Isolasi dan karakterisasi protease dari bakteri isolat nato

ISOLASI DAN PENCIRIAN PROTEASE DARI
BAKTERI ISOLAT NATO

SELVI YUNINGSIH

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

ABSTRAK
SELVI YUNINGSIH. Isolasi dan Pencirian Protease dari Bakteri Isolat Nato.
Dibimbing oleh DONDIN SAJUTHI dan YANTI.
Isolasi dan pencirian protease dari bakteri isolat nato merupakan salah satu
upaya untuk mendapatkan sumber protease dari pangan fermentasi. Jumlah
isolat yang dapat diisolasi dari nato sebanyak 4 isolat yang terdiri dari NA1,
NA2, NA3 dan NA4. Aktivitas protease tertinggi dihasilkan oleh isolat NA4
(0.2263 U/ml). Ekstrak enzim dimurnikan dengan presipitasi amonium sulfat 75
persen, dan di dialsisis menggunakan kantung dialisis (cut off 10 kD). Kondisi
optimum kerja enzim protease dicapai pada suhu 50ºC, dan pH 4. Aktivitas

protease meningkat dengan adanya penambahan ion logam K+ dan Zn 2+.
Inhibitor yang menghambat aktivitas enzim, yaitu fenil metil sulfonil fluorida
dan soybean tripsin inhibitor sehingga termasuk dalam kelompok protease serin
serupa tripsin. Hasil analisis SDS-PAGE 15 persen memperlihatkan enzim
memiliki tiga buah pita proteolitik dengan bobot molekul 14.64, 17.74, dan
42.88 kD untuk ekstrak enzim kasar, sedangkan dialisat memiliki bobot molekul
14.64, 19.90, dan 30.36 kD. Uji zimogram 15 persen menunjukkan bahwa enzim
protease nato mempunyai aktivitas kaseinolitik dan fibrinolitik yang potensial.

ABSTRACT
SELVI YUNINGSIH. Isolation and Characterization of Protease from Isolate
Natto. Supervised by DONDIN SAJUTHI and YANTI.
Isolation and characterization of protease from isolate natto is an attempt
to obtain protease source from food fermented. The result showed that four
isolated from natto were found, NA1, NA2, NA3, and NA4. The high activity of
protease was produced by NA4 (0.2263 U/ml). The extract of protease went
throught several steps of purification using ammonium sulfate 75 percent
saturation, and dialyzed (cut-off 10 kD). The optimum condition of enzyme
protease activity was reached at pH 4, and temperature of 50ºC. The activity of
protease increase with metal K+ and Zn 2+. The enzyme also grouped in serine

like trypsin protease because it is strongly inhibited by fenil metal sulfonil
florida and soybean tripsin inhibitor. SDS-PAGE analysis of crude and dialysat
natto showed three protein bands (14.64, 17.74, and 42.88 kD for crude and
14.64, 19.90, and 42.88 kD for dialysat). The protease enzyme from natto had a
potential caseinolytic and fibrinolytic activities from zymography analysis.

ISOLASI DAN PENCIRIAN PROTEASE DARI
BAKTERI ISOLAT NATO

SELVI YUNINGSIH

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR

2006

Judul

: Isolasi dan Pencirian Protease dari Bakteri Isolat Nato

Nama mahasiswa

: Selvi Yuningsih

NIM

: G44201025

Menyetujui:

Pembimbing I,

Pembimbing II,

Prof. drh. Dondin Sajuthi, MST, Ph.D.

Yanti, S. Si, M.Si

NIP 131 536 684

NIP 120 041 094

Mengetahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Dr.Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP 131 473 999

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur hanya milik Allah Swt yang atas rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis
dimudahkan dan diberi kekuatan untuk menyelesaikan karya ilmiah ini. Shalawat dan

salam semoga selalu tercurah kepada suri teladan kita Nabi Muhammad saw. Tema yang
dipilih dalam penelitian ini adalah isolasi protease dari pangan fermentasi, dengan judul
Isolasi dan Pencirian Protease dari Bakteri Isolat Nato.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Prof. drh. Dondin Sajuthi MST,
Ph.D. dan Ibu Irma Suparto MSi selaku pembimbing dari program studi kimia dan Ibu
Yanti MSi selaku pembimbing lapangan dari Atma Jaya yang telah mencurahkan ilmu
dan waktunya. Ucapan terima kasih yang tak terhingga teruntuk Ayahanda Momon
Juanda, Ibunda Asroriah, aa dan teteh atas segala perhatian, doa, dan dorongannya.
Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada semua teknisi dari Atma Jaya (Mas
Yudi, Mas Bambang, Mas Ridwan dan Mas Nurdin), Mas Heri, penghuni Bagunde 12
(Mba Wiwin, dan Desi), Rini, teman-teman kimia 38, dan semua pihak yang telah
membantu penulis, hingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Terima kasih atas segala
bantuan yang sudah diberikan
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Amin.

Bogor, Maret 2006

Selvi Yuningsih

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Pandeglang pada tanggal 23 Juni 1983 dari ayah Momon Juanda
dan ibu Asroriah. Penulis merupakan putri ketiga dari tiga bersaudara. Tahun 2001
penulis lulus dari SMA Negeri I Menes dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk
IPB melalui jalur Undangan Masuk Seleksi IPB. Penulis memilih Program Studi Kimia,
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah melaksanakan praktik lapangan di
Pusat Penelitian dan Pengembangan Gizi dan Makanan, Bogor, pada tahun ajaran
2003/2004.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL..................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR .............................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN............................................................................................ ix
PENDAHULUAN .................................................................................................... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Nato.............................................................................................................. 1
Protease Fibrinolitik..................................................................................... 2
Pemurnian Enzim......................................................................................... 3
SDS-PAGE dan Zimografi........................................................................... 4

BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan............................................................................................. 4
Metode ......................................................................................................... 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
Seleksi Isolat Bakteri Proteolitik ................................................................. 6
Pemurnian Enzim......................................................................................... 7
Penentuan Suhu Optimum ........................................................................... 7
Penentuan pH Optimum............................................................................... 8
Pengaruh Ion Logam.................................................................................... 8
Pengaruh Inhibibitor .................................................................................... 9
Penentuan Nilai Km dan Vmaks.................................................................. 9
Penentuan Bobot Molekul.......................................................................... 10
Zimografi ................................................................................................... 11
SIMPULAN DAN SARAN .................................................................................... 11
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................. 12
LAMPIRAN............................................................................................................ 13

