Isolasi dan Karakterisasi Gen Penyandi Endo-1,4-β-glukanase dari Kapang Aspergillus fumigatus dan Aspergillus niger

ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI ENDO 1,4
β GLUKANASE DARI KAPANG
DAN

SAELI

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010

ABSTRAK
SAELI. Isolasi dan Karakterisasi Gen Penyandi Endo 1,4 β glukanase dari
Kapang
dan
. Dibimbing oleh EDY
DJAUHARI PURWAKUSUMAH dan DJOKO SANTOSO.
Biomassa limbah pertanian yang mengandung selulosa merupakan bahan
baku pembuatan bioetanol yang paling murah dan banyak terdapat di alam. Bahan
baku ini dapat dihidrolisis dengan bantuan enzim selulase yang dihasilkan kapang

dan
. Enzim ini terdiri atas tiga komponen utama, yaitu endo
1,4 β glukanase, ekso 1,4 β glukanase, dan β glukosidase. Tujuan utama
penelitian ini yaitu mengisolasi dan mengkarakterisasi gen penyandi endo 1,4 β
glukanase dari
dan
. Hipotesis yang diajukan adalah gen
penyandi endoglukanase dapat diisolasi menggunakan primer spesifik yang
dirancang berdasarkan sekuen gen yang terdapat di bank gen. Gen penyandi
endoglukanase diisolasi menggunakan teknik RT PCR (
) dan disisipkan ke vektor pGEM T
. Pengukuran
aktivitas endoglukanase dilakukan terhadap pelet dan supernatan sel rekombinan
dengan metode DNS (asam dinitrosalisilat). Hasil elektroforesis menunjukkan
bahwa gen tersebut berukuran sekitar 1300 bp. Analisis BLAST terhadap sekuen
DNAnya memperlihatkan bahwa gen gen tersebut homolog dengan gen penyandi
endoglukanase yang terdapat pada bank gen. Uji ekspresi gen penyandi
endoglukanase
menunjukkan bahwa gen tersebut telah berhasil
diekspresikan ke

melalui vektor pYES2/CT. Aktivitas
endoglukanase tertinggi terdapat pada supernatan sel rekombinan yang membawa
vektor pYES2/CT (8.8309 U/mg).

ABSTRACT
SAELI. Isolation and Characterization of Genes Encoding Endo 1,4 β glucanase
from the Fungi of
and
. Under the
direction of EDY DJAUHARI PURWAKUSUMAH and DJOKO SANTOSO.
Agricultural waste biomass containing cellulose is the raw material for
bioethanol production and is the cheapest and most abundant in nature. It can be
hydrolyzed with the help of cellulase enzymes produced by fungus
and
. These enzymes consist of three main activities, namely endo 1,4 β
glucanase, exo 1,4 β glucanase, and β glucosidase. The main purpose of this
research is isolation and characterization of genes encoding endo 1,4 β glucanase
from
and
. The hypothesis is the gene encoding

endoglucanase can be isolated using specific primers designed based on gene
sequences accessible from the gene bank. Genes encoding endoglucanase isolated
using RT PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction) techniques
and inserted into the vector pGEM T Easy. Endoglucanase activity measurements
carried out on pellets and supernatant of the recombinant cells by DNS
(dinitrosalicylic acid) method. Electrophoresis of the PCR products showed that
the gene has a size of approximately 1300 bp. BLAST analysis of the DNA
sekuen showed that these genes are homologous with genes encoding
endoglucanase accessible from the gene bank. Expression test of the genes
encoding endoglucanase of
showed that this gene has been successfully
expressed in the cells of
through pYES2/CT vector. The highest
activity of endoglucanase was found in the supernatant of the recombinant cells
carrying vector pYES2/CT (8.8309 U/mg).

ISOLASI DAN KARAKTERISASI GEN PENYANDI ENDO 1,4
β GLUKANASE DARI KAPANG
DAN

SAELI

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biokimia

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010

Judul Skripsi : Isolasi dan Karakterisasi Gen Penyandi Endo 1,4 β glukanase
dari Kapang
dan
Nama
: Saeli
NIM
: G84051205

Disetujui
Komisi Pembimbing

Drs. Edy Djauhari PK, M.Si
Ketua

Dr. Djoko Santoso
Anggota

Diketahui

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc.
Ketua Departemen Biokimia

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Penulis memanjatkan puji syukur kepada Allah SWT atas segala karunia
Nya sehingga penelitian dapat diselesaikan. Penelitian yang berjudul Isolasi dan

Karakterisasi Gen Penyandi Endo 1,4 β glukanase dari Kapang
dan
ini dilaksanakan dari bulan Maret hingga
Desember 2009 di Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada semua pihak yang telah
membantu dalam penyelesaian penelitian ini, antara lain kepada Bapak Drs. Edy
Djauhari PK, M.Si selaku pembimbing utama, Bapak Dr. Djoko Santoso selaku
pembimbing anggota, dan Bapak Dr. Darmono Taniwiryono, M.Sc. sebagai
Kepala Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan Indonesia atas izinnya. Tidak
lupa penulis sampaikan terima kasih kepada orang tua penulis untuk semua doa
dan kasih sayangnya. Penulis juga berterima kasih kepada Teh Rini, Teh Niyyah,
Teh Nina, Teh Herti, Teh Alin, Teh Riana, Teh Aan, Teh Irma, dan teman teman
Biokimia 42. Untuk teman teman seperjuangan, Ellen dan Izzah serta Ratna Dewi,
Embi, Tri, dan Nunung terima kasih atas motivasinya.
Penulis menyadari bahwa banyak kekurangan dan kesalahan yang harus
diperbaiki, namun penulis berharap semoga penelitian ini dapat memberikan
manfaat bagi semua pihak yang membutuhkannya demi kemajuan ilmu
pengetahuan.

