Specific Promoters Root Construction of Oil Palm by Using Method of Gateway

KONSTRUKSI PROMOTOR SPESIFIK AKAR KELAPA
SAWIT DENGAN MENGGUNAKAN METODE GATEWAY

RENDI PALAR

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis dengan judul Konstruksi
Promotor Spesifik Akar Kelapa Sawit dengan Menggunakan Metode Gateway
adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan
dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor , July 2011

Rendi Palar
NIM : G851080021

ABSTRACT

RENDI PALAR. Specific Promoters Root Construction of Oil Palm by Using
Method of Gateway. Under direction of MARIA BINTANG and TETTY
CHAIDAMSARY
Palm oil is one of the popular industrial product in the world today. With
the growing number of new land-clearing case, was also attended by various
production constraints such as diseases and pests that attack that caused the failure
of production to the death of oil palm itself. Ganoderma is one of the pathogens
that attack the disease of oil palm. It is well known proteins such as chitinase,
glucanase, and stilbene synthetase are proteins that can inhibit the growth of
Ganoderma. This study aims to construct a specific promoter (PSA) on the roots
of oil palm to be able to express all three proteins earlier. Verification PSA oil
palm has been tested using promoter prediction software and showed positive
results.
Keywords: palm oil, promotor, Ganoderma.

RINGKASAN
RENDI PALAR. Konstruksi Promotor Spesifik Akar Kelapa Sawit
dengan Menggunakan Metode Gateway. Dibimbing oleh MARIA
BINTANG dan TETTY CHAIDAMSARY
Kelapa sawit (Elaeis) adalah tumbuhan industri penting penghasil minyak
masak, minyak industri, maupun bahan bakar (biodiesel). Perkebunan kelapa
sawit menghasilkan keuntungan yang sangat besar sehingga banyak hutan dan
perkebunan lama dikonversi menjadi perkebunan kelapa sawit. Di Indonesia
penyebarannya di daerah Aceh, pantai timur Sumatra, Jawa, dan Sulawesi.
Berdasarkan data tahun 2006, Indonesia telah menjadi negara penghasil
CPO (crude palm oil) terbesar di dunia dengan total produksi sekitar 16 juta ton.
Sementara negara tetangga kita Malaysia yang selama ini berada pada posisi no.1,
saat ini berada pada posisi ke-2 dengan total produksi sebesar 15.8 juta ton. Boleh
dibilang, industri kelapa sawit ini dapat diharapkan menjadi motor pertumbuhan
ekonomi nasional.
Di balik prestasi di atas, sederet permasalahan masih membelit industri ini.
Agaknya, jika sebahagian permasalahan saja bisa diatasi, Indonesia akan mampu
memperoleh devisa jauh lebih besar daripada yang dapat kita nikmati saat ini.
Salah satu permasalahan utamanya adalah masih rendahnya muatan teknologi

yang mampu diterapkan, sehingga mayoritas devisa dari industri ini berasal dari
industri hulunya. Teknologi yang perlu dikembangkan yaitu teknologi produksi
tanaman tersebut, salah satunya adalah teknik dalam penanggulangan penyakit
yang efektif, misalnya jamur.
Jamur yang dikenal dengan nama Ganoderma bersifat patogenik terhadap
tanaman kelapa sawit. Ganoderma adalah cendawan patogen. Serangannya dapat
mengakibatkan pembusukan pada pangkal batang kelapa sakit. Oleh karena itulah
disebut busuk pangkal batang (BPB). Jika pangkalnya busuk maka tanaman akan
mati dan tumbang. Sementara ini hanya Ganoderma yang bisa menumbangkan
pohon kelapa sakit dewasa. Karena ukurannya yang besar, Ganoderma tak
ubahnya sebagai monster yang hidup di bawah permukaan tanah dan memakan
setiap tanaman kelapa sawit baik yang masih muda maupun yang sudah tua
(Darmono 2010).
Pengembangan teknologi terus dilakukan untuk memberantas hama
penyakit kelapa sawit yang disebabkan oleh jamur Ganoderma ini. Penelitian ini
diarahkan untuk meneliti promotor spesifik akar (PSA) kelapa sawit. Dengan
adanya promotor spesifik akar diharapkan nanti gen-gen penghasil protein
penghambat pertumbuhan Ganoderma ini terekspresikan sehingga dapat membuat
kelapa sawit tahan terhadap hama jamur Ganoderma.
Hipotesis pada penelitian ini adalah plasmid rekombinan yang membawa

DNA PSA dapat dikonstruksi dan sisipkan pada vektor ekspresi dengan metode
Gateway. Setelah diketahui dan dapat di klon DNA PSA kelapa sawit dan dapat
ditransferkan ke Agrobacterium, maka hal ini akan dapat membuka peluang untuk
menyusun protein penghambat atau mekanisme serupa pada akar kelapa sawit
yang merupakan media jangkit dari jamur Ganoderma ini, sehingga kelapa sawit
bisa tahan serangan penyakit yang disebabkan oleh jamur Ganoderma ini.

Gejala dini penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit sukar dideteksi
karena perkembangannya sangat lambat. Pada pangkal batang atau bagian tengah
tanaman kelapa sawit mengalami pembusukan yang kadang-kadang diikuti
tumbuhnya tubuh buah Ganoderma. Tetapi tidak semua tanaman bergejala
menghasilkan tubuh buah, bahkan tidak ada gejala sedikitpun.
Penyebab penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit di Indonesia adalah
jamur Ganoderma boninense. Penularan penyakit ini sebagian besar melalui
mekanisme kontak akar sawit sakit dan sangat kecil melalui basidiospora.
Primer spesifik didesain untuk mendapatkan promotor dari suatu gen.
Primer spesifik ini didesain berdasarkan sekuen DNA target. Selain berdasarkan
urutan DNA target, primer juga didesain sesuai vektor dan teknologi yang di
gunakan. Dalam penelitian ini digunakan beberapa primer seperti M13 dan primer
khusus gateway. M13 digunakan karena plasmid yang digunakan yaitu TOPO 2.1

(Shuman, 1991; Shuman, 1994) mempunyai sekuen M13 yang komplemen baik
reverse dan forward. Primer khusus gateway dibuat menurut aturannya.
Pembuatan primer gateway dalam penelitian ini memperhatikan sekuen att yang
ditambahakan pada urutan DNA primer, dan urutan 4 basa guanin (GGGG)
sebelum situs att.
Dari hasil sekuen terbaca DNA target memiliki 809 bp. Kemudian
digunakan software bioinformatik untuk menentukan DNA target sebagai
promotor. Software yang digunakan yaitu TSSP (transcription start positions
predicts) dan NSITE (number site transcription elements) dari Softberry inc, serta
software modENCODE Consortium yaitu Neural Network Promoter Prediction.
Pemeriksaan data ditemukan motif promotor dari 23 spesies pada pemeriksaan
pada 1816 element regulatory dari berbagai spesies.
Dari data hasil pembacaan ketiga software yang digunakan maka hasil
konstruksi promotor spesifik akar (PSA) Kelapa Sawit berhasil dikerjakan dengan
baik sesuai dengan harapan dan dapat simpulkan bahwa DNA target merupakan
promotor.

