ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI Actinomycetes ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU

ABSTRAK

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI Actinomycetes ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU

Oleh

Riki Eriyanti Andini

Pada penelitian ini, enzim protease diisolasi dari actinomycetes isolat lumpur hutan bakau. Produksi enzim ini dilakukan dalam media fermentasi Mineral Salt Medium yang mengandung skim milk sebanyak 2% selama 120 jam. Sentrifugasi pada suhu 4ºC dengan laju kecepatan 3500 rpm selama 30 menit menghasilkan ekstrak kasar enzim. Ekstrak kasar enzim dimurnikan dengan pengendapan terfraksi menggunakan garam ammonium sulfat dan didialisis dengan membran semipermeabel. Aktivitas protease di uji dengan menggunakan metode Kunitz termodifikasi dan kadar protein dengan metode Lowry.

Proses pemurnian meningkatkan aktivitas unit enzim sebesar 1,002 U/mL, kadar protein 0,723 mg/mL, aktivitas spesifik 1,386 U/mg pada ekstrak kasar enzim menjadi 8,78 U/mL, kadar protein 1,04 mg/mL, aktivitas spesifik 8,44 U/mg pada fraksi ammonium sulfat dengan tingkat kemurnian 6,08 kali.

Enzim protease hasil isolasi dan pemurnian mempunyai aktivitas tertinggi pada kondisi pH 7, temperatur 50º C, dan waktu inkubasi 60 menit. Nilai Km dan Vm enzim protease hasil isolasi adalah 8,0867 mg/mL dan 0,5560 µmol/mL · menit

II. TINJAUAN PUSTAKA

A. Hutan Bakau

Lautan Indonesia adalah bagian dari wilayah Indopasifik yang merupakan salah satu pusat keanekaragaman biota laut terbesar di dunia. Sumber biota laut tersebut merupakan aset potensial yang dapat didayagunakan menjadi aneka produk termasuk diantaranya farmasi. Jenis biota laut di daerah tropis Indonesia diperkirakan 2-3 kali lebih besar dibandingkan dengan biota laut di daerah subtropis dan daerah beriklim dingin (Van Soest, 1994).

Hutan bakau atau disebut juga hutan mangrove adalah hutan yang tumbuh di atas rawa-rawa berair payau yang terletak pada garis pantai dan dipengaruhi oleh pasang-surut air laut. Hutan ini tumbuh khususnya di tempat-tempat di mana ter-jadi pelumpuran dan akumulasi bahan organik. Baik di teluk-teluk yang terlin-dung dari gempuran ombak, maupun di sekitar muara sungai di mana air melam-bat dan mengendapkan lumpur yang dibawanya dari hulu (Irwanto, 2007).

Ekosistem hutan bakau bersifat khas, baik karena adanya pelumpuran yang mengakibatkan kurangnya abrasi tanah, salinitas tanahnya yang tinggi, serta mengalami daur penggenangan oleh pasang-surut air laut. Hanya sedikit jenis tumbuhan yang bertahan hidup di tempat semacam ini, dan jenis-jenis ini keba-

nyakan bersifat khas hutan bakau karena telah melewati proses adaptasi dan evolusi. Hutan-hutan bakau menyebar luas di bagian yang cukup panas di dunia, terutama di sekeliling khatulistiwa di wilayah tropika dan sedikit di subtropika. Luas hutan bakau Indonesia antara 2,5 hingga 4,5 juta hektar, merupakan mangrove yang terluas di dunia melebihi Brazil (1,3 juta ha), Nigeria (1,1 juta ha) dan Australia (0,97 ha) (Spalding at al., 1997 dalam Noor at al., 1999).

B. Mikroorganisme

Mikroorganisme merupakan jasad hidup yang mempunyai ukuran sangat kecil (Kusnadi dkk., 2003). Setiap sel tunggal mikroorganisme memiliki kemampuan untuk melangsungkan aktivitas kehidupan antara lain dapat mengalami pertumbuhan, menghasilkan energi dan bereproduksi dengan sendirinya. Mikroorganisme memiliki fleksibilitas metabolisme yang tinggi karena mikroorganisme ini harus mempunyai kemampuan menyesuaikan diri yang besar sehingga apabila ada interaksi yang tinggi dengan lingkungan menyebabkan terjadinya konversi zat yang tinggi pula. Mikroorganisme ini juga tidak memerlukan tempat yang besar, mudah ditumbuhkan dalam media buatan, dan tingkat pembiakannya relatif cepat (Darkuni, 2001). Oleh karena aktivitasnya tersebut, maka setiap mikroorganisme memiliki peranan dalam kehidupan, baik yang merugikan maupun yang menguntungkan.

1. Sel

Sel merupakan satuan struktural yang fundamental dan fungsional bagi kehidupan. Sel merupakan kerangka alamiah dari hampir semua reaksi biokimia.

Reaksi-reaksi biokimia pada sel hidup berlangsung dalam ukuran yang sangat kecil dari sel hidup atau bagiannya, dengan dinding yang rapuh dan tebalnya hanya beberapa molekul (Michael et al., 2008). Terdapat dua kelas utama sel, yaitu sel prokariot dan sel eukariot (Albert et al., 1994). Sel prokariot memiliki struktur yang sederhana, pertumbuhan sel yang mudah dan cepat, serta mekanisme yang relatif sederhana dalam proses reproduksi. Sel prokariot bereproduksi dengan cara aseksual yang sangat sederhana. Organisme ini tumbuh hingga ukurannya berlipat ganda, lalu membelah diri menjadi sel anak yang identik (Lehninger, 1988). Dalam keadaan optimum, sel prokariot tunggal dapat membelah diri setiap 20 menit dan karena itu dapat mencapai jumlah 5 miliar sel dalam waktu kurang dari 11 jam(Albert et al., 1994). Sel eukariot merupakan divisi terbesar dari organisme yang hidup, yaitu seluruh organisme yang ada di bumi, termasuk hewan, tumbuhan, fungi, dan protozoa. Pada sel eukariot nukleus dan sitoplasma terdapat sebagai dua kompartemen yang terpisah oleh membran inti (Wolfe, 1993).

2. Bakteri

Bakteri berasal dari kata Latin bacterium (jamak, bacteria) merupakan kelompok terbesar dari organisme hidup. Bakteri berukuran sangatlah kecil (mikroskopik) dan kebanyakan uniselular (bersel tunggal), dengan struktur sel yang relatif sederhana tanpa inti sel, cytoskeleton, dan organel lain seperti mitokondria dan kloroplas. Bakteri adalah yang paling berkelimpahan dari semua organisme. Bakteri tersebar di mana-mana seperti di tanah, air, dan dapat bersifat simbiosis dari organisme lain. Banyak patogen merupakan bakteri. Kebanyakan bakteri

biasanya hanya berukuran 0,5-5 μm, meski ada jenis yang dapat menjangkau 0,3 mm dalam diameter (Thiomargarita). Bakteri umumnya memiliki dinding sel, seperti sel hewan dan jamur, tetapi dengan komposisi sangat berbeda (peptido-glikan). Bakteri berukuran sangat kecil dan dapat berkembang biak dengan cepat, cukup dengan cara membelah diri. Kemampuan bakteri untuk membelah dengan cepat memungkinkan populasi bakteri dapat segera menyesuaikan diri terhadap perubahan-perubahan dalam lingkungannya. Banyak bakteri yang bergerak menggunakan flagela, yang berbeda dalam strukturnya dari flagela kelompok lain. (Albert et. al., 1994).

Bakteri merupakan prokariot, dan berdasarkan bentuknya, bakteri dibagi menjadi tiga golongan besar, yaitu:

a. Kokus (Coccus) dalah bakteri yang berbentuk bulat seperti bola, dan mem-punyai beberapa variasi sebagai berikut:

o Mikrococcus, jika kecil dan tunggal o Diplococcus, jka bergandanya dua-dua

o Tetracoccus, jika bergandengan empat dan membentuk bujur sangkar o Sarcina, jika bergerombol membentuk kubus

o Staphylococcus, jika bergerombol

o Streptococcus, jika bergandengan membentuk rantai

b. Basil (Bacillus) adalah kelompok bakteri yang berbentuk batang atau silinder, dan mempunyai variasi sebagai berikut:

o Streptobacillus, jika bergandengan membentuk rantai

c. Spiril (Spirilum) adalah bakteri yang berbentuk lengkung dan mempunyai variasi sebagai berikut:

o Vibrio (bentuk koma), jika lengkung kurang dari setengah lingkaran o Spiral, jika lengkung lebih dari setengah lingkaran

Gambar 1. Bentuk-bentuk sel bakteri (Davidson, 2007)

Bentuk tubuh/morfologi bakteri dipengaruhi oleh keadaan lingkungan, medium dan usia. Oleh karena itu untuk membandingkan bentuk serta ukuran bakteri, kondisinya harus sama. Pada umumnya bakteri yang usianya lebih muda ukurannya relatif lebih besar daripada yang sudah tua (Michael et al, 2008).