Bogor, Maret 2010

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Cirebon pada tanggal 12 Mei 1987 dari ayah Sadiin
dan ibu Karwiti. Penulis merupakan anak tunggal.
Tahun 2005 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Babakan, Cirebon dan
melanjutkan pendidikannya di IPB melaui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB
(USMI). Penulis memilih Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah aktif dalam kegiatan
kemahasiswaan Koperasi Mahasiswa (KOPMA) IPB periode 2006/2007 dan
pernah aktif dalam kepanitiaan masa pengenalan departemen Biokimia
2007/2008. Penulis melakukan Praktik Lapangan di Laboratorium Biologi
Molekuler dan Rekayasa Genetika, Balai Penelitian Bioteknologi Perkebunan
Indonesia dengan judul Produksi dan Pengujian Selulase Fungi untuk
Meningkatkan Efisiensi Fermentasi Etanol dari Singkong.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL .............................................................................................. viii
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................... viii

DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................... ix
PENDAHULUAN .............................................................................................

1

TINJAUAN PUSTAKA
Kapang
...................................................................................
Enzim Selulase .........................................................................................
(RT PCR) ...............
Isolasi dan Pengklonan Gen .....................................................................
Bioinformatika ..........................................................................................

2
3
4
5
5

BAHAN DAN METODE

Alat dan Bahan .........................................................................................
Metode ......................................................................................................

6
6

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi RNA Total .....................................................................................
Perancangan Primer ..................................................................................
Amplifikasi Gen Penyandi Endo β 1,4 glukanase ...................................
Pengklonan Fragmen DNA dengan Vektor pGEM T
.....................
Analisis Sekuen Gen .................................................................................
Konstruksi Gen Penyandi Endo 1,4 β glukanase ke Vektor pYES2/CT .
Uji Ekspresi Gen Penyandi Endo 1,4 β glukanase
......

10
11
11

12
14
16
17

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ................................................................................................... 18
Saran ......................................................................................................... 18
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 18
LAMPIRAN ....................................................................................................... 21

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Konsentrasi dan kemurnian RNA hasil isolasi ................................................ 10
2 Karakteristik pasangan primer

dan

.............................. 11

3 Analisis BLAST sekuen fragmen DNA

..................................... 14

4 Analisis BLAST sekuen fragmen DNA

............................................ 14

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Kapang

........................................................................ 2

2 Kapang

................................................................................ 3

3 Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim ...................................................... 3
4 Tahapan proses RT PCR ................................................................................. 4
5 Hasil elektroforesis RNA total

dan

............................. 10

6 Hasil RT PCR gen target ................................................................................ 12
7 Seleksi transforman

rekombinan dengan vektor pGEM T

8 Hasil elektroforesis PCR koloni dengan plasmid pGEM T
9 Hasil elektroforesis isolasi pasmid pGEM T E

......... 13
................... 13

......................................... 13

10 Sekuen gen penyandi endoglukanase

......................................... 15

11 Sekuen gen penyandi endoglukanase

................................................ 16

12 Pemotongan dengan enzim restriksi

RI dan

I .................................... 17

13 Hasil elektroforesis PCR koloni
yang disipkan gen penyandi
endoglukanase
melalui vektor pYES2/CT ........................................ 17
14 Aktivitas endoglukanase supernatan dan pelet sel rekombinan yang
disisipkan gen penyandi endoglukanase
........................................... 18

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian .......................................................................................... 22
2 Hasil analisis BLAST terhadap sekuen

..................................... 23

3 Hasil analisis BLAST terhadap sekuen

............................................. 24

4 Peta restriksi vektor pGEM T

dan pYES2/CT ....................................... 25

5 Kurva standar protein pada λ = 750 nm .......................................................... 26
6 Kurva standar glukosa pada pada λ = 575 nm ................................................ 27
7 Kadar protein sel

rekombinan .............................................................. 28

8 Aktivitas endoglukanase sel

rekombinan ............................................ 29

9 Analisis ANOVA dengan program komputer MINITAB 14 .......................... 30
10 Analisis uji Duncan dengan program komputer SPSS 13.0 ............................ 31

