Ibu, Bapak, Aa,
Teteh, atas doa dan kasih sayang yang selalu menyertai. Semoga Karya Ilmiah ini
dapat bermanfaat.
Bogor, Oktober 2009
Embi Lilis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ........................................................................ vi
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... vi
PENDAHULUAN ............................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit ...............................................................................................
Stilbena Sintase .........................................................................................
Vektor Pengklonan pGEM-T Easy .............................................................
Vektor Ekspresi pCambia 1303. ..................................................................
Rekombinasi DNA.........................................................................................
Polimerase Chain Reaction (PCR) .............................................................
Elektroforesis Gel Agarosa untuk Analisis Fragmen................................. .
1
2
2
3
3
4
5
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan..........................................................................................
Metode......................................................................................................
5
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Purifikasi dan Pengujian Produk PCR (stilbena sintase) ..............................
Kloning Gen Stilbena Sintase ke pGEM-T Easy........................................
Urutan Nukleotida Gen Stilbena Sintase.......................................................
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam Vektor Ekspresi
pCAMBIA 1303......................................................................................
Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase ke dalam
Agrobacterium tumefaciens......................................................................
8
8
9
10
12
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 13
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 14
LAMPIRAN .................................................................................................... 15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq) ......................................................... 1
2
Kelapa sawit yang terkena penyakit busuk akar............................................ 2
3
Profil vektor pengklonan pGEM-T easy ....................................................... 2
2
Hasil purifikasi gen stilbena sintase sebagai produk PCR ............................. 8
5
Koloni biru putih hasil transformsi pGEM-T Easy ke
Escherichia coli XL-1 Blue ......................................................................... 9
6
Hasil PCR koloni gen stilbena sintase ......................................................... 9
7
Hasil pemotongan pGEMT-Easy dan STS menggunakan
enzim restriksi Spe 1 dan Nco1................................................................... 10
8
Hasil pemotongan pCAMBIA 1303 dengan enzim Nco1 dan Spe1.............. 11
9
Hasil purifikasi pCAMBIA 1303................................................................ 11
10 Hasil transformasi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena sintase
ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue ........................................................ 12
11 Hasil pemotongan pCAMBIA 1303-STS dengan enzim Spe1
dan Nco1.................................................................................................... 12
12 Hasil transformasi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-STS ke
Agrobacterium tumefaciens........................................................................ 13
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian ........................................................................................ 16
2 Prosedur elektroforesis gel agarosa .............................................................. 17
3 Komposisi larutan sediaan............................................................................. 18
4 Prosedur kerja isolasi plasmid dengan kit dari Qiagen .................................. 20
5 Elektroforegram hasil sekuensing.................................................................. 21
6 Hasil analisis BLASTX fragmen gen stilbena sintase ................................... 22
7 Peta restriksi pCAMBIA 1303 .................................................................... 24
KONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pCAMBIA 1303STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA
SAWIT
EMBI LILIS
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
ABSTRAK
EMBI LILIS. Konstruksi DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase
Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan
TETTY CHAIDAMSARI.
Kelapa sawit merupakan komoditas perkebunan yang penting di Indonesia.
Namun usaha peningkatan produksi kelapa sawit memiliki hambatan. Salah satu
hambatan itu adalah adanya penyakit busuk akar yang disebabkan oleh
Ganoderma spp. Pendekatan baru untuk memperoleh kelapa sawit yang tahan
terhadap serangan Ganoderma adalah dengan menyisipkan gen penghasil zat
yang berfungsi sebagai antijamur. Salah satu gen penghasil zat antijamur adalah
gen stilbena sintase yang berasal dari anggur (Vitis vinifera). Tujuan penelitian ini
adalah mengklon gen stilbena sintase pada vektor ekspresi pCAMBIA 1303
diantara promotor CaMV 35S. Gen stilbena sintase diklon terlebih dahulu ke
dalam vektor ekspresi pCAMBIA 1303, kemudian ditransformasikan ke
Eschericia coli XL-1 Blue dan selanjutnya dimasukkan kedalam Agrobacterium
tumefaciens. Hasil penelitian membuktikan bahwa gen stilbena sintase telah
berhasil diklon ke dalam vektor pCAMBIA 1303. Hasil ini ditunjukkan oleh
terbentuknya dua pita pada gel elektroforesis masing-masing berukuran 12000 bp
(plasmid pCAMBIA 1303) dan 1500 bp (gen stilbena sintase) setelah dipotong
dengan enzim Spe1 dan Nco1.
ABSTRACT
EMBI LILIS. The Construction of pCAMBIA 1303-Stilbene Syntase
Recombinant DNA Preventive for Rotten Root Disease of Oil Palm. Under the
direction of I MADE ARTIKA and TETTY CHAIDAMSARI.
An oil palm is one of the important estate commodities in Indonesia.
Nevertheless the effort to increase its productivity has many hindrances. One of
them is rotten root disease caused by Ganoderma spp. New approach to get
resistence oil palm toward Ganoderma attack is to insert gene produces substance
played role as an antifungi. One of genes that produces antifungi is stilbene
syntase gene derived from grapes (Vitis vinifera). The purpose of this research is
to cloning stilbene syntase gene on to pCAMBIA 1303 expression vector between
35S CaMV promoter. Stilbene syntase gene was cloned on to pCAMBIA 1303
expression vector then to be transformed on to Escherichia coli XL-1 Blue and the
last to be inserted on to Agrobacterium tumefaciens. The result of this research
shows stilbene syntase gene was successful to be cloned to pCAMBIA 1303. This
result was showed by two band sized 12000 bp (pCAMBIA 1303 plasmid) and
1500 bp (stilbene syntase gene) in agarose gel after have been restricted with SpeI
and NcoI enzyme.
KONSTRUKSI DNA REKOMBINAN pCAMBIA 1303STILBENA SINTASE PENCEGAH BUSUK AKAR KELAPA
SAWIT
EMBI LILIS
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009
Judul
Nama
NIM
: Konstruksi DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase
Pencegah Busuk Akar Kelapa Sawit
: Embi Lilis
: G84052166
Disetujui
Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc.
Ketua
Dr. Tetty Chaidamsari,M.Si.
Anggota
Diketahui
Dr. drh. Hasim, DEA
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Tanggal Lulus:
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cianjur pada tanggal 11 Mei 1986 dari pasangan H.
