Isolasi, Karakterisasi Dan Produksi Lipase Dari Kapang Indigenous.

ISOLASI, KARAKTERISASI DAN PRODUKSI LIPASE
DARI KAPANG INDIGENOUS

LISA PRATAMA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi, Karakterisasi dan
Produksi Lipase dari Kapang Indigenous adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Oktober 2015

Lisa Pratama
NIM P051130321

RINGKASAN
LISA PRATAMA. Isolasi, Karakterisasi dan Produksi Lipase dari Kapang
Indigenous. Dibimbing oleh ANI SURYANI dan BUDIASIH WAHYUNTARI.
Ketergantungan beberapa industri di Indonesia dalam memanfaatkan enzim
yang diperoleh atau diproduksi dari luar negeri, mendorong para ahli enzim atau
peneliti untuk mengisolasi enzim yang diperoleh dari mikroorgasnisme
indigenous. Salah satu enzim yang digunakan di industri pangan adalah lipase.
Lipase merupakan biokatalisator yang mempunyai kemampuan mengkatalisis
reaksi hidrolisis minyak/lemak menjadi asam lemak dan gliserol. Salah satu
pemanfaatan lipase yaitu sebagai biokatalis dalam interesterifikasi enzimatik pada
pembuatan margarin. Untuk memodifikasi lemak pada campuran bahan baku
margarin melalui intereseterifikasi enzimatik, maka dibutuhkan mikroorganisme
penghasil lipase dengan aktivitas tinggi. Salah satu mikrorganisme yang potensial
dan mampu menghasilkan lipase adalah kapang. Penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan isolat kapang indigenous penghasil lipase, mengetahui morfologi
dan spesies kapang, stabilitas enzim, kondisi suhu dan pH optimum. Penelitian
dilakukan melalui beberapa tahap yaitu isolasi kapang penghasil lipase,

identifikasi morfologi dan spesies kapang, uji aktivitas lipase secara kualitatif dan
kuantitatif, penentuan media dan waktu produksi enzim, serta karakterisasi enzim.
Hasil percobaan menunjukkan bahwa ketiga kapang hasil isolasi dari isolat
BPPT, tempe dan oncom positif menghasilkan lipase setelah diuji secara kualitatif
menggunakan media dengan penambahan Rhodamin B olive oil dan PVA. Ketiga
isolat mampu menghasilan pendaran berwarna orange dan membentuk zona
bening disekitar koloni isolat. Berdasarkan hasil penentuan konsentrasi suspensi
spora dengan konsentrasi 5% dan 10% (v/v) dengan tingkat kepadatan spora
berkisar 105-4.3x108 selama 4 hari fermentasi, konsentrasi suspensi spora 10%
menghasilkan aktivitas spesifik lebih tinggi dibandingkan dengan konsentrasi
spora 5% pada ketiga kapang. Berdasarkan kurva pertumbuhan kapang dan enzim
yang dihasilkannya dapat dijelaskan bahwa lipase dihasilkan pada awal
pertumbuhan. Secara kuantitatif, penentuan media dan waktu produksi dari hasil
perbandingan aktivitas spesifik enzim ketiga kapang pada media produksi PDB
dan olive oil 2%, PDB dan crude palm oil (CPO) 2% serta media Blain (1978)
yang mengandung KH2PO4 0.3%, NaNO3 0.1%, MgSO4.7H2O 0.05%, pepton 4%,
glukosa 2% dan olive oil 2% menunjukkan bahwa aktivitas enzim paling tinggi
adalah pada media PDB olive oil jam ke 48. Lipase yang dihasilkan ketiga kapang
memiliki aktivitas optimum pada pH 4, suhu 40oC dan stabil pada suhu 55oC
selama 30 - 40 menit. Aktivitas spesifik enzim setelah dilakukan pemekatan 10

kali (v/v) dengan polietilen glikol (PEG) mampu meningkatkan aktivitasnya
menjadi 2.9-5.1 kali lipat dibandingkan dengan aktivitas spesifik sebelum
dipekatkan. Sedangkan hasil pemekatan menggunakan aseton dengan berbagai
konsentrasi, menunjukkan bahwa aktivitas spesifik enzim pekat mengalami
penurunan. Berdasarkan identifikasi morfologinya dan molekuler isolat R (dari
isolat BPPT) merupakan kapang genus Aspergillus, isolat T (dari tempe) termasuk
dalam Rhizopus sp dan isolat O (dari oncom) termasuk dalam Neurospora sp.
Kata Kunci : enzim, lipase, interestrifikasi, kapang indigenous

SUMMARY
LISA PRATAMA. Isolation, Characterization and Production of Lipase from
Indigenous Fungal. Supervised by ANI SURYANI
and BUDIASIH
WAHYUNTARI
Dependence of imported enzymes in some industries in Indonesia
encourages researchers to isolate the enzyme or enzymes derived from Indigenous
microorgasnisme. One of the enzymes used in the food industry is lipase. Lipase
is a biocatalyst that catalyses oil/fat hydrolysis becomes fatty acids and glycerol.
One of the lipase application is for enzymatic interesterification process in
margarine. To modify fats in margarine mixture of raw materials through

enzymatic interseterifikasi, needs high activity lipase. One of the potential
microorganisms and producing lipase are fungi. Dependence of enzyme utilizing
industries in Indonesia imported enzymes only encourages researchers to isolate
Indigenous enzyme producing mikroorgasnisms. One of the enzymes used in the
food industry is lipase.The purpose of this research was to get lipase produced by
indigenous fungi, identify the selected fungi, observe enzyme stability, optimum
temperature and pH. The study was done through six steps of experiment. First
step was to isolate lipase producing fungi, identify the selected fungi, qualitative
and quantitative lipase activity assay, determine the media and the time
production of enzymes and characterization of enzymes.
The results showed that the three fungi isolated from BPPT, tempeh (food
made from soybeans fermentation) and oncom (traditional staple food
fermentation of West Java) were recognized as positive lipase producing isolates
basec on qualitative assay using Rhodamine B, olive oil and PVA. Three Isolates
showed orange luminescence and formed a clear zone around the media. The
results showed that spore suspension of 10% (v / v) for 4 days of fermentation,
produces a higher specific activity than that of the spore concentration of 5% on
all isolates. Based on the growth curve and enzymes produced by the fungus it can
be concluded that the lipase was produced at the beginning of growth. Using
Potato dextro broth (PDB) with olive oil 2%, PDB and crude palm oil (CPO) 2%

and medium of Blain (1978) showed that the highest specific activity of the
enzyme was in PDB medium containing 2% olive oil after 48 hours. Optimum
activity of the lipase produced from three isolate was at pH 4, temperatures at
40°C and interesterification reaction was stable at (55°C) for 30-40 minutes. Ten
times (v/v) concentrated enzyme with polyethylene glycol (PEG) was able to
increase activity up to 2.9 to 5.1 times higher than that of the original activity.
While the results of concentration using acetone with various concentrations,
indice that the specific activity of the concentration enzyme decreased. Based on
morphological and molecular identification, isolate R (from BPPT isolate) was
indicated as genus Aspergillus, isolates T (from tempeh) was as a genus Rhizopus
sp and O isolates (from oncom) was a genus of Neurospora sp.