Adaptasi bakteri pada lingkungan termal memiliki peranan yang sangat penting dalam penelitian dan pembelajaran teori adaptasi dalam biologi evolusioner (Crill et al, 1996). Temperatur merupakan kunci variabel lingkungan, karena temperatur dapat mempengaruhi pengaturan hampir seluruh laju proses fisiologis dan oleh karena itu mempengaruhi faktor-faktor biologis seperti pertumbuhan dan reproduksi (Bronikowski, 2001).

C. Actinomycetes

Actinomycetes adalah istilah yang digunakan untuk menunjukkan organisme jenis actinomycetales, subdivison utama dari Prokariot, yang terdiri dari semua organisme dengan sel prokariotik. Berbeda dengan organisme yang lain (Protista, Fungi, Plantae dan Animalia) yang semua memiliki sel eukariotik.

Actinomycetes dibagi menjadi tiga yaitu:

a. Actinomyceteae terdiri dari dua genus: Actinomyces dan Nocardia. Beberapa spesies bersifat patogen. A. Israeli menyebabkan actinomycosis dalam manusia, A. bovis pada sapi.

b. Mycobacteriaceae memiliki satu genus, Mycobacterium, yang berisi beberapa spesies patogen menyebabkan penyakit-penyakit seperti kusta dan TBC. c. Streptomyceteae terdiri dari beberapa organisme yang ditemukan di dalam

tanah. Mereka jarang patogen. Sebaliknya, beberapa spesies dari genus Streptomyces menghasilkan antibiotik. Erythromycin dihasilkan oleh Streptomyces erythreus, streptomisin oleh S. griseus, aureomycin oleh S. Aureofaciens, oleandomycin oleh S. Antibioticus, spiramycin oleh S. Ambofaciens.

Actinomycetes memiliki sifat antara bakteri dan fungi. Actinomycetes adalah bentuk fungi, seperti bakteri yang terbentuk panjang, benang filamen bercabang-cabang seperti yang terlihat seperti jaring laba-laba abu-abu. Actinomycetes adalah dekomposer utama dari bahan tanaman keras seperti kulit kayu, koran dan batang kayu.

Gambar 2. Isolat Actinomycetes pada media ISP-2

Pada medium cair, pertumbuhan actinomycetes ditandai dengan keruhnya medium dan terbentuk lapisan tipis di permukaan medium. Menurut Rao (1994), pada lempeng agar, actinomycetes dapat dibedakan dengan mudah dari bakteri, dimana koloni bakteri tumbuh dengan cepat dan berlendir, sedangkan actinomycetes muncul perlahan dan berbubuk serta melekat erat pada permukaan agar, seperti terlihat pada Gambar 1 dimana isolat actinomycetes ditumbuhkan pada agar plate dalam media ISP-2. Rentang pH dan temperatur yang cocok untuk pertumbuhan actinomycetes ini sekitar 6,5 – 8,0 dan 25 – 300C. Namun, ada beberapa actinomycetes termofilik yang dapat tumbuh pada temperatur sekitar 55 – 65oC seperti Thermoactinomycetes dan Streptomycetes.

D. Enzim

Enzim adalah biokatalis yang dihasilkan oleh jaringan yang meningkatkan laju reaksi kimia yang berlangsung di jaringan (Montegomery, 1993). Enzim merupakan unit fungsional dari metabolisme sel. Bekerja dengan urutan-urutan teratur, enzim mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang mengubah kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel (Lehninger, 1988). Berdasarkan strukturnya, enzim terdiri atas komponen yang disebut apoenzim yang berupa protein dan komponen lain yang disebut gugus prostetik yang berupa nonprotein. Gugus prostetik dibedakan menjadi koenzim dan kofaktor. Koenzim berupa gugus organik yang pada umumnya merupakan vitamin, seperti vitamin B1, B2, NAD+ (Nicotinamide Adenine Dinucleotide). Kofaktor berupa gugus anorganik yang biasanya berupa ion-ion logam, seperti Cu2+, Mg2+, dan Fe2+. Beberapa jenis vitamin seperti kelompok vitamin B merupakan koenzim. Jadi, enzim yang utuh tersusun atas bagian protein yang aktif yang disebut apoenzim dan koenzim, yang bersatu dan kemudian disebut holoenzim (Rahayu, 1990).

1. Penggolongan Enzim

Suatu dasar penemuan dan penggolongan enzim secara sistematis telah dikemukakan oleh persetujuan Internasional. Sistem ini menempatkan semua enzim ke dalam enam kelas utama, masing-masing dengan subkelas, berdasarkan atas jenis reaksi yang dikatalisis. Klasifikasi Internasional dari enzim akan disebutkan berikut ini (Montegomery, 1993) :

1. Oksidoreduktase, enzim-enzim yang mengkatalisis berbagai macam reaksi oksidasi-reduksi.

2. Transferase, merupakan kelompok enzim yang mengkatalisis reaksi pe- mindahan berbagai gugus seperti amino, karboksil, karbonil, metil, asil, glikosil, atau fosforil.

3. Hidrolase, merupakan kelompok enzim yang mengkatalisis pemutusan ikatan antara karbon dengan atom lain sambil mengikat molekul air. 4. Liase, merupakan kelompok enzim yang mengkatalisis pemecahan ikatan

antara karbon dengan karbon, karbon dengan belerang serta beberapa jenis ikatan antara karbon dengan nitrogen (tidak termasuk ikatan peptida). 5. Isomerase, merupakan kelompok enzim yang mengkatalisis reaksi

rasemisasi isomer optik atau geometrik dan reaksi-reaksi oksidasi-reduksi intramolekular tertentu. Namun trivial dari enzim-enzim yang termasuk kelas ini antara lain adalah epimirase, rasemase, dan mutase.

6. Ligase, merupakan kelompok enzim yang mengkatalisis pembentukan ikatan antara karbon dengan oksigen, belerang, nitrogen, dan atom-atom lain.

2. Fungsi dan Cara Kerja Enzim

Enzim adalah satu atau beberapa gugus polipeptida (protein) yang berfungsi sebagai katalis (senyawa yang mempercepat proses reaksi tanpa habis bereaksi) dalam suatu reaksi kimia. Dimana suatu enzim dapat mempercepat reaksi 108 sampai 1011 kali lebih cepat daripada reaksi tersebut dilakukan tanpa katalis.

Seperti katalis lainnya enzim dapat menurunkan energi aktivasi suatu reaksi kimia.

Saat berlangsungnya reaksi enzimatik terjadi ikatan sementara antara enzim dengan substrat (reaktan). Ikatan sementara ini bersifat labil dan hanya untuk waktu yang singkat saja. Selanjutnya ikatan enzim-substrat akan pecah menjadi enzim dan hasil akhir. Enzim yang terlepas kembali setelah reaksi dapat berfungsi lagi sebagai biokatalisator untuk reaksi yang sama. Enzim bekerja dengan dua cara, yaitu menurut Teori Kunci-Gembok (Lock and Key Theory) dan Teori Kecocokan Induksi (Induced Fit Theory).

Gambar 3. Pembentukan kompleks enzim-substrat berdasarkan Teori Kunci-Gembok (Lock and Key Theory) dan Teori Kecocokan Induksi (Induced Fit Theory).

Menurut teori kunci-gembok, terjadinya reaksi antara substrat dengan enzim karena adanya kesesuaian bentuk ruang antara substrat dengan situs aktif (active site) dari enzim, sehingga sisi aktif enzim cenderung kaku. Substrat berperan sebagai kunci masuk ke dalam situs aktif, yang berperan sebagai gembok, sehingga terjadi kompleks substrat. Pada saat ikatan kompleks enzim-substrat terputus, produk hasil reaksi akan dilepas dan enzim akan kembali pada

konfigurasi semula. Berbeda dengan teori kunci gembok, menurut teori kecocokan induksi reaksi antara enzim dengan substrat berlangsung karena adanya induksi substrat terhadap situs aktif enzim sedemikian rupa sehingga keduanya merupakan struktur yang komplemen atau saling melengkapi. Menurut teori ini situs aktif tidak bersifat kaku, tetapi lebih fleksibel (Murray, 1997).

3. Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Reaksi Enzimatik

Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi reaksi enzimatik, antara lain adalah:

1. Substrat (reaktan)

Kecepatan reaksi enzimatik umumnya dipengaruhi kadar substrat. Penambahan kadar substrat sampai jumlah tertentu dengan jumlah enzim yang tetap, akan mempercepat reaksi enzimatik sampai mencapai maksimum. Penambahan substrat selanjutnya tidak akan menambah kecepatan reaksi (Orten dan Neuhaus, 1970).