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Contoh enzim fibrinolitik dari mikroba beserta karakterisasinya ............. 3

2 Komposisi gel pemisah dan penahan SDS-PAGE dan Zimografi ............ 6
3 Ringkasan karakterisasi protease dari isolat NA4 ................................... 11

DAFTAR GAMBAR
Halaman
0

1 Pertumbuhan isolat NA4 pada suhu 37 C ................................................. 7
2 Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim protease nato............................. 7
3 Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim protease nato ............................... 8
4 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas residu (%) enzim protease nato .. 9
5 Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas residu (%) enzim protease nato..... 9
6 Kurva Michaelis Menten protease kasar dan dialisat nato........................ 9
7 Kurva Lineweaver-Burk protease kasar dan dialisat nato....................... 10
8 Analisis SDS-PAGE 15% protease nato ................................................. 10
9 Analisis zimogram pada berbagai substrat protein ................................. 11
10 Kurva hubungan konsentrasi dengan absorbansi standar protein ........... 15
11 Kurva standar LMW SDS-PAGE 15% ................................................... 18

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1 Bagan alir penelitian ............................................................................... 14
2 Aktivitas enzim pada empat isolat nato .................................................. 15
3 Kadar protein pada empat isolat nato...................................................... 15
4 Data kurva standar protein ...................................................................... 15
5 Data presipitasi oleh amonium sulfat nato .............................................. 16
6 Data semipemurnian protease dari isolat NA4 ........................................ 16
7 Pengaruh suhu terhadap aktivitas protease kasar dan dialisat nato......... 16
8 Pengaruh pH terhadap aktivitas protease kasar dan dialisat nato ........... 17
9 Pengaruh inhibitor terhadap aktivitas protease kasar dan dialisat nato... 17
10 Pengaruh ion logam terhadap aktivitas protease kasar dan dialisat nato 17
11 Penentuan kinetika enzim protease kasar dan dialisat nato .................... 18
12 Contoh perhitungan aktivitas enzim dan aktivitas enzim spesifik .......... 18
13 Kurva standar LMW SDS-PAGE 15% ................................................. 18
14 Komposisi media pertumbuhan dan media produksi protease................ 19
15 Prosedur pembuatan pereaksi kimia........................................................ 19

1

PENDAHULUAN

Proses fermentasi merupakan suatu proses
yang mendayagunakan aktivitas metabolisme
suatu mikrob tertentu atau campuran dari
beberapa spesies mikrob untuk menghasilkan
senyawa tertentu (Rahman 1992). Salah satu
pemanfaatan teknologi fermentasi digunakan
dalam bidang industri yang menghasilkan
pangan fermentasi. Pangan fermentasi
merupakan salah satu makanan yang banyak
dikonsumsi sebagai menu makanan seharihari oleh masyarakat Indonesia karena rasanya
yang enak dan harganya yang relatif murah.
Contoh makanan fermentasi yang sudah
dikenal luas, yaitu tempe, oncom, roti, tauco,
dan lain-lain.
Belakangan
ini
banyak
penelitian
mengungkapkan bahwa pangan fermentasi
merupakan makanan yang baik untuk

kesehatan karena banyak mengandung
vitamin, asam amino, dan enzim yang diduga
diproduksi selama proses fermentasi. Enzim
yang diperoleh dari pangan fermentasi
diantaranya yaitu enzim fibrinolitik. Penelitian
terhadap chungkook-jang, pangan fermentasi
tradisional Korea dengan bahan pokok
kacang
kedelai
menemukan
bahwa
chungkook-jang mengandung enzim protease
fibrinolitik yang potensial (Kim et al. 1996).
Penelitian yang dilakukan terhadap pangan
fermentasi kedelai asal Thailand dari galur
Bacillus 38 juga menemukan adanya
kandungan enzim fibrinolitik potensial yang
terdapat dalam pangan fermentasi asal
Thailand tersebut (Chantawannakul et al.
2001).
Berbagai macam enzim fibrinolitik
misalnya
urokinase,
streptokinase,
rekombinan plasminogen aktivator jaringan,
stafilokinase, dan rekombainan prourokinase
telah dipelajari secara luas, namun obat-obat
ini harganya mahal dan kemampuannya
terbatas (misalnya mudah hancur dan dapat
menimbulkan pendarahan). Oleh karena itu,
obat-obat penemuan baru anti beku darah
yang memiliki keefektifan lebih baik dan efek
samping yang lebih rendah sangat diperlukan.
Baru-baru ini, lumbrokinase dari cacing
L.rubellus menunjukkan potensinya sebagai
altenatif obat trombolitik baru yang bersifat
aman, tidak toksik, dan tidak menimbulkan
efek samping terhadap fungsi jantung, hati,
ginjal, sisitem respirasi, dan sistem saraf.
Lumbrokinase merupakan enam fraksi
protease serin yang diekstraksi dari cacing
tanah Lumbricus rubellus (Mihara et al,
1991). Kelebihan lumbrokinase adalah

dosisnya diberikan secara administrasi oral,
sedangkan enzim trombolitik komersial
lainnya (sterptokinase, urokinase, anistreplase,
alteplase, dan lainnya) harus diberikan secara
injeksi intravena.
Enzim fibrinolitik dapat juga dihasilkan
dan diproduksi dari mikrob, yang bisa
diisolasi dari pangan fermentasi. Protease
yang dihasilkan oleh mikrob sangat potensial
untuk digunakan karena sumbernya yang
berlimpah, produksi enzim yang cepat, biaya
produksi relatif murah, dan mudah dikontrol.
Nato merupakan pangan fermentasi
tradisional Jepang dengan bahan pokok
kacang kedelai. Bacillus nato diduga
memproduksi berbagai enzim, vitamin, dan
asam amino selama proses fermentasinya.
Kandungan kompleks nato itulah yang
memungkinkan nato dipercaya bermanfaat
untuk pencegahan dan penyembuhan berbagai
penyakit seperti stroke, kanker, osteoporosis,
dan juga dipercaya dapat memecah bekuan
darah. Sehubungan dengan khasiatnya
tersebut, maka nato diduga mengandung
komponen enzim protease tertentu terutama
protease fibrinolitik yang potensial untuk
membantu proses penguraian darah kental
atau beku.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi
bakteri penghasil protease dan melakukan
kajian rinci tentang pencirian enzim protease
potensial yang dihasilkan pada pangan
fermentasi nato.
Hasil penelitian ini diharapkan dapat
dijadikan informasi awal mengenai sifat
biokimiawi enzim protease nato dan
keamanan pemakaiannya sehingga kelak dapat
dikembangkan sebagai bahan baku obatobatan dalam industri biofarmasi.