Keyword : enzymes, lipase, interesterification, indigenous fungal

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan

IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI, KARAKTERISASI DAN PRODUKSI LIPASE
DARI KAPANG INDIGENOUS

LISA PRATAMA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis:

Prof Dr Anja Meryandini, MS

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala nikmat dan
karunia Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini. Tesis yang berjudul
“Isolasi, Karakterisasi dan Produksi Lipase dari Kapang Indigenous” ini ditujukan
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program
Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Ir Ani Suryani, DEA
sebagai Ketua komisi pembimbing dan Dr Ir Budiasih Wahyuntari, MSc sebagai
anggota pembimbing atas bimbingan, pengarahan dan saran yang telah diberikan.
Penulis juga berterima kasih kepada Ibu Dr Is Helianti, MSc dan seluruh staf
Biokatalis di Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro-Biomedika
(LABTIAB), Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT) Kawasan Pusat
Riset dan Teknologi (PUSPITEK) Serpong, Tangerang Selatan, serta semua pihak
yang telah membantu baik langsung maupun tidak langsung dalam penyelesaian
tesis ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga atas segala
perhatian, doa restu, serta dukungan baik material maupun spiritual, dan kepada

teman-teman Pascasarjana Bioteknologi 2013.
Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan tesis ini.
Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang bersifat membangun.
Penulis juga berharap semoga penyusunan tesis ini dapat bermanfaat bagi semua
pihak yang membutuhkannya.

Bogor, Oktober 2015
Lisa Pratama

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian

1
1
2
2
2

2 TINJAUAN PUSTAKA
Lipase
Reaksi yang dikatalisis Lipase
Lipase yang dihasilkan dari Kapang
Produksi Lipase

3
3
3
6
7

3 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan
Alat
Prosedur Kerja

8
8
8
8
8

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Kapang Penghasil Lipase

Uji Aktivitas Lipase (Kualitatif)
Identifikasi Morfologi Kapang
Perhitungan Jumlah Spora
Kurva Pertumbuhan Kapang
Penentuan Media dan Waktu Produksi
Pengaruh pH, Suhu terhadap Aktivitas dan Stabilitas Enzim
Produksi Enzim
Pemekatan Enzim dengan Polietilen Glikol (PEG) dan Aseton
Identifikasi Molekular

15
15
15
18
19
19
22
25
28
29
31

5 SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Saran

31
31
31

DAFTAR PUSTAKA

32

LAMPIRAN

36

RIWAYAT HIDUP

39

DAFTAR TABEL
1 Lipase diproduksi dari kapang
2 Diameter zona bening dan intensitas pendaran enzim ekstrak kasar dari
tiga isolat kapang dibawah sinar UV pada media ROA
3 Hasil Identifikasi morfologi kapang secara mikroskopis dan
makroskopis
4 Hasil perhitungan spora masing - masing isolat kapang pada larutan
akuades selama tiga hari
5 Aktivitas enzim dari ketiga isolat sebelum dan sesudah pemekatan
dengan polietilen glikol (PEG)
6 Perubahan aktivitas enzim dari ketiga isolat sebelum dan sesudah
pemekatan dengan aseton pada konsentrasi 20%, 40% dan 60%

6
16
18
19
30
30

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

Reaksi katalitik lipase pada reaksi hidrolisis dan sistesis
Hidrolisis lemak dengan lipase
Jalur reaksi hidrolisis menggunakan lipase spesifik dan non spesifik
Hasil isolasi kapang penghasil lipase dari beberapa sumber setelah
dimurnikan
Uji aktivitas enzim ekstrak kasar lipase secara kualitatif dari tiga isolat
kapang dibawah sinar UV pada media ROA
Hasil pengamatan karakter morfologi pada tiga isolat kapang murni
umur 2 hari secara mikroskopis menggunakan mikroskop
Aktivitas enzim dari tiga isolat kapang pada berbagai jenis konsentrasi
spora
Kurva pertumbuhan kapang dalam media PDB olive oil 2% selama 6
hari fermentasi pada suhu ruang
Aktivitas enzim dari ketiga isolat dalam media PDB olive oil 2%
selama 6 hari fermentasi pada suhu ruang
Perubahan pH dalam media PDB olive oil 2% selama 6 hari fermentasi
Perbandingan aktivitas enzim terhadap berbagai media
Aktivitas enzim pada berbagai kondisi pH dengan a) metode titrasi dan
b) metode Silva
Aktivitas enzim pada berbagai suhu dengan a) metode titrasi dan b)
metode Silva
Stabilitas enzim ketiga isolat terhadap berbagai suhu
Stabilitas enzim pada suhu reaksi (55oC)

4
4
5
15
16
17
20
20
21
22
23
26
26
27
28

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4

Alur Kegiatan Penelitian
Kurva standar p-Nitropenol (pNP)
Kurva standar bovine serum albumin (BSA)
Perbandingan aktivitas enzim dari ketiga isolat terhadap berbagai media
produksi dari jam ke 24 sampai dengan jam ke 96
5 Perbandingan aktivitas enzim dari ketiga isolat terhadap berbagai
kondisi pH dan suhu inkubasi dengan metode titrasi dan metode Silva

36
37
37
38
38

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Perkembangan teknologi di dalam industri telah banyak memanfaatkan
enzim. Dalam aplikasi teknologi saat ini, enzim banyak dimanfaatkan pada
pengolahan produk tradisional maupun modern. Enzim memiliki potensi yang
tinggi dibidang bioteknologi karena memiliki sifat yang cocok untuk
dimanfaatkan dalam proses industri yaitu efisiensi yang tinggi, spesifitas dan kerja
yang selektif, reaksi yang tanpa produk samping, dan dapat tumbuh pada suhu
kamar serta pH normal (Suhartono 1989). Kendala pengembangannya dalam
proses biokonversi enzimatis di bidang industri adalah ketersediaan dan harga
lipase impor yang mahal karena hanya sedikit produsen lipase di dunia (Suzuki et
al.1988; Panji et al. 2008). Ketergantungan beberapa industri di Indonesia dalam
memanfaatkan enzim yang diperoleh atau diproduksi dari luar negeri, mendorong
para ahli enzim atau peneliti untuk mengisolasi enzim yang diperoleh dari
mikroorgasnisme indigenous. Dengan kekayaan alam dan keanekaragaman
mikroorganisme yang dimiliki Indonesia diharapkan dapat diperoleh enzim yang
memiliki aktivitas tinggi dan dapat digunakan dalam proses industri.
Enzim semakin banyak diaplikasikan secara luas dalam proses pengolahan
pangan. Salah satu enzim yang mempunyai peranan di dalam industri pangan
adalah lipase. Lipase (triasilgliserol hidrolase) merupakan biokatalisator yang
mempunyai kemampuan mengkatalisis reaksi hidrolisis lipid menjadi asam lemak
dan gliserol. Lipase secara luas dapat ditemukan pada hewan, tanaman dan
mikroorganisme (Damaso 2008). Pada mikroorganisme, lipase dapat diproduksi
oleh bakteri, kapang dan khamir (Faloni et al. 2006). Penggunaan lipase yang
diproduksi dari mikroorganisme dianggap lebih cepat dan murah. Beberapa
mikroorganisme penghasil lipase dari bakteri adalah Bacillus sp, Pseudomonas sp,
Burkholderia sp, dan Staphylococcus sp, dari kapang diantaranya adalah Rhizopus
sp, Aspergillus sp, Geothricum sp, Mucor sp, Thricoderma reseei, Fusarium sp
dan Rhizomucor sp (Treichel et al. 2010), sedangkan diproduksi dari khamir
diantaranya adalah Candida rugosa (CRL) dan Candida antarctica (CAL)
(Bussamara et al. 2010).
Beberapa reaksi yang dikatalisis oleh lipase diantaranya adalah reaksi
hidrolisis, alkoholisis, esterifikasi, dan interesterifikasi (Dosanjh dan Kaur 2002).
Dalam industri pembuatan margarin, lipase digunakan sebagai biokatalis dalam
reaksi interesterifikasi enzimatik untuk memodifikasi karakteristik fisokimia
lemak yang akan menyebabkan perubahan komposisi penyusun tri asil gliserol
(TAG) sehingga diperoleh sifat - sifat yang diinginkan pada pembuatan margarin.
Salah satu sifat yang diinginkan oleh industri margarin adalah spreadable atau
mudah dioleskan. Untuk memproduksi lipase sendiri tanpa mengandalkan lipase
dari produsen luar negeri, dibutuhkan eksplorasi dan penapisan mikroorgasnisme
indigenous yang berpotensi tinggi sebagai penghasil lipase.
Penggunaan kapang merupakan salah satu agen produksi lipase yang
potensial (Rajesh et al. 2010) dan dianggap menghasilkan lipase yang paling baik
(Ming et al. 1998). Beberapa kapang indigenous telah diteliti untuk