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa seizin tertulis dari

Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam
bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm, dan sebagainya

KONSTRUKSI PROMOTOR SPESIFIK AKAR KELAPA
SAWIT DENGAN MENGGUNAKAN METODE GATEWAY

RENDI PALAR

Tesis
sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Master Sains pada
Departemen Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

Judul

: Konstruksi Promotor Spesifik
Menggunakan Metode Gateway

Nama

: Rendi Palar

NIM

: G851080021

Akar

Kelapa

Sawit

dengan

Disetujui

Komisi Pembimbing

Prof Dr. drh. Maria Bintang,MSc
Ketua

Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si.
Anggota

Diketahui
Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr. drh. Maria Bintang,M.Sc

Dr. Ir. Dahrul Syah, MSc.Agr

Tanggal Ujian: 26 Juli2011

Tanggal Lulus :

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Manado pada tanggal 3 November 1981 dari ayah
Viktor Palar dan ibu Mieke Kilapong. Penulis merupakan putra kedua dari dua
bersaudara.
Tahun 2000 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Airmadidi dan pada tahun
yang sama lulus seleksi masuk UNIMA melalui jalur seleksi siswa berprestasi.
Penulis memilih jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam. Pada Tahun 2008 penulis di terima di Program Studi Biokimia pada
program Sekolah Pascasarjana IPB.

PRAKATA
Dengan penuh syukur yang besar penulis panjatkan kehadirat Tuhan Allah
YME

atas segala

limpahan dan karunia-Nya

sehingga penulis

dapat

menyelesaikan tesis ini. Penulis menyampaikan terima kasih kepada semua pihak
yang telah membantu dalam penyusunan tesis ini secara langsung maupun tidak
langsung. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Prof Dr. drh. Maria
Bintang,MSc sebagai pembimbing pertama dan Dr. Tetty Chaidamsari, M.Si
sebagai pembimbing kedua pada Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan
Indonesia. Juga kepada Papa-san, Mama, oma dan saudara-saudaraku atas segala
perhatian, doa, dan kasih sayang serta motivasinya. Serta rekan-rekan se-asrama
mahasiswa Sam Ratulangi di Bogor atas segala dorongan dan semangatnya.
Penulis menyadari berbagai kekurangan dalam tesis ini. Oleh karena itu,
penulis mengharapkan saran dan kritik membangun yang diharapkan dapat
berguna dalam pengembangan tesis ini. Semoga tesis ini bermanfaat bagi semua
pihak yang membutuhkan.

Bogor, Juli 2011

Rendi Palar, S.Si

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR
DAFTAR LAMPIRAN
PENDAHULUAN
Latar Belakang ......................................................................................
Rumusan Masalah .................................................................................
Tujuan Penelitian ...................................................................................
Hipotesis................................................................................................
Manfaat Penelitian .................................................................................
Waktu dan Tempat Penelitian ................................................................

1
2
2
3
3
3

TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit (Elaeis guineensis) ........................................................... 4
Penyakit Busuk Pangkal Batang Kelapa Sawit ....................................... 8
Desain Primer untuk Gateway ................................................................ 11
Metode Teknologi Gateway ................................................................... 12
Polymerase Chain Reaction (PCR) ........................................................ 20
BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ...................................................................................... 25
Metode................................................................................................... 26
HASIL DAN PEMBAHASAN
Desain Primer .......................................................................................
Kloning PSA dengan menggunakan TOPO 2.1..........................................
Metode Gateway......................................................................................
Konfirmasi DNA target sebagai promotor ..............................................

29
29
32
33

KESIMPULAN DAN SARAN ...................................................................... 41
DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 43
LAMPIRAN ................................................................................................ 46

DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Kelapa sawit Afrika (Elaeis guineensis) ........................................ 4
Gambar 2. Mekanisme dan penyebaran Ganoderma boninense ....................... 9
Gambar 3. Ganoderma boninense ................................................................... 10
Gambar 4. Transfer DNA teknologi Gateway ke berbagai sistem vektor ......... 12
Gambar 5. Reaksi BP ....................................................................................... 15
Gambar 6. Reaksi LR ....................................................................................... 15
Gambar 7. Reaksi BP menghasilkan entry clone .............................................. 17
Gambar 8. Alat pengatur suhu reaksi pada teknik PCR ..................................... 21
Gambar 9. Skematik siklus PCR. ..................................................................... 22
Gambar 10. Hasil elektroforesis Plasmid PSA .................................................. 30
Gambar 11. Letak primer M13 pada vektor TOPO 2.1 ..................................... 31
Gambar 12. Hasil elektroforesis koloni PSA (TOPO 2.1) ................................ 31
Gambar 13. Hasil elektroforesis elusi PSA ....................................................... 32
Gambar 14. Hasil Elektroforesis amplifikasi primer gateway .......................... 32
Gambar 15. Hasil elektroforesis purifikasi PSA ............................................... 33

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Data dari kejadian busuk pangkal batang kelapa sawit di Sumatra Utara .... 11
2 Jalur lysogenic dan lytic ............................................................................. 14
3 Dareah modifikasi pada att ......................................................................... 15
4 Perbedaan tiga tipe dari vektor yang di adopsi Gateway ............................. 17
5 Tatanama vektor dan klone dari Gateway ................................................... 19
6

Urutan DNA primer PSA tanpa att ............................................................ 29

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Peta vektor pDONR 221............................................................................. 46
2 Tahapan penelitian Pertama........................................................................ 47
3 Tahapan penelitian Kedua .......................................................................... 48
4 Tampilan NSITE, TSSP, NNPP (Berturut-turut)......................................... 49

5 Koloni PSA Aka yang tumbuh .................................................................. 50
6

Hasil elektroforesis ................................................................................... 51

7

IUPAC Nucleotide Code ........................................................................... 52