TINJAUAN PUSTAKA
Nato
Nato merupakan salah satu makanan hasil
fermentasi khas dari Jepang yang berbahan
dasar kacang kedelai sehingga disebut dengan
natto soybeans. Nato di fermentasi mirip
tempe namun dalam bentuk terurai, berlendir
dengan beraroma ragi sangat tajam. Nato
biasa disajikan dengan soyu (kecap Jepang)
dan mustard untuk menambahkan rasa pedas,
digemari sebagian orang Jepang sebagai
makanan murah yang sehat, meskipun
sebagian orang justru tidak menyukainya
karena aroma ragi dan lendirnya yang lengket.
Produk akhir nato terlihat pada Gambar 1.

2

tetapi belum ada penelitian secara kimia
(Focus Agustus 2002).
Protease Fibrinolitik

Gambar 1 Nato komersial.
Proses pembuatan nato relatif mudah,
langkah awal dengan mencuci kacang kedelai
dan merendamnya dalam air selama duabelas
sampai dengan dua puluh jam. Selanjutnya
dikukus selama 6 jam sampai lunak.
Sementara itu siapkan jerami kering dan
jerami tersebut dimasukkan ke dalam air
mendidih untuk sterilisasi pada 100ºC selama
6 menit (Bacilus sp. masih bisa hidup pada
kondisi ini). Kemudian nato dimasukkan ke
dalam jerami yang sudah steril dan
difermentasi pada 40ºC selama 24 jam.
Fermentasi nato juga dapat dicampur dengan
saus yang berisi gula, garam, yeast, dan
sebagainya tergantung dari rasa diinginkan.
Nato hasil fermentasi selanjutnya dimasukkan
pada suhu 4ºC untuk kemudian dilakukan
pengemasan (Japan Tips.net).
Nato selain memiliki rasa yang khas, juga
dipercaya sebagai makanan yang baik bagi
kesehatan. Penelitian menemukan bahwa nato
mengandung suatu senyawa pyrazine, yang
tidak hanya memberikan aroma khas untuk
nato tetapi juga dapat menurunkan bekuan
darah. Ekstrak nato yang mengandung
nattokinase dapat juga dijadikan sebagai
suplemen diet. Pemberian natokinase secara
oral pada tikus dan anjing yang dilakukan dr.
Sumi di Jepang (Focus Agustus 2002),
menunjukkan adanya aktivitas fibrinolitik. Hal
ini mendukung hipotesis bahwa nato dapat
menurunkan bekuan darah pada manusia,
meskipun belum dilakukan penelitian yang
pasti secara medis.
Manfaat nato dalam bidang medis lainnya
yaitu dapat mencegah osteoporosis karena
nato ditemukan mengandung cukup besar
vitamin K. Nato juga mengandung sejumlah
zat kimia untuk mencegah kanker, seperti
diadzein, genistein, infrabin, fitoestrogen, dan
unsur selenium, akan tetapi kebanyakan dari
zat-zat kimia ini dapat juga ditemukan pada
produk lain kacang kedelai, dan nato juga
belum tentu sebagai obat terbaik untuk kanker
karena belum ada penelitian sejauh itu. Selain
itu, nato diketahui mempunyai efek antibiotik
dan digunakan sebagai obat disentri untuk
tentara Jepang sebelum perang dunia ke-2,

Enzim fibrinolitik merupakan kelompok
enzim protease yang mampu mendegradasi
fibrin atau fibrinogen. Dalam tubuh, enzim
fibrinolitik atau plasmin diproduksi oleh sel
endotel dalam saluran pankreas. Seiring
dengan pertambahan usia dan juga pola
konsumsi pangan yang tidak seimbang, maka
produksi plasmin alami oleh tubuh akan
semakin berkurang sehingga kerja sistem
fibrinolitik dalam tubuh akan terganggu. Bila
hal ini berlangsung terus secara berkala maka
akan memicu timbulnya penyakit trombosis
yang akhirnya mengarah pada berbagai
penyakit
degeneratif,
seperti
stroke,
asterosklorosis, hipertensi, dan diabetes
(Suhartono 1992).
Berdasarkan reaksi yang dikatalisisnya,
enzim ini tergolong hidrolase karena
mengakatalis pemecahan substrat dengan
pertolongan air (Suhartono 1992).
Protease fibrinolitik yang diperoleh dari
mikroba mempunyai kelebihan, yaitu dapat
diproduksi
dalam
jumlah
besar,
produktifitasnya mudah ditingkatkan dan
mutunya lebih seragam dan harganya lebih
murah (Stanbury & Whitaker 1984). Hal ini
menyebabkan meluasnya penggunaan mikrob
sebagai penghasil enzim.
Ward (1983) membagi enzim protease
mikroorganisme ke dalam 6 kelompok, yaitu
aminopeptidase, karboksipeptidase, proteinase
serin, proteinase tiol, proteinase asam, dan
proteinase metal (metaloproteinase).
Aminopeptidase mengkatalisis pemecahan
protein pada ujung amina bebasnya,
sedangkan karboksipeptidase mengkatalisis
pemecahan molekul protein pada ujung
karboksil bebasnya.
Protease serin ialah protease yang
memiliki residu serin pada sisi akifnya.
Protease seperti tripsin, kimotripsin, elastase,
dan subtilisin termasuk ke dalam golongan ini.
Protease golongan ini dihambat diisopropil
fosfofluoridat (DPF) karena adanya reaksi
DPF dengan gugus hidroksil dari residu serin
pada sisi aktif.
Protease sulfihidril atau disebut juga
protease tiol, pada sisi aktifnya terdapat satu
atau lebih residu sulfihidril. Protease
sulfihidril
dihambat
oleh
adanya
oksidator/alkilator yang memutuskan ikatan
S-S, juga karena adanya logam-logam berat
yang berikatan grup tiolnya. Enzim protease