Marjuk dan Hj. Nurjanah. Penulis merupakan anak keempat dari empat
bersaudara.
Pendidikan penulis dimulai dari SDN Karang Anyar Sukaresmi Cianjur
hingga lulus tahun 1999. Kemudian penulis melanjutkan pendidikan ke SMPN 1
Sukaresmi Cianjur dan lulus tahun 2002. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA
Negeri 1 Sukaresmi Cianjur dan melanjutkan pendikannya ke Institut Pertanian
Bogor Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam kegiatan-kegiatan
organisasi kemahasiswaan diantaranya penulis aktif di Lembaga Dakwah Fakultas
MIPA (Serum G) dan CREBs. Penulis juga aktif mengikuti beberapa acara
kepanitiaan di IPB seperti politic expose 2006/2007 dan masa pengenalan
departemen Biokimia 2007/2008. Penulis melakukan Praktik Lapangan di PT
Gizindo Primanusantara Padalarang, Bandung.
PRAKATA
Puji syukur kehadirat Allah SWT atas rahmat dan ridhaNya sehingga
penulis dapat menyelesaikan Karya Ilmiah ini. Penelitian ini dilaksanakan pada
bulan Februari sampai dengan Juli 2009 di Laboratorium Biologi Molekuler Balai
Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia. Penelitian ini berjudul Konstruksi
DNA Rekombinan pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase Pencegah Busuk Akar
Kelapa Sawit.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah
membantu penyusunan Karya Ilmiah ini terutama kepada Ibu Dr. Tetty
Chaidamsari, M.Si dan Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M.App. Sc, selaku
pembimbing, Teh Herti, dan Teh Nina serta seluruh staf Laboratorium Biologi
Molekular. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Tri, Nunung,
Saeli, Jimy, Wiwin, Mba Ratna, Yoanita, Dwi dan teman-teman Biokimia 42 atas
motivasinya. Tak lupa penulis sampaikan terima kasih kepada Ibu, Bapak, Aa,
Teteh, atas doa dan kasih sayang yang selalu menyertai. Semoga Karya Ilmiah ini
dapat bermanfaat.
Bogor, Oktober 2009
Embi Lilis
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ........................................................................ vi
DAFTAR LAMPIRAN..................................................................................... vi
PENDAHULUAN ............................................................................................. 1
TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit ...............................................................................................
Stilbena Sintase .........................................................................................
Vektor Pengklonan pGEM-T Easy .............................................................
Vektor Ekspresi pCambia 1303. ..................................................................
Rekombinasi DNA.........................................................................................
Polimerase Chain Reaction (PCR) .............................................................
Elektroforesis Gel Agarosa untuk Analisis Fragmen................................. .
1
2
2
3
3
4
5
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan..........................................................................................
Metode......................................................................................................
5
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Purifikasi dan Pengujian Produk PCR (stilbena sintase) ..............................
Kloning Gen Stilbena Sintase ke pGEM-T Easy........................................
Urutan Nukleotida Gen Stilbena Sintase.......................................................
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam Vektor Ekspresi
pCAMBIA 1303......................................................................................
Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena Sintase ke dalam
Agrobacterium tumefaciens......................................................................
8
8
9
10
12
SIMPULAN DAN SARAN .............................................................................. 13
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 14
LAMPIRAN .................................................................................................... 15
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
Kelapa sawit (Elaeis guineensis Jacq) ......................................................... 1
2
Kelapa sawit yang terkena penyakit busuk akar............................................ 2
3
Profil vektor pengklonan pGEM-T easy ....................................................... 2
2
Hasil purifikasi gen stilbena sintase sebagai produk PCR ............................. 8
5
Koloni biru putih hasil transformsi pGEM-T Easy ke
Escherichia coli XL-1 Blue ......................................................................... 9
6
Hasil PCR koloni gen stilbena sintase ......................................................... 9
7
Hasil pemotongan pGEMT-Easy dan STS menggunakan
enzim restriksi Spe 1 dan Nco1................................................................... 10
8
Hasil pemotongan pCAMBIA 1303 dengan enzim Nco1 dan Spe1.............. 11
9
Hasil purifikasi pCAMBIA 1303................................................................ 11
10 Hasil transformasi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-stilbena sintase
ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue ........................................................ 12
11 Hasil pemotongan pCAMBIA 1303-STS dengan enzim Spe1
dan Nco1.................................................................................................... 12
12 Hasil transformasi DNA rekombinan pCAMBIA 1303-STS ke
Agrobacterium tumefaciens........................................................................ 13
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian ........................................................................................ 16
2 Prosedur elektroforesis gel agarosa .............................................................. 17
3 Komposisi larutan sediaan............................................................................. 18
4 Prosedur kerja isolasi plasmid dengan kit dari Qiagen .................................. 20
5 Elektroforegram hasil sekuensing.................................................................. 21
6 Hasil analisis BLASTX fragmen gen stilbena sintase ................................... 22
7 Peta restriksi pCAMBIA 1303 .................................................................... 24
PENDAHULUAN
Kelapa sawit merupakan tanaman
komoditas perkebunan yang penting di
Indonesia dan masih memiliki prospek
pengembangan
yang
cukup
bagus.
Komoditas kelapa sawit, baik berupa bahan
mentah maupun hasil olahannya, menduduki
peringkat ketiga penyumbang devisa
nonmigas terbesar bagi Indonesia setelah
karet dan kopi (Lubis , 1992). Akan tetapi,
usaha peningkatan produksi kelapa sawit
memiliki hambatan yang diakibatkan oleh
hama dan penyakit, antara lain disebabkan
oleh cendawan patogenik Ganoderma spp.
Cendawan ini menyebabkan penyakit busuk
akar. Penyakit busuk akar merupakan
penyakit pada kelapa sawit yang sulit
ditanggulangi (Lubis 1992).
Pendekatan yang umum dilakukan
dalam pengendalian penyakit tersebut adalah
dengan cara mekanis, kimia dan hayati. Cara
mekanis dilakukan dengan membersihkan
sumber infeksi sebelum tanam dan
menghindari pelukaan pada batang dan akar,
namun ternyata pendekatan ini dianggap
kurang ekonomis karena masih banyak
generasi tanaman baru yang terkena infeksi
Ganoderma
spp.