PENDAHULUAN
Energi dibutuhkan oleh manusia untuk
berbagai keperluan, mulai dari transportasi,
perindustrian, sampai pada kebutuhan rumah
tangga. Salah satu sumber energi yang banyak
dimanfaatkan adalah minyak bumi. Hingga
saat ini konsumsi minyak bumi, baik di negara
maju maupun di negara berkembang masih
sangat tinggi. Laju penggunaan minyak bumi
yang tinggi telah menyebabkan persediaan
minyak dunia mengalami masa krisis. Krisis
energi
ini
dapat
mengakibatkan
melambungnya
harga
produk
dan
mempengaruhi mobilitas masyarakat. Selain
itu, penggunaan minyak bumi yang terus
menerus juga dapat menimbulkan dampak
negatif terhadap lingkungan akibat efek rumah
kaca.
Seiring dengan menipisnya cadangan
energi minyak bumi, berbagai penelitian telah
diarahkan untuk pengembangan energi
alternatif terbarukan. Salah satu teknologi
yang sedang dikembangkan adalah konversi
biomassa yang dapat menghasilkan bahan
bakar hayati berupa biodiesel, biogas, dan
bioetanol. Produk produk tersebut memiliki
keunggulan,
yaitu
terbarukan,
ramah
lingkungan, dan dalam beberapa hal biaya
produksinya yang relatif lebih murah.
Perkembangan bahan bakar hayati di Brazil
dan Jepang telah berhasil mengkonversi
biomassa menjadi bioetanol dari bahan dasar
lignoselulosa secara efisien sebagai campuran
bahan bakar bensin (Howard
2003).
Bioetanol (C2H5OH) adalah cairan yang
dihasilkan melalui proses fermentasi gula dari
sumber karbohidrat menggunakan bantuan
mikroorganisme. Sebagai campuran bahan
bakar kendaraan bermotor, produk ini lebih
dikenal sebagai gasohol (campuran gasolin
dan alkohol).
Produksi
bioetanol
umumnya
menggunakan glukosa sebagai substrat
fermentasi. Sementara itu, sumber bahan baku
untuk pembuatan bioetanol yang paling murah
dan banyak terdapat di alam adalah biomassa
limbah pertanian yang mengandung selulosa.
Saat ini, penanganan limbah pertanian dapat
dilakukan dengan memanfaatkan selulosa
yang ada pada limbah pertanian. Selulosa ini
dapat dihidrolisis menjadi glukosa dengan
bantuan enzim selulase. Beberapa negara
maju sudah mampu memproduksi selulase
secara
komersial.
Penjualan
selulase
diperkirakan mencapai 20% dari industri
enzim (Howard
2003). Penggunaan
enzim dalam mendegradasi senyawa polimer

di bidang industri maupun pertanian telah
banyak dilakukan untuk efisiensi biaya
produksi. Mahalnya harga selulase impor
karena tingginya ongkos pengiriman menjadi
hambatan majunya sektor pertanian dan
perindustrian.
Indonesia merupakan negara yang
mempunyai potensi yang sangat besar untuk
menghasilkan bioetanol mengingat bahan
bakar nabati ini dapat memanfaatkan kondisi
geografis dan keanekaragaman hayati yang
tersedia di Indonesia cukup tinggi. Usaha
pengembangan teknologi enzim sedang
dikembangkan untuk menjawab masalah
mahalnya harga enzim impor dengan
memanfaatkan sumber daya hayati yang ada
di Indonesia. Salah satunya adalah eksplorasi
mikrob selulolitik, seperti fungi, bakteri, dan
khamir. Fungi dari genus
diyakini
mempunyai peranan dalam produksi enzim
secara komersial, termasuk selulase (Onsori
. 2005; Okafor 2007). Krikstaponis
.
(2001) melaporkan bahwa kapang
yang diisolasi dari sampah organik
mampu mensekresikan enzim selulase
ekstraseluler. Sementara itu, beberapa studi
menunjukkan bahwa kapang
mampu memproduksi enzim selulase dalam
jumlah yang cukup tinggi (Abu & Ado 2004;
Ikram ul Haq
. 2005; Ali & Saad El Dein
2008).
Pada umumnya enzim yang diisolasi dari
mikroorganisme asalnya memiliki tingkat
kemurnian yang rendah bila dibandingkan
dengan enzim produk rekayasa genetika. Oleh
karena itu, salah satu upaya untuk
meningkatkan produksi enzim adalah melalui
rekayasa genetika. Namun, aktivitas enzim ini
dipengaruhi oleh karakteristik gen yang
diekspresikan. Karakterisasi gen penyandi
endo 1,4 β glukanase
dan
isolat koleksi BPBPI belum pernah
dilakukan. Tujuan utama penelitian ini yaitu
mengisolasi dan mengkarakterisasi gen
penyandi endo 1,4 β glukanase dari
dan
. Hipotesis yang
diajukan adalah gen penyandi endo 1,4 β
glukanase dengan
penuh
dapat diisolasi menggunakan primer spesifik
yang dirancang berdasarkan sekuen gen yang
terdapat di bank gen. Manfaat penelitian ini
yaitu dengan didapatkannya klon klon gen
penyandi selulase membuka peluang untuk
memproduksi enzim selulase yang lebih
murah melalui rekayasa genetika. Selanjutnya
tersedianya enzim yang lebih murah akan
dapat memajukan industri bioetanol dari
biomassa. Dengan demikian, permasalahan

2

yang muncul dari konsumsi bahan bakar
minyak dari fosil yang jumlahnya besar dapat
diminimalkan.