2. Suhu

Seperti reaksi kimia pada umumnya, maka reaksi enzimatik dipengaruhi oleh suhu. Kenaikan suhu sampai optimum akan diikuti pula oleh kenaikan kecepatan reaksi enzimatik. Kepekaan enzim terhadap suhu pada keadaan suhu melebihi optimum disebabkan terjadinya perubahan fisikokimia protein penyusun enzim. Umumnya enzim mengalami kerusakan (denaturasi) pada suhu diatas 50 oC (Wolfe, 1993).

3. Kemasaman (pH)

pH dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Daya katalisis enzim menjadi rendah pada pH rendah maupun tinggi, karena terjadi denaturasi protein enzim. Enzim mempunyai gugus aktif yang bermuatan positif (+) dan negatif (-). Aktivitas enzim akan optimum kalau terdapat keseimbangan antara kedua muatan. Pada keadaan asam cenderung bermuatan positif, dan pada keadaan basa cenderung bermuatan negatif, sehingga aktivitas enzim menjadi berkurang atau bahkan menjadi tidak aktif. pH optimum untuk masing-masing enzim tidak selalu sama (Orten dan Neuhaus, 1970).

4. Penghambat enzim (inhibitor)

Inhibitor enzim adalah zat atau senyawa yang dapat menghambat enzim. Ada beberapa cara penghambatan enzim, seperti penghambat secara bersaing (kompetitif), penghambat tidak bersaing (non-kompetitif), penghambat umpan balik (feed back inhibitor), dan penghambat alosterik (Wolfe, 1993). 5. Waktu Inkubasi

Waktu yang diperlukan oleh enzim untuk bereaksi secara optimum dengan produk tidaklah seragam, ada beberapa yang membutuhkan waktu yang lebih lama untuk bereaksi (Orten dan Neuhaus, 1970).

E. Protein

Protein berasal dari bahasa Yunani protos yang berarti "yang paling utama" merupakan senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen,

nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor (Wood. J. H et al, 1966). Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.

Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentuk hormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi orga-nisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).

Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekul yang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jöns Jakob Berzelius pada tahun 1838.

Biosintesis protein alami sama dengan ekspresi genetik. Kode genetik yang dibawa DNA ditranskripsi menjadi RNA, yang berperan sebagai cetakan bagi translasi yang dilakukan ribosom. Sampai tahap ini, protein masih "mentah", hanya tersusun dari asam amino proteinogenik. Melalui mekanisme pascatranslasi, terbentuklah protein yang memiliki fungsi penuh secara biologi.

Struktur protein dapat berupa struktur primer (tingkat satu), sekunder (tingkat dua), tersier (tingkat tiga), dan kuartener (tingkat empat). Struktur primer protein merupakan urutan asam amino penyusun protein yang dihubungkan melalui ikatan peptida (amida). Sementara itu, struktur sekunder protein adalah struktur tiga

dimensi lokal dari berbagai rangkaian asam amino pada protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen. Gabungan dari aneka ragam dari struktur sekunder akan menghasilkan struktur tiga dimensi yang dinamakan struktur tersier. Struktur tersier biasanya berupa gumpalan. Beberapa molekul protein dapat berinteraksi secara fisik tanpa ikatan kovalen membentuk oligomer yang stabil (misalnya dimer, trimer, atau kuartomer) dan membentuk struktur kuartener.

Gambar 4. Struktur tersier protein. Protein ini memiliki banyak struktur sekunder beta-sheet dan alpha-helix yang sangat pendek

F. Protease

Protease adalah enzim yang dapat menghidrolisis protein menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana seperti peptida kecil dan asam amino. Berdasarkan International Union of Biochemistry (IUB) protease merupakan enzim kelas 3, hidrolase, dan subkelas 3.4, peptida hidrolase atau peptidase (Boynom dan Bond, 1989). Berdasarkan cara pemotongan ikatan peptida, enzim protease dapat dibagi menjadi eksopeptidase dan endopeptodase. Eksopeptidase terdiri atas karboksil eksopeptidase yang memo-tong peptida dari arah gugus karboksil terminal dan

amino-ekso-peptidase dari gugus amino terminal, sedang endopeptidase memecah ikatan peptida dari dalam (Bergmann, 1942; Mubarik et al., 2000).

Menurut Harley (1960) dalam Winarno (1986), endopeptidase dapat dibedakan berdasarkan gugus reaktif pada sisi aktif yang terlibat dalam katalisis, menjadi:

a. Protease serin, artinya memiliki residu dalam lokasi aktifnya.

b. Protease Sulfhidril, artinya mempunyai residu sulfhidril pada lokasi aktifnya. Enzim ini dihambat oleh senyawa oksidator, senyawa yang menyebabkan suasana menjadi alkali, dan logam berat.

c. Protease metal, yaitu protease yang keaktifannya tergantung pada adanya metal per mol enzim. Metal tersebut dapat terdiri dari Mg, Zn, Co, Fe, Hg, Ni, dan sebagainya. Enzim tersebut dihambat oleh EDTA yang dapat mengkhelat metal sehingga keaktifan enzim hilang.

d. Protease asam, yaitu enzim yang pada lokasi aktifnya terdapat dua gugus karbonil. Keaktifannya dapat dihambat oleh p-bromofenasilbromida.

Penggunaan enzim protease dalam berbagai produk komersial semakin meluasnya sejalan dengan kemajuan dalam bidang bioteknologi. Protease dimanfaatkan dalam bidang industri antara lain dalam pengolahan pangan, penyamakan kulit, deterjen, dan pengolahan limbah cair. Aplikasi enzim protease untuk deterjen sudah dimulai sejak tahun 1959 oleh perusahaan Swiss Gebruder Schyner. Enzim ini mampu menghidrolisis kotoran yang berupa protein dan memecahnya menjadi polipeptida yang lebih larut atau asam amino. Enzim bekerjasama dengan komponen lain dalam detergen, sehingga menghasilkan cucian yang lebih bersih. Di Indonesia kebutuhan akan enzim protease juga semangkin meningkat namun

kebutuhan ini masih tergantung pada produksi impor. Salah satu cara mengantisipasi ketergantungan terhadap impor tersebut perlu ada usaha untuk memproduksi enzim protease (Daniel, 1979; Suhartono, 2000; Thomas, 1984). Enzim protease dapat diperoleh dari empat macam sumber, yaitu:

a) Tumbuhan, misalnya dari pepaya. b) Hewan, misalnya pankreas sapi. c) Bakteri, misalnya Bacillus subtilis.

d) Fungi, misalnya Aspergillus niger, Aspergilus flavus.

G. Isolasi dan Pemurnian Enzim

Proses isolasi enzim haruslah memperhatikan letak enzim tersebut. Ada dua macam letak enzim, yaitu enzim yang berada di dalam sel yang disebut dengan intraseluler dan enzim yang berada diluar sel yang disebut ekstraseluler. Proses isolasi enzim yang berada diluar sel lebih mudah dilakukan dibandingkan dengan isolasi enzim yang berada di dalam sel, hal ini dikarenakan tidak perlu memecah dinding sel untuk mengeluarkan enzimnya dan sel lebih mudah dipisahkan dari pengotornya (Gumbira, 1987). Tahap – tahap proses isolasi dan pemurniaan enzim yang paling dasar menurut Darwis dan Sukara (1990) serta Judoamijojo et al (1989) adalah sebagai berikut:

1. Lisis Dinding Sel

Proses ini bertujuan untuk mengeluarkan enzim dari sel atau konstituen seluler. Pada proses ini diperlukan pengrusakan atau penghancuran dinding sel secara fisik, mekanik atau kimiawi. Proses lisis ini dilakukan untuk mengeluarkan enzim intra seluler dari dalam sel. Pemecahan dinding sel secara kimia dilakukan

dengan beberapa cara, antara lain dengan perlakuan senyawa anorganik seperti asam atau basa kuat yang mampu melarutkan komponen dinding sel, dengan menggunakan enzim lisozim. Pemecahan dinding sel secara mekanik atau fisik dapat dilakukan dengan cara pembekuan atau pencairan, ultrasonifikasi, dan homogenasi.

2. Sentrifugasi (Pemusingan)

Molekul – molekul dengan berat molekul yang besar dapat mengendap dengan cepat bila disentrifugasi dengan kecepatan tinggi. Kecepatan pengendapan molekul bergantung pada beberapa faktor seperti besar molekul, bentuk molekul, dan viskositas larutan. Tetapi kecepatan pengendapan molekul tersebut sangat bergantung pada berat molekulnya.