Pendekatan
kimia
menggunakan
fungisida,
diantaranya
fungisida Tridemorph atau Triadimenol 50
ppm dan Bayfidan 10 ppm. Fungisida ini
dapat membunuh miselium Ganoderma
secara in vitro namun pemberian fungisida
pada perkebunan kelapa sawit ternyata sulit
dilakukan karena areal kelapa sawit yang
luas dan menimbulkan dampak negatif
terhadap lingkungan. Cara hayati dilakukan
dengan
menggunakan
biofungisida
Trichoderma dan Penicilium namun daya
bunuh biofungisida relatif lebih lama
dibandingkan dengan senyawa kimia yang
biasa digunakan sebagai fungisida (Lubis
1992).
Solusi yang paling tepat untuk
pengendalian penyakit ini adalah melalui
program pemuliaan tanaman dengan
menemukan gen-gen yang tahan terhadap
Ganoderma baik yang berasal dari interspesies maupun antar-spesies tetapi hingga
saat ini tanaman tersebut belum pernah ada.
Oleh karena itu, diperlukan pendekatan baru
untuk memperoleh kelapa sawit yang tahan
terhadap serangan Ganoderma. Upaya yang
dilakukan adalah dengan menyisipkan gen
penghasil zat yang berfungsi sebagai anti
jamur salah satunya adalah gen stilbena
sintase (STS) yang berasal dari anggur (Vitis
vinifera).
Tujuan Penelitian ini adalah
mengklon gen stilbena sintase (STS) ke
dalam vektor ekspresi pCAMBIA 1303
diantara promotor CAMP 35S. Hipotesis
dari penelitian ini adalah gen stilbena sintase
(STS) yang berasal dari anggur dapat diklon
ke dalam vektor pCAMBIA 1303.
Pendekatan bioteknologi melalui transfer
gen stilbena sintase (STS) diharapkan
mampu menghasilkan bibit transgenik
kelapa sawit yang toleran terhadap
Ganoderma spp.
TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit
Kelapa sawit (Elaeis guineensis
Jacq) berasal dari Afrika. Tanaman ini
dikenal di Indonesia sejak tahun 1848,
namun baru ditanam secara komersial pada
tahun 1911. Elaeis berasal dari kata Elaion
(bahasa Yunani) yang berarti minyak,
sedangkan guineensis berasal dari Guinea
yaitu nama pantai barat Afrika, dan Jacq
adalah nama penemu kelapa sawit yaitu
Jacquis. Kelapa sawit termasuk divisi
trancheophyta, kelas monocotyledoneae,
ordo cocoideae, famili palmae, spesies
Elaeis guineensis Jacq (Gambar 1).
Upaya peningkatan produksi kelapa
sawit memiliki beberapa hambatan. Salah
satu hambatan untuk meningkatkan produksi
kelapa sawit adalah adanya gangguan
penyakit yang disebabkan oleh Ganoderma
spp. Ganoderma adalah jamur yang
menyebabkan penyakit busuk akar. Penyakit
ini sampai saat ini belum dapat dikendalikan
dengan baik.
Gambar 1 Kelapa sawit (Elaeis guineensis
Jacq).
stilbena
sintase
yang
mengatalisis
pembentukan stilbena hidroksi yang berasal
dari malonil CoA dan p-Coumaroyl CoA.
Tanaman tembakau, tomat, alfafa dan
varietas anggur rentan yang disisipi gen
tersebut terbukti resisten terhadap berbagai
patogen jamur (Hain et al. 1993).
Gambar 2
Kelapa sawit yang terkena
penyakit busuk akar.
Gejala awal penyakit ini adalah
pelepah daun yang berada di pucuk
berwarna pucat seperti kekurangan hara
kemudian daun mengalami nekrosis yang
dimulai dari daun tua ke daun yang lebih
muda, pelepah daun akan patah dan
menggantung. Selain itu, pelepah daun muda
tidak membuka dan terkumpul lebih banyak
dari biasanya. (Gambar 2). Umumnya 6-12
bulan setelah gejala terakhir tanaman akan
mati. Infeksi terjadi karena kontak akar yang
sakit (Lubis 1992).
Stilbena Sintase
Stilbena sintase merupakan gen
yang
berperan
sebagai
pengendali
resveratrol.
Resveratrol
merupakan
pitoaleksin yang paling lama dan intensif
diteliti
dalam
hubungannya
dengan
mekanisme ketahanan suatu tanaman
terhadap
serangan
jamur
patogen.
Resveratrol (trans 3,4,5-trihidroksistilbena)
merupakan pitoaleksin dengan berat molekul
rendah dan bersifat nonprotein yang
terbentuk bila tanaman terinduksi oleh
patogen. Pitoaleksin merupakan metabolit
sekunder yang bersifat antimikrobial
(Ingham 1973).
Beberapa
varietas
tanaman
diketahui memiliki kandungan resveratrol
tinggi secara alami, seperti anggur, kacang
tanah dan pinus. Kandungan resveratrol di
daun anggur sebesar 400 µg g-1 per berat
segar. Konsentrasi sebesar ini menyebabkan
tanaman anggur resisten terhadap serangan
jamur (Sbaghi et al. 1995).
Biosintesis stilbena (resveratrol)
dapat berlangsung bila tersedia enzim
Vektor Pengklonan pGEM-T Easy
Plasmid pGEM-T Easy (Gambar3)
merupakan plasmid sirkular terbuka,
memiliki dua buah origin of replication dan
gen ketahanan terhadap ampisilin (Amp).
Plasmid ini mengandung multy cloning site.
Karena memiliki kelebihan timin yang
menggantung di ujung terbuka plasmid ( T
overhang), plasmid ini sering dipakai
sebagai vektor untuk produk PCR yang
selalu memiliki kelebihan adenin pada
ujungnya tanpa memerlukan tahapan
pemotongan terlebih dahulu.
Plasmid
pGEM-T Easy juga termasuk plasmid high
copy number yang cocok untuk menyimpan
gen insert dalam suatu inang (Kendrew &
Lawrence 1994). Selain itu, pGEM-T Easy
merupakan vektor yang berukuran kecil
yaitu 3015 bp. Ukuran tersebut relatif kecil
sehingga vektor dapat membawa DNA
target cukup banyak dan memudahkan
preparasi DNA sisipan dalam jumlah besar.