2
mengeksplorasi jenis kapang yang mampu menghasilkan lipase. Nuraida et al.
(2000) mengisolasi kapang Rhizopus sp dan Mucor sp dari makanan lokal di
Indonesia seperti tempe dan oncom, sedangkan Panji et al. (2008) telah
memfermentasikan crude palm oil (CPO) dengan Neurospora sitophila dan
mampu memproduksi lipase spesifik 1.3-gliserida.
Eksplorasi dan penapisan kapang indigenous yang berpotensi tinggi
sebagai penghasil lipase dapat diketahui dengan menguji aktivitas enzimnya
terhadap suatu substrat. Aktivitas enzim merupakan kemampuan enzim dalam
mengubah suatu substrat menjadi produk. Produksi lipase dari kapang yang tinggi
dipengaruhi oleh beberapa faktor, antara lain adalah jenis kapang, kondisi atau
lingkungan (seperti suhu dan pH) dan media produksi yang digunakan. Setiap
lipase yang diproduksi dari kapang memiliki kondisi optimum yang berbeda beda. Oleh karena itu, agar lipase yang diproduksi memiliki aktivitas tinggi maka
dalam produksinya dibutuhkan pemilihan media produksi yang paling baik, serta
penentuan kondisi terbaik enzim terhadap stabilitas suhu dan pH optimum.

Perumusan Masalah
Salah satu mikrorganisme yang potensial dan mampu menghasilkan lipase
adalah kapang. Isolasi kapang indigenous dapat diperoleh dari berbagai sumber.
Permasalahan yang diambil dari penelitian ini adalah belum diperolehnya kapang
penghasil lipase dengan aktivitas tinggi, kapang penghasil lipase belum diketahui
karakter morfologi dan spesiesnya, belum diketahui komposisi media yang
digunakan dalam produksi lipase dari kapang, belum diketahui stabilitas enzimnya
pada kondisi suhu dan pH.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan isolat kapang indigenous
penghasil lipase yang diisolasi dari beberapa sumber dengan menguji aktivitas
enzimnya baik secara kualitatif maupun kuantitatif, mengidentifikasi morfologi
dan spesies kapang penghasil lipase, mengkarakterisasi enzim dengan mengetahui
kondisi terbaiknya terhadap stabilitas suhu dan pH.

Manfaat Penelitian
Hasil yang diharapkan dari penelitian ini adalah diperolehnya isolat kapang
indigenous penghasil lipase dengan aktivitas tinggi yang nantinya dapat
digunakan untuk memodifikasi lemak secara enzimatik pada pembuatan margarin
dalam industri pangan.
.

3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Lipase
Menurut International Union of Biochemistry (IUB), enzim dibagi
menjadi enam golongan yaitu golongan enzim oksidoreduktase, transferase,
hidrolase, liase, isomerase dan ligase. Lipase merupakan enzim lipolitik yang
digolongkan ke dalam golongan hidrolase dengan nama sistematis gliserol ester
hidrolase (EC 3.1.1.3). Lipase memiliki beberapa aplikasi dalam reaksi sintesis
bioorganik, hidrolisis, modifikasi lemak dan minyak serta transesterifikasi pada
triasilgliserol (Gardilo et al. 1998).
Lipase dapat diperoleh dari mikroba seperti Pseudomonas sp, Aspergillus
niger, Mucor miehei, Candida rugosa. Candida sp dan Rhizopus sp merupakan
organisme yang paling sering dipakai sebagai sumber penghasil lipase (Pandey et
al. 1999). Pada mikroorganisme, lipase dapat diperoleh dari intraseluler maupun
ekstraseluler. Namun secara umum aktivitas lipase yang paling tinggi diperoleh
dari lipase eksraselular (Hiol et al.1999; Kristanti 2001). Aktivitas enzim
merupakan kemampuan enzim dalam mengubah suatu substrat menjadi produk.
Uji aktivitas lipase secara kualitatif juga merupakan suatu uji konfirmasi
penghasil lipase bedasarkan penampakannya. Beberapa metode yang telah
digunakan untuk menguji aktivitas lipase adalah metode Vorderwiilbecke et al.
(1992) dengan menghitung aktivitas enzim lipase berdasarkan p-nitrofenol yang
terbentuk dari hasil hidrolisis oleh lipase terhadap substrat p-nitrofenilbutirat,
metode kolorimetri dengan mengamati perubahan warna tembaga piridinasetat
sebagai reagen warna (Kwon dan Rhee, 1986), metode dengan menambahkan
Rhodamine B ke dalam media pertumbuhan dengan mengamati zona bening dan
pendaran yang dihasilkan (Kouker and Jaeger 1986) dan metode Silva (2005)
menggunakan p-nitrophenyl palmitate (pNPP) sebagai substratnya. Uji aktivitas
lipase dapat dilakukan dengan metode potensiometri. Pengujian tersebut
dilakukan dengan cara membuat substrat olive oil dalam bentuk emulsi kemudian
diberi enzim yang belum diketahui aktivitasnya dan diinkubasi pada suhu 35oC
dan pH 5 dan 6 (Crueger dan Crueger 1984). Aktivitas lipase dipengaruhi oleh
beberapa faktor yaitu pH, kadar air, suhu, komposisi substrat, konsentrasi produk,
dan kandungan lipase. Aktivitas lipase produksi dari Trichoderma reesei optimum
pada kondisi pH 5 dan suhu 50oC (Rajesh et al. 2010). Lipase yang dihasilkan dari
bakteri mempunyai pH optimum pada kondisi netral atau mendekati kisaran basa,
sedangkan lipase yang dihasilkan dari kapang pH optimumnya pada kondisi netral
atau mendekati asam (August 2000). Suhu optimum lipase pada umumnya
berkisar antara 30oC dan 400C.