3

jenis fisin dan bromelin digolongkan ke dalam
golongan ini.
Aktivitas protease logam sangat ditentukan
oleh adanya logam sebagai kofaktor enzim,
sehingga sering disebut metaloprotease.
Metaloprotease merupakan protease yang
lazim dihasilkan oleh bakteri. Kehilangan
logam pada metaloprotease karena adanya
EDTA (senyawa pengkelat logam) akan
menyebabkan berkurangnya aktivitas protease
tersebut. Pada endopeptidase logam, aktivitas
dan kestabilannya ditentukan oleh keberadaan
ion Zn2+ dan ion Ca2+.
Protease asam merupakan protease yang
mempunyai gugus karboksil pada sisi
aktifnya. Aktivitas protease asam ini dihambat
oleh p-bromofenasil bromida atau pelarut
diazo. Enzim-enzim yang termasuk dalam
golongan ini antara lain pepsin, renin dan
beberapa protease dari kapang yang aktif pada
pH dua sampai pH empat.
Contoh enzim fibrinolitik yang diisolasi
dari mikroba beberapa pangan fermentasi
disajikan dalam Tabel 1.
Tabel 1 Contoh dan ciri enzim fibrinolitik dari
mikrob
Sumber

Natto
(Jepang)

Chungkokjang
(Korea)

Douchi
(China)

Doen-jang
(Korea)

Galur
bakteri

Pencirian

Referensi

B.natto
B.firmus
NA-1

T dan pH
optimum :
40oC dan
7-9

Sumi
et al.
1987

Bacillus
sp.
CK 11-4

T dan pH
optimum:
70oC dan
10.5
BM: 28.2

Kim
et al.
1996

B.amyloli
quefaciens
DC-4

Protease
serin
BM 28

Peng
et al.
2003

Bacillus
sp. DJ-4
B.subtilis
KH-4

T dan pH
optimum:
40oC dan
7-8

Kim
&
Choi
2000

Pemurnian Enzim
Dalam mempelajari ciri fisis dan biologis
suatu enzim untuk memperoleh data yang
lebih akurat biasanya diperlukan proses
pemurnian. Secara umum pemurnian enzim
dilakukan dalam tiga tahap, yaitu ekstraksi,

pemekatan, dan fraksinasi. Metode ekstraksi
yang digunakan tergantung pada sumber dan
lokasi
enzim. Enzim yang dihasilkan
dipisahkan dari sel dengan sentrifugasi.
Proses pemisahan dengan sentrifugasi
merupakan sistem pemisahan berdasarkan
ukuran dan berat molekul. Partikel dengan
berat, ukuran, dan bentuk yang berbeda akan
mengendap pada kecepatan yang berbeda.
Dengan metode ini spora bakteri dan sel dapat
dipisahkan pada proses klarifikasi dengan
bagian enzimnya. Proses sentrifugasi terhadap
enzim-enzim yang bersifat rapuh dilakukan
pada suhu rendah, sehingga kehilangan
aktivitas enzim dapat dijaga seminimal
mungkin (Suhartono 1989).
Pemekatan enzim dilakukan untuk
memisahkan protein enzim dari molekul lain
seperti lipida dan karbohidrat. Molekul
kompleks perlu dipecahkan, jika gugus non
protein tempat enzim melekat tidak
dibutuhkan untuk aktivitas enzim. Metode
pemekatan yang sering digunakan adalah
presipitasi dengan garam, pelarut organik,
dialisis, dan ultrafiltrasi.
Metode presipitasi dengan garam (ion
garam yang ditambahkan) mempengaruhi
kelarutan protein. Ketika konsentrasinya
rendah, ion-ion ini akan mengelilingi molekul
protein dan mencegah bersatunya molekulmolekul ini, sehingga protein larut dan disebut
salting in. Jika konsentrasinya tinggi, terjadi
peningkatan muatan listrik disekitar protein
yang akan menarik mantel air dari koloid
protein. Interaksi hidrofobik diantara sesama
molekul pada suasana ionik yang tinggi akan
menurunkan kelarutan protein dan disebut
salting out. Presipitasi dengan salting out
dilakukan pada suhu rendah (4ºC). Enzim
yang telah menggumpal dipisahkan dari
supernatan
dengan
sentrifugasi
atau
penyaringan/filtrasi. Enzim ini masih belum
murni dan tercampur dengan protein lainnya,
walaupun sudah bebas dari kontaminan non
protein (Suhartono 1989). Sisa garam dari
proses presipitasi enzim dihilangkan dengan
dialisis.
Dialisis ialah salah satu tahap pemurnian
enzim.
Proses
ini
bertujuan
untuk
menghilangkan garam dan zat terlarut lainnya
yang mempunyai berat molekul yang lebih
rendah daripada protein enzim. Prinsip dialisis
didasarkan pada sifat semipermiabel untuk
meloloskan molekul-molekul kecil dan
menahan molekul yang besar. Molekul kecil
melewati membran dan masuk ke dalam
larutan di luar membran sampai tercapai
keseimbangan (Scopes 1982). Prosesnya ialah

4

difusi selektif yang melewati membran
selofan. Selofan yang membungkus larutan
protein memungkinkan bufer dan molekul
kecil seperti garam dengan bebas keluar
selofan melalui pori-pori. Larutan di uar
selofan adalah larutan yang memiliki
konsentrasi yang lebih kecil agar molekul
dapat berdifusi keluar.

namun dalam kondisi tidak tereduksi.
Penambahan detergen Triton X-100 akan
melepaskan SDS dan kembali terjadi pelipatan
protein (renaturasi). Gel diwarnai dengan
coomassie blue, dan molekul yang memiliki
aktivitas proteolitik tampak sebagai pita
bening. Metode zimografi bersifat mudah,
sensitif, dan kuantitatif dalam menganalisis
aktivitas proteolitik.