Vektor berukuran kecil lebih mudah
dimasukkan ke dalam sel inang dan lebih
mudah dimurnikan karena cenderung tidak
rapuh
dibandingkan
dengan
vektor
berukuran besar ( Sambrook et al. 1991).
Gambar
3
Profil vektor pengklonan
pGEM-T Easy.
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
DNA vektor adalah molekul DNA
yang dapat bereplikasi secara mandiri dan
dapat digunakan sebagai pembawa molekul
DNA lain yang tidak memiliki kemampuan
bereplikasi sendiri di dalam sel. DNA yang
sering digunakan adalah plasmid bakteri.
Plasmid
adalah
bahan
genetik
ekstrakromosom yang diwariskan secara
tetap. Ciri-ciri plasmid antara lain berukuran
kecil dan hanya mengandung beberapa gen,
membawa informasi genetik, terlepas dari
DNA kromosom atau kadang-kadang dapat
berintegrasi dengan DNA kromosom, dan
dapat diisolasi dengan mudah dari sel
bakteri. Ciri lain plasmid adalah mempunyai
situs untuk memulai replikasi yang disebut
ORI (origin of replication) (Nicholl 1994)
Plasmid
pCAMBIA
1303
merupakan plasmid yang dikonstruksi
sebagai vektor DNA dalam metode
transformasi langsung dan menggunakan
Agrobacterium
tumefaciens.
Plasmid
pCAMBIA 1303 mengandung promotor
CaMV 35S (cauliflower mosaic virus).
Promotor ini berhubungan dengan urutan
yang terpoliadenilasi pada T-DNA plasmid.
Hal ini memungkinkan pembuatan klon
langsung ke dalam T-DNA plasmid.
Tersedianya promotor aktif yang kuat sangat
diperlukan untuk ekspresi suatu gen pada
tanaman baik monokotil maupun dikotil.
Beberapa hasil penelitian menyatakan
bahwa
CaMV35S
adalah
promotor
konstitutif yang aktif pada sel tanaman
monokotil akan tetapi kekuatannya sedikit
menurun pada sel tumbuhan dikotil dan
tidak aktif pada beberapa tipe sel seperti
pollen (Tzfira & Citovsky 2002). Selain itu,
pCAMBIA 1303 mempunyai gen gusA. Gen
gusA ( -glucuronidase) dalam plasmid
pCAMBIA 1303 berfungsi sebagai gen
reporter
untuk
memonitor
proses
transformasi dan introduksi gen yang
direkayasa (Tzfira & Citovsky 2002).
Rekombinasi DNA
Rekombinasi
DNA
adalah
pembentukan kombinasi baru dari materi
pembawa informasi genetik. Rekombinasi
dilakukan dengan melakukan penyisipan
molekul asam nukleat yang dikerjakan di
luar sel ke suatu vektor dan dibawa masuk
ke dalam sel inang. Rekombinasi DNA
memerlukan adanya vektor dan enzimenzim. Enzim yang umum digunakan adalah
enzim nuklease, ligase, polimerase dan
enzim modifikasi (Brown 1991).
Enzim nuklease adalah enzim yang
mendegradasi DNA dengan memecah ikatan
fosfodiester yang menghubungkan satu
nukleotida dengan nukleotida lainnya pada
urutan DNA. Enzim nuklease terdiri atas
endonuklease
dan
eksonuklease.
Eksonuklease memecah nukleotida satu per
satu dari ujung rantai DNA sementara
endonuklease memecah ikatan fosfodiester
di tengah-tengah pada rantai DNA. Salah
satu
contoh
endonuklease
adalah
endonuklease
restriksi.
Endonuklease
restriksi merupakan enzim bakteri yang
memotong DNA utas ganda hanya pada
tempat pengenalan spesifik. Aktivitas enzim
restriksi dipengaruhi oleh kemurnian DNA,
buffer, dan temperatur. Enzim restriksi
membutuhkan NaCl, Mg2+, dan terkadang
ditriotreitol (DDT) sebagai pereduksi. Sifat
hasil pemotongan DNA oleh enzim nuklease
ini ada dua yaitu (1) ujung tumpul (blunt
end) terjadi karena enzim membuat
potongan utas ganda yang sederhana pada
pertengahan urutan pengenal dan (2) ujung
lengket (sticky end) terjadi karena enzim
restriksi menghasilkan potongan berbentuk
zig zag atau dengan belok tajam melalui dua
atau empat nukleoitida. Salah satu contoh
endonuklease restriksi adalah Spe1 dan Nco1
(Brown 1991). Situs pemotongan enzim
Spe1 adalah di antara basa AC pada urutan
basa ACTAGT sedangkan situs pemotongan
enzim Nco1 adalah di antara basa CC pada
urutan CCATGG. Sifat hasil pemotongan
dari kedua ujung ini adalah ujung lengket.
Enzim kedua dari kelompok enzim
manipulasi DNA adalah enzim ligase.
Enzim ligase berfungsi menyambungkan
utas DNA. Penyambungan DNA terjadi jika
nukleotida yang satu mempunyai gugus 5’
fosfat dan nukleotida yang lain terdiri atas
gugus 3’ hidroksil. Ujung lengket yang
komplementer
jauh
lebih
efisien
dibandingkan dengan ujung tumpul pada
proses ligasi karena ujung-ujung lengket
yang cocok dapat saling berpasangan dengan
ikatan hidrogen (Brown 1991).
Enzim yang ketiga adalah enzim
polimerase. Menurut Brown (1991) enzim
polimerase adalah enzim yang dapat
mensintesis DNA baru. Enzim polimerase
ini dibagi menjadi tiga jenis, yaitu
polimerase DNA 1, polimerase klenow, dan
polimerase transkriptase reversi. Polimerase
DNA 1 melekat pada untaian DNA tunggal
yang pendek dan mensintesis DNA baru
sekaligus mendegradasi DNA yang ada.
Enzim
polimerase
klenow
dapat
mensisntesis DNA komplementer hanya
pada cetakan DNA tunggal. Jenis enzim
yang ketiga yaitu polimerase transkriptase
reversi dapat membentuk untaian DNA
dengan menggunakan RNA sebagai cetakan.