Reaksi yang dikatalisis Lipase
Lipase merupakan salah satu enzim yang banyak digunakan dalam
industri. Penggunaan lipase dalam industri makanan memiliki kelebihan karena
hidrolisis yang dikatalisis bersifat spesifik (posisi 2 atau 1.3). Lipase dalam
industri antara lain diaplikasikan dalam industri makanan untuk modifikasi rasa,

4
bahan kimia (sintesis ester), deterjen (hidrolisis lemak), pengolahan air limbah
(dekomposisi), kosmetik (pengangkatan lipid), obat-obatan (pencernaan minyak
dan lemak dalam makanan) (Salihu et al. 2012). Kegunaan lipase baru-baru ini
adalah untuk memodifikasi karakteristik fisokimia lemak yang akan menyebabkan
perubahan komposisi penyusun TAG.
Reaksi katalitik oleh lipase diklasifikasikan dalam dua kategori yaitu
hidrolisis dan sintesis. Reaksi yang masuk ke dalam sintesis terdiri atas reaksi
esterifikasi, interesterifikasi, alkoholisis dan asidoslisis (Gambar 1) (Dosanjh dan
Kaur 2002). Lipase menghidrolisis trigliserida menjadi gliserida (digliserida atau
monogliserida) dan asam lemak bebas (Joseph et al. 2008) seperti terlihat pada
Gambar 2.
(i) Hidrolisis

(ii) Sintesis
(a) Esterifikasi

(b) Interseterifikasi

(c) Alkoholisis

(d) Asidolisis

Gambar 1 Reaksi katalitik lipase pada reaksi hidrolisis dan sistesis

Trigliserida
Gambar 2

Gliserol

Asam lemak

Hidrolisis lemak dengan lipase (Kurnia 2010)

5
Berdasarkan spesifitasnya, lipase dapat dibagi menjadi lipase spesifik dan
lipase non spesifik. Lipase spesifik akan menghidrolisis ester pada posisi 1.3 atau
hanya pada posisi 2 sehingga hasil yang akan terbentuk adalah asam lemak
dengan monoasilgliserol atau diasilgliserol, sedangkan lipase non spesifik akan
menghidrolisis triasilgliserol pada ketiga posisi ikatan ester dengan sempurna
sehingga akan membentuk asam lemak bebas dan gliserol (Macrae 1983).
Penggunaan lipase yang memiliki spesifisitas pada posisi 1.3 dapat memberikan
kontribusi dalam memodifikasi lemak. Beberapa penggunaan lipase spesifik 1.3
antara lain adalah untuk pembuatan margarin sebagai alternatif pengganti mentega
dengan reaksi interesterifikasi enzimatik. Selain itu lipase spesifik 1.3 juga
digunakan untuk mensubsitusi lemak kakao pada Cocoa Butter Substitute (CBS)
dengan penambahan asam lemak (asidolisis) dari luar seperti palmitat dan stearat.
Salah satu lipase komersial yang telah banyak digunakan dalam industri adalah
Lypozime IM ® yang berasal dari lipase mikrobial Rhizomucor miehei yang
mempunyai kespesifitasan posisional molekul trigliserol yaitu pada posisi pimer
(sn-1 dan sn-3) (Yang et al. 2014). Spesifisitas enzim sangat bermanfaat untuk
menghasilkan produk dan tujuan yang diinginkan.

Gambar 3

Jalur reaksi hidrolisis menggunakan lipase spesifik dan non spesifik
(Macrae 1983)

6
Menurut Saktiwansyah (2001) dan Kurnia (2010) spesifisitas lipase
terhadap substrat dapat dikelompokkan menjadi: 1) spesifisitas jenis lipid, yaitu
kemampuan suatu lipase untuk bereaksi dengan jenis lipid tertentu; 2) spesifisitas
posisi, yaitu kemampuan lipase untuk membedakan substrat berdasarkan posisi
ikatan ester pada triasilgliserol; 3) spesifisitas asam lemak, yaitu kemampuan
lipase untuk membedakan substrat berdasarkan panjang rantai dan derajat
kejenuhan dari asam lemak; 4) spesifisitas alkohol, yaitu spesifisitas yang
berhubungan dengan reaksi sintesis ester, dimana dalam aktifitas esterifikasinya
setiap jenis lipase memiliki perbedaan terhadap jenis alkohol selain terhadap jenis
asam lemaknya; dan 5) spesifisitas gabungan, yaitu gabungan dari beberapa jenis
spesifisitas yang menyebabkan suatu lipase dapat mempunyai lebih dari satu
spesifisitas.

Lipase yang dihasilkan dari Kapang
Lipase yang dihasilkan dari mikroorganisme lebih banyak ditemukan pada
eukariot. Kapang merupakan sumber lipase yang biasanya disekresikan secara
ekstraseluler (Sumathy et al. 2012). Penggunaan kapang merupakan salah satu
agen produksi lipase yang potensial (Rajesh et al. 2010). Beberapa lipase yang
diproduksi dari kapang terdapat pada Tabel 1. Lipase yang diproduksi dari kapang
dan telah dikomersialkan antara lain Lipozyme RM-IM (dari kapang Rhizomucor
miehei) dan Lipozyme TL-IM (dari kapang Thermomyces lanuginosus). Di
Indonesia kapang indigenous yang memproduksi lipase banyak diperoleh dari
genus Aspergillus sp, Mucor sp, dan Rhizopus sp.
Tabel 1. Lipase diproduksi dari kapang (Sharma et al. 2001)
Genus
Rhizopus

Spesies
Rhizopus delemar
Rhizopus oryzae
Rhizopus arrhizus
Rhizopus nigricans
Rhizopus nodosus
Rhizopus microsporous
Rhizopus chinensis
Rhizopus japonicus
Rhizopus niveus
Aspergillus Aspergillus flavus
Aspergillus niger
Aspergillus japonicus
Aspergillus awamori
Aspergillus fumigatus
Aspergillus oryzae
Aspergillus carneus
Aspergillus repens
Aspergillus nidulans
Penicillium Penicillium cyclopium
Penicillium citrinum

Genus

Mucor

Ashbya
Geotrichum
Beauveria
Humicola
Rhizomucor
Fusarium
Acremonium
Alternaria
Eurotrium
Ophiostoma

Spesies
Penicillium roqueforti
Penicillium fumiculosum
Penicillium camambertii
Penicillium wortmanii
Mucor miehei
Mucor javanicus
Mucor circinelloides
Mucor hiemalis
Mucor racemosus
Ashbya gossypii
Geotrichum candidum
Beauveria bassiana
Humicola lanuginosa
Rhizomucor miehei
Fusarium oxysporum
Fusarium heterosporum
Acremonium strictum
Alternaria brassicicola
Eurotrium herbanorium
Ophiostoma piliferum

7
Untuk memproduksi lipase dari kapang diperlukan pengamatan perubahan
miselia dan pertumbuhan kapang terlebih dahulu karena akan mempengaruhi
produktivitas lipase yang dihasilkan (Stergiou et al. 2013). Pada proses fermentasi
menggunakan kapang sebagai penghasil lipase, pembentukan misellium selalu
diikuti oleh pembentukan spora yang berguna untuk pembuatan inokulum. Pada
proses fermentasi, inokulum yang berupa spora merupakan starter yang baik
dalam fermentasi (Anggirasti 2008). Hasil penelitian Colin et al. (2010)
menunjukkan bahwa produksi lipase ekstraseluler tertinggi dari A. niger MYA
135 adalah setelah kapang membentuk miselia. Produksi lipase tertinggi dari
Rhizopus chinensis juga menunjukkan kondisi yang sama (Teng et al. 2009).