TINJAUAN PUSTAKA
Kapang
Kapang adalah organisme eukariot yang
tumbuh dengan cara perpanjangan hifa.
Panjang hifa dipengaruhi oleh kondisi
pertumbuhan. Jika tumbuh pada permukaan
medium, hifa berukuran panjang, sedangkan
jika di bawah permukaan (terendam), hifa
akan terputus putus sehingga ukurannya lebih
pendek
tetapi
bercabang cabang.
Mikroorganisme ini dapat menyerap molekul
sederhana seperti gula dan komponen lainnya
yang terlarut di sekeliling hifa secara
langsung. Makromolekul yang lebih kompleks
seperti selulosa, pati, dan protein harus
dipecah sebelum diserap ke dalam sel dengan
menseksresikan beberapa enzim ekstraseluler
(Fardiaz 1988).
Kapang
dapat diklasifikasi ke
dalam dunia Fungi, filum Eumycota, kelas
Ascomycetes, ordo Moniliales, famili
Moniliaceae,
dan
genus
(Alexopoulos
1961;
Fardiaz
1989).
terdapat di alam sebagai saprofit.
Ciri ciri khusus yang dimiliki oleh kapang
jenis ini yaitu memiliki hifa yang bersepta dan
miselium bercabang, struktur koloni kompak,
konidiofor septa atau nonsepta muncul dari
(sel miselium yang membengkak dan
berdinding tebal. Konidiofor
membengkak menjadi vesikel pada ujungnya
dan memiliki fialid yang sederhana, berwarna
atau tidak berwarna. Konidianya membentuk
rantai yang berwarna hijau, coklat atau hitam
dan tumbuh baik pada suhu 37 oC atau lebih.
Kapang ini tumbuh baik pada substrat dengan
konsentrasi gula dan garam tinggi. Oleh
karena itu,
dapat tumbuh pada
makanan dengan kadar air rendah (Fardiaz
1989). Kapang dari genus ini dapat
menimbulkan kerusakan pada sayuran dan
buah buahan dengan memanfaatkan enzim
selulase untuk mendegradasi dinding sel
sayuran
dan
buah buahan
sehingga
strukturnya menjadi lunak (Gandjar
2006).

Koloni
berwarna
hijau tua karena lebatnya konidiofor yang
terbentuk dari miselia (Gambar 1).
Konidianya berbentuk semibulat, berwarna

hijau, dan berdinding kasar hingga berduri.
Pertumbuhan koloni lebih cepat dan lebih
lebat pada media MEA (
).
Spesies ini bersifat tropik termotoleran dan
banyak ditemukan pada serealia bersuhu
tinggi serta telah diisolasi dari debu rumah,
kompos, tanah, serasah rhizosfer tanaman
kopi, kacang tanah, bawang, dan jagung.
dapat tumbuh pada suhu tinggi,
yaitu 55 oC dan pada tekanan oksigen yang
rendah. Spesies ini bersporulasi dengan lebat
dan bersifat patogen sehingga harus berhati
hati dalam menanganinya (Gandjar
1999). Selain itu, kapang ini juga dapat
menimbulkan reaksi alergi dan apabila kondisi
seseorang sedang menurun, kapang jenis ini
dapat tumbuh di bronki paru paru (Gandjar
2006).

Gambar 1 Kapang

.

Koloni
terdiri atas suatu
lapisan basal yang kompak berwarna putih
hingga kuning dan suatu lapisan konidiofor
yang lebat yang berwarna coklat tua hingga
hitam. Kepala konidia berwarna hitam,
berbentuk bulat, dan cenderung merekah
menjadi kolom kolom pada koloni berumur
tua. Konidia berbentuk bulat hingga
semibulat, berwarna coklat, dan memiliki
ornamentasi berupa tonjolan dan duri duri
yang tidak beraturan (Gambar 2). Koloni pada
media MEA (
) lebih tipis
tetapi bersporulasi lebat. Spesies ini
kosmopolit di daerah tropik dan subtropik,
mudah diisolasi dari tanah, udara, air, rempah
rempah, kapas, buah buahan, gandum, beras,
jagung, tebu, ketimun, kopi, teh, kakao, dan
serasah dedaunan (Gandjar
. 1999).
memiliki konidia yang kasar dan
mengandung pigmen. Kebanyakan galur
dalam grup ini mempunyai sklerotia yang
berwarna abu abu sampai hitam. Beberapa
galur dari jenis ini digunakan dalam produksi
asam sitrat, asam glukonat, dan enzim
(Fardiaz 1989). Kapang jenis ini di Indonesia

3

digunakan dalam proses fermentasi untuk
produksi asam sitrat dengan substrat molassa
pabrik gula tebu dan digunakan di industri
kimia dan pangan karena harga produknya
murah bila dibandingkan dengan produk yang
dihasilkan melalui suatu proses kimia murni
(Gandjar
2006).

Gambar 2 Kapang

.

Enzim Selulase
Selulase merupakan salah satu enzim
ekstraseluler yang dapat menghasilkan produk
berupa glukosa dan selobiosa (Fardiaz 1988).
Enzim ini mampu memecah ikatan β 1,4
glikosida yang terdapat pada selulosa
(Gambar 3). Enzim selulase terdiri atas tiga
enzim utama, yaitu endoglukanase atau endo
1,4 β glukanase (EC 3.2.1.4), ekso 1,4 β
glukanase atau selobiohidrolase (EC 3.2.1.91),

Daerah amorf

dan β glukosidase atau selobiase (EC
3.2.1.21) (Howard
. 2003; Zee 2005;
Okafor 2007).
Mekanisme keja enzim selulase yaitu
endoglukanase akan menyerang daerah amorf
dari selulosa secara acak dan membentuk
makin banyak ujung ujung nonpereduksi yang
memudahkan
kerja
selobiohidrolase.
Selobiohidrolase kemudian menghidrolisis
daerah kristal dari selulosa dengan
membebaskan dua unit glukosa. Kerja kedua
enzim ini saling bersinergi menghasilkan unit
unit sakarida yang lebih kecil berupa
selobiosa dan selotetrosa. Selanjutnya, unit
glukosa tersebut dihidrolisis oleh β
glukosidase menghasilkan glukosa.
Endoglukanase memiliki afinitas yang
tinggi terhadap serat selulosa yang memiliki
kristalinitas rendah. Aktivitas enzim ini
menyebabkan penurunan viskositas substrat
yang dapat larut. Oleh karena itu pengukuran
penurunan
viskositas
larutan
CMC
(karboksimetil selulosa) merupakan metode
yang sering digunakan untuk menentukan
aktivitas endoglukanase
(Fikrinda 2000).
Enzim ini dikenal dengan nama CMC ase
(karboksimetil selulase) karena aktivitasnya
yang tinggi dalam menghidrolisis substrat
CMC (Lelana 2009).