8

Perkiraan ketepatan prediksi untuk Neural Network Promoter Prediction. . 53

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Kelapa sawit (Elaeis) adalah tumbuhan industri penting penghasil minyak
masak, minyak industri, maupun bahan bakar (biodiesel). Perkebunan kelapa
sawit menghasilkan keuntungan yang sangat besar sehingga banyak hutan dan
perkebunan lama dikonversi menjadi perkebunan kelapa sawit. Di Indonesia
penyebarannya di daerah Aceh, pantai timur Sumatra, Jawa, dan Sulawesi
(Lötschert 1983).
Berdasarkan data tahun 2006, Indonesia telah menjadi negara penghasil
CPO (crude palm oil) terbesar di dunia dengan total produksi sekitar 16 juta ton.
Sementara negara tetangga kita Malaysia yang selama ini berada pada posisi no.1,
saat ini berada pada posisi ke-2 dengan total produksi sebesar 15.8 juta ton
(berkas pidato sambutan kepala BPP Teknologi & berkas sambutan menteri
perindustrian RI, BPPT 2007). Yang menarik dari data ini adalah, ternyata
Indonesia mampu menjadi negara penghasil CPO nomor 1 di dunia 4 tahun lebih
cepat dari prediksi sebelumnya, di mana Indonesia diperkirakan baru akan
menjadi produsen CPO terbesar di dunia pada tahun 2010 (berkas pidato menteri
riset dan teknologi, presentasi deputi kepala BPPT bidang teknologi informasi,
industri dan material, BPPT 2007).
Dengan besarnya produksi CPO yang mampu dihasilkan, tentunya hal ini
berdampak positif bagi perekenomian Indonesia, baik dari segi kontribusinya
terhadap pendapatan negara, maupun besarnya tenaga kerja yang terserap di
sektor industri ini yang mencapai 8.5 juta orang. Sektor ini juga mampu
meningkatkan taraf hidup masyarakat di sekitar perkebunan sawit, di mana
presentase penduduk miskin di areal ini kurang dari 6%, jauh lebih rendah dari
angka penduduk miskin nasional sebesar 17% (berkas sambutan menteri negara
riset dan teknologi, BPPT 2007). Boleh dibilang, industri kelapa sawit ini dapat
diharapkan menjadi motor pertumbuhan ekonomi nasional.
Di balik prestasi di atas, sederet permasalahan masih membelit industri ini.
Agaknya, jika sebahagian permasalahan saja bisa diatasi, Indonesia akan mampu
memperoleh devisa jauh lebih besar daripada yang dapat kita nikmati saat ini.
Salah satu permasalahan utamanya adalah masih rendahnya muatan teknologi

2

yang mampu diterapkan, sehingga mayoritas devisa dari industri ini berasal dari
industri hulunya. Teknologi yang perlu dikembangkan yaitu teknologi produksi
tanaman tersebut, salah satunya adalah teknik dalam penanggulangan penyakit
yang efektif, misalnya jamur.
Jamur yang dikenal dengan nama Ganoderma bersifat patogenik terhadap
tanaman kelapa sawit. Ganoderma adalah cendawan patogen. Serangannya dapat
mengakibatkan pembusukan pada pangkal batang kelapa sakit. Oleh karena itu
disebut busuk pangkal batang (BPB). Jika pangkalnya busuk maka tanaman akan
mati dan tumbang. Sementara ini hanya Ganoderma yang bisa menumbangkan
pohon kelapa sakit dewasa. Karena ukurannya yang besar, Ganoderma tak
ubahnya sebagai monster yang hidup di bawah permukaan tanah dan memakan
setiap tanaman kelapa sawit baik yang masih muda maupun yang sudah tua
(Darmono 2010).
Pengembangan teknologi terus dilakukan untuk memberantas hama
penyakit kelapa sawit yang disebabkan oleh jamur Ganoderma ini. Penelitian ini
diarahkan untuk meneliti promotor spesifik akar (PSA) kelapa sawit. Dengan
adanya promotor spesifik akar diharapkan nanti gen-gen penghasil protein
penghambat pertumbuhan Ganoderma ini terekspresikan sehingga dapat membuat
kelapa sawit tahan terhadap hama jamur Ganoderma.
Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang di atas maka didapat beberapa masalah yang
memerlukan pengkajian khusus. Masalah-masalah itu adalah :
1. Penanganan penyakit yang disebabkan oleh jamur Ganoderma pada
kelapa sawit belum bisa diatasi sampai sekarang secara efisien.
2. Perlu didapatkan terlebih dahulu suatu promotor spesifik dalam rangka
untuk

mengekspresikan

gen-gen

penghambat

pertumbuhan

Ganoderma ini.
3. Upaya rekombinasi PSA pada kelapa sawit belum pernah dilakukan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi dan merekombinasi PSA
dengan metode Gateway.

3

Hipotesis
Hipotesis pada penelitian ini adalah plasmid rekombinan yang membawa
DNA PSA dapat dikonstruksi dan disisipkan pada vektor ekspresi dengan metode
Gateway.
Manfaat Penelitian
Setelah diketahui dan dapat di klon DNA PSA kelapa sawit dan dapat
ditransferkan ke Agrobacterium, maka hal ini akan dapat membuka peluang untuk
menyusun protein penghambat atau mekanisme serupa pada akar kelapa sawit
yang merupakan media jangkit dari jamur Ganoderma ini, sehingga kelapa sawit
bisa tahan serangan penyakit yang disebabkan oleh jamur Ganoderma ini.
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan November 2010 sampai Juni 2011.
Tempat pelaksanaan di laboratorium Biologi Molekuler dan Rekayasa Genetika,
Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia, Bogor.

4

TINJAUAN PUSTAKA
Kelapa Sawit (Elaeis guineensis)
Kelapa sawit berbentuk pohon. Tingginya dapat mencapai 24 meter. Akar
serabut tanaman kelapa sawit mengarah ke bawah dan samping. Selain itu juga
terdapat beberapa akar napas yang tumbuh mengarah ke samping atas.

Gambar 1. Kelapa sawit Afrika (Elaeis guineensis)

Seperti jenis palma lainnya, daunnya tersusun majemuk menyirip. Daun
berwarna hijau tua dan pelepah berwarna sedikit lebih muda. Penampilannya agak
mirip dengan tanaman salak, hanya saja dengan duri yang tidak terlalu keras dan
tajam. Batang tanaman diselimuti bekas pelepah hingga umur 12 tahun. Setelah
umur 12 tahun pelapah yang mengering akan terlepas sehingga penampilan
menjadi mirip dengan kelapa. Tanaman Kelapa Sawit (Elaeis gunensis) termasuk
kedalam Family Arecaceae, Ordo Arecales, dan Genus Elaeis.
Bunga jantan dan betina terpisah namun berada pada satu pohon
(monoecious diclin) dan memiliki waktu pematangan berbeda sehingga sangat

5

jarang terjadi penyerbukan sendiri. Bunga jantan memiliki bentuk lancip dan
panjang sementara bunga betina terlihat lebih besar dan mekar.
Buah sawit mempunyai warna bervariasi dari hitam, ungu, hingga merah
tergantung bibit yang digunakan. Buah bergerombol dalam tandan yang muncul
dari tiap pelapah.
Minyak dihasilkan oleh buah. Kandungan minyak bertambah sesuai
kematangan buah. Setelah melewati fase matang, kandungan asam lemak bebas
(FFA, free fatty acid) akan meningkat dan buah akan rontok dengan sendirinya.
Buah terdiri dari tiga lapisan:


Eksoskarp, bagian kulit buah berwarna kemerahan dan licin.