Produksi Lipase
Dalam produksi enzim dari mikroorganisme seperti kapang, beberapa yang
perlu diperhatikan adalah pemilihan strain dan pengaturan kondisi proses.
Pemilihan strain dimaksudkan untuk memilih kapang yang memiliki keunggulan
dengan menghasilkan enzim ekstraselular yang memiliki aktivitas tinggi,
sedangkan pengaturan kondisi yang perlu diperhatikan antara lain adalah
komposisi media, induser, suhu, pH, aerasi dan pengadukan (Murni et al. 2011).
Selain beberapa faktor tersebut, dalam fermentasi produksi enzim yang perlu
diperhatikan lainnya adalah pola pertumbuhan mikroorganismenya. Pertumbuhan
kapang mengikuti pola pertumbuhan pada umumnya. Biasanya pada saat awal
fermentasi, aktivitas enzim yang dihasilkan masih rendah dan akan meningkat
seperti pada pola pertumbuhannya. Metode yang umum digunakan untuk
memproduksi enzim adalah metode fermentasi semi padat atau fermentasi
medium cair. Fermentasi medium cair merupakan suatu fermentasi dengan
menggunakan media cair yang substratnya terlarut atau terdispersi dalam cairan
dan mikroorganismenya berada dibawah permukaan cairan pada kondisi aerob
dengan bantuan aerasi dan agitasi (Saktiwansyah 2001).
Dalam produksi enzim diharapkan menghasilkan enzim dengan aktivitas
yang tinggi. Faktor-faktor yang perlu diperhatikan antara lain dalah cara isolasi,
jenis substrat yang digunakan dan kondisi pertumbuhan seperti pH, suhu dan
waktu inkubasi serta komposisi media yang harus mengandung sumber energi,
karbon, nitrogen dan mineral. Faktor lain yang mempengaruhi produksi lipase
adalah faktor media dan adanya induser. Penambahan lemak ke dalam media yang
digunakan dalam pertumbuhan mikroorganisme dapat meningkatan produksi
lipase yang dihasilkan. Enzim-enzim ekstraselular pada umumnya bersifat
terinduksi, dimana produksinya akan meningkat jika ada substrat yang sesuai
disekelilingnya. Tanpa induksi, enzim tetap diproduksi tetapi dalam jumlah kecil
(Fardiaz 1988). Beberapa induser yang telah digunakan adalah induser minyak
kelapa, minyak sawit, minyak jagung, minyak zaitun. Mishra dan Gupta (2014)
menggunakan Tween dan trigliserida dari minyak nabati sebagai induser dalam
memproduksi lipase. Hasil penelitian lain juga menunjukkan bahwa produksi
lipase dari kapang A.niger menggunakan minyak kelapa sawit sebagai induser
diperoleh hasil enzim dari A.niger yang lebih tinggi dibanding minyak biji bunga
matahari, maupun minyak kelapa (Sumathy dan Vijayalakshmi 2014).

8

3 METODE

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Agustus 2014 sampai dengan
Mei 2015 di Laboratorium Teknologi Bioindustri, Laboratoria Pengembangan
Teknologi Industri Agro Biomedika (LAPTIAB), Badan Pengkajian dan
Penerapan Teknologi (BPPT), Kawasan Pusat Riset dan Teknologi (PUSPITEK)
Serpong, Tangerang Selatan.

Bahan
Bahan - bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi tempe kedelai,
oncom, margarin berjamur dan isolat koleksi BPPT (Badan Pengkajian dan
Penerapan Teknologi) dari ragi. Bahan kimia yang digunakan untuk media
pertumbuhan dan uji aktivitas kapang meliputi potato dextrose agar (PDA),
potato dextrose broth (PDB), chloramphenicol, rhodamine-B, polivynil alcohol
(PVA), olive oil, crude palm oil (CPO), alkohol 70% dan 96%, glycerol 10%,
NaCl 1M, mili-Q water, p-nitrophenyl palmitate (pNPP), gum arabic, 2-propanol,
triton X-100, glukosa, pepton, CaCl2, agar, MgSO4, KH2PO4, NaNO3, NaH2PO4,
C6H8O7H2O, C6H5Na3O7.2H2O, methanol, NaOH 0.05M, maltodextrin, indikator
penolpthalein (pp), bovine serum albumin (BSA), tubing/kantong dialisis 33 mm,
polyethylene glycol 20.000, aseton serta bahan lain seperti kapas, kertas saring
dan lainnya.

Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah gelas ukur, cawan
petri, tabung reaksi, autoklaf, erlenmeyer 100 mL, 300 mL dan 500 mL (Iwaky
PYREX ®), neraca analitik, mikropipet 1mL, inkubator shaker (Siemens),
magnetic stirrer, oven, laminar airflow cabinet (ESCO), mikroskop (Olympus
Vanox), hemasitometer, centrifuge (Sorvall Fresco), refrigerated centrifuge
(Hitachi CR266), cold microsentrifuge sorvall, inlab pH meter (USA), autoklaf
untuk sterelisasi (ALP KT- 40), inkubator shaker (Kuhner UNIMAX),
spectrophotometer (Genesys UV-10), gelas beaker 500 mL (Iwaky PYREX ®),
rotor RIOA2, deep freezer -80oC (LG Expresscool) pH meter.

Prosedur Kerja
Penelitian ini dilakukan melalui beberapa tahap utama yaitu (1) isolasi
kapang penghasil lipase (2) karakterisasi morfologi dan spesies kapang (3) uji
aktivitas lipase kualitatif dan kuantitatif (4) penentuan media dan waktu produksi