Daerah kristal

Rantai
pendek

A = serat selulosa murni
B = hidrolisis awal pada daerah amorf
C = residu daerah kristal
D = hidrolisis pada dearah kristal
Gambar 3 Mekanisme hidrolisis selulosa oleh enzim (Okafor 2007).

4

Berbeda dengan endoglukanase yang
memiliki aktivitas hidrolisis yang tinggi pada
selulosa
amorf,
selobiohidrolase
atau
aksoglukanase menunjukkan aktivitas yang
tinggi terhadap selulosa kristal tetapi sangat
rendah pada selulosa amorf seperti CMC.
Enzim ini bereaksi sebagai eksoenzim dan
melepaskan selobiosa sebagai produk utama
dari selulosa kristal. Menurut Yosakawa
.
(2003), enzim ini berperan dalam inisiasi
hidrolisis selulase pada selulosa kristal.
Enzim terakhir yang berperan pada
hidrolisis selulosa yaitu β glukosidase. Enzim
ini tidak menghidrolisis CMC atau selulosa
tetapi menghidrolisis selooligosakarida dan
selobiosa menjadi glukosa (Fikrinda 2000).
Kemampuan fungi mensekresikan enzim
selulase
menjadikannya
mampu
menghidrolisis selulosa yang terdapat pada
substratnya menjadi glukosa yang merupakan
sumber karbon untuk pertumbuhan fungi
(Irawan
. 2008).
Beberapa mikroorganisme dari jenis
fungi yang menghasilkan selulase antara
lain
!
"
#
$
%
&
dan
(Gandjar
. 2006). Selain itu
bakteri
dari
genus
dan bakteri Actinomycetes
seperti
dan %
'
serta
dan
dapat juga memproduksi enzim
selulase (Howard
. 2003). Meskipun
sejumlah besar mikroorganisme dapat
mendegradasi selulosa tetapi hanya sedikit
mikroorganisme yang mampu memproduksi
enzim yang dapat sempurna menghidrolisis
selulosa kristal secara
.
Menurut Howard
(2003), ekso 1,4 β
glukanase merupakan komponen utama dari
sistem selulase fungi yaitu sekitar 40 70%
dari total protein selulase dan mampu
menghidrolisis
daerah
kristal. Kapang
memproduksi endoglukanase dan
β glukosidase dalam jumlah besar tetapi
sedikit
menghasilkan
selobiohidrolase.
Penggunaan selulase banyak diaplikasikan
dalam industri kimia, bahan bakar, makanan,
proses fermentasi, pakan ternak, tekstil, pulp,
dan pertanian.

digunakan untuk memperbanyak salinan
cDNA dengan menggunakan RNA sebagai
cetakan (Sambrook & Russell 2001). Teknik
RT PCR terdiri atas dua tahap, yaitu sintesis
cDNA dari RNA menggunakan enzim
dan amplifikasi cDNA dengan
proses PCR. RT PCR merupakan metode
yang sensitif untuk mendeteksi keberadaan
sampel yang spesifik sehingga dapat
digunakan walaupun jumlah RNA yang
dianalisis sedikit (Dale & Schantz 2002).
Gambar 4 memperlihatkan tahapan proses
RT PCR.
Berbeda dengan teknik PCR yang
menggunakan bahan dasar DNA, teknik RT
PCR ini memerlukan mRNA sebagai bahan
dasar untuk amplifikasi fragmen DNA. Oleh
karena itu, komponen dalam RT PCR adalah
molekul mRNA, pemicu reaksi (primer),
dNTPs, enzim
, dan
bufer reaksi. Enzim
yang digunakan untuk transkripsi balik
biasanya berasal dari
'
(AMV), %
(
(Mo MLV), )
% *
%+)
yang menghambat
aktivitas RNase H, atau Tth DNA
yang bersifat termostabil (Sambrook &
Russell 2001).

(RT PCR)
(RT PCR) adalah suatu metode yang

Gambar 4 Tahapan proses RT PCR (Dale &
Schantz 2002).