Mesoskarp, serabut buah



Endoskarp, cangkang pelindung inti

Inti sawit (kernel, yang sebetulnya adalah biji) merupakan endosperma dan
embrio dengan kandungan minyak inti berkualitas tinggi.
Kelapa sawit berkembang biak dengan cara generatif. Buah sawit matang
pada kondisi tertentu embrionya akan berkecambah menghasilkan tunas (plumula)
dan bakal akar (radikula).
Syarat hidup Kelapa Sawit
Habitat aslinya adalah daerah semak belukar. Sawit dapat tumbuh dengan
baik di daerah tropis (15° LU - 15° LS). Tanaman ini tumbuh sempurna di
ketinggian 0-500 meter dari permukaan laut dengan kelembaban 80-90%. Sawit
membutuhkan iklim dengan curah hujan stabil, 2000-2500 mM setahun, yaitu
daerah yang tidak tergenang air saat hujan dan tidak kekeringan saat kemarau.
Pola curah hujan tahunan memperngaruhi perilaku pembungaan dan produksi
buah sawit.
Tipe kelapa sawit
Kelapa sawit yang dibudidayakan terdiri dari dua jenis: E. guineensis dan
E. oleifera. Jenis pertama adalah yang pertama kali dan terluas dibudidayakan
orang. E. oleifera sekarang mulai dibudidayakan pula untuk menambah
keanekaragaman sumber daya genetik.

6

Penangkar seringkali melihat tipe kelapa sawit berdasarkan ketebalan
cangkang, yang terdiri dari :


Dura,



Pisifera, dan



Tenera.

Dura merupakan sawit yang buahnya memiliki cangkang tebal sehingga
dianggap memperpendek umur mesin pengolah namun biasanya tandan buahnya
besar-besar dan kandungan minyak per tandannya berkisar 18%. Pisifera buahnya
tidak memiliki cangkang namun bunga betinanya steril sehingga sangat jarang
menghasilkan buah. Tenera adalah persilangan antara induk Dura dan jantan
Pisifera. Jenis ini dianggap bibit unggul sebab melengkapi kekurangan masingmasing induk dengan sifat cangkang buah tipis namun bunga betinanya tetap
fertil. Beberapa tenera unggul memiliki persentase daging per buahnya mencapai
90% dan kandungan minyak per tandannya dapat mencapai 28%. Untuk
pembibitan massal, sekarang digunakan teknik kultur jaringan.
Hasil tanaman
Minyak sawit digunakan sebagai bahan baku minyak makan, margarin,
sabun, kosmetika, dan industri farmasi. Minyak sawit dapat digunakan untuk
beragam peruntukan karena keunggulan sifat yang dimilikinya yaitu tahan
oksidasi dengan tekanan tinggi, mampu melarutkan bahan kimia yang tidak larut
oleh bahan pelarut lainnya, mempunyai daya melapisi yang tinggi dan tidak
menimbulkan iritasi pada tubuh dalam bidang kosmetik.
Bagian yang paling populer untuk diolah dari kelapa sawit adalah buah.
Bagian daging buah menghasilkan minyak kelapa sawit mentah yang diolah
menjadi bahan baku minyak goreng dan berbagai jenis turunannya. Kelebihan
minyak nabati dari sawit adalah harga yang murah, rendah kolesterol, dan
memiliki kandungan karoten tinggi. Minyak sawit juga diolah menjadi bahan
baku margarin.

7

Minyak inti menjadi bahan baku minyak alkohol dan industri kosmetika.
Bunga dan buahnya berupa tandan, bercabang banyak. Buahnya kecil, bila masak
berwarna merah kehitaman. Daging buahnya padat. Daging dan kulit buahnya
mengandung minyak. Minyaknya itu digunakan sebagai bahan minyak goreng,
sabun, dan lilin. Ampasnya dimanfaatkan untuk makanan ternak. Ampas yang
disebut bungkil inti sawit itu digunakan sebagai salah satu bahan pembuatan
makanan ayam. Tempurungnya digunakan sebagai bahan bakar dan arang.
Buah diproses dengan membuat lunak bagian daging buah dengan
temperatur 90 °C. Daging yang telah melunak dipaksa untuk berpisah dengan
bagian inti dan cangkang dengan pressing pada mesin silinder berlubang. Daging
inti dan cangkang dipisahkan dengan pemanasan dan teknik pressing. Setelah itu
dialirkan ke dalam lumpur sehingga sisa cangkang akan turun ke bagian bawah
lumpur. Sisa pengolahan buah sawit sangat potensial menjadi bahan campuran
makanan ternak dan difermentasikan menjadi kompos.
Penyakit Busuk Pangkal Batang Kelapa Sawit
Gejala dini penyakit ini sukar dideteksi karena perkembangannya sangat
lambat. Gejala mudah dilihat apabila sudah membentuk tubuh buah, akibatnya
tindakan pengendalian sudah sulit untuk dilakukan. Pada tanaman yang belum
menghasilkan gejala yang muncul adalah daun kuning kemudian mengering dan
nekrosis (kematian sel) dari pelepah bawah terus ke pelepah atas dan akhirnya
semua bagian tanaman mengering dan mati. Gejala pada tanaman menghasilkan
lebih mudah ditemukan yaitu daun menguning pucat. Pada gejala labih lanjut
ditandai dengan patahnya pelepah bagian bawah dan menggantung. Pada pangkal
batang atau bagian tengah tanaman kelapa sawit mengalami pembusukan yang
kadang-kadang diikuti tumbuhnya tubuh buah Ganoderma. Tetapi tidak semua
tanaman bergejala menghasilkan tubuh buah, bahkan tidak ada gejala sedikitpun.
Secara tiba-tiba pohon kelapa sawit tumbang dan bagian dalam batang telah
mengalami pembusukan. Selain itu juga ada gejala internal yaitu terjadinya
pembusukan di pangkal batang. Pada jaringan batang yang busuk, lesio (jaringan
abnormal) tampak sebagai daerah berwarna coklat muda disertai adanya daerah
gelap berbentuk pita tak beraturan. Pita ini sering disebut sebagai zona reaksi yang

8

mengandung getah. Secara mikroskopis gejala internal akar yang terserang
Ganoderma mirip pada batang yang terinfeksi. Jaringan korteks akar yang sakit
berubah warna dari putih menjadi coklat. Pada serangan yang sudah lanjut,
jaringan korteks rapuh dan mudah hancur.
Penyebab penyakit busuk pangkal batang kelapa sawit di Indonesia adalah
jamur Ganoderma boninense. Penularan penyakit ini sebagian besar melalui
mekanisme kontak akar sawit sakit dan sangat kecil melalui basidiospora.