SDS-PAGE dan Zimografi
Elektroforesis
didefinisikan
sebagai
perpindahan
partikel-partikel
bermuatan
karena pengaruh medan listrik. Beberapa jenis
elektrofesis yang dikenal antara lain
elektroforesis kertas, elektroforesis selulosa
asetat atau selulosa nitrat, dan elektroforesis
gel. Elektroforesis yang bermanfaat bagi
pemisahan protein dan asam nukleat adalah
elektroforesis
gel,
sedangkan
jenis
elektroforesis lainnya bermanfaat dalam
pemisahan molekul yang lebih kecil. Bentuk
elektroforesis gel dapat berupa kolom atau
lempengan (slab). Jenis gel yang biasa
digunakan antara lain gel pati, gel agarosa,
dan gel poliakrilamida. Gel poliakrilamida
merupakan polimer yang disusun oleh
akrilamida dan N,N'-metilena-bis-akrilamida
yang berpolimerisasi dengan bantuan suatu
katalis atau sistem radikal bebas, seperti
amonium persulfat dan katalis N,N,N',N'tetrametiletilenadiamin (TEMED).
Elektroforesis gel poliakrilamida sodium
dedosil sulfat (SDS-PAGE) merupakan teknik
elektroforesis yang paling banyak digunakan
untuk analisis campuran protein. Mekanisme
pada SDS-PAGE yaitu protein akan bereaksi
dengan SDS yang merupakan detergen
anionik
membentuk
kompleks
yang
bermuatan negatif. Protein akan terdenaturasi
dan terlarut membentuk kompleks berikatan
dengan SDS yang berbentuk elips atau batang
yang ukurannya sebanding dengan berat
molekul protein. Protein dalam bentuk
kompleks yang bermuatan negatif ini
dipisahkan
berdasarkan
muatan
dan
ukurannya secara elektroforesis di dalam
matriks gel poliakrilamida. Berat molekul
protein dapat diukur dengan menggunakan
protein standar yang telah diketahui bobot
molekulnya dengan cara membandingkan
nilai mobilitas relatif (Rf) (Smith 1980).
Zimografi adalah teknik elektroforesis
untuk menetapkan aktivitas proteolitik.
Berbeda dengan SDS-PAGE, gel pemisah
disispi substrat protein yang akan dihidrolisis
oleh protease selama masa inkubasi. Enzim
dipisahkan dalam gel denaturasi (SDS),

BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat-alat
yang
digunakan
adalah
spektrofotometer UV/VIS (Optima), pH meter
Orion, sentrifugasi mikro berpendingin
Beckmann, otoklaf, inkubator, neraca analitik,
oven, perangkat elektroforesis, deep-freezer,
pipet mikro dan tipnya, tabung ependrof,
tabung mikro, cawan petri, jarum ose, dan
alat-alat gelas lainnya.
Bahan-bahan yang digunakan, yaitu nato,
substrat protein (kasein hammarsten), standar
L-tirosina, bovine serum albumin (BSA)
fraktion V (Merck), amonium sulfat,
polietilena glikol, bufer fosfat pH 7.0,
pereaksi Folin Ciocalteau, garam NaCl, bufer
tris-HCl 1 M (pH 6.8 dan 8.8), HCl 0.1 M,
etilen diamiana tetra asetat (EDTA), inhibitor
fenil metil sulfonil fluorida (PMSF), N-ptosil-L-lisin klorometil keton (TLCK),
soybean tripsin inhibitor (STI), sodium
dodesil sulfat (SDS) 10% b/v, gliserol 15%
v/v,
akrilamida,
N,N'-bis-akrilamida,
amonium persulfat 10% b/v, N,N,N',N'tetrametiletilenadiamin
(TEMED),
biru
bromfenol
1%
b/v,
glisin,
fibrin,
merkaptoetanol, coomassie brilliant blue R250, pereaksi Bradford, standar marker low
molecular weight (LMW), metanol, asam
asetat
glasial,
bufer
elektroforesis,
trichloroacetic acid (TCA), larutan pewarna
dan peluntur, media skim milk agar (SMA),
media luria bertani both (LB). Komposisi
media dan pereaksi kimia secara lengkap
terlihat pada Lampiran 2 dan 3.
Metode
Pemilahan dan Produksi Protease
Sampel yang akan diuji ialah nato dari
Jepang. Sampel tidak mendapat perlakuan
apapun, hanya dimasukkan ke dalam lemari
pendingin agar tidak terjadi kerusakan pada
sampel.

5

Isolasi Mikrob. Tahapan awal untuk
isolasi mikrob penghasil protease, yaitu
dengan mengambil 10% b/v sampel nato yang
telah dicampur dengan garam fisiologis
(0.85% NaCl). Kultur disuspensi kemudian
disebarkan pada media skim milk agar (SMA)
yang steril, lalu diinkubasi selama 2 hari pada
suhu 37ºC dan diamati adanya koloni mikrob
yang memiliki zona bening. Koloni mikrob
dipindahkan ke media SMA baru untuk isolasi
sampai didapat mikrob koloni tunggal. Koloni
tunggal yang dihasilkan kemudian disimpan
dalam gliserol 15% sebagai stok bakteri untuk
pengujian selanjutnya.
Produksi Protease. Sebanyak 2 ose
bakteri diambil dari stok bakteri, lalu
ditumbuhkan ke dalam 25 ml media LB steril
yang telah ditambahkan 10 ml susu skim
steril. Inkubasi selama 2 hari pada suhu 37ºC
pada inkubator goyang dengan kecepatan 180
g. Media produksi yang telah mengandung
protease kemudian disentrifugasi dengan
kecepatan 7500 g selama 15 menit pada suhu
4ºC. Supernatan yang diperoleh merupakan
ekstrak enzim kasar. Diagram alir penelitian
secara lengkap terdapat pada Lampiran 1.
Pemurnian Enzim
Ekstrak enzim kasar dipresipitasi dengan
garam amonium sulfat sampai dicapai kondisi
optimum, lalu didialisis dengan menggunakan
kolom PD-10 untuk menghilangkan pengaruh
garam. Hasil dialisat (eluat enzim) digunakan
untuk pencirian lebih lanjut.
Analisis Aktivitas Protase dan Kadar
Protein
Aktivitas protase secara kuantitatif diukur
dengan modifikasi metode Bergmeyer dan
Grassl (1983) dengan menggunakan substrat
kasein Hammarsten (2% b/v). Tedapat tiga
perlakuan analisis yang dilakukan, yaitu
blanko, standar, dan sampel. Larutan enzim
yang sudah dipanaskan pada suhu dan waktu
inkubasi tertentu (yang menghasilkan aktivitas
maksimum) ditambahkan ke dalam tabung
ependrof yang berisi 250 µl 50 mM bufer
universal pH 7. Perlakuan pada blanko dan
standar, enzim digantikan dengan akuades dan
tirosine 5 mM.
Larutan diinkubasi pada variasi suhu 50ºC
selama 10 menit ( suhu dan waktu inkubasi
optimum enzim). Reaksi hidrolisis dihentikan
dengan cara penambahan 500 µl TCA 0.1 M.
Pada blanko dan standar ditambahkan 50 µl
larutan enzim, sedangkan pada sampel