3. Fraksinasi

Cara pemurnian enzim yang umum dilakukan adalah dengan proses pengendapan bertahap atau biasa disebut fraksinasi. Pengendapan protein yang sering dilakukan adalah dengan senyawa elektrolit menggunakan garam amonium sulfat, (NH4)2 SO 4. Penambahan senyawa ini menyebabkan menurunnya kelarutan

enzim tersebut, sehingga terbentuk endapan protein.

Garam amonium sulfat sering digunakan dalam pengendapan enzim dan protein, hal ini karena kebanyakan enzim tahan terhadap garam ini, memiliki daya pengendapan yang cukup besar, mempunyai efek penstabilan terhadap kebanyakan enzim (Soedigdo, 1988). Selain itu, garam amonium sulfat memiliki kelarutan besar dalam air, dapat diperoleh dalam bentuk yang sangat murni, dan murah (Reed et al, 1998). Penambahan fraksinya sebagai berikut: (0-20)% jenuh,

(20-40)% jenuh, (40-60)% jenuh, (60-80)% jenuh, (80-100)% jenuh. Pengendapan ini dikenal sebagai salting out.

4. Dialisis

Dialisis adalah suatu proses pemisahan molekul – molekul besar dari ion – ion sederhana dengan menggunakan membran berdasarkan difusi. Proses ini terjadi karena adanya perbedaan tekanan osmosa antara cairan yang ada di dalam membran dengan cairan yang ada di luar membran. Membran yang digunakan adalah kantung selofan berbentuk selang.

Proses dialisis secara garis besar adalah sebagai berikut: Sampel dimasukkan ke dalam larutan buffer. Molekul dengan berat molekul lebih kecil dari 20000 dalton dapat melewati membran, sedangkan molekul dengan berat molekul lebih besar akan tetap berada di dalam kantung selofan. Molekul –molekul kecil akan terdifusi keluar dari membran sampai tekanan osmosik antara sampel dan buffer yang digunakan telah seimbang. Sehingga buffer harus diganti beberapa kali agar semua ion dalam larutan dapat dihilangkan.

III. METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilaksanakan dari bulan November 2009 sampai dengan bulan Mei 2010 di Laboratorium Biomassa dan Laboratorium Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

B. Alat dan Bahan

Dalam penelitian ini alat-alat yang digunakan adalah microplate reader Hospitex Diagnostix, inkubator CO2 Memmert-Germany/INC-02, orbital shaker Wiggen

Hauser/OS150, autoclave Kleinfeld-Germany/HV-L25, centrifuge Hitachi/CF-46RX, laminar air flow ESCO/AVC4A1, water Bath Wiggen Hauser, jarum ose, pinset, lampu spiritus, mikropipet, magnetic stirer, timbangan, penangas air, lemari pendingin, kertas saring, termometer, cawan petri, dan peralatan gelas lainnya seperti labu erlenmeyer, gelas beker, labu takar, tabung reaksi, spatula, pipet tetes dan lain-lain.

Adapun bahan-bahan yang digunakan adalah media ISP-2 (yeast ekstrak, malt ekstrak, dekstrose, dan agar), gelatin, susu skim, air laut steril, kasein, mineral salt medium (NaCl, CaCl2, KH2PO4, MgSO4·7H2O ,FeSO4·7H2O), kantung

selofan, buffer pospat pH 7. Sumber enzim adalah isolat actinomycetes yang diperoleh dari lumpur hutan bakau Pantai Ringgung, Perairan Teluk Lampung.

C. Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Media dan Larutan Pereaksi

a. Pembuatan Media Pertumbuhan dan Peremajaan actinomycetes

1). Media ISP-2 untuk Peremajaan actinomycetes

Media ISP-2 terdiri dari 0,4% yeast extract; 1% malt extract; 0,4% dextrose dan 2,4% agar dilarutkan dalam air laut steril, lalu di sterilisasi selama 15 menit, pada 121ºC, 1 atm (Margavey, N. A., et al., 2004).

2). Pembuatan Mineral Salt Medium untuk Produksi Enzim

Mineral salt medium dibuat dengan cara (0,6% NaCl; 0,01% CaCl2; 0,01%

MgSO4·7H2O; 0,1% FeSO4·7H2O; 0,1% KH2PO4), ditambahkan dengan 2% skim

milk, lalu dilarutkan ke dalam air laut steril sampai pH 7,0. Kemudian di sterilisasi selama 15 menit pada 121ºC, 1 atm.

b. Pembuatan Media Uji Biokimia Protease

Media uji biokimia enzim protease yang digunakan adalah mineral salt medium yang mengandung 10% gelatin, dilarutkan ke dalam aquades. Kemudian di sterilisasi selama 15 menit, 121ºC, 1 atm.

c. Pembuatan Pereaksi Untuk Pengukuran aktivitas Protease Metode Kunitz Termodifikasi

1) 0,65% larutan kasein

Sebanyak 0,6 gram kasein dilarutkan dalam buffer Phosfat pH 7,5 2) 110mM Larutan Asam Trikloro Asetat (TCA)

Sebanyak 1,7985 gram TCA dilarutkan kedalam labu takar 100 mL dengan aguades lalu encerkan hingga garis batas.

3) Pereaksi Lowry

Pereaksi A (Na2CO3), reagen Folin – Ciocelteau 1 N.

4) Larutan Standar L-Tirosin

Larutan tirosin dengan konsentrasi 1,1 mM.

d. Pembuatan Pereaksi Untuk Pengukuran Kadar Protein Dengan Metode Lowry

1). Pereaksi A: 2 g Na2CO3 dilarutkan dalam 100 mL NaOH 0,1 N.

2). Pereaksi B: 2 mL larutan CuSO4· 5H2O 1% ditambahkan ke dalam larutan

NaK-tartarat 1%.

3). Pereaksi C: 2 mL pereaksi B ditambahkan 100 mL pereaksi A. 4). Pereaksi D: Reagen Folin-Ciocelteau 1 N.

2. Peremajaan dan Pengamatan Actynomicetes

Media yang digunakan untuk peremajaan dan pengamatan isolat Actinomycetes adalah media ISP-2. Isolat diremajakan pada media ISP-2 selama 1 minggu, setelah itu dilihat pertumbuhannya.

3. Uji Proteolitik

Media yang digunakan untuk uji biokimia biakan actinomycetes dalam mendegradasi protein adalah Mineral Salt Medium yang mengandung 10% gelatin. Sebanyak 10 mL media dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian dimasukkan biakan actinomycetes dan diinkubasi selama 4 hari. Setelah 4 hari lalu dipindahkan ke dalam lemari es dan di simpan selama 6 jam pada suhu 4ºC. Selanjutnya, biakan actinomycetes dikeluarkan dari dalam lemari es dan didiamkan selama 10 menit pada suhu ruang, lalu diamati tabung reaksi mana yang mencair.

4. Penentuan Kondisi Optimum Pertumbuhan Isolat Actinomycetes

Media yang digunakan untuk menentukan kondisi optimum actinomycetes untuk menghasilkan enzim protease adalah Mineral Salt Medium yang mengandung (0,6% NaCl; 0,01% CaCl2; 0,01% MgSO4·7H2O; 0,1% FeSO4·7H2O; 0,1%

KH2PO4). Pada masing-masing media diberikan kondisi lingkungan yang

bervariasi yaitu variasi pH dan waktu inkubasi. Variasi pH yg dilakukan adalah 6, 6.5, 7, 7.5 dan pH 8. Variasi waktu inkubasi yang dilakukan adalah 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216, 240 jam.

Setelah waktu pengamatan selesai, dilakukan pengukuran jumlah sel dengan melakukan pembacaan optical density (OD) pada panjang gelombang 600 nm menggunakan mikroplate rider. Dari data hasil pengukuran OD600 dapat diketahui

5. Penyiapan Inokulum

Isolat bakteri yang telah ditumbuhkan pada media ISP-2 selama 7 hari diinokulasikan ke dalam Erlenmeyer 500 mL yang berisi 100 mL media produksi dengan pH optimum dan kemudian diinkubasi pada temperatur optimum dan waktu inkubasi optimum. Biakan ini disebut starter atau inokulum.