Gambar 2. Mekanisme dan penyebaran Ganoderma boninense
Di dalam tanah Ganoderma tumbuh menjadi berukuran besar melalui
perantaraan akar tanaman sawit. Semula satu tanaman terinfeksi di bagian
perakarannya. Karena akar tanaman sawit yang sudah dewasa saling bertemu dan
membentuk bantalan perakaran seluas perkebunan itu sendiri, maka Ganoderma
yang semula berukuran 4 m x 4 m x 1 m dengan mudah tumbuh membesar pada
bantalan perakaran sawit di bawah permukaan tanah. Apalagi bahan tanaman
kelapa sawit yang dikembangkan di Indonesia diketahui peka terhadap serangan
Ganoderma. Ketika pangkal batang terserang, cepat atau lambat tanaman akan
mati. Pada pangkal batang yang terserang sering terbentuk tubuh Ganoderma
umumnya berbentuk cakram dan bertekstur menyerupai kayu, bagian atas licin
berwarna cokelat muda sampai cokelat gelap sedangkan bagian permukaan
bawahnya kasar berwarna krem, tempat di mana jutaan spora diproduksi
(Paterson, 2007).

9

Gambar 3. Ganoderma boninense
Para pekebun sering salah persepsi bahwa ukuran Ganoderma hanya
sebesar tubuh buah yang terbentuk, kurang lebih sebesar cawan. Padahal kalau
dibandingkan dengan ukuran sebenarnya, tubuh buah Ganoderma dapat
diibaratkan hanya merupakan rambut-rambut kecil monster raksasa. Dengan
demikian ketika tubuh buah dimatikan, Ganoderma yang ukurannya sebesar kapal
selam tidak akan mati. Tunggul-tunggul tanaman yang terserang merupakan urat
nadi Ganoderma, karena merupakan tempat di mana Ganoderma bertahan hidup
ketika tanaman sudah mati.
Serangan monster Ganoderma cenderung meningkat dari tahun ke tahun
dan dari generasi ke generasi. Satu generasi tanaman kelapa sawit adalah 25
tahun. Dari hasil pengamatan kondisi serangan pada beberapa lokasi perkebunan
kelapa sawit diduga tingkat serangan rata-rata Ganoderma mencapai 5%. Penyakit
busuk pangkal batang kelapa sawit, khususnya untuk daerah Sumatra Utara
mencapai 80% pada tanaman tua generasi 3. Diperkirakan secara nasional jumlah
tanaman kelapa sawit yang mati berkisar 50%.

10

Tabel 1. Data dari kejadian busuk pangkal batang kelapa sawit di Sumatra Utara yang
berkorelasi dengan generasi kebun kelapa sawit (TBM : tanaman belum menghasilkan;
TM : Tanaman Menghasilkan; T : Tanaman Tua)

Desain Primer untuk Gateway
Pemilihan primer oligonukletida berguna untuk polymerase chain reaction
(PCR), hibridisasi oligo dan sekuensing DNA. Desain primer yang tepat
merupakan salah satu faktor penting dalam keberhasilan isolasi gen dan
sekuensing DNA. Syarat oligonukleotida dapat digunakan sebagai primer untuk
PCR bergantung pada beberapa faktor yakni, pergerakan asosiasi dan disosiasi
template primer ganda pada suhu penempelan primer dan pemanjangan primer,
kestabilan ganda nukleotida mismatched dan lokasinya, efisiensi polimerase yang
dapat mengenali dan memperpanjang mismatched duplex (Abd-Elsalam 2003).
Desain yang benar dari primer attB untuk amplifikasi, pengklonan, dan
ekspresi gen dalam Gateway membutuhkan pertimbangan penempatan yang tepat
dari unsur ekspresi protein (pengenalan sekuens ribosom, start kodon, stop kodon,
reading frame consideration) ke situs rekombinasi. Posisi yang tepat dari unsur
ekspresi ditentukan oleh bentuk dari protein (native, N-terminal fusion, Cterminal fusion). Informasi penurunan attB1 atau peningkatan attB2 harus
termasuk dalam amplikasi sekuens primer. Desain primer attB1 dan attB2 perlu
memperhatikan poin utama, yakni bentuk protein yang akan diekspresikan (native,
N-terminal fusion, C-terminal fusion). Hal ini akan menentukan posisi start kodon

11

yang berkonstribusi dengan destination vector untuk N-terminal fusion atau
termasuk dalam penurunan hasil PCR dari attB1 untuk native atau C-terminal
fusion, stop kodon yang berkontribusi dengan destination vector untuk C-terminal
fusion atau termasuk dalam peningkatan hasil PCR dari attB2 untuk native atau Nterminal fusion.
Metode Teknologi Gateway
Teknologi Gateway merupakan metode kloning secara universal yang
berdasarkan pada rekombinasi bagian site-specific dari bacteriophage lamda
(Landy 1989). Teknologi Gateway menyediakan teknik yang cepat dan begitu
efisien untuk memindahkan sekuen DNA ke berbagai sistem vektor untuk
dilakukannya analisis fungsional dan ekspresi protein (Hartley et al,2000).
Restrction Endonuclease
Digestion and Ligation

PCR

cDNA
Library

Gambar 4. Transfer DNA teknologi Gateway ke berbagai sistem vektor
Keuntungan dengan menggunakan teknologi Gateway :


Dapat diperoleh hasil dengan cepat dan begitu efisien dalam transfer
sekuen DNA kedalam berbagai sistem vektor untuk ekspresi protein
dan analisis fungsional disaat yang sama bisa mempertahankan
orientasi dan reading frame.

12



Memungkinkan penggunaan dan ekspresi dari berbagai tipe sekuen
DNA (misalnya dari hasil PCR, clone cDNA, atau dari fragment
restriksi).



Memudahkan pemindahan sejumlah besar sekuen DNA ke berbagai
destination vector (lihat tabel 4).



Sangat cocok untuk adaptasi pada high-throughput (HTP) format.



Memungkinkan pengkorversian dari vektor yang kita miliki kedalam
destination vector (lihat tabel 4).

Teknologi Gateway yang berdasarkan pada rekombinasi bacteriophage
lambda site-specific ini difasilitasi dengan integrasi lambda ke dalam kromosom
E. Coli dan di switch diantara jalur lytic dan lysolitic (Ptashne 1992). Pada
teknologi Gateway, komponen dari sistem rekombinasi lamda telah dimodifikasi
untuk meningkatkan spesifitas dan efisiensi pada sistem (Bushman et al, 1985).
Rekombinasi berbasiskan lambda ini melibatkan dua komponen penting :


Sekuen DNA rekombinan (att sites) dan



Protein perantara pada reaksi rekombinasi ini (misalnya Clonase
enzyme mix).