Enzim yang keempat adalah enzim
modifikasi. Enzim modifikasi adalah enzim
yang
dapat
menambahkan
dan
menghilangkan gugus kimia. Salah satu
contoh enzim ini adalah calf intestinal
alkaline phosphatase (CIAP). Enzim ini
mengatalisis pemindahan gugus 5’ fosfat
dari DNA . Pemindahan gugus 5’ fosfat
bertujuan
mencegah
terjadinya
penyambungan intramolekul (Kendrew &
Lawrence 1994).
Tahap-Tahap Rekombinasi DNA
Secara umum rekombinasi DNA
dilakukan sebanyak 6 tahap. Tahap pertama
merupakan tahap isolasi fragmen DNA dan
DNA vektor, masing-masing DNA dapat
diisolasi dari bakteri. Setelah diisolasi,
fragmen DNA dan DNA vektor dipotong
dengan enzim restriksi yang sama. Tahap
selanjutnya adalah penggabungan fragmen
DNA dengan DNA vektor. Tahap ini
biasanya disebut tahap ligasi. Penggabungan
DNA ini biasanya dibantu oleh enzim ligase.
Hasil tahap ligasi adalah terbentuknya DNA
rekombinan (fragmen DNA dengan DNA
vektor).
Tahap ketiga dari rekombinasi
DNA adalah transformasi DNA rekombinan
ke bakteri. Transformasi adalah proses
memasukkan DNA asing ke dalam sel inang.
Tahap keempat adalah seleksi sel inang yang
telah mengalami transformasi dan telah
mengandung DNA rekombinan. Inang yang
telah mengalami transformasi dan telah
mengandung DNA rekombinan dapat
diseleksi
berdasarkan
gen
penanda
(selectable marker) yang dibawa oleh
plasmid. Gen penanda yang biasa digunakan
adalah gen yang tahan terhadap antibiotik
tertentu.
Tahap
selanjutnya
adalah
transformasi ke sel target. Tahap terakhir
dari rekombinasi DNA adalah meneliti gen
yang diklon. Kegiatan ini ditekankan pada
cara mendapatkan informasi mengenai
lokasi gen, struktur gen, cara gen
ditranskripsi, dan produk translasi yang
dikode oleh gen (Brown 1991).
Polymerase Chain Reaction
(PCR)
Teknik PCR merupakan salah satu
komponen
utama
teknologi
DNA
rekombinan dan pertama kali ditemukan
oleh Kary B. Mulis pada tahun 1983. Teknik
ini merupakan amplifikasi in vitro sejumlah
sekuens DNA dengan menggunakan 2
oligonukleotida sebagai primer yang
berhibridisasi secara berlawanan pada sisi
daerah target utas DNA yang diinginkan
(Old & Primrose 1994). PCR mampu
mengamplifikasi secara selektif sekuens
DNA spesifik dengan faktor 106, hal inilah
yang membuat penggunaan teknik PCR
semakin meluas disamping kesederhanaan
metodenya (Saiki 1989).
Reaksi PCR adalah tiruan dari
proses replikasi DNA, yaitu dengan adanya
pembukaan rantai DNA utas ganda,
penempatan primer, dan perpanjanagan
rantai DNA baru oleh DNA polimerase dari
arah 5’ ke 3’, hanya saja pada teknik PCR
tidak menggunakan enzim ligase dan primer
RNA. Secara ringkas, teknik PCR dilakukan
dengan cara mencampurkan sampel DNA
dengan
primer
oligonukleotida,
deoksiribonukleotida trifosfat,
enzim
termostabil Taq DNA polimerase dalam
larutan yang sesuai, kemudian menaikkan
dan menurunkan suhu campuran secara
berulang selama beberapa jam sampai
diperoleh jumlah sekuen DNA yang
diinginkan.
Satu siklus pada teknik PCR terdiri
atas tiga tahap, yaitu denaturasi, annealing
dan ekstensi. Denaturasi dilakukan pada
suhu 90-95 oC, sehingga terjadi pemisahan
utas ganda DNA menjadi dua utas tunggal
DNA yang menjadi cetakan (template)
tempat penempelan primer dan tempat kerja
DNA
polimerase.
Selanjutnya suhu
diturunkan untuk penempelan primer
oligonukleotida
pada
sekuen
yang
komplementer pada molekul DNA cetakan.
Tahap ini disebut annealing. Suhu annealing
tiap sekuen DNA sifatnya spesifik dan
merupakan penentu utama keberhasilan
suatu reaksi PCR. Tahap terakhir adalah
tahap ekstensi yang dilakukan pada suhu 72
o
C. Suhu ini merupakan suhu optimum
untuk kerja enzim Taq DNA polimerase.
Sintesis DNA komplemen dengan DNA
cetakan terjadi pada rahap ekstensi. Ketiga
tahap tersebut disusun berulang kali dalam
mesin PCR, umumnya antara 25-40 siklus,
bergantung pada jumlah DNA yang
diinginkan
Primer
oligonukleotida
yang
digunakan dalam teknik PCR harus
memenuhi beberapa syarat, antara lain
memiliki susunan basa yang acak, sehingga
tidak terjadi polipurin atau polipirimidin,
memiliki jumlah purin dan pirimidin yang
seimbang, memiliki titik leleh saling
mendekati satu sama lain, dan sedikit
mungkin memiliki basa yang komplementer.
Panjang primer yang umum digunakan
berkisar 20-30 basa (Saiki 1989).
Elektroforesis Gel Agarosa untuk Analisis
Fragmen
Elektroforesis
merupakan
pergerakan zat bermuatan listrik akibat
adanya pengaruh medan listrik. Molekul
DNA termasuk senyawa bermuatan negatif.
Sifat ini menjadikan molekul DNA yang
ditempatkan pada medan listrik akan
bermigrasi menuju kutub positif. Kecepatan
migrasi molekul DNA tergantung pada
konsentrasi gel yang digunakan, ukuran
molekul yang dianalisis, serta tegangan
listrik yang diberikan. Salah satu gel yang
dapat digunakan pada elektroforesis adalah
gel agarosa. Agarosa digunakan untuk
memisahkan,
mengidentifikasi,
dan
memurnikan
fragmen-fragmen
DNA
(Sambrook et al.1989).