ditambahkan 50 µl akuades, kemudian larutan
diinkubasi kembali pada suhu 37ºC selama 10
menit, dilanjutkan dengan sentrifugasi pada
kecepatan 6000 g dan suhu 4ºC selama 10
menit.
Supernatan sebanyak 375 µl ditambahkan
ke dalam tabung berisi 1.25 ml Na2CO3 0.4 M
dan pereaksi Folin Ciocalteau, lalu diinkubasi
kembali pada suhu 37ºC selama 20 menit.
Absorbans larutan diukur pada panjang
gelombang 578 nm.
Analisis Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan metode
Bradford (1976), menggunakan bovine serum
albumin (BSA) sebagai standar protein.
Sebanyak 100 µl enzim ditambahkan ke
dalam tabung yang berisi 1 ml akuades dan 1
ml pereaksi Bradford. Perlakuan pada blanko,
larutan enzim diganti dengan akuades.
Selamjutnya larutan tersebut divorteks dan
didiamkan selama 20 menit pada suhu ruang.
Absorbans larutan diukur pada panjang
gelombang 595 nm.
Larutan enzim pada kurva standar protein
diganti dengan BSA Fraktion V dengan
kisaran konsentrasi 0-250 µg/ml. Konsentrasi
protein larutan enzim ditentukan berdasarkan
persamaan garis linier hubungan antara
konsentrasi standar protein dan absorbans.
Kurva standar protein terlihat pada Lampiran
6.
Pencirian Enzim
Pencirian enzim protease diuji secara
kuantitatif dengan metode spektrofotometri
(Bregmeyer 1983), yang meliputi pengaruh
suhu dan waktu stabilitasnya, pengaruh pH
optimum, pengaruh inhibitor, pengaruh ion
logam, kinetika enzim, uji kualitatif dengan
uji SDS-PAGE, dan zimografi.
Pengaruh enzim terhadap suhu.
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan
uji aktivitas enzim pada berbagai suhu (3080ºC) dalam bufer universal pH 7.0.
Pengaruh enzim terhadap pH. Optimasi
pH enzim dilakukan pada suhu optimum
dengan cara analisis aktivitas enzim dengan
menggunakan bufer universal pH 2-12.
Pengaruh inhibitor. Pengaruh aktivitas
protease terhadap penambahan inhibitor
ditentukan dengan cara inkubasi 100 µl enzim
dan 100 µl larutan inhibitor dengan
konsentrasi akhir 5 mM selama satu jam pada
suhu ruang, lalu dianalisis aktivitas residunya

6

secara kuantitatif. Inhibitor yang digunakan,
yaitu PMSF, EDTA, TLCK, dan STI.
Pengaruh ion logam. Pengaruh aktivitas
protease terhadap ion logam dilakukan dengan
cara inkubasi 100 µl enzim dan 100 µl larutan
ion logam dengan konsentrasi akhir 5 mM
selama satu jam pada suhu ruang, lalu diuji
aktivitas residunya secara kuantitatif. Logam
yang digunakan, yaitu KCl, NaCl, CaCl2,
MgCl2, dan ZnCl2.
Kinetika enzim. Analisis Km dan Vmaks
dilakukan pada suhu dan pH optimum dengan
berbagai variasi konsentrasi kasein (0.1, 0.5,
1.0, 1.5, dan 2.0)% b/v, lalu dianalisis
aktivitas residunya secara kuantitatif.

diperoleh pita protein biru dengan latar gel
bening. Sementara pada zimografi, setelah
elektroforesis, gel didenaturasi terlebih dahulu
dalam larutan Triton X-100 2.5% v/v sambil
digoyang selama 1 jam. Kemudian gel
didigesti dalam 50 mM bufer universal pH 7
dan suhu 50ºC (kondisi suhu dan pH optimum
enzim) selama 30 menit. Gel diwarnai dengan
larutan pewarna (coomassie brilliant blue R250) selama 15 menit. Pelunturan warna gel
dilakukan dengan larutan peluntur berulang
kali sampai diperoleh pita enzim proteolitik
putih dengan latar gel biru.
Tabel 2 Komposisi gel pemisah dan gel
penahan SDS-PAGE dan zimografi

Analisis SDS-PAGE dan Zimogran
Elektriforesis gel poliakrilamida yang
dikombinasikan dengan suatu deterjen soduim
dodesil sulfat (SDS) digunakan untuk
memisahkan dan meneliti jumlah dan ukuran
(bobot molekul) rantai protein dan rantai
subunit protein. Zimografi merupakan salah
satu teknik elektroforesis yang bertujuan
untuk mendeteksi aktivitas enzim proteolitik
secara langsung.
Tahapan kerja yang dilakukan dalam
analisis SDS-PAGE dan zimografi meliputi
penyiapan gel pemisah dan penahan, preparasi
sampel dan loading, kondisi running,
pewarnaan gel, dan pelunturan warna.
Penyaipan gel pemisah dan penahan.
Pembuatan gel pemisah 15% dan gel penahan
4% untuk SDS-PAGE dan zimografi
dilakukan dengan komposisi yang tertera pada
Tabel 2.
Preparasi sampel dan loading. Khusus SDSPAGE, 20 µl sampel ditambahkan dengan 5 µl
bufer sampel yang mengandung 2merkaptoetanol, lalu dipanaskan pada suhu
100ºC selama 3-5 menit. Sampel pada
zimografi dilarutkan dalam bufer sampel yang
tidak mengandung 2-merkaptoetanol dan tidak
mengalami perlakuan pemanasan. Tiap
sampel diinjeksikan ke dalam sumur gel
dengan kisaran volume 10-20 µl, sedangkan
volume marker LMW yang digunakan
sebanyak 5 µl.
Kondisi running, pewarnaan, dan
pelenturan warna. Gel dijalankan pada
tegangan 100 V selama 1.5 jam dalam bufer
elektoforesis. Pada SDS-PAGE, setelah
elektroforesis, gel langsung diwarnai dengan
menggunakan larutan pewarna (coomassie
brilliant blue R-250) selama 15 menit.
Pelenturan warna pada gel dilakukan dengan
larutan peluntur berulang kali sampai