5

Primer yang digunakan untuk sintesis
cDNA dapat dibedakan menjadi oligo (dT)
yang akan menempel pada ujung poli A yang
terdapat pada ujung 3’ mRNA, dan primer
yang akan menempel secara
acak pada mRNA (Invitrogen 2003). Tahap
kedua yaitu amplifikasi cDNA dengan PCR
biasa yang memerlukan primer spesifik. Hasil
amplifikasi dapat dideteksi melalui 30 40
siklus tergantung jumlah mRNA hasil
transkripsi yang digunakan.
Isolasi dan Pengklonan Gen
Isolasi gen spesifik dari potongan
kromosom eukariot dapat dilakukan dengan
pendekatan isolasi DNA secara keseluruhan
(
) atau membangun cDNA dari
mRNAnya. mRNA ini digunakan sebagai
cetakan cDNA dengan bantuan enzim
. Perlu diperhatikan bahwa DNA
yang didapatkan tidak mengandung intron
(Lehninger 1982).
Penggunaan RNA dalam proses rekayasa
genetika memiliki beberapa keuntungan, yaitu
sekuen gen yang didapatkan merupakan
representasi
bagian
dari
gen
yang
diekspresikan, tidak adanya intron dalam
molekul RNA, dan ukurannya relatif lebih
kecil sehingga memudahkan dalam penyisipan
gen ke dalam vektor (Old & Primrose 1989).
Menurut Budiani
. (2004), kualitas RNA
merupakan salah satu faktor penting dalam
berbagai penelitian seperti isolasi gen atau
mRNA target yang terekspresi pada organ
atau tahap perkembangan tertentu. Namun,
isolasi RNA seringkali menghadapi berbagai
hambatan sehingga RNA yang dihasilkan
dalam
keadaan
terdegradasi
atau
terkontaminasi oleh komponen lain termasuk
DNA.
Selanjutnya, DNA yang telah didapatkan
disisipkan ke dalam vektor. Vektor
pengklonan yang digunakan dalam penelitian
ini adalah vektor pGEM T
. Vektor ini
mengandung gen β laktamase yang menyandi
resistensi ampisilin dan gen
, yang
menyandi bagian peptida α dari enzim β
galaktosidase. β galaktosidase adalah enzim
yang mengkatalisis pemecahan laktosa
menjadi glukosa dan galaktosa. Enzim ini
memecah X gal (senyawa analog laktosa)
menghasilkan
produk
berwarna
biru.
Penambahan
IPTG
(isopropil
tiogalaktosidase) pada media seleksi akan
menginduksi promoter gen
, (Sambrook &
Russell 2001). Sementara itu, untuk ekspresi
gen ke sel inang digunakan vektor pYES2/CT
yang merupakan vektor untuk sel khamir.

Vektor ini umumnya dirancang agar selain
dapat bereplikasi di dalam sel khamir, dapat
juga bereplikasi di dalam
. Begitu pula
untuk proses amplifikasi DNA vektor. Oleh
karena itu, vektor untuk sel khamir juga
mengandung origin replikasi yang dikenali
oleh bakteri serta marka seleksi untuk bakteri
(Old & Primrose 1989).
Marka seleksi yang umum digunakan pada
vektor
adalah gen penyandi enzim yang
terlibat dalam biosintesis asam amino dan gen
penyandi enzim yang terlibat dalam
biosintesis nukleotida. Contoh gen yang
terlibat dalam biosintesis asam amino adalah
$- 3, + .2, dan
1 yang masing masing
terlibat dalam biosintesis asam amino
histidina, leusina, dan triptofan. Sementara itu,
gen . 3 terlibat dalam biosintesis urasil.
Seleksi transforman dilakukan dengan
menumbuhkan sel khamir dalam media
minimal (tidak mengandung asam amino dan
nukleotida) sehingga sel yang tumbuh adalah
sel rekombinan yang mengandung gen
penyandi yang terlibat dalam biosintesis asam
amino dan nukleotida (Old & Primrose 1989).
Bioinformatika
Bioinformatika
adalah
teknologi
pengumpulan,
penyimpanan,
analisis,
interpretasi, penyebaran, dan aplikasi dari data
biologi
molekuler.
Perangkat
utama
bioinformatika yaitu
/
dan didukung
oleh kesediaan internet dan server /
/
/ ' (WWW) (Aprijani & Elfaizi 2004).
Bioinformatika
muncul
atas
desakan
kebutuhan untuk mengumpulkan, menyimpan,
dan menganalisis data data biologi dari
'
DNA, RNA, maupun protein.
Pencarian
'
umumnya berdasarkan
hasil
atau penyejajaran sekuen, baik
sekuen DNA maupun protein. Metode ini
digunakan berdasarkan pada kenyataan bahwa
sekuen DNA atau protein bisa berbeda sedikit
tetapi memiliki fungsi yang sama (Witarto
2003).
Saat ini, banyak pekerjaan bioinformatika
yang berkaitan dengan teknologi
' .
Penggunaan
'
ini meliputi baik tempat
penyimpanan
'
yang bersifat umum
(dapat diakses oleh banyak pengguna) seperti
# ! ( atau PDB (
' )
maupun
'
yang bersifat pribadi seperti
yang digunakan oleh grup riset yang terlibat
dalam proyek pemetaan gen atau
'
yang dimiliki oleh perusahaan perusahaan
bioteknologi. 0 '
dari sekuen data yang
ada dapat digunakan untuk mengidentifikasi
adanya kehomologian pada molekul baru yang

6

telah dikuatkan dengan data yang disekuenkan
di laboratorium. Setelah informasi dari
'
diperoleh, langkah berikutnya adalah
menganalisis data. Pencarian
'
umumnya
berdasarkan
pada
hasil
penyejajaran sekuen (Aprijani & Elfaizi
2004).
Salah satu perangkat lunak pencari
'
yang paling berhasil dan bisa
dikatakan menjadi standar saat ini adalah
BLAST (!
+
).
BLAST merupakan program pencarian
kesamaan yang didisain untuk mengeksplorasi
semua
'
sekuen yang diminta, baik itu
berupa DNA atau protein (Aprijani & Elfaizi
2004). Perangkat lunak ini telah diadaptasi
untuk melakukan
terhadap berbagai
sekuen seperti DNA (blastn), protein (blastp),
dan sebagainya. Sementara itu, perangkat
lunak yang digunakan untuk melakukan
terhadap sekuen terbatas yang
lazim digunakan adalah ClustalX dan
ClustalW (Witarto 2003).

BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Alat alat yang digunakan adalah sentrifus
Beckman Coulter Allegra 4R, sentrifus
Eppendorf 5417R, spektrofotometer UV VIS
Beckman Coulter DU150,
)
DNA Savant V110, PCR Biometra, kamera
Canon
/
A640, Geldoc, pipet
mikro, pipet Mohr, tabung Eppendorf, neraca
analitik,
/ '
, cawan petri,
/ ,
peralatan
elektroforesis,
/
' , alat pemotong gel, mortar, lemari
asam, tabung sentrifus 30 mL, autoklaf,
Decby
&
40°C, Sansio freezer 20°C,
pH meter, inkubator bergoyang, dan alat
gelas seperti cawan petri, gelas piala,
Erlenmeyer, dan gelas ukur.
Bahan yang digunakan adalah isolat
kapang
dan
koleksi Balai Penelitian Bioteknologi
Perkebunan Indonesia, 1
%
%
2 , kit
-- " *
*
(Invitrogen),
$
2 (Roche),
vektor pGEM T
(Promega), vektor
pYES2/CT (Invitrogen), T4 DNA ligase,
bufer ligasi, media LB (Luria Bertani), media
LB agar, agarosa, bufer
!
EDTA (TBE) 0.5X, etidium bromida (EtBr),
etanol 96%,
'
(brom fenol biru
2.5%, sukrosa 40%), β merkaptoetanol,
marker 1 kb plus 0
(Invitrogen)

tips pipet mikro, nitrogen cair, ddH2O,
XL1 ' , reagen DNS (3,5
),
larutan
CMC
( '
) 2%, bufer fosfat pH
4.8, bufer lisis bakteri, reagen Lowry, dan
primer spesifik endo 1,4 β glukanase
dan
.
Metode
Isolasi RNA Total
Isolasi RNA dilakukan menggunakan
1
% 2 . Sebanyak 0.1
g kapang yang sudah digerus dengan nitrogen
cair dimasukkan ke dalam Eppendorf
berukuran 2 mL. Sampel ditambahkan 450 OL
bufer RLT (Qiagen) dan β merkaptoetanol,
campuran diekstraksi dengan cara divorteks.
Selanjutnya, tabung Eppendorf diinkubasi
dalam /
'
pada suhu 56 °C selama 1 3
menit. Isi larutan dipindahkan ke dalam
tabung berwarna ungu dan disentrifus pada
kecepatan 13000 rpm selama 2 menit,
supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam
tabung yang baru. Supernatan ditambahkan
225 OL etanol 96% lalu dikocok sampai
homogen. Setelah itu, campuran dimasukkan
dalam tabung berwarna merah muda dan
disentrifus kembali dengan kecepatan 10000
rpm selama 1 menit.
Selanjutnya, endapan yang tertinggal di
dalam tabung ditambahkan dengan 700 OL
bufer RW1 (Qiagen) dan disentrifus kembali
pada kecepatan 10000 rpm selama 1 menit.
Pelet hasil sentrifugasi dipindahkan ke dalam
Eppendorf berukuran 2 mL yang baru dan
ditambahkan bufer RPE (Qiagen) sebanyak
500 OL, campuran disentrifus pada 10000 rpm
selama 1 menit dan supernatannya dibuang.
Endapan yang tersisa ditambahkan 500 OL
bufer RPE dan disentrifus dengan kecepatan
10000 rpm selama 2 menit. Hasil sentrifugasi
dipindahkan ke dalam tabung berukuran 2 mL
yang baru dan disentrifus kembali selama 1
menit dengan kecepatan 13000 rpm. Pelet
yang didapatkan dipindahkan ke dalam tabung
berukuran 1.5 mL dan ditambahkan 30 OL
/
Campuran disentrifus pada
10000 rpm selama 1 menit lalu dilakukan
pengukuran konsentrasi RNA dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
260, 280, dan 230 nm. Hasil isolasi RNA
dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa
1% dengan tegangan 25 volt selama 2 jam.
Perancangan Primer
Primer dirancang secara semimanual
dengan terlebih dahulu mencari sekuen cDNA
dari gen penyandi endo 1,4 β glukanase yang