Interegasi lambda kedalam kromosom E. coli terjadi dengan melalui
rekombinasi DNA intermolekular yang ditengahi oleh suatu campuran dari
lambda dan rekombinasi protein E.coli-encoded. Berikut ini garis besar
rekombinasi lambda :


Rekombinasi terjadi diantara bagian spesifik attachment (att) pada
molekul DNA yang berinteraksi.



Rekombinasi berlangsung secara konservatif (misalnya tidak terjadi
penambahan atau pengurangan dari nukleotida) dan tidak dibutuhkan
sintesis DNA. Segment DNA mengapit bagian rekombinasi yang di
swicth, setelah itu bagian att menjadi sekuen hybrid yang terdiri dari
sekuen yang diberikan oleh masing-masing

parental vector.

Contohnya, attL sites terdiri dari sekuen yang berasal dari attB dan
attP sites.


Pertukaran untai terjadi pada suatu wilayah inti pada semua att sites.

13



Rekombinasi dapat terjadi antara DNA dari topologi apa saja
(misalnya supercoiled, linear, atau relaxed) dengan efisiensi yang
bervariasi.

Rekombinasi lambda terjadi diantara bagian site-specific attachment (att) :
attB pada kromosom E.coli dan attP pada kromosom lambda. Bagian att
berfungsi sebagai binding site untuk rekombinasi protein yang berguna pada
protein rekombinasi dan telah dikarakterisasi dengan baik (Weiberg & Landy
1983). Pada saat integrasi lambda, rekombinasi terjadi diantara bagian attB dan
attP untuk menghasilkan bagian attL dan attR. Crossover sebenarnya terjadi
diantara 15 bp homolog core regions pada kedua bagian, tetapi bagaimanapun
juga daerah disekitar core regions sangat diperlukan karena mempunyai bagian
binding sites untuk keperluan protein rekombinasi (Landy 1989).
Protein Rekombinasi
Rekombinasi lambda dikatalisis oleh sejenis campuran enzim yang dapat
mengikat pada sekuen spesifik (daerah att), yang menyatukan daerah target,
membelah mereka, dan secara kovalen melekatkan DNA. Rekombinasi terjadi
setelah dua pasang untai bertukar dan DNA ligasi membentuk bentuk baru.
Jalur lysogenic dikatalisis oleh protein bacteriophage λ Integrase (Int) dan
E.coli Integration Host Factor (IHF)(Enzim BP Clonase Mix) semantara pada
jalur lytic dikatalis oleh protein bacteriophage λ int dan Excisionase (Xis), dan
protein E.coli Integration Host Factor (IHF)(LR Clonase enzyme mix).
Tabel 2. Jalur lysogenic dan lytic

Reaksi Rekombinasi Gateway
Teknologi gateway menggunakan sistem rekombinasi lambda untuk
menfasilitasi pemindahan sekuen heterologous DNA (yang diapit oleh att site
yang termodifikasi) diantara vektor (Harley et al, 2000). Ada dua reaksi
rekombinasi yang merupakan basis dari teknologi Gateway :


Reaksi BP : menfasilitasi rekombinasi dari subtrat attB (produk attB PCR
atau suatu clone attB expression) dengan subtrat attP (donor vector) untuk

14

menghasilkan attL yang mempunyai entry clone (lihat diagram di bawah).
Reaksi ini dikatalisis oleh BP Clonase enzyme mix.

Gambar 5. Reaksi BP


Reaksi LR : menfasilitasi rekombinasi dari subtrat attL (entry clone)
dengan subtrat

attR (destination vector) untuk menghasilkan attB

yang mempunyai expression clone (lihat diagram di bawah). Rekasi
ini dikatalisis oleh LR Clonase enzyme mix.

Gambar 6. Reaksi LR
Daerah rekombinasi wild-type λ att telah dimodifikasi untuk meningkatkan
efisiensi dan spesifikasi dari reaksi rekombinasi gateway BP dan LR. Bagian
berikut ini akan menggambarkan modifikasi dan

contoh bagaimana reaksi

rekombinasi Gateway antara bagian attB x attp dan attL x attR.
Tabel 3. Dareah modifikasi pada att

Modifikasi pada daerah att

15

Dalam sistem Gateway,daerah rekombinasi wild-type λ att telah di
modifikasi seperti dibawah ini untuk meningkatkan efisiensi dan spesifitas dari
reaksi rekombinasi Gateway BP dan LR:


Telah dilakukan mutasi pada core regions dari daerah att untuk
menhapus kodon stop dan memastikan speksifitas dari reaksi
rekombinasi untuk mempertahankan orientasi dan reading frame.



Mutasi telah di ketahui pada daerah pendek (5 bp) yang mengapit 15bp core region dari daerah attB untuk memperkecil formasi struktur
secondary pada bentuk untai tunggal dari plasmid attB (misalnya
phagemid ss(single strand)DNA atau m(messenger)RNA)



Bagian 43 bp dari daerah att telah dihilangkan untuk in vitro reaksi
attL x attR irreversible dan lebih efektif (Bushman et al, 1985).

Sebagai tambahan penjelasan modifikasi diatas, titik mutasi site-specific
telah dibuat dengan beberapa daerah att

untuk meningkatkan efisiensi

rekombinasi. Sebagai hasilnya, variasi sekuen bisa ada hampir diseluruh daerah
att. Contohnya, pDONR 201 attP1 sedikit bervariasi sekuennya dari pDONR 221
attP1. Variasi sekuen ini tidak memberikan efek spesifik dari reaksi rekombinasi
atau fungsionalitas vektor. Modifikasi daerah att mengikuti karakterisasi dan
spesifitas.
Diagram (Gambar 7) di bawah menggambarkan reaksi rekombinasi BP
antara produk attB-PCR dan vektor pDONR221 atau pDONR/Zeo untuk
menghasilkan entry clone dan produk sampingannya.
Fitur-fitur dari daerah rekombinasi :


Pada daerah yang terasir berhubangan dengan transfer sekuens dari
produk attbB-PCR kedalam entry clone selama rekombinasi. Sebagai
catatan bahwa daerah attL tersusun dari sekuen attB dan attP.



Daerah yang dikota berhubungan denga transfer sekuen dari
pDONR221 atau pDONR/ZEO kedalam produk samping selama
rekombinasi.

16

Gambar 7. Reaksi BP menghasilkan entry clone

Tabel 4. Perbedaan tiga tipe dari vektor yang di adopsi Gateway :
Vektor Gateway
Vector Donor

Entry vector

Destination vector

Karakteristik
Mempunyai daerah attP
Digunakan pada klon produk PCR yang
diapit attB
Mempunyai daerah attL
Digunakan pada klon produk PCR atau
yang
tidak
fragmen
restriction
mempunyai
daerah
att
untuk
menghasilkan entry clone
Mempunyai daerah attR
Direkombinasikan dengan entry clone
pada reaksi LR untuk menghasilkan
suatu expression clone
Mempunyai elemen yang diperlukan
untuk mengekspresi gen yang kita
inginkan dari sistem yang sesuai
(misalnya E.coli, mamalia, serangga,
ragi).