Mobilitas fragmen DNA pada gel
elektroforesis sangat dipengaruhi oleh
komposisi dan kelarutan ion buffer
elektroforesis. Jika konsentrasi ion-ion
sangat sedikit maka konduktifitas listrik
sangat kecil dan migrasi DNA menjadi
lambat. Konsentrasi ion yang berlebih akan
mengakibatkan gel mencair dan DNA
terdenaturasi. Selain buffer elektroforesis,
teknik elektroforesis DNA juga memerlukan
loading buffer. Buffer ini berfungsi
meningkatkan densitas sampel sehingga
fragmen tersebut berada di dasar well dan
tidak menyebar. Fungsi lainnya adalah
memberi warna pada fragmen DNA
sehingga mempermudah pengamatan proses
elektroforesis. Buffer ini dapat juga
membantu pergerakan sampel ke anoda.
Ukuran fragmen DNA hasil pemotongan
dengan endonuklease restriksi dapat
ditentukan dengan memakai penanda DNA
(marker). Penanda DNA adalah fragmen
DNA yang telah diketahui ukurannya
(Sambrook et al.1989).
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan pada
penelitian ini adalah tabung mikro 500 µL,
pipet mikro, alumunium foil, parafilm,
sarung tangan, cawan petri, Erlenmeyer,
gelas piala, sudip, peralatan elektroforesis,
gel doc, sentrifus, ose, stirer, laminar air
flow cabinet, inkubator bergoyang, autoklaf,
penangas air, mesin PCR, penangas air
bergoyang, dan lemari es.
Bahan-bahan
yang
digunakan
adalah E. coli galur XL1-Blue, gen stilbena
sintase, plasmid pGEM-T Easy, pCAMBIA
1303, Agrobacterium tumefacians galur
AGL-0, enzim restriksi Nco1 dan Spe1, kit
elusi dari Invitrogen, kit ligasi dari promega,
kit isolasi plasmid dari Roche, kit elusi dari
Qiagen, es batu, TBE 0.5x, EtBr, loading
dye, marker 1 Kb plus, media luria bertani
(LB) yang terdiri atas tripton, ekstrak kamir
dan NaCl, media luria bertani agar (LA)
yang terdiri atas tripton, ekstrak kamir, NaCl
dan agar , KOH 10 N, HCl 5M, bufer ligasi,
T4 ligase, glukosa, Ampisilin 100 mg/L,
IPTG 0.1 mM, X-Gal 40 mg/L, kanamisin
100000 mg/L, rifampisin 25000 mg/L,
EDTA, dNTP, primer M13 F, primer M13
R, Taq polimerase, MW, Mg2+ dan buffer.
Metode Penelitian
Purifikasi Produk PCR (Stilbena Sintase)
Penelitian
ini
dimulai
dari
purifikasi terhadap produk PCR yang
didapatkan. Purifikasi ini menggunakan high
pure plasmid isolation kit dari Invitrogen.
Fragmen dipotong dari gel menggunakan
pisau skalpel, kemudian ditimbang dan
dilarutkan dengan buffer GS1. Penimbangan
dilakukan untuk menentukan banyaknya
buffer GS1 yang harus ditambahkan.
Perbandingan antara sampel dan buffer GS1
adalah
1:3.
Selanjutnya,
campuran
diinkubasi pada suhu 50 oC selama 15 menit,
setiap 3 menit larutan dikocok dengan
membolak-balikan tabung secara perlahan
dan setelah larut campuran dikocok setiap 5
menit. Larutan kemudian ditransfer ke
dalam kolom, lalu disentrifugasi dengan
kecepatan 12000 rpm selama 2 menit pada
suhu 25oC.
Tahap selanjutnya adalah sebanyak
500 µL buffer GS1 ditambahkan ke dalam
kolom dan diinkubasi selama 1 menit,
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 2 menit. Sampel yang
berada di dalam kolom kemudian ditambah
dengan 700 µL W9 dan diinkubasi selama 5
menit, sampel selanjutnya disentrifugasi
kembali dengan kecepatan 12000 rpm
selama 2 menit untuk menghilangkan sisa
etanol. Setelah itu, 30 µL buffer TE yang
sudah dipanaskan (65-70oC) dimasukkan ke
dalam sampel, kemudian diinkubasi selama
1 menit dan disentrifugasi dengan kecepatan
12000 rpm selama 3 menit. Hasil purifikasi
kemudian diuji dengan elektroforesis gel
agarosa 1% sebanyak 2 µL.
Kloning Gen Stilbena Sintase (STS) ke
dalam Plasmid pGEM-T Easy
Kloning gen diawali dengan ligasi
gen STS dengan pGEM-T Easy. Ligasi
dilakukan dengan menggunakan kit dari
Promega. Sebanyak 5 µL buffer ligase
dicampurkan dengan 0.5 µL plasmid pGEMT Easy , 1 µL T4 Ligase dan 3.5 µL gen
stilbena sintase. Kemudian campuran
diinkubasi pada suhu 25 oC selama 1 jam
atau pada suhu 4 oC selama satu malam.
Hasil ligasi selanjutnya ditransformasikan ke
E.coli XL1-Blue
Transformasi gen hasil ligasi ke
bakteri E.coli XL1-Blue menggunakan
metode heat shock. Sebanyak 10 µ L hasil
ligasi dimasukkan ke dalam 200 µL sel
kompeten dan dikocok perlahan sampai
campuran merata. Selanjutnya, campuran
diinkubasi di dalam es selama 30 menit,
kemudian diinkubasi pada suhu 42 oC
selama 50 detik. Tabung yang telah
diinkubasi pada suhu 42 oC kemudian
diinkubasi di dalam es selama 10 menit.
Larutan kemudian ditambah dengan 800 µL
LB glukosa dan dikocok menggunakan
inkubator bergoyang dengan kecepatan 150
rpm pada suhu 37 oC selama 90 menit.
Selanjutnya, larutan diambil dan disebar ke
media luria bertani agar (LA) ditambah
ampisilin 100 ppm, isopropil tiogalaktosida
(IPTG) 0.1 mM dan X-Gal 40 mg/L.
Selanjutnya dilakukan seleksi putih biru
untuk membedakan sel yang mengandung
plasmid rekombinan dengan sel yang tidak
mengandung plasmid rekombinan.