6. Isolasi dan Pemurnian Enzim

Isolasi protein enzim dilakukan dengan menumbuhkan starter pada media produksi dengan pH optimum dan waktu inkubasi maksimum, agar diperoleh jumlah maksimal enzim yang diproduksi actinomycetes tersebut. Untuk memisahkan larutan enzim dari konstituen seluler lainnya dilakukan sentrifugasi pada 3500 rpm selama 30 menit. Filtrat yang diperoleh disebut ekstrak kasar enzim, terhadap ekstrak kasar enzim tersebut dilakukan penentuan kadar protein dengan metode Lowry dan uji aktifitas enzim menggunakan metode Kunitz termodifikasi.

a. Fraksinasi dengan Amonium Sulfat

Ekstrak kasar enzim yang diperoleh diendapkan dengan menggunakan garam amonium sulfat dan pengendapan dilakukan secara bertahap. Skema proses pengendapan dengan penambahan amonium sulfat dapat dilihat pada Gambar 5

Gambar 5. Skema proses fraksinasi enzim dengan penambahan amonium sulfat

Setelah itu endapan protein enzim dipisahkan dari filtratnya dengan sentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Kemudian endapan yang diperoleh dilarutkan dalam buffer pospat pH 7 .

b. Dialisis

Endapan enzim dari tiap fraksi dilarutkan dalam buffer pospat pH 7, kemudian dimasukkan ke dalam kantong selofan dan didialisis dengan buffer pospat pH 7 selama ±30 jam pada suhu dingin. Pada hasil dialisis dilakukan pengujian

Filtrat

+(NH4)2SO4 (80-100%)

Endapan (F1)

Endapan (F2)

+(NH4)2SO4 (40-60%)

Endapan (F3) Filtrat

+(NH4)2SO4 (60-80%)

Filtrat

+(NH4)2SO4 (20-40%)

Ekstrak Kasar Enzim

+(NH4)2SO4 (0-20%)

Filtrat

Endapan (F4)

Endapan (F1)

Endapan (F2)

+(NH4)2SO4 (40-60%)

Endapan (F3) Filtrat

+(NH4)2SO4 (60-80%)

Filtrat

+(NH4)2SO4 (20-40%)

Ekstrak Kasar Enzim

+(NH4)2SO4 (0-20%)

Filtrat

aktifitas enzim metode Kunitz termodifikasi pada panjang gelombang 660 nm dan ditentukan kadar protein menggunakan metode Lowry pada panjang gelombang 600 nm.

7. Karakterisasi Enzim

a. Penentuan Temperatur Optimum

Untuk mengetahui suhu optimum dari enzim hasil isolasi, dilakukan pengukuran aktifitas enzim dengan metode Kunitz termodifikasi, dengan variasi temperatur yang digunakan adalah 30, 40, 50, 60, 70 dan 80ºC.

b. Penentuan pH Optimum

Untuk mengetahui pH optimum dari enzim hasil isolasi, dilakukan pengukuran aktifitas enzim menggunakan metode Kunitz termodifikasi dengan variasi pH yang digunakan adalah 6; 6,5; 7; 7,5; dan 8.

c. Penentuan Waktu Inkubasi Maksimum

Untuk mengetahui waktu inkubasi optimum dari enzim hasil isolasi, dilakukan pengukuran aktifitas enzim menggunakan metode Kunitz termodifikasi dengan variasi waktu inkubasi 30, 40, 50, 60, dan 70 menit.

d. Penentuan Nilai Km dan Vm

Ke dalam tabung reaksi dimasukkan larutan substrat (kasein) dengan konsentrasi berturut-turut 5; 7,5; 10; 12,5; 15; 17,5; 20 dan 22,5 mg/ml. Pengerjaan selanjutnya sama dengan pengukuran aktifitas enzim metode Kunitz termodifikasi, dengan menggunakan data penentuan suhu, pH, dan waktu inkubasi maksimum

optimum. Nilai Km dan Vm ditentukan dengan menggunakan kurva Lineweaver-Burk.

8. Uji Aktifitas Protease dan Penentuan Kadar Protein

Uji aktifitas protease dilakukan pada tahap isolasi, tiap tahap pemurnian dan pada saat karakterisasi enzim hasil isolasi dan pemurnian. Penentuan kadar protein di- lakukan pada tahap isolasi dan pada tiap tahap pemurnian.

a. Pengujian Aktifitas Protease Metode Kunitz Termodifikasi

Analisis aktifitas dilakukan menurut metode Kunitz menggunakan substrat kasein (Soedigdo, 1988). Sedangkan pada penelitian ini digunakan medote Kunitz Termodifikasi (Anson, M.L., 1938). Pengukuran didasarkan pada satu unit enzim akan menghidrolisis kasein untuk menghasilkan warna dari tirosin per menit, dimana warna yang dihasilkan berasal dari reagen Folin-Ciocelteau. Prosedur pengujian adalah sebagai berikut: 5 ml kasein dimasukkan ke dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan1 ml larutan enzim. Kemudian diinkubasi pada suhu 37ºC selama 10 menit. Setelah itu masukkan 5mL reagen TCA, lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit menit, tabung reaksi dikeluarkan lalu disaring dan didapatkan filtratnya. Kemudian Filtrat yang didapatkan, diambil sebanyak 2 mL dan ditambahkan 5 mL reagen Na2CO3 dan 1 mL reagen Folin Ciucelteau.

Kemudian larutan diaduk dan diinkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit dan setelah itu didiamkan pada suhu kamar hingga dingin. Endapan yang terbentuk dipisahkan dengan penyaringan atau sentrifugasi. Absorbansi filtrat diukur pada panjang gelombang 660 nm. Kontrol dibuat dengan menambahkan enzim setelah di inkubasi selama 10 menit pada suhu 37ºC. Aktifitas enzim dihitung

berdasarkan jumlah asam amino (peptida sederhana) yang terbentuk dengan menggunakan kurva standar tirosin. Aktivitas 1 unit enzim ditetapkan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menguraikan 1µg tirosin dari kasein di dalam 1 ml volume reaksi per menit .

b. Penentuan Kadar Protein ( Metode Lowry)

Analisis ini dilakukan untuk memperoleh data tentang jumlah protein dalam tiap ml cairan enzim, yang dilakukan dengan metode Lowry (Lowry et al., 1951). Sebanyak 0,1 ml larutan sampel yang akan diukur kandungan proteinnya ditam-bahkan dengan 0,9 ml aquades atau larutan standar dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Kemudian kedalam tabung reaksi tersebut dimasukkan 5 ml pereaksi C dan dicampurkan hingga homogen, lalu dibiarkan selama 10 menit pada suhu kamar. Kemudian ditambahkan pereaksi D dan dicampurkan hingga homogen, lalu didiamkan selama 10 menit pada suhu kamar, setelah itu absorbansinya dibaca dengan Sperktrofotometer pada panjang gelombang 600 nm. Untuk menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar Bovine Serum Albumin (BSA).

Gambar 6. Diagram alir penelitian

Penentuan Kadar Protein Metode Lowry Fraksinasi dengan

Amonium Sulfat

Filtrat Enzim

Penentuan kondisi optimum pertumbuhan Actinomycetes Penumbuhbiakan isolat Actinomycetes pada media ISP-2

Uji proteolitik isolat Actinomycetes

Penyiapan inokulum

Isolasi enzim

Uji Aktivitas Enzim dengan metode Kunitz Termodifikasi Dialisis

Karakterisasi Enzim

Ekstrak kasar enzim Endapan

V. SIMPULAN DAN SARAN

1. Simpulan

Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka dapat diambil beberapa kesimpulan sebagai berikut:

a. Dari ketiga isolat yang telah diremajakan, yaitu 4, 12 dan ANL-2b-3, yang memiliki aktivitas proteolitik adalah ANL-2b-3.

b. Fase eksponensial pertumbuhan actinomycetes tercapai pada waktu 144 jam dengan aktivitas enzim protease tertinggi pada waktu 120 jam.

c. Aktivitas spesifik enzim pada ekstrak kasar enzim sebesar 1,386 U/mL. Aktivitas spesifik enzim setelah tahap pemurnian sebesar 8,44 U/mL terjadi peningkatan kemurnian enzim sebesar 6,08 kali.

d. Enzim protease hasil isolasi dan pemurnian memiliki kondisi optimum pada pH 7, temperatur 50ºC,dan waktu inkubasi 60 menit. Nilai Km dan Vm enzim protease hasil isolasi adalah 8,0867 mg/mL dan 0,5560 µmol/mL·menit.

2. Saran

Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, maka penulis menyarankan untuk melakukan variasi temperatur optimum actinomycetes dan proses kromatografi kolom setelah tahap dialisis agar di dapatkan enzim yang lebih murni.

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Masalah

Lautan Indonesia merupakan bagian dari Indopasifik yang merupakan salah satu pusat keanekaragaman biota laut terbesar di dunia (Van Soest, 1994). Pada garis pantai lautan Indonesia terdapat hutan bakau atau disebut hutan mangrove. Hutan bakau ini merupakan hutan yang hidup digaris pantai dan dipengaruhi oleh pasang surut air laut (Irwanto, 2007).