9
enzim (5) karakterisasi enzim akibat pengaruh suhu, pH dan stabilitasnya (6)
produksi dan pemekatan enzim (Lampiran 1).
Isolasi Kapang dan Pemurnian Kapang Penghasil Lipase
Kapang penghasil lipase diisolasi dari beberapa sumber yaitu, tempe
kedelai, oncom dan margarin yang telah tumbuh jamur. Selain itu juga digunakan
isolat kapang murni BPPT (Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi).
Penapisan kapang penghasil lipase dilakukan menggunakan cawan petri yang
berisi media Potato Dextrose Agar (PDA) sebanyak 39 g/L dengan kandungan
bahan di dalamnya yaitu ekstrak kentang 40 g/L, dextrose 10 g/L dan agar 15 g/L.
Media dihomogenkan dan dipanaskan hingga mendidih dan disterilkan
menggunakan autoklaf selama 15 menit pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm,
dan didinginkan hingga suhu sekitar 40oC. Setelah media mencapai suhu tersebut,
media ditambahkan chloramphenicol 500 mg/L. Media yang telah diinokulasi
kapang dari empat macam sumber, selanjutnya diinkubasi pada suhu ruang (30oC)
selama 2-3 hari. Kapang yang tumbuh pada media kemudian dimurnikan kembali
dengan cara menggoreskan spora pada media baru menggunakan jarum ose.
Kapang yang telah tumbuh pada media penapisan selanjutnya dilakukan
pemurnian dengan pengenceran 10-2 sampai dengan 10-5 menggunakan larutan
NaCl 0.85% dan ditumbuhkan kembali pada media PDA dengan metode sebar
permukaan (surface). Setelah 3 hari diinkubasi, kapang yang membentuk koloni
tunggal diinokulasikan kembali ke dalam media PDA untuk memperoleh isolat
kapang yang murni.
Pembuatan Original, Stok dan Working Culture
Isolat kapang dari berbagai sumber yang tumbuh pada media seleksi
disimpan dalam gliserol stok 10% pada suhu -80oC. Selanjutnya isolat di refresh/
diremajakan dengan cara mengambil spora kapang dan digoreskan pada media
PDA miring sebagai working culture dan digoreskan pada media PDA plate
sebagai stock culture dengan inkubasi selama 2 - 3 hari pada suhu 30oC. Kapang
yang tumbuh pada media PDA miring dan PDA plate selanjutnya disimpan dalam
ruang penyimpanan dingin (coldroom) pada suhu 8oC.
Karakterisasi Morfologi dan Spesies Kapang
Identifikasi Morfologi Kapang
Identifikasi morfologi isolat kapang dilakukan berdasarkan pada panduan
Gandjar et al. (1999) dan Watanabe (1937). Identifikasi kapang dilakukan dengan
mengamati beberapa karakter morfologi baik secara makroskopis maupun
mikroskopis pada kapang berumur 3 hari. Pengamatan makroskopis dilakukan
pada media PDA dalam cawan petri. Inokulasi kapang ke media PDA dilakukan
dengan teknik stab. Satu stab dilakukan pada pusat media sehingga akan
dihasilkan satu koloni kapang. Pengamatan meliputi warna dan permukaan koloni,
tekstur, zonasi, daerah tumbuh, garis-garis radial dan konsentris, warna balik
koloni (reverse color), dan tetes eksudat (exudate drops). Pengamatan secara
mikroskopis meliputi ada tidaknya septa pada hifa, pigmentasi hifa, penghubung
ketam (clamp connection), bentuk dan ornamentasi spora (vegetatif dan generatif),
serta bentuk dan ornamentasi tangkai spora (Gandjar et al. 1999; Ilyas 2006).
Pengamatan secara mikroskopis dilakukan dengan cara menumbuhkan kapang

10
pada potongan media PDA di atas object glass secara aseptis yang diinkubasi di
dalam cawan petri selama 2-3 hari. Hasil pengamatan selanjutnya dibandingkan
dengan buku panduan untuk mengetahui identitas kapang tersebut.
Uji Aktivitas Lipase Kualitatif dan Kuantitatif
Uji Aktivitas Lipase secara Kualitatif
Uji aktivitas lipase secara kualitatif dilakukan dengan menggunakan
metode Rhodamin olive oil berdasarkan Koeker dan Jaeger (1987). Isolat kapang
yang diperoleh dari isolat BPPT, tempe kedelai, dan oncom, diseleksi
kemampuannya dalam menghasilkan lipase. Identifikasi dan penapisan kapang
penghasil lipase serta penentuan aktivitas lipase dilakukan menggunakan media
seleksi plate Rhodamin B agar (modifiasi Kouker dan Jaeger 1987) yang
mengandung PDA 39 g/L, Rhodamin B 0.01%, PVA 1.5% dan substrat olive oil
4%. Kapang yang telah diperoleh dari isolasi menggunakan media PDA yang
mengandung 500 mg/L chloramphenicol diinokulasikan ke dalam cawan petri
yang berisi media seleksi. Kapang yang tumbuh diseleksi berdasarkan pada zona
yang terbentuk disekeliling koloni yang tumbuh pada media. Rhodamin B
merupakan pewarna yang akan membentuk kompleks dengan asam lemak bebas,
sehingga ketika koloni penghasil lipase di bawah sinar ultraviolet (UV) akan
memberikan zona berpendar, sedangkan olive oil berfungsi sebagai sumber lipida
(Gupta et al. 2003).
Uji Aktivitas Lipase (Kuantitatif)
Pengukuran aktivitas kapang penghasil lipase dilakukan secara kuantitatif
menggunakan metode modifikasi Silva (2005) dan metode titrasi (Yang et al.
2006).
Modifikasi metode Silva (2005), bahan - bahan yang digunakan dalam uji
aktivitas lipase dengan modifikasi metode ini adalah p-nitrophenyl palmitate
(pNPP), 2-propanol, 50 mM buffer dan stabilizer yang sesuai. Pengujian aktivitas
enzim lipase dilakukan dengan cara membuat terlebih dahulu larutan A dan
larutan B dengan cara 3 mg pNPP dilarutkan dalam 1 mL 2-propanol (Larutan A).
10 mg stabilizer dan 40 mg Triton X-100 dilarutkan dalam 9 mL buffer 50 mM
(Larutan B). Kemudian larutan A dan larutan B dicampurkan. Selanjutnya
pengujian dilakukan dengan cara mengambil 0.1 mL sampel enzim dan
dicampurkan dengan 0.9 mL larutan substrat dan diinkubasi selama 30 menit pada
suhu 37oC (pada suhu yang sesuai). Setelah diinkubasi, sampel diukur serapan
pada panjang gelombang 410 nm terhadap kontrol bebas enzim dan dihitung
berdasarkan kurva standar p-nitrophenol (Lampiran 2) dengan nilai absorbansi
pada panjang gelombang 410 nm.
Metode titrasi, pengujian titrasi untuk melihat aktivitas enzim yang
dilakukan menggunakan olive oil sebagai substrat. Aktivitas enzim ditentukan
oleh titrasi asam lemak bebas yang dibebaskan dari olive oil terhadap larutan
alkali (Yang et al. 2006). Substrat mengandung 25% olive oil, 1.5% polivynil
alcohol (PVA) dalam air. Larutan enzim ekstrak kasar (EEK) diambil 1mL dari
masing - masing kultur sebanyak 5 mL substrat dengan ditambah 4 mL buffer
phosphat 0.05 M pH 7 dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 20 menit dalam
shaker incubator. Setelah diinkubasi, ditambahkan 5 mL metanol (Ethanol 100%)
untuk menghentikan reaksi dan ditambah dua tetes indikator phenolpthalein (PP).