17

Untuk memungkinkan kloning secara rekombinasi ini dan efisiensi
pemilihan dari entry dan expression clone, kebanyakan vektor gateway
mempunyai dua daerah att yang diapit suatu pita yang berisi :
 Gen ccdB untuk kontrol negatif ( ada pada donor, destination, dan
supercoiled entry vector)
 Gen tahan terhadap Cloramphenicol (CmR) counterselection (ada pada
donor dan destination vectors )
Setelah reaksi rekombinasi BP dan LR, pita ini digantikan dengan gen
yang kita miliki untuk menghasilkan entry clone dan expression clone, berlaku
untuk masing-masing.
Kehadiran gen ccdB memungkinkan kontrol negatif pada donor dan
destination (beberapa pada entry) vectors dalam E.coli bersamaan dengan tahap
rekombinasi dan transformasinya. Protein ccdB terganggu dengan adanya DNA
gyrase E.coli (Bernard & Couturier 1992), dengan demikian menghambat
pertumbuhan hampir semua strain E.coli (misalnya DH5α™, TOP10). Pada saat
rekombinasi (misalnya antara destination vector dan entry clone atau donor vector
dan produk attB-PCR), gen ccdB digantikan dengan gen milik kita. Sel yang
mengambil vektor tak beraksi dar

i

gen

ccdB

atau molekul produk sampingan yang mempunyai gen ccdB akan gagal untuk
bertumbuh. Hal ini memungkinkan efisiensi yang tinggi untuk mendapatkan klone
yang kita inginkan.
Karena efek yang mematikan dari protein ccdB, semua vektor Gateway
mempunyai gen ccdB yang harus disebarkan pada stain E.coli yang tahan terhadap
efek dari ccdB. Di rekomendasikan menggunakan strain E.coli DB3.1 yang
mempunyai suatu mutasi pada gyrase-nya (gyrA463) yang membuatnya tahan
terhadap efek dari ccdB (Bernard & Couturier 1992; Bernard et al 1993; Miki et
al, 1992).

18

Tabel 5. Tatanama vektor dan klone dari Gateway bisa dilihat dari tabel di
bawah ini.
Tipe Plasmid

Keterangan

Penamaan vektor atau klone

attL Vector

Entry clone

pENTR1, 2,...

attL Subclone

Entry clone

pENTR3-gus,...;pENTR221-gus

Angka 3 menunjukan entry vector

221 menunjukan donor vector yang
digunakan untuk membuat entry
clone

Gus merupakan subclone gene
attR Vector

Destination Vector

pDEST1, 2, 3,...;p...-DEST

attB Vector

Expression Vector

pEXP501, 502, ...

Vektor ini digunakan untuk
mempersiapkan ekspresi cDNA
libraries
attB Subclone

Expression Clone

pEXP14-cat,...;pcDNA/GW-47/cat

14 dan 47 menunjukan destination
vector (yaitu pDEST14, dan
pcDNA-DEST47) yang digunakan
untuk membuat expression clone

Cat adalah subclone gen
attP Vector

Donor Vector

pDONR201, 221, . . .

1. pENTR201-tet x pDEST14  pEXP14-tet
2. pENTR221-cat x pcDNA-DEST47  pcDNA/GW-47/cat
1. PCR produk attB-p53 x pDONR221  pENTR221-p53
2. pEXP14-lacZ x pDONR201  pENTR201-lacZ

19

Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang
banyak digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk
menghasilkan suatu tanaman transgenik. Secara alami, A tumefaciens dapat
menginfeksi tanaman dikotiledon melalui bagian tanaman yang terluka sehingga
menyebabkan tumor mahkota empedu (crown gall tumor). Bakteri yang tergolong
ke dalam gram negatif ini memiliki sebuah plasmid besar yang disebut plasmid-Ti
yang berisi gen penyandi faktor virulensi penyebab infeksi bakteri ini pada
tanaman (Gustavo 1998). Untuk memulai pembentukan tumor, A tumefaciens
harus menempel terlebih dahulu pada permukaan sel inang dengan memanfaatkan
polisakarida asam yang akan digunakan untuk mengkoloniasi/menguasai sel
tanaman (Madigan 2000). Selain tanaman dikotil, tanaman monokotil seperti
jagung, gandum, dan tebu telah digunakan untuk memasukkan sel asing ke dalam
genom tanaman. A tumefaciens adalah bakteri patogen pada tanaman yang banyak
digunakan untuk memasukkan gen asing ke dalam sel tanaman untuk
menghasilkan suatu tanaman transgenik.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu teknik atau metode
perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme
(Sambrook et al, 2001). Dengan teknik ini, DNA dapat dihasilkan dalam jumlah
besar dengan waktu relatif singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain
yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983
dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut.
Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular
karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang kecil.

20

Gambar 8. Alat pengatur suhu reaksi yang biasanya digunakan pada teknik PCR
Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30
kali siklus. Setiap siklus terdiri atas tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap
bekerjanya PCR dalam satu siklus:
Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung
pada suhu tinggi, 94–96 °C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA
menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan
agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah.
Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template
(patokan) bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit.
Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA
template yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–
60°C. Penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak
terjadinya penempelan primer di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit.
Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari
jenis DNA polimerase (ditunjukkan oleh P pada gambar) yang dipakai. Dengan
Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76 °C. Durasi tahap ini
biasanya 1 menit.
Setelah tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Akibat denaturasi
dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi template bagi

21

primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer
yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi
secara eksponensial.

Gambar 9. Skematik
siklus PCR. Garis
biru menandakan
template DNA dan
garis merah
merupakan primer.

Teknik ini juga didukung oleh beberapa komponen pereaksi yang
memiliki

fungsi

khusus,

yaitu

Taq

DNA

polimerase,

cetakan

DNA,

oligonukleotida primer, deoxynucleotide triphosphate (dNTP), dan larutan bufer.
Taq DNA polimerase merupakan enzim tahan panas yang diisolasi dari bakteri
termofilik Thermus aquaticus, enzim ini akan mengkatalisis proses PCR. Primer
merupakan oligonukleotida yang menempel pada daerah spesifik yang diinginkan.
Oligonukleotida yang digunakan sebagai primer paling sedikit merupakan
gabungan dari 16 pasang basa, disarankan menggunakan 20-24 pasang basa.
Primer yang terlalu pendek tidak menempel secara spesifik sehingga akan terjadi
penggandaan pada daerah yang tidak spesifik pula sedangkan primer yang terlalu
panjang akan sulit untuk menempel pada cetakan DNA sehingga amplifikasi tidak
terjadi. Keberadaan dNTP dan konsentrasi larutan bufer dalam reaksi PCR, dapat
mempengaruhi spesifitas amplikon. Reaksi PCR membutuhkan suatu bufer yang