Hutan bakau ini tumbuh khususnya di tempat-tempat dimana terjadi pelumpuran dan akumulasi bahan organik. Baik di teluk-teluk yang terlindung dari gempuran ombak, maupun di sekitar muara sungai dimana air melambat dan mengendapkan lumpur yang dibawanya dari hulu. Lumpur yang mengendap ini mengandung sejumlah mikroorganisme. Mikroorganisme yang ada di sekitar bakau dapat mendegradasi daun dan batang bakau, rumput laut serta mineral lain yang dapat digunakan sebagai sumber makanan (Anonim, 2006). Salah satu mikroorganisme yang terdapat di lingkungan hutan bakau ini adalah actinomycetes (Jensen et al., 1991; Das et al., 2006).

Actinomycetes adalah suatu kelompok mikroorganisme yang morfologinya merupakan bentuk peralihan antara bakteri dan jamur, merupakan produsen sejumlah besar produk alami, dan banyak digunakan dalam bidang farmasi, klinis

dan pada bidang pertanian. Selain itu, actinomycetes laut dapat bersimbiosis dengan berbagai invertebrata laut, terutama sponga. Actinomycetes menarik perhatian karena mereka dapat melakukan metabolisme yang unik dan kemampuan fisiologis yang menghasilkan produk alami (Salas, 2009). Actinomycetes mempunyai kemampuan sitotoksik dengan aktivitas farmakologi yang menarik dan karena itu mereka menyediakan sumber produk alami dengan aplikasi potensial dalam waktu dekat (Sanchez, 2009). Selain itu, Actinomycetes berpotensi menghasilkan senyawa metabolit sekunder, enzim selulase, enzim protease dan enzim kitinase (Magarvey et al., 2004; Suryanto dan Yurnaliza, 2005; Rifaat et al., 2007).

Di Indonesia kebutuhan akan enzim protease juga semakin meningkat namun kebutuhan ini masih tergantung pada produksi impor. Salah satu cara mengantisipasi ketergantungan terhadap impor tersebut perlu ada usaha untuk memproduksi enzim protease dari mikroorganisme (Daniel, 1979; Suhartono, 1989; Thomas, 1984) . Selain itu, untuk melakukan peningkatan produksi enzim oleh mikroorganisme dapat dilakukan dengan memanipulasi kondisi lingkungan. Penggunaan mikroorganisme untuk produksi enzim mempunyai beberapa kelebihan, diantaranya mudah diproduksi dalam skala besar, waktu produksi relatif pendek serta dapat diproduksi secara berkesinambungan dengan biaya yang relatif rendah (Basuki, 1997).

Enzim protease dapat diproduksi dari berbagai mikroorganisme, diantaranya adalah actinomycetes (Alina, 2003). Pada penelitian ini Actinomycetes yang digunakan di dapatkan dari isolasi lumpur hutan bakau yang berada di Pantai

Ringgung Teluk Lampung (Lina, 2009). Enzim protease dari bakteri mulai diperkenalkan tahun1960-an oleh Gebruder Schyder dari Swiss dan Novo Industri A/S dari Denmark, dan sampai sekarang penggunaan bakteri sebagai penghasil protease mempunyai peluang yang besar (Basuki, 1997).

Dalam penelitian ini, enzim protease yang akan diisolasi dan dikarakterisasi. Hal ini dikarenakan enzim protease yang dihasilkan dari actinomycetes belum banyak dimanfaatkan dan dikelola secara optimal. Ini tentunya merupakan aset besar yang berpeluang untuk dimanfaatkan dalam pengembangan bioteknologi. Dari hasil penelitian yang dilakukan oleh Vonothini et al (2008), protease dari Actinomycetes telaga India mempunyai temperatur optimum 40ºC, dan pH optimumnya adalah 7. Hasil dari penelitian tersebut dapat dipakai sebagai acuan untuk penelitian yang akan penulis lakukan. Pada penelitian ini penulis mencoba mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim protease dari actinomycetes lumpur hutan bakau.

B. Tujuan

Tujuan penelitian ini adalah

1. Mempelajari kondisi pH dan waktu inkubasi optimum bagi pertumbuhan sel actinomycetes Isolat Lumpur Hutan Bakau dalam memproduksi enzim protease

2. Mengisolasi dan memurnikan serta menentukan karakter enzim protease dari actinomycetes Isolat Lumpur Hutan Bakau

C. Manfaat

Manfaat dari penelitian ini adalah

1. Dapat dimanfaatkannya actinomycetes Isolat Lumpur Hutan Bakau sebagai sumber alternatif penghasil enzim protease

2. Dapat meningkatkan pendapatan lokal daerah dengan cara pengembangan hutan bakau pada daerah pesisir pantai dan terpenuhinya kebutuhan akan enzim protease

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Robert, and J. D.Watson. 1994. Biologi Molekular Sel, edisi kedua, Jilid I. Alih Bahasa oleh Alex Tri Kantjono W. PT. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta. Halaman 278-281. Alina, A. 2003. Isolasi Bakteri Penghasil Enzim Protease Alkalin Termostabil.

Bulletin Flasma Nutfah, Vol 9, No.2.

Anonim. 2006. Profil Mangrove Center Lampung.

Http://Mangrove.Unila.Ac.Id/Index/Php. Dibuka pada 17 September 2009, pukul 11.00 WIB

Anson, M.L., (1938) J. Gen. Physiol. 22, 79-89

Basuki, W. 1997. Enzim dalam industri deterjen. Proceeding the first

Conference on Industrial Enzyme and Biotechnology; Technology, Strategy and Finance, September 10–11, Jakarta.

Bergmann M, 1942. A classification of proteolytic enzymes. Adv. Enzymol. Beynom, R. J., J. S. Bond. 1989. Proteolytic enzymes: A Practical Approach.

Academic Press. Oxford. Halaman 128-131.

Bronikowski, A. M. 2001. Evolutionary Adaptation to Temperature. VIII. Effects of Temperature on Growth Rate in Natural Isolates of Escheria coli and Salmonella enterica From Different thermal Environments. Evolution. Volume 55, Nomor 1, Halaman 33-40.

Crill, W. D., R B. Huey., G. W.Gilchrist. 1996. Within and

Between-Generation Effects of Temperature on The Morphology and Physiology of Drosophila melanogaster. Evolution. Volume 50, Halaman 1205-1218. Daniel ICW, 1979. Fermentation and Enzyme Technology. John Willey and Sons,

New York.

Darkuni, M. Noviar. 2001. Mikrobiologi (Bakteriologi, Virologi, dan Mikologi). Universitas Negeri Malang. Malang.

Darwis, A. A. dan Sukara. 1990. Teknologi Mikrobial. Pusat Antar Universitas. IPB. Bogor.

Davidson, Michael. 2007. "Bacteria Cell Structure." Molecular Expressions: Cell Biology and Microscopy--Structure and Function of Cells and Viruses. Florida State University. Florida.

Gumbira, S. E. 1989. Biokonversi. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan. Dirjen Dikti, PAU Bioteknologi IPB. 124-126.

Irwanto, 2007. Suksesi Hutan Mangrove Pulau Marsegu.

Http://Irwantoshut.Com/ .Dibuka pada 14 Februari 2008, pukul 11.00 WIB Judoamijojo, R. M., S. E. Gumbira, L. Hartato. 1989. Biokonversi.

Departemen Pendidikan dan kebudayaan. Dirjen Dikti, PAU Bioteknologi IPB. Bogor.

Lehninger, A. L. 1988. Dasar-Dasar Biokimia. Alih Bahasa oleh Maggy Thenawijaya. Erlangga. Jakarta.

Lina, F. G. 2009. Isolasi dan Seleksi Actinomycetes Penghasil Enzim Selulase dari Lumpur Hutan Bakau Pantai Ringgung Perairan Teluk Lampung. [Skripsi]. Universitas Lampung. Bandar Lampung.

Lowry, O.H., Rosenbrough, N.J., Farr, A.L. & Randall, R.J., 1951, Protein Measurement with the Folin Phenol Reagent, J. Biol. Chem, 193: 265-275 Magarvey, N.A., J.M. Keller, V. Bernan, M. Dworkin, and D.H. Sherman. 2004. Isolation and Characterization of Novel Marine-Derived Actinomycete Taxa

Rich in Bioactive Metabolites†. Applied and Environmental Microbiology, Dec. 2004, P. 7520–7529 Vol. 70, No. 12

Mangunwidjaja.D,Suryani.A. 1994. Teknologi Bioproses. Penebar Swadaya. Jakarta. Halaman 72-79.

Michael, J., Pelczar, Jr., E. C. S. Chan. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi 1. Alih Bahasa oleh Ratna Siri Hadioetomo. UI-Press. Jakarta.