11
Selanjutkan dilakukan titrasi dengan NaOH 0.05 M. Aktivitas lipase dapat
dihitung menggunakan rumus sebagi berikut:
V2-V1. n NaOH.1000
Aktivitas lipase (U/mL) =
t (menit)
Keterangan:
V1
= volume yang dibutuhkan untuk titrasi kontrol
V2
= volume yang dibutuhkan untuk titrasi sampel
n
= konsentrasi NaOH
t
= waktu inkubasi
Satu unit aktivitas lipase didefinisikan sebagai jumlah lipase yang mampu
melepaskan / membebaskan 1 μmol asam lemak per mL/menit yang disimbolkan
dengan U/mL. Aktivitas lipase yang semakin tinggi ditunjukkan oleh semakin
banyaknya volume NaOH yang dibutuhkan untuk titrasi.
Penentuan Kadar Protein
Pembuatan kurva standar: Pembuatan kurva standar bovine serum
albumin (BSA) dilakukan dengan cara membuat variasi konsentrasi BSA di dalam
larutan Tris - HCl pH 9. Setiap variasi konsentrasi BSA diambil sebanyak 30 µL
kemudian dicampur dengan 1.5 mL larutan Bradford dalam tabung reaksi. Larutan
yang telah dicampur kemudian dihomogenkan menggunakan vortex, kemudian
diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar. Pengukuran absorbansi dilakukakn
pada panjang gelombang 595 nm. Kurva standar BSA adalah grafik hubungan
konsentrasi protein standar (BSA dengan berbagai variasi) dengan nilai absorbansi
pada panjang gelombang 595 nm (Lampiran 3).
Pengukuran kadar protein.: Kadar protein enzim yang dihasilkan oleh
kapang ditentukan berdasarkan metode Bradford (1976) dengan menggunakan
larutan standar bovine serum albumin (BSA). Selanjutnya 0.1 mL larutan enzim
ekstrak kasar ditambahkan dengan 5 mL reagen Bradford dan diinkubasi pada
suhu ruang selama 10-60 menit. Absorbansi larutan sampel protein dibaca pada
panjang gelombang 595 nm. Dengan persamaan matematik dari kurva standar
protein, akan didapatkan kadar protein terlarut yang terkandung dalam larutan
ekstrak enzim kasar.
Pengukuran Aktivitas Spesifik Lipase
Pengukuran aktivitas spesifik lipase diukur dengan menggunakan rumus
sebagai berikut:
Aktifitas spesifik lipase (unit/mg) =

aktivitas lipase (unit/mL)
kadar protein (mg/mL)

Perhitungan Jumlah Spora, Penentuan Konsentrasi Suspensi Spora
Perhitungan spora kapang dilakukan dengan hemasitometer (counting
chamber) di bawah mikroskop. Pengamatan jumlah spora ini bertujuan untuk
mengetahui berapa hari jumlah spora kapang optimal dapat digunakan sebagai
inokulum dalam kultivasi.

12
Penentuan konsentrasi suspensi spora dilakukan sebelum penentuan kurva
pertumbuhan kapang. Konsentrasi suspensi spora yang diuji adalah 5% dan 10%
dari volume media. Pengujian dilakukan dengan cara menumbuhkan kapang
terlebih dahulu pada media PDA miring. Setelah berumur 3 hari, masing-masing
isolat pada media miring ditambahkan dengan akuades steril sebanyak 10 ml dan
digosok-gosok menggunakan ose hingga terbentuk suspensi spora. Hasil suspensi
spora pada masing-masing isolat selanjutnya dimasukkan kedalam erelenmeyer
baru. Dari erelenmeyer yang berisi suspensi spora tersebut, pada masing-masing
isolat diambil sebanyak 5% dan 10% dari volume media fermentasi (PDB dan 2%
olive oil) untuk dilakukan pengujian. Pengujian dilakukan selama 4 hari, dengan
pengambilan sampel setiap hari untuk dianalisis aktivitas enzimnya berdasarkan
metode Silva (2005) dan kadar protein berdasarkan metode Bradford (1976).
Kurva Pertumbuhan Kapang
Sebelum penentuan media dan waktu produksi dari kapang, perlu diketahui
terlebih dahulu pola pertumbuhan kapang yaitu dengan cara membuat kurva
pertumbuhan dari masing-masing kapang. Kurva pertumbuhan kapang dilakukan
dengan cara menumbuhkan kapang pada dua media kultivasi (PDB dan olive oil
2% dan PDB dan crude palm oil 2%) sebanyak 150 mL dalam erlenmeyer 300
mL. Kapang yang akan ditumbuhkan pada masing-masing media kultivasi
diambil dari stock culture yang telah diremajakan dan berumur 3 hari. Selanjutnya,
isolat disuspensikan dengan akuades steril secara aseptik dalam laminar airflow
(LAF). Pada konsentrasi yang telah ditetapkan, suspensi spora dengan jumlah
spora berkisar 4.0x106 - 7.28x107 kemudian dimasukkan ke dalam masing-masing
media kultivasi pada shaker incubator dalam suhu ruang selama 6 hari.
Pengambilan sampel dilakukan setiap 1 hari pada masing-masing erlenmeyer.
Sampel disaring menggunakan kertas Whatman (sebelumnya telah dioven pada
suhu 105oC selama 1 jam dan ditimbang) untuk memisahkan miselia kapang.
Setelah disaring, miselia ditimbang untuk memperoleh berat basahnya (berat b).
miselia kapang selanjutnya dikeringkan dalam oven pada suhu 80oC selama 1 jam
sampai berat konstan (berat c). Berat kering kapang yang konstan digunakan
untuk mengukur berat kering miselianya dengan rumus: Berat miselia (g/mL) =
[berat b] - [berat c]. Hubungan antara berat kering sel kapang dan waktu
pertumbuhan digunakan untuk membuat kurva pertumbuhan.
Penentuan Media Kultivasi dan Waktu Produksi Enzim
Untuk melihat kesesuaian/kecocokan media kultivasi maka isolat kapang
ditumbuhkan pada berbagai media dengan volume media sebanyak 250 mL dalam
erlenmeyer 500 mL. Media kultivasi yang digunakan yaitu (1) media PDB dan
olive oil mengandung PDB 24 g/L dan olive oil 2%; (2) media PDB dan crude
palm oil (CPO) mengandung PDB 24 g/L dan CPO 2% dan (3) media Blain et al.
(1978) yang mengandung KH2PO4 0.3%, NaNO3 0.1%, MgSO4.7H2O 0.05%,
pepton 4%, glukosa 2% dan olive oil 2%. Penentuan media kultivasi ini juga
sekaligus dilakukan untuk melihat waktu optimum untuk produksi enzim.
Pengambilan sampel dilakukan selama 24 jam sekali dengan mengamati
perubahan pH, aktivitas enzim, dan kadar protein.
Kapang yang akan ditumbuhkan pada media kultivasi diambil dari stock
culture dengan cara mensuspensikan spora dengan air steril secara aseptik dalam