Konfirmasi Koloni Transforman yang
Membawa Fragmen Sisipan
Konfirmasi koloni transforman
dilakukan dengan teknik PCR koloni. PCR
koloni dilakukan menggunakan mesin PCR
(Biometra T-Personal). Proses ini diawali
oleh pemecahan sel dengan pemanasan 96
o
C selama 5 menit, kemudian suhu turun
menjadi 50 oC dan berlangsung selama 90
detik, suhu naik kembali menjadi 96 oC
selama 90 detik, lalu 90 detik selanjutnya
pada suhu 45 oC, 1 menit pada suhu 96 oC
dan 40 oC selama 1 menit. Setelah
pemanasan pada proses lisis, campuran PCR
(buffer, MW, dNTPs, primer universal M13
F, M13 R dan Taq polimerase) ditambahkan
pada setiap sampel. Proses PCR dilanjutkan
kembali dengan suhu 94 oC selama 30 detik,
55 oC selama 1 menit, dan 2 menit pada 72
o
C selama 30 siklus dan selanjutnya 72 oC
selama 5 menit. Hasil PCR koloni
diverifikasi pada gel agarosa. Koloni terpilih
kemudian dikultur dalam medium LB cair
yang mengandung ampisilin dan diinkubasi
pada inkubator bergoyang suhu 37 oC
dengan kecepatan 150 rpm. Selanjutnya
dilakukan isolasi plasmid menggunakan
High Pure Plasmid Isolation Kit (Roche)
dari kultur bakteri yang tumbuh. Hasil
isolasi plasmid selanjutnya diverifikasi
kembali pada gel agarosa dan dilakukan
sekuensing.
Sekuensing Fragmen Terklon
Pengurutan
basa
(sekuensing)
fragmen gen terklon dilakukan di Lembaga
Molekuler Eijkman Jakarta menggunakan
primer universal M13 F dan M13 R. Hasil
sekuen fragen selanjutnya dianalisis dengan
program bioinformatika.
Isolasi DNA Plasmid
Prosedur
yang
digunakan
mengikuti prosedur High Pure Plasmid
Isolation Kit dari Roche. Isolasi DNA
plasmid dilakukan terhadap koloni yang
berdasarkan hasil PCR koloni diketahui
mengandung plasmid terinsersi fragmen
yang diinginkan. Koloni tersebut dikulturkan
dalam media luria bertani (LB) yang
mengandung ampisilin kemudian diinkubasi
selama 16 jam pada suhu 37 oC dengan
pengocokan 150 rpm . DNA plasmid yang
diperoleh dielektroforesis dengan gel
agarosa 1% untuk melihat kemurniannya.
Sebanyak 3-4 mL kultur sel
Escherichia coli diransfer ke dalam tabung
mikro dan disentrifugasi dengan kecepatan
8000 rpm pada suhu 25 oC selama 2 menit.
Pellet
yang
dihasilkan
kemudian
diresuspensikan dengan suspension buffer
250 µL dan ditambahkan lysis buffer
selanjutnya diaduk 6-8 kali. Campuran
kemudian diinkubasi selama 5 menit pada
suhu ruang dan ditambah dengan 350 µ L
binding buffer dan diaduk 3-4 kali,
campuran diinkubasi kembali didalam es
selam 5 menit. Selanjutnya, campuran
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm
selama 10 menit pada suhu 25 oC,
supernatan kemudian ditransfer ke kolom
dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan
13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC.
Cairan di bawah kolom dibuang dan
ditambah dengan 500 µL wash buffer 1.
Selanjutnya, larutan disentrifugasi dengan
kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada
suhu 25 oC, cairan di bawah kolom dibuang
dan ditambah dengan wash buffer 2. Larutan
kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
13000 rpm selama 1 menit pada suhu 25 oC,
cairan di bawah kolom dibuang selanjutnya
disentrifugasi kembali. Sebanyak 30 µL
elution buffer selanjutnya ditambahkan ke
dalam kolom dan disentrifugasi dengan
kecepatan 13000 rpm selama 1 menit pada
suhu 25 o C, hasil purifikasi kemudian diuji
dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Pemotongan
pGEM-T
Easy
dan
Pemurnian Gen Stilbena Sintase
Plasmid pGEM-T Easy yang
mengandung gen stilbena sintase dipotong
menggunakan enzim restriksi Spe1 dan
Nco1. Sebanyak 49 µL DNA plasmid
rekombinan dicampur dengan 7 µL dH2O, 7
µL buffer 2 SpeI, 7 µL enzim SpeI dan 7 µL
enzim NcoI . Campuran diinkubasi selama 1
jam pada suhu 37 oC dan kemudian
dielektroforesis menggunakan gel agarosa
0.6%. Setelah elektroforesis selesai, gel
diletakkan pada gel doc. Selanjutnya
fragmen yang berukuran 1500 bp dipotong
menggunakan skalpel untuk dipurifikasi.
Kloning Gen Stilbena Sintase dengan
Vektor Ekspresi pCAMBIA 1303
Sebelum diligasi dengan gen
stilbena sintase, plasmid pCAMBIA 1303
dipotong terlebih dahulu dengan enzim
restriksi Spe1 dan Nco1. Pemotongan ini
dilakukan pada suhu 37 oC selama 1 jam.
Ligasi dilakukan menggunakan T4 ligase
dan buffer ligase dari Promega. Sebanyak 5
µL gen stilbena sintase yang telah
dipurifikasi dicampur dengan buffer ligase
sebanyak 10 µL, 3 µL plasmid pCAMBIA
1303 dan 2 µL T4 ligase di dalam tabung
mikro 500 µL . Selanjutnya, tabung ditutup
dengan parafilm, diaduk menggunakan alat
spin kira-kira 1 menit, kemudian diinkubasi
pada suhu 4 oC selama 16 jam.
Transformasi gen stilbena sintase
ke dalam bakteri E.coli XL1-Blue
menggunakan metode heat shock. Sebanyak
10 µL hasil ligasi dimasukkan ke dalam 200
µL sel kompeten dan dikocok perlahan
sampai campuran merata. Selanjutnya,
campuran diinkubasi di dalam es selama 30
menit, kemudian diinkubasi pada suhu 42 oC
selama 50 detik. Campuran kemudian
diinkubasi di dalam es selama 10 menit,
ditambah dengan 800 µL LB glukosa dan
dikocok menggunakan inkubator bergoyang
dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC
selama 90 menit. Selanjutnya, campuran
disebar ke media LA dengan penambahan
kanamisin 25 mg/L kemudian diinkubasi
selama 1 malam.