Mubarik NR., A. Suwanto dan MT. Suhartono. 2000. Isolasi dan karakterisasi protease ektraseluler dari isolat bakteri termofilik ekstrim. Prosiding Seminar Nasional Industri Enzim dan Bioteknologi II. Mikrobiologi, Enzim dan Bioteknologi Dalam Perspektif Ekonomi dan Industri. Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi, Jakarta, 151–158.

Montegomery, R., T. W. Conway., A. A. Spector. 1993. Biokimia Berorientasi Pada Kasus Klinik. Alih Bahasa oleh Mohammad Sadikin. Bina Rupa Aksara. Jakarta.

Murray, R. K. 1997. Biokimia Harper. Alih Bahasa oleh dr. Andri Hartono. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.

Noor, R. M., M. Khazali., N. Suryadiputra. 1999. Panduan Pengenalan Mangrove di Indonesia. Direktur Jendral PKA / Wetlands International Indonesia Programme. Bogor.

Orten, J. M., O. W Neuhaus. 1970. Biochemistry. C. V. Mosby Company. Saint Louis.

Rahayu, K. 1990. Enzim Mikroba. Universitas Gajah Mada. Yogyakarta. Rao, N. 1994. Mikrooganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. UI press.

Jakarta. Halaman 17-18.

Rifaat, H.M., O.H. El-Said, S.M. Hassanein and M.S. M. Selim. 2007. Protease Activity of Some Mesophilic Streptomycetes Isolated from Egyptian Habitats. Journal of Culture Collections Vol. 5, 2006-2007, Pp. 16-24 Salas, J. A. 2009. Marine Actinomycetes: A New of Natural Product. Fakultas

Kedokteran. Universitas Oviedo. Spanyol. [Paper]

Sanchez, MC. 2009. Peran Kelautan Actinomycetes dalam Drug Discovery pada PharmaMan. Mikrobiologi R & D Dpt. PharmaMan. Spanyol. [Paper] Soedigdo. 1988. Metode Penelitian Biokimia. PAU Bioteknologi Institut

Teknologi Bandung. Bandung.

Soemitro, S. 2005. Pengaruh Modifikasi Kimiawi Selektif Terhadap Kestabilan Enzim Amilase dari Saccharomycopsis fibuligera. J. Bionatura. Vol. 7 (3): 259-273

Spalding, M. D., F. Blasco and C. D. Field (Eds). 1997. World Bakau Atlas. The International Society of Bakau Ecosystem. Okinawa, Japan. 179 pp. Stefani, Dwi. 2005. Isolasi dan Karakterisasi Enzim Protease dari Bakteri Isolat

Lokal. [Skripsi]. Universitas Lampung. BandarLampung.

Suhartono MT, 2000. Eksplorasi protease bakteri asal Indonesia untuk aplikasi industri dan riset bioteknologi. Prosiding Seminar Nasional IndustriEnzim dan Bioteknologi II. 125–133.

Suryanto, D., E.M. dan Yurnaliza. 2005. Eksplorasi Bakteri Kitinolitik : Keragaman Genetik Gen Penyandi Kitinase pada Berbagai Jenis Bakteri dan Pemanfaatannya. USU

Thomas DB, 1984. A Textbook of Industrial Microbiology. Sinaver Associates Sunderland, USA.

Van Soest, R.W.M. 1994. “Demosponge distribution pattern, In: Van Kompen,

T.M.G, Braekman, J.C. (Eds), Sponge in Time and Space”, A.A. Balkema. Rotterdam.

Vonothini, G et al. 2008. Optimization of protease production by an actinomycete Strain, PS-18A isolated from an estuarine shrimp pond. African Journal of Biotechnology.Vol. 7 (18), pp. 3225-3230.

Winarno, F.G. 1986. Enzim Pangan. PT. Gramedia. Jakarta. Halaman 79-82. Wolfe, Stephen L. 1993. Molecular and Cellular Biology. Wadsworth

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... iv

DAFTAR GAMBAR ... v

PENDAHULUAN ... 1

Latar Belakang Penelitian ... 1

Tujuan Penelitian ... 3

Manfaat Penelitian ... 4

TINJAUAN PUSTAKA ... 5

Hutan Bakau ... 5

Mikroorganisme ... 6

Sel ... 6

Bakteri ... 7

Actinomycetes ... 10

Enzim ... 12

Penggolongan Enzim ... 12

Fungsi dan Cara Kerja Enzim ... 13

Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Reaksi Enzimatik ... 15

Protein ... 16

Protease ... 18

Isolasi dan Pemurnian Enzim ... 20

Lisis Dinding Sel ... 20

Sentrifugasi (Pemusingan) ... 21

Fraksinasi ... 21

Dialisis ... 22

METODE PENELITIAN ... 23

Waktu dan Tempat Penelitian ... 23

Alat dan Bahan ... 23

Pembuatan Media dan Larutan Pereaksi ... 24

Peremajaan dan Pengamatan Actinomycetes………... ... 25

Uji Proteolitik ... 26

Penentuan Kondisi Optimum Pertumbuhan Isolat Actinomycetes ... 26

Penyiapan Inokulum ... 27

Isolasi dan Pemurnian Enzim ... 27

Fraksinasi dengan Amonium Sulfat ... 27

Dialisis ... 28

Karakterisasi Enzim ... 29

Uji Aktivitas Protease dan Penentuan Kadar Protein ... 30

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ... 33

Peremajaan Isolat Actinomycetes dan Uji Proteolitik ... 33

Penentuan Kondisi Optimum Pertumbuhan Isolat Actinomycetes ... 34

Isolasi dan Pemurnian Enzim ... 37

Fraksinasi dengan Ammonium Sulfat ... 38

Dialisis………... ... 49

Karakterisasi Enzim ... 41

Penentuan Waktu Inkubasi Optimum Enzim Protease ... 41

Penentuan pH Optimum Enzim Protease ... 42

Penentuan Temperatur Optimum Enzim Protease... 44

Konstanta Michaelis-Menten ... 45

SIMPULAN ... 47

Simpulan ... 47

Saran ... 48

DAFTAR PUSTAKA ... 49

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Hasil pemurnian enzim protease ... 40

2. Pengaruh waktu inkubasi terhadap pertumbuhan isolat Actinomycetes ... 56

3. Pengaruh variasi pH terhadap pertumbuhan isolat Actinomycetes. ... 56

4. Hasil dialisis setelah fraksinasi ... 56

5. Penentuan waktu inkubasi optimum enzim protease ... 57

6. Penentuan pH optimum enzim protease ... 57

7. Penentuan temperatur optimum enzim ... 57

8. Penentuan nilai Km dan Vmax ... 58

9. Data standar Tirosin ... 59

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Bentuk-bentuk sel bakteri ... 9

2. Isolat Actinomycetes pada media ISP-2 ... 11

3. Pembentukan kompleks enzim-substrat berdasarkan teori kunci gembok (Lock and Key Theory) dan teori kecocokan induksi (Induced Fit Theory). ... 14

4. Struktur tersier protein ... 18

5. Skema proses fraksinasi enzim dengan penambahan amonium sulfat ... 28

6. Diagram alir penelitian ... 32

7. Isolat actinomycetes ... 33

8. Uji proteolitik dari isolat actinomycetes ... 34

9. Hubungan antara jumlah sel (OD600) dan aktivitas unit (U/mL) dengan waktu inkubasi pertumbuhan Actinomycetes ... 35

10. Kurva Hubungan pH dengan jumlah sel pada OD600 ... 37

11 Kurva Hubungan antara AUP dengan tiap fraksi setelah dialisis. ... 40

12. Kurva Hubungan antara waktu inkubasi optimum dengan AUP ... 42

13. Kurva Hubungan antara pH optimum dengan AUP ... 43

15. Kurva Hubungan antara konsentrasi substrat dengan AUP ... 45 16. Kurva Lineweaver - Burk hasil Penelitian ... 46

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI

Actinomycetes ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU (Skripsi)

Oleh

RIKI ERIYANTI ANDINI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2010

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI

Actinomycetes ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU

Oleh

RIKI ERIYANTI ANDINI

Skripsi

Sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains

pada Jurusan Kimia

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS LAMPUNG

BANDAR LAMPUNG 2010

Judul Penelitian : Isolasi dan Karakterisasi Enzim Protease dari Actinomycetes Isolat Lumpur Hutan

Bakau

Nama Mahasiswa : Riki Eriyanti Andini

Nomor Pokok Mahasiswa : 0517011051

Jurusan : Kimia

Fakultas : Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

MENYETUJUI

1. Komisi pembimbing

Dian Herasari, M.Si Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T. NIP. 19710806200003.2.001 NIP. 19740705200003.1.001

2. Ketua Jurusan

Dr. Andi Setiawan, M.Sc NIP. 19580922 198811.1.001

MENSAHKAN

1. Tim Penguji

Ketua : Dian Herasari, M.Si ...