13
laminar airflow (LAF), kemudian dimasukkan ke dalam media kultivasi. Kapang
ditumbuhan dalam media fermentasi pada shaker incubator dengan kecepatan 150
rpm pada suhu 30oC (suhu ruang). Setelah hari ke 6, kultivasi masing - masing
isolat dipanen dengan cara mengambil masing - masing sampel sebanyak 15 mL
dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifugasi/falcon centrifuge 50 mL. Sampel
selanjutnya disentrifuse pada kecepatan 4000 rpm dalam suhu 4oC selama 15
menit. Hasil Supernatan dipisahkan dengan pellet ke dalam tabung sentrifugasi
baru. Selanjutnya supernatan diambil sebanyak 1 mL dan dicampurkan dengan
substrat untuk diukur aktivitas enzimnya menggunakan metode Silva (2005) dan
20µL untuk mengukur kadar proteinnya berdasarkan metode Bradford (1976).
Karakterisasi Enzim
Pengaruh pH, Suhu terhadap Aktivitas Enzim
Penentuan pH optimum enzim dilakukan pada berbagai kondisi yaitu pH 4
& 5 (buffer Sitrat), 6 & 7 (buffer Fosfat) dan pH 8 (buffer Tris-HCl). Setelah
mendapat pH optimum enzim selanjutnya dilakukan penentuan suhu optimum
pada suhu 25, 30, 35, 40, 45 oC dengan metode Silva (2005) dan metode titrasi
(Yang et al. 2006) sebagai pembanding. Selain itu, dilakukan juga pengujian
aktivitas enzim terhadap suhu reaksi interesterifikasi pada suhu 40, 50 dan 60 oC.
Stabilitas Enzim
Pengujian stabilitas lipase dilakukan dari hasil pengujian suhu reaksi
interesterifikasi. Masing-masing enzim ekstrak kasar lipase sebanyak 25 mL
diinkubasi pada berbagai kondisi suhu tersebut tanpa menggunakan substrat.
Pengamatan dilakukan dengan pengambilan sampel setiap lima belas menit
setelah inkubasi selama 1, 2 dan 3 jam. Aktivitas spesifik lipase dihitung
berdasarkan aktivitas enzim metode Silva (2005) dan kadar protein metode
Bradford (1976).
Produksi dan Pemekatan Enzim
Produksi Enzim
Setelah penentuan media produksi, produksi enzim dilakukan dengan
medium terpilih dengan waktu optimum produksi yang telah diperoleh. Sebanyak
10% suspensi spora hasil peremajaan pada media PDA miring (berumur 3 hari)
sebagai inokulum dimasukkan ke dalam media produksi steril 1000 mL dalam
erlenmeyer 2000 mL dan diinkubasi pada pada inkubator bergoyang (shaker
incubator) dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 30oC (suhu ruang). Setelah
sampai pada waktu optimum produksi, miselia kapang disaring menggunakan
kertas Whatman untuk memisahkannya dengan selnya. Selanjutnya hasil saringan
disentrifugasi dengan kecepatan 8000 rpm pada suhu 4oC selama 20 menit.
Supernatan hasil sentrifugasi diambil sebagai enzim ekstrak kasar (EEK).
Pemekatan Enzim
Pemekatan dengan Polietilen Glikol (PEG)
Enzim dipekatkan menggunakan polietilen glikon (PEG) dengan dialysis
tubing cellulose. Sebelum dipekatkan, enzim ekstrak kasar terlebih dahulu diukur
aktivitasnya menggunakan metode Silva (2005) dan kadar proteinnya

14
menggunakan metode Bradford (1976). Pemekatan enzim dilakukan dengan cara
mencuci tubing/kantong dialisis menggunakan air RO mengalir selama 3-4 jam,
selanjutnya kantong dialisis dicuci kembali dengan Sodium Sulfide pada suhu
80oC selama 1 menit (0.3% b/v) dan cuci kembali dengan air RO dengan suhu
60oC selama 2 menit. Setelah dicuci dengan RO, kantong dicuci dengan asam
sulfat 0.2 % (v/v) selama ± 1 menit pada suhu 60oC dan dibilas kembali dengan
air RO dengan suhu 60oC selama 2 menit untuk menghilangkan sisa asam pada
kantong dialisis. Enzim yang akan dipekatkan kemudian dimasukkan ke dalam
kantong dialisis yang telah dicuci dan ditaburi polietilen glikol diatasnya. Untuk
peningkatan 10 kali, pemekatan membutuhkan waktu ± 4 jam diinkubasi pada
lemari pendingin. Hasil pemekatan enzim dibandingkan dengan aktivitas enzim
dan kadar protein sebelum dan sesudah dipekatkan menggunakan polietilen glikon
(PEG).
Pemekatan dengan Aseton:
Untuk membandingkan metode pemekatan enzim terhadap aktivitasnya
maka enzim ekstrak kasar yang diperoleh dari ketiga kapang dipekatkan
menggunakan aseton pada konsentrasi. Sebanyak 250 mL enzim ekstrak kasar
ditambahkan aseton pada suhu -20oC dengan konsentrasi 20, 40, dan 60 % (v/v),
kemudian diaduk menggunakan magnet stirrer selama 30 menit. Setelah itu,
enzim disentrifuge dengan kecepatan 8000 rpm selama 20 menit dan diambil
pelletnya. Selanjutnya, pellet hasil sentrifugasi dilarutkan menggunakan buffer
fosfat 0.05 M pH 7 dan diuji aktivitasnya menggunakan metode Silva (2005) dan
diuji kadar proteinnya dengan metode Bradford (1976). Hasil pengujian enzim
dibandingkan dengan aktivitas enzim dan kadar protein sebelum dipekatkan
menggunakan aseton.
Identifikasi Molekular
Isolat kapang diidentifikasi menggunakan gen 18S rRNA diamplifikasi
oleh polymerase chain reaction (PCR) menggunakan primer NL1 (5’- GCATAT
CAATAAGCG GAGGAAAAG-3’) dan NL4 (5’- GGTCCGTGTTTCAAGACG
G-3’). Identifikasi ini dilakukan oleh Tim Rekayasa Genetika, bidang Teknologi
Biokatalis BPPT. Urutan gen 18S rRNA dari isolat terpilih kemudian
dibandingkan pada National Center for Biotechnology Information (NCBI)
dengan menggunakan program BLAST untuk mengetahui spesies dari kapang
tersebut.

15

4 HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi Kapang Penghasil Lipase
Kapang penghasil lipase diisolasi dari berbagai sumber makanan lokal
Indonesia diantaranya adalah ragi, tempe, margarin, dan oncom. Isolasi kapang ini
merupakan suatu proses pengambilan kapang dari lingkungan asalnya dan
ditumbuhkan pada medium buatan untuk memperoleh kapang yang lebih murni.
Pemurnian kapang bertujuan untuk memisahkan hasil inokulasi yang terdiri atas
berbagai jenis kapang sehingga didapatkan kapang yang murni pada setiap biakan
kapang. Pemurnian dilakukan menggunakan metode quadrant streak yaitu suatu
metode sebaran sel menggunakan teknik gores dengan membagi beberapa daerah,
umumnya adalah empat daerah pada media agar di dalam cawan petri.

Gambar 4 Hasil isolasi kapang penghasil lipase dari beberapa sumber setelah
dimurnikan; a) Isolat R dari BPPT, b) Isolat T dari tempe kedelai, c)
Isolat O dari oncom.
Hasil isolasi kapang dari beberapa sumber setelah diinkubasi selama 2-3
hari tersebut didapatkan 4 (empat) isolat murni yang terdiri dari 1(satu) kelompok
khamir yang diperoleh dari margarin yang telah berjamur dan 3 (tiga) kelompok
kapang yang diperoleh dari isolat BPPT, tempe dan oncom (Gambar 4). Tiga
kapang yang telah murni tersebut selanjutnya dilakukan untuk pengujian aktivitas
enzim.

Uji Aktivitas Lipase (Kualitatif)
Uji aktivitas lipase dilakukan untuk mendeteksi dan mengetahui
kemampuan isolat kapang yang telah murni dalam menghasilkan lipase. Metode
ini hanya dapat mengkonfirmasi lipase yang dihasilkan saja tetapi tidak bisa
melihat besarnya aktivitas enzim yang dihasilkannya.
Pada pengujian ini media yang digunakan adalah media selektif dengan
penambahan Rhodamin B dan olive oil serta penambahan polyvinyl alcohol
(PVA). Pewarna Rhodamin B berfungsi sebagai pengabsorbsi zona perbendar

16
berwarna orange ketika kapang yang menghasilkan lipase berada dibawah sinar
UV. Rhodamin B akan mem