22

mengandung MgCl2 karena aktivitas enzim polimerase dipengaruhi oleh
konsentrasi ion Mg2+. Ion Mg2+ akan menyetimulasi aktivitas enzim secara
maksimal pada konsentrasi 2 mM jika konsentrasinya lebih tinggi, maka dapat
bersifat inhibitor (Sambrook & Russell 2001).
Salah satu kegunaan PCR adalah untuk identifikasi suatu gen atau DNA
yang spesifik. Identifikasi keberadaan suatu gen dapat dilakukan dengan mudah
bila daerah pengapit (flanking region) telah diketahui. Daerah pengapit yang
spesifik ini digunakan sebagai primer. Penggunaan PCR untuk identifikasi adanya
suatu patogen penyebab suatu penyakit telah banyak dilakukan, seperti hepatitis
B, TBC, AIDS, atau kelainan lainnya. Perbanyakan gen untuk berbagai keperluan,
pengurutan DNA, ataupun kajian keragaman molekuler dapat pula dilakukan
dengan PCR (Suharsono 2000).

23

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Berbagai bahan yang digunakan dalam PCR-Colony (kit Fermentas) dan
PCR (kit Invitrogen). Proses amplifikasi (PCR-Colony) menggunakan kit dari
Fermentas yang memerlukan bahan-bahan seperti template PSA Aka(Promotor
spesifik akar-Aka), primer M13 (M13F dan M13R,), buffer complete,
Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs), Taq polimerase, dan molecular water
(aquabides). Proses amplifikasi (PCR) menggunakan kit dari Invitrogen yang
memerlukan bahan-bahan seperti template PSA-Aka(Promotor spesifik akar-Aka),
primer gateway PSA-AKA (reverse dan forward), buffer complete, MgCl, dNTPs,
Taq polimerase, dan molecular water (aquabides). Berbagai bahan yang
digunakan dalam elektroforesis yaitu gel agarosa (Sigma), bufer Tris-BorateEDTA (TBE) 0.5x, Etidium bromida (EtBr) 5 µg/100mL, loading bufer
(Bromfenol biru 2.5%, sukrosa 40%), dan marker 1 kb plus (Invitrogen). Tahap
transformasi dibutuhkan bahan-bahan seperti sel kompeten E.coli XL-1 Blue,
larutan Proteinase K, Donor vektor (pDONR 221), Enzim BP clonase, clonase
reaction buffer, TE buffer, pH 8.0 (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA),
Destination vector (150 ng/µl dalam TE, pH 8.0), LR clonase enzyme mix, LR
Clonase reaction buffer, Medium S.O.C, LB-Glokosa (20mM), media Luria
Bertani Agar (LBA) selektif (Kanamisin (50ppm), YEP (Yeast Extract Pepton),
berbagai vektor Gateway.
Alat yang digunakan untuk elektroforesis adalah sisir dan cetakan agar,
bak elektroforesis, mikropipet, tabung mikro, microwave, adaptor 100 Volt,
transluminator ultraviolet (UV) T2201 (Sigma). Selain itu alat yang digunakan
adalah mesin PCR (Biometra T-Personal dan ESCO), DNA speed vacuum 110
savant, inkubator bergoyang (shacker incubator), laminar air flow cabinet,
autoklaf, eppendorf sentrifus 5417R, neraca analitik, dan peralatan-peralatan gelas
seperti cawan petri, gelas piala, labu Erlenmeyer, dan gelas ukur.

24

Metode
Amplifikasi DNA PSA Aka dengan Primer Gateway (invitrogen)
Amplifikasi DNA PSA(Promotor spesifik akar) Aka menggunakan primer
Gateway yakni:
Forward

: GGGG CCA ACT TTG TAC AAA AAA GCA GGC T ----20 bp from gene----attL1

Reverse

: GGGG CC AAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GT ----20 bp from gene----attL2

Proses amplifikasi dimulai dengan menyiapkan komponen mix yang terdiri atas
2.5 µL buffer complete, 1 µL dNTPs, 0.5 µL Taq polimerase, dan 15 µL
molecular water. Kemudian DNA (PSA Aka) dimasukkan ke dalam tabung mikro
sebanyak 1 µL. Gateway Reverse primer (primer R) ditambahkan sebanyak 1 µL
ke dalam tabung mikro kemudian ditambahkan pula sebanyak 1 µL Gateway
forward primer (primer F) ke dalam tabung. Komponen mix yang telah
dipersiapkan sebelumnya ditambahkan setelah penambahan DNA, primer R, dan
primer F. DNA PSA Aka diamplifikasi dengan mesin PCR selama 3 jam dengan
program PCR: predenaturasi pada suhu 940C selama 7 menit, denaturasi pada
suhu 940C selama 45 detik, penempelan primer (annealing) pada suhu 580C
selama 45 detik, pemanjangan primer (extension) pada suhu 720C selama 2 menit,
pascapemanjangan pada suhu 720C selama 5 menit, dan waktu penyimpanan pada
suhu 100C.
Rekombinasi DNA PSA Aka dengan reaksi BP (metode Gateway yang
dimodifikasi dari Hartley 2000; Landy 1989; Kertbundit et al. 1991)
Rekombinasi DNA PSA Aka pada donor vector dimulai dengan
menyiapkan sebanyak 2-3µL DNA PSA Aka, 1µL donor vector (pDONR)
kemudian ditambahkan bufer TE bisa sampai 4-5 µL. Setelah itu, ditambahkan
sebanyak 4 µL BP Clonase 5X dan diinkbuasi selama 1 jam (atau semalaman)
pada suhu 250C. Setelah inkubasi selesai larutan ditambahkan sebanyak 2 µL
Proteinase K dan diinkubasi lagi pada suhu 350C selama 10 sampai 15 menit.
Hasil rekombinasi Aka pada Entry vector kemudian ditransformasikan ke
destination vektor.

25

Rekombinasi DNA PSA Aka pada vektro entry dengan reaksi LR (metode
Gateway yang dimodifikasi dari Hartley 2000; Landy 1989; Kertbundit et al.
1991)
Sebanyak 150 ng hasil rekombinasi pada entry vector dimasukkan ke
dalam tabung mikro kemudian ditambahkan 150 ng destination vector. Setelah itu
ditambahkan bufer TE hingga volume larutan mencapai 8 µL. Ke dalam tabung
mikro ditambahkan sebanyak 2 µL LR Clonase kemudian diinkubasi pada suhu
250C selama 1 jam. Setelah inkubasi larutan kemudian ditambhkan 2 µL
proteinase K yang selanjutnya diinkubasi kembali pada suhu 370C selama 15
menit. Hasil rekombianasi pada destination v