Sekretaris : Dr. Eng. Suripto Dwi Yuwono, M.T. ...

Penguji

Bukan Pembimbing : Dra. Aspita Laila, M.S ...

2. Dekan Fakultas MIPA

Dr. Sutyarso, M.Biomed. NIP 195704241987031001

PERSEMBAHAN

Sebuah karya kecilku ini penulis persembahkan teruntuk:

Papa dan mama tercintaYang selalu memberikan kasih

sayangnya, tak pernah lelah bermandi peluh dan selalu

mendoakanku dalam sujudnya

Adik-adikku Tersayang (adek Tiwi dan adek Geo)

dan

Seseorang yang akan menemani hidupku kelak

Almamater Tercinta

Universitas Lampung

Menjadi kuat

bukan berarti mampu melakukan segala hal

tapi menjadi kuat adalah

mampu berdiri tegak dan

mampu melangkah disaat yang lain tak

mampu melakukannya

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kotabumi, Lampung Utara pada tanggal 9 Juni 1987 dan merupakan anak pertama dari tiga bersaudara, putri dari pasangan Bapak Ir. Misnandar Kaswan dan Ibu Suryati Asnawi, A.Md.

Penulis memulai pendidikan di Taman Kanak-Kanak Darma Wanita Ogan Lima, dan diselesaikan pada tahun 1993. Kemudian melanjutkan pendidikan ke Sekolah Dasar di SDN 1 Kotagapura, Kotabumi, Lampung Utara pada tahun 1999, kemudian melanjutkan ke Sekolah Menengah Pertama di SLTPN 1 Kotabumi dan menamatkan pendidikan pada tahun 2002. Selanjutnya penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Umum di SMAN 3 Kotabumi pada tahun 2005. Pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui jalur ujian Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB).

Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi anggota HIMAKI (Himpunan Mahasiswa Kimia) pada tahun 2005. Pada tahun 2006 penulis pernah mengikuti kegiatan KUILMA (Kunjungan Ilmiah Mahasiswa) di daerah Serang, Banten. Pada tahun 2007 penulis mengikuti kegiatan KWI (Kunjungan Wisata Ilmiah) di daerah

menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah Kimia Dasar 1, Kimia Dasar 2, Biokimia 1 dan Biokimia 2.

Puji syukur penulis ucapkan atas kehadirat ALLAH SWT karena rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul :

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI ACTINOMYCETES ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU

Skripsi ini disusun berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebagai syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

Dalam kesempatan ini saya mengucapkan terima kasih kepada :

1. Ibu Dian Herasari, M.Si., selaku pembimbing utama dan pembimbing akademis, atas kesediaannya meluangkan watu, memberi bimbingan, dan pengarahan selama penyusunan skripsi ini.

2. Ibu Nurhasanah, M.Si., selaku pembimbing II, atas bantuan, saran dan bimbingannya.

3. ibu Dra. Aspita Laila, M.S., selaku penguji yang telah memberikan saran dan kritik untuk perbaikan skripsi ini.

4. Bapak Andi Setiawan, PhD. Selaku kepala jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung, beserta Bapak/Ibu staf pengajar yang memberikan bekal ilmu serta bimbingan selama saya menyelesaikan studi di jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung.

6. Staf dosen dan karyawan di Lingkungan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

7. Papa, mama, adik-adikku (Pertiwi Surya Sari dan Geo Surya Andika) serta seluruh keluargaku atas dukungan dan doa kalian semua.

8. Seseorang yang kutunggu kedatangannya untuk menemani sisa umurku kelak. 9. Sahabat terbaikku, Pita Rini(Cacing) yang selama bertahun-tahun ini telah

memberikan support, doa dan perhatiannya, terima kasih untuk persahabatan yang indah ini.

10. Sahabat-sahabat terbaikku tice, tika sapi, ony, helm, liya.

11. Fera Yuliantina, S.Si. teman satu tim dan satu pembimbing yang telah berjuang bersamaku.

12. Teman-temanku satu angkatan dan teman-teman kimia 06 dan Tim Laboratorium Biomassa, Reni, Slamet, Peni, Pi2t, Sana, Kak bowo.

Akhirnya, penulis menyadari bahwa informasi yang penulis sajikan pada skripsi ini masih jauh dari sempurna, namun semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua.

Bandar lampung, 09 November 2010 Riki Eriyanti Andini

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kotabumi, Lampung Utara pada tanggal 9 Juni 1987 dan merupakan anak pertama dari tiga bersaudara, putri dari pasangan Bapak Ir. Misnandar Kaswan dan Ibu Suryati Asnawi, A.Md.

Penulis memulai pendidikan di Taman Kanak-Kanak Darma Wanita Ogan Lima, dan diselesaikan pada tahun 1993. Kemudian melanjutkan pendidikan ke Sekolah Dasar di SDN 1 Kotagapura, Kotabumi, Lampung Utara pada tahun 1999, kemudian melanjutkan ke Sekolah Menengah Pertama di SLTPN 1 Kotabumi dan menamatkan pendidikan pada tahun 2002. Selanjutnya penulis menyelesaikan pendidikan Sekolah Menengah Umum di SMAN 3 Kotabumi pada tahun 2005. Pada tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung melalui jalur ujian Seleksi Penerimaan Mahasiswa Baru (SPMB).

Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi anggota HIMAKI (Himpunan Mahasiswa Kimia) pada tahun 2005. Pada tahun 2006 penulis pernah mengikuti kegiatan KUILMA (Kunjungan Ilmiah Mahasiswa) di daerah Serang, Banten. Pada tahun 2007 penulis mengikuti kegiatan KWI (Kunjungan Wisata Ilmiah) di daerah Pringsewu, Lampung. Pada bulan Agustus-November 2008, penulis

melaksanakan Praktek Kerja Lapangan (PKL) di Laboratorium Instrumen Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lampung. Selama menjadi mahasiswa, penulis pernah menjadi asisten praktikum untuk mata kuliah Kimia Dasar 1, Kimia Dasar 2, Biokimia 1 dan Biokimia 2.

SANWACANA

Puji syukur penulis ucapkan atas kehadirat ALLAH SWT karena rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul :

ISOLASI DAN KARAKTERISASI ENZIM PROTEASE DARI ACTINOMYCETES ISOLAT LUMPUR HUTAN BAKAU

Skripsi ini disusun berdasarkan penelitian yang telah dilakukan sebagai syarat untuk mencapai gelar Sarjana Sains pada Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

Dalam kesempatan ini saya mengucapkan terima kasih kepada :

1. Ibu Dian Herasari, M.Si., selaku pembimbing utama dan pembimbing akademis, atas kesediaannya meluangkan watu, memberi bimbingan, dan pengarahan selama penyusunan skripsi ini.

2. Ibu Nurhasanah, M.Si., selaku pembimbing II, atas bantuan, saran dan bimbingannya.

3. ibu Dra. Aspita Laila, M.S., selaku penguji yang telah memberikan saran dan kritik untuk perbaikan skripsi ini.

4. Bapak Andi Setiawan, PhD. Selaku kepala jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung, beserta Bapak/Ibu staf pengajar yang memberikan bekal ilmu serta bimbingan selama saya menyelesaikan studi di jurusan Kimia Fakultas MIPA Universitas Lampung.

5. Bapak Dr. Sutyarso, M.Biomed selaku Dekan Fakultas MIPA Universitas Lampung.

6. Staf dosen dan karyawan di Lingkungan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Lampung.

7. Papa, mama, adik-adikku (Pertiwi Surya Sari dan Geo Surya Andika) serta seluruh keluargaku atas dukungan dan doa kalian semua.

8. Seseorang yang kutunggu kedatangannya untuk menemani sisa umurku kelak. 9. Sahabat terbaikku, Pita Rini(Cacing) yang selama bertahun-tahun ini telah

memberikan support, doa dan perhatiannya, terima kasih untuk persahabatan yang indah ini.

10. Sahabat-sahabat terbaikku tice, tika sapi, ony, helm, liya.

11. Fera Yuliantina, S.Si. teman satu tim dan satu pembimbing yang telah berjuang bersamaku.

12. Teman-temanku satu angkatan dan teman-teman kimia 06 dan Tim Laboratorium Biomassa, Reni, Slamet, Peni, Pi2t, Sana, Kak bowo.

Akhirnya, penulis menyadari bahwa informasi yang penulis sajikan pada skripsi ini masih jauh dari sempurna, namun semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua.

Bandar lampung, 09 November 2010