Pereaksi
Larutan A
Larutan B
Larutan C
Susbtrat
Akuades
Amonium
persulfat
TEMED
Total

Gel pemisah 15%
(ml)
SDSZimografi
PAGE

Gel
penahan
4% (ml)

2.50 ml
1.25 ml
1.25 ml
100 µl

2.50 ml
1.25 ml
1.00 ml
0.25 ml
100 µl

0.67 ml
1.25 ml
3.00 ml
50 µl

10 µl
5.00

10 µl
5.00

5 µl
5.00

HASIL DAN PEMBAHASAN
Seleksi isolat bakteri proteolitik
Hasil penapisan bakteri nato diperoleh
empat isolat terpilih yang secara konsisten
membentuk zona bening pada medium SMA
yang diberi kode NA1, NA2, NA3, dan NA4.
NA4 merupakan isolat yang digunakan pada
penelitian ini berdasarkan aktivitas protease
dan kadar proteinnya yang lebih tinggi
dibandingkan dengan isolat lainnya, yaitu
0.2263 U/ml dan 0.1212 mg/ml seperti terlihat
pada Lampiran 4 dan 5.
Produksi protease dilakukan pada media
LB. Enzim yang telah dihasilkan oleh bakteri
dipisahkan
dari
sel
bakteri
dengan
menggunakan sentrifugasi. Melalui teknik ini,
sel akan mengendap oleh adanya gaya
gravutasi sedangkan enzim tetap terdapat pada
supernatan. Sentrifugasi dilakukan pada suhu
rendah untuk mencegah terjadinya kerusakan
struktur enzim.
Gambar 2 menunjukkan isolat NA4, dari
gambar terlihat isolat NA4 memiliki suatu

7

lingkaran zona bening di sekeliling koloni
mikrobnya pada media skim milk agar (SMA)
suhu 37ºC, sehingga dapat digunakan sebagai
sumber produksi enzim.

kasar dengan aktivitas 0.2263 U/ml. Aktivitas
protease tertinggi terdapat pada dialisat, yaitu
0.3516 U/ml dengan tingkat kemurnian 1.85
kali dibanding protease kasar.
Penentuan suhu optimum

Pemurnian Enzim

0.4

0.4

protease kasar (U/ml)
dialisat (U/ml)

0.3

0.3

0.2

0.2

0.1

0.1

0

0
37

50

70

Aktivitas dialsiat (U/ml)

Tahap awal pemurnian enzim ialah
dilakukan presipitasi pada ekstrak kasar
protease menggunakan amonium sulfat.
Konsentrasi amonium sulfat yang digunakan
ialah 75%, karena pada konsentrasi tersebut
memberikan kadar protein terendah pada
supernatan dan aktivitas tertinggi pada pelet,
yaitu 0.1314 mg/ml, dan 0.367 U/ml
(Lampiran 5). Pengaruh garam pada protein
enzim dari hasil presipitasi dihilangkan
dengan cara dialisis nitroselulosa asetat (cutoff 10 kD).
Pengukuran aktivitas protease pada
penelitian
ini
menggunakan
metode
Bergmeyer (1983). Prinsip kerja metode ini
ialah kasein akan terhidrolisis oleh protease
dengan bantuan air menjadi peptida dan asam
amino. Laju pembentukan peptida dan asam
amino tersebut dapat dijadikan tolak ukur
aktivitas katalisis protease. Asam amino yang
terbentuk harus dipisahkan dari substrat yang
tidak terhidrolisis. Umumnya pemisahan ini
dilakukan
dengan
penambahan
TCA
(trichloroacetic acid). Penambahan TCA
tersebut
menyebabkan
produk
yang
mengandung peptida dan asam amino akan
larut dalam TCA, sedangkan protein yang
terhidrolisis akan mengendap. Penambahan
TCA ini sekaligus akan menginaktifkan enzim
protease. Penambahan Na2CO3 bertujuan
mendapatkan pH sekitar 11.5 yang merupakan
optimum untuk intensitas dan stabilitas warna.
Warna yang terbentuk diukur absorbansnya
pada daerah sinar tampak 578 nm. Besarnya
serapan berbanding lurus dengan konsentrasi
protein yang terhidrolisis.
Aktivitas enzim protease meningkat pada
berbagai tahap pemurnian (Lampiran 8).
Aktivitas enzim protease terendah terdapat
pada crude yang merupakan enzim protease

Aktivitas protease kasar
(U/ml)

Gambar 2 Pertumbuhan isolat NA4 pada suhu
37ºC.

Umumnya setiap enzim memiliki aktivitas
maksimum pada suhu tertentu, aktivitas enzim
akan
semakin
meningkat
dengan
bertambahnya suhu hingga suhu optimum
tercapai. Setelah itu kenaikan suhu lebih lanjut
akan menyebabkan aktivitas enzim menurun.
Gambar 3 menunjukkan pengaruh suhu
terhadap enzim protease natto pada ekstrak
enzim kasar dan dialisat. Aktivitas protease
kasar nato mencapai optimum pada suhu 70ºC
dalam 50 mM bufer fosfat pH 7 dengan nilai
0.2669 U/ml, sedangkan suhu optimum
dialisat dicapai pada suhu 50ºC (Lampiran 9).