Seleksi DNA Rekombinan
Setelah diinkubasi semalam, koloni
yang terbentuk diambil dengan tusuk gigi
dan diberi nomor kemudian dimasukkan ke
dalam media LA untuk dibuat duplikatnya
dan juga koloni tersebut dikulturkan dalam
media LB yang mengandung kanamisin 25
mg/L. Selanjutnya dikocok pada kecepatan
150 rpm selama 1 malam. Hasil kultur
selanjutnya diisolasi menggunakan kit dari
Qiagen dan ditransformasikan ke dalam
Agrobacterium setelah dilakukan analisis
restriksi menggunakan enzim Spe1 dan
Nco1.
Transformasi pCAMBIA 1303-Stilbena
Sintase
ke dalam Agrobacterium
tumefaciens
Transformasi pCAMBIA 1303stilbena sintase ke dalam Agrobacterium
tumefaciens menggunakan metode heat
shock. Sebanyak 10 µL DNA plasmid
ditambahkan ke dalam 500 µL sel kompeten
Agrobacterium strain AGL-0. Kemudian
diinkubasi didalam es selama 15 menit.
Selanjutnya, campuran diinkubasi selama 5
menit di nitrogen cair lalu 5 menit pada suhu
37 oC. Campuran kemudian ditambah
dengan 1 mL YEP dan diinkubasi selama 3
jam pada suhu 28 oC. Selanjutnya, campuran
disentrifugasi 3 menit dengan kecepatan
6000 rpm pada suhu 25 o C. Supernatan
dibuang dan 200 µL dicampur dengan pellet.
Campuran kemudian disebar ke media LA
yang mengandung rifampisin 50 mg/L dan
kanamisin 25 mg/L lalu diinkubasi pada
suhu 28 oC selama 2 malam dalam keadaan
gelap sambil dikocok dengan kecepatan 150
rpm.
Seleksi DNA Rekombinan
Setelah
DNA
rekombinan
pCAMBIA
1303-stilbena
sintase
ditransformasikan
ke
Agrobacterium
tumefaciens diinkubasi 2 malam, koloni
yang terbentuk diambil dengan tusuk gigi.
Kemudian koloni tersebut diberi nomor.
Selanjutnya, koloni dimasukkan ke dalam
media LA untuk dibuat duplikatnya dan juga
koloni tersebut dikulturkan dalam media LB
yang mengandung kanamisin 25 mg/L dan
rifampisin 50 mg/L. Selanjutnya koloni
dalam media LB diinkubasi pada suhu 28 oC
sambil dikocok pada kecepatan 150 rpm
selama 2 malam kemudian dilakukan isolasi
plasmid.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Purifikasi dan Pengujian Produk PCR
(Stilbena Sintase)
Purifikasi ini menggunakan high
pure plasmid isolation kit dari Invitrogen.
Percobaan dilakukan sesuai dengan prosedur
yang terdapat dalam metode. Purifikasi
bertujuan memurnikan produk PCR yang
diperoleh dari pengotor yang mungkin ada
pada produk PCR. Hasil purifikasi kemudian
diuji dengan elektroforesis gel agarosa.
Hasil elektroforesis menunjukkan
adanya satu fragmen hasil purifikasi.
Fragmen tersebut berukuran sekitar 1500 bp
dan fragmen ini diperkirakan merupakan gen
stilbena sintase yang diinginkan (Gambar 4).
Pengujian dengan elektroforesis gel agarosa
dilakukan untuk mengetahui kualitas dan
kuantitas gen stilbena sintase yang akan
diligasi dengan vektor pGEM-T Easy. Hasil
purifikasi ini selanjutnya dimasukkan ke
dalam vektor pengklonan pGEM-T Easy
5000 bp
1500 bp
1000 bp
M
Gambar 4
Hasil purifikasi gen stilbena
sintase, M= marker, fragmen
berukuran 1500 bp = Gen
stilbena sintase.
Kloning Gen Stilbena Sintase ke dalam
Vektor pGEM-T Easy
Tahapan kloning terdiri atas ligasi,
transformasi dan seleksi. Ligasi dilakukan
dengan menggabungkan fregmen gen
stilbena sintase, plasmid pGEM-T Easy
sebagai vektor, buffer dan T4 DNA ligase.
Produk ligasi kemudian ditransformasikan
ke dalam Escherichia coli XL-1 Blue
kompeten. Produk ligasi pada tahap ini
adalah stilbena sintase yang sudah disisipkan
pada vektor pGEM-T Easy.
Transformasi ke Escherichia coli
dilakukan untuk memperbanyak DNA
plasmid
rekombinan.
Transformasi
dilakukan menggunakan metode heat shock
yaitu dengan pemberian kejut panas pada
suhu 42 oC selama 50 detik. Prinsip dari
proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu
dari 0 oC ke 42 oC terhadap sel yang telah
diberi perlakuan CaCl2. Perlakuan CaCl2 ini
dilakukan dalam pembuatan sel kompeten.
Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas
membran sel sehingga pada saat terjadi
lonjakan suhu membran menjadi tidak
selektif terhadap molekul asing dan produk
ligasi dapat masuk ke dalam sel. Sel
kemudian dikultur dalam media tumbuh LB
dengan penambahan glukosa selama 1.5 jam
untuk memperbanyak jumlah sel dan
memberi kesempatan kepada sel untuk
mengekspresikan marka seleksi dari plasmid
yang dibawanya. Setelah itu sel disebar pada
media seleksi LA, IPTG, dan X-Gal
kemudian diinkubasi selama 16 jam pada
suhu
37 o C. Penambahan IPTG dalam
media seleksi berfungsi sebagai penginduksi
ekspresi gen sedangkan X-Gal berfungsi
sebagai substrat.
Hasil transformasi ke Escherichia
coli menunjukkan terbentuknya koloni putih
dan biru (Gambar 5). Koloni putih
merupakan koloni yang diperkirakan
mengandung fragmen gen sisipan (gen
stilbena sintase) sedangkan koloni biru
diperkirakan merupakan koloni yang tidak
mengandung
fragmen
gen
sisipan.
Terbentuknya koloni putih biru ini
disebabkan adanya marka seleksi pada
vektor pGEM-T Easy. Marka seleksi
biasanya berupa gen yang membawa sifat
re