7

diperoleh dari situs web http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/. Apabila gen yang diinginkan tidak
terdapat pada kapang
dan
maka digunakan gen kapang lain
sebagai dasar untuk analisis BLAST pada
situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.
Perancangan primer dilakukan dengan
kriteria, memiliki 18 25 pasang basa,
mengandung G+C 40 60%, pasangan primer
/
dan
tidak saling komplemen,
tidak dapat membentuk primer dimer, pada
ujung 3’ tidak mempunyai basa nukleotida T,
dan memiliki
(Tm) tidak
melebihi 70 oC (Sambrook & Russell 2001).
Kualitas hasil rancangan diuji lagi dengan
bantuan program komputer #
.
Amplifikasi Gen Penyandi Endo β 1,4
glukanase
dengan
Metode
(RT PCR)
Sintesis
dilakukan dengan
%
-menggunakan kit
(Invitrogen). Sintesis
dilakukan dengan cara sebanyak 2 Og
RNA dilarutkan dalam 10 OL ddH2O.
Campuran ditambahkan oligo (dT) dan dNTP
masing masing 1 OL. Campuran tersebut
dipanaskan pada suhu 65 oC selama 5 menit
lalu segera dimasukkan ke dalam es.
Selanjutnya, campuran ditambahkan reagen
yang berisi 2 RL bufer RT 10X, 4 RL 25 mM
MgCl2, 2 RL 0.1 M DTT, dan 1 RL
3.
'
- '
kemudian
dikocok
pelan.
Campuran
diinkubasi pada suhu 25 °C selama 2 menit
kemudian ditambahkan 1 RL Super ScriptTMII
RT, dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu
25 °C selama 10 menit. Campuran diinkubasi
kembali pada suhu 42 °C selama 50 menit dan
70 °C selama 15 menit. Setelah itu, campuran
dimasukkan ke dalam es dan ditambahkan 1
RL RNaseH kemudian diinkubasi pada suhu
37 °C selama 20 menit. Hasilnya berupa
cDNA disimpan pada suhu 20 °C.
Utas cDNA yang terbentuk selanjutnya
digunakan sebagai
untuk amplifikasi
gen penyandi endo 1,4 β glukanase.
Proses PCR dilakukan dengan cara 1 OL
cDNA dilarutkan dalam campuran berisi
18.05 OL ddH2O, 2.5 OL bufer lengkap 10X,
0.5 OL dNTPs, 1 OL primer
/ , 1 OL
primer
, dan 0.2 OL (1 unit) Taq
polimerase. Volume total untuk reaksi
tersebut adalah 25 OL. Selanjutnya, campuran
dimasukkan dalam mesin PCR dengan
program suhu pradenaturasi 94 oC selama 5
menit dan dilanjutkan dengan 35 siklus yang

terdiri atas denaturasi pada 94 oC selama 45
detik,
pada suhu 57 oC selama 45
detik, suhu pemanjangan 72 oC selama 1
menit
30
detik,
dan
1
siklus
pascapemanjangan 72 oC selama 5 menit.
Hasil
amplifikasi
diverifikasi
dengan
elektroforesis gel agarosa 1% dengan
tegangan 75 volt selama 45 menit. Pita yang
terbentuk dibandingkan dengan marker.
Ekstraksi dan Purifikasi DNA Hasil
Amplifikasi
Bagian gel yang menunjukkan adanya
fragmen DNA hasil amplifikasi dipotong dan
dimasukkan dalam tabung mikro 2 mL.
Fragmen DNA dari gel agarosa dimurnikan
menggunakan
+ (1 (#
2 (Invitrogen). Gel dilarutkan dengan GS1
(#
' &
) sebanyak 3X bobot gel
yang diperoleh lalu dipanaskan pada suhu 50
°C selama 15 menit dan tabung dikocok
setiap 3 menit sekali. Setelah 15 menit, waktu
inkubasi ditambahkan 5 menit lagi.
Gel yang sudah larut dimasukkan ke dalam
kolom berfilter yang tersedia dalam kit dan
disentrifus 12000 rpm selama 2 menit pada
suhu 25 oC kemudian dibuang supernatannya.
Kolom ditambahkan 500 RL GS1 dan
diinkubasi selama 1 menit pada suhu ruang.
Supernatan dibuang dan residu ditambahkan
700 RL bufer W9 lalu diinkubasi selama 5
menit pada suhu ruang. Setelah itu, larutan
kembali disentrifus 12000 rpm pada 25 oC
selama 2 menit, supernatan dibuang dan
disentrifus kembali dalam keadaan kosong.
Kolom ditambahkan dengan 30 RL bufer TE
/
(65 70 °C) lalu diinkubasi selama 1
menit pada suhu ruang. Kolom yang berfilter
dipindahkan ke tabung mikro 1.5 mL dan
disentrifus pada 12000 rpm, 25 oC selama 3
menit. Hasil elusi berupa supernatan
diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa
1 %.
Pengklonan Fragmen DNA dengan Vektor
pGEM T
Hasil amplifikasi disisipkan ke dalam
vektor
pGEM T
(Promega)
menggunakan T4 DNA ligase. Sebanyak 5 OL
2X rapid
'
, 3.5 OL DNA insersi,
0.5 OL vektor pGEM T
, dan 1 OL T4
DNA ligase dimasukkan ke dalam tabung dan
diinkubasi selama 16 jam, 4 oC. Vektor
kemudian ditransformasikan ke dalam sel
yang telah dibuat kompeten.
Preparasi sel kompeten dilakukan dengan
penambahan CaCl2. Bakteri
XL1 '
dikulturkan dalam media LB (Luria Bertani)

8

yang telah ditambahkan ampisilin 100 ppm
pada suhu 37 oC selama semalam. Sebanyak 1
mL bakteri hasil kultur diinokulasikan ke
dalam 3 mL LB yang mengandung ampisilin
100 ppm dan diinkubasi dalam inkubator
bergoyang pada suhu 37 oC dengan kecepatan
150 rpm hingga OD mencapai 0.6.
Selanjutnya, hasil inokulasi dimasukkan ke
dalam tabung mikro