80

Suhu (C)

Gambar 3 Pengaruh suhu terhadap aktivitas
enzim protease nato.
Perbedaan suhu optimum antara dialisat
dan ekstrak enzim kasar ini disebabkan karena
pada ekstrak enzim kasar masih terdapat
biomolekul lain selain protein atau
kontaminan-kontaminan
yang
ikut
mempengaruhi aktivitas enzim sehingga suhu
optimum yang dicapai lebih tinggi dibanding
dialisat. Suhu di bawah suhu optimum
aktivitas enzimnya rendah, hal ini disebabkan
oleh rendahnya energi aktivasi yang tersedia.
Aktivitas enzim mencapai kondisi yang
maksimum saat suhu optimum ketika energi
kinetik enzim dan substrat mencapai titik
untuk bereaksi secara sempurna. Ketika suhu
dinaikkan lagi di atas suhu optimum enzim
terjadi penurunan aktivitas enzim karena
energi kinetika molekul-molekul enzim
menjadi demikian besar sehingga dapat
mempengaruhi struktur 3D disertai hilangnya
aktivitas hayati.
Suhu optimum enzim fibrinolitik dari
galur Bacillus sp. CK 11-4 yang diisolasi dari
chungkook-jang (makanan tradisional Korea

8

Penentuan pH optimum
Enzim merupakan protein yang memiliki
gugus amino dan karboksil pada molekulnya.
Seperti halnya protein, semua reaksi enzimatis
juga dipengaruhi pH sehingga diperlukan
bufer untuk mengontrol pH reaksi.
Gambar 4 memperlihatkan pengaruh pH
terhadap aktivitas enzim protease kasar dan
dialisat nato, pH optimum yang dicapai sama,
yaitu pada pH 4. Ketika pH 3 aktivitas enzim
masih kecil, yaitu 0.993 U/ml untuk ekstrak
enzim kasar (aktivitas relatif 30.26%), dan
0.221 U/ml untuk dialisat dengan aktivitas
relatif hanya mencapai 11.26% dari kondisi
optimum seperti terlihat pada Lampiran 10.
Aktivitas enzim yang kecil ini menunjukkan
gugus fungsional pada sisi aktif enzim
terganggu dengan adanya ion H+ yang
berlebihan pada pH 3. Saat pH 4 enzim
mencapai tingkat ionisasi yang diinginkan
enzim sehingga aktivitas enzim mencapai
maksimum. Sedangkan pada pH 5 sampai pH
7 aktivitas enzim mengalami penurunan
sedikit (nilai aktivitas relatif yang tersisa lebih
dari 60%) sehubungan dengan perubahan
ionisasi gugus-gugus fungsionalnya karena
pada hakekatnya enzim adalah protein yang
tersusun atas asam amino yang dapat

mengadakan
ionisasi
(mengikat)
dan
melepaskan proton atau ion hidrogen pada
gugus amino, karboksil dan gugus fungsional
lainnya. Pada pH 10 aktivitas enzim
mengalami penurunan yang ekstrim, aktivitas
relatif yang tersisa 8.78% untuk protease kasar
dan 31.60% untuk dialisat, hal ini disebabkan
karena ion OH- yang berlebihan.

A k tiv ita s p r o te a s e
k a s a r (U /m l )

0.5

0.4

protease kasar (U/ml)
dialisat (U/ml)

0.4

0.3

0.3

0.2

0.2

0.1

0.1
0

A k ti v i ta s d i a l i s a t
(U /m l)

hasil fermentasi kedelai) ialah 70ºC (Kim et
al. 1996). Penelitian lain yang dilakukan
Chantawannakul et al. (2001) melaporkan
suhu optimum protease fibrinolitk dari strain
Bacillus 38 isolat fermentasi kedelai asal
Thailand dicapai pada suhu 47ºC.
Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis
dengan dua cara. Pertama, kenaikan suhu akan
meningkatkan energi molekul substrat dan
pada akhirnya meningkatkan laju reaksi
enzim. Peningkatan suhu juga berpengaruh
terhadap perubahan konformasi substrat
sehingga sisi aktif substrat mengalami
hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim
dan menyebabkan turunnya aktivitas enzim.
Kedua, peningkatan energi termal molekul
yang membentuk struktur protein enzim itu
sendiri akan menyebabkan rusaknya interaksiinteraksi nonkovalen (ikatan hidrogen, ikatan
van der Waals, ikatan hidrofobik, dan
interaksi elektrostatik) yang menjaga struktur
3D enzim secara bersama-sama sehingga
enzim mengalami denaturasi. Denaturasi
menyebabkan
struktur
lipatan
enzim
membuka pada bagian permukaannya
sehingga sisi aktif enzim berubah dan terjadi
penurunan aktivitas enzim (Hames dan
Hooper 2000).

0
3

4

5

6

7

10

pH

Gambar 4 Pengaruh pH terhadap aktivitas
enzim protease nato.
Hasil uji fibrinolitik pH optimum dari
protease dari strain Bacillus sp. CK 11-4 yang
diisolasi dari chungkook-jang (makanan
tradisional Korea hasil fermentasi kedelai)
didapatkan pada pH 6.5 (Kim et al. 1996).
Chantawannakul et al. (2001) melaporkan pH
optimum protease fibrinolitk dari galur
Bacillus 38 isolat fermentasi kedelai asal
Thailand dicapai pada pH 10.5.
Pengaruh ion logam
Beberapa enzim membutuhkan ion logam
sebagai kofaktor untuk mendukung efisiensi
katalitik enzim. Logam tersebut membantu
reaksi katalitik dengan cara mengikat substrat
pada sisi pemotongan. Selain berperan dalam
pengikatan antara enzim dengan substrat,
beberapa logam juga dapat mengikat enzim
secara
langsung
untuk
menstabilkan
konformasi aktifnya atau menginduksi
formasi situs pengikatan atau situs aktif suatu
enzim (Devlin 1982).
Gambar 5 memperlihatkan bahwa
aktivator kuat untuk protease nato adalah K+
dan Zn2+ pada konsentrasi akhir 5 mM mampu
meningkatkan aktivitas katalitik protease
natto. Pada ekstrak kasar dan dialisat nato,
keberadaan ion K+ meningkatkan aktivitas
protease 1.28 kali lipat dari kontrol yaitu dari
0.3478 U/ml menjadi 0.5079 U/ml (Lampiran
12). Demikian juga ion Zn2+ yang
meningkatkan aktivitas protease ekastrak
enzim kasar 1,21 kali lipat dari kontrol. Ca2+
dan Na2+ merupakan inhibitor kuat terhadap

9

A k tiv ita s r e s id u (% )

protease kasar dan dialisat nato karena ion
logam tersebut mampu menghambat aktivitas
enzim hingga aktivitas residu yang tersisa
kurang dari 25%.

160
140

protease kasar(%)

dialisat (%)

120
100
80
60
40
20
0
Kontrol

K

Na

Ca

Mg

Zn

dialisis,
molekul-molekul
kecil
yang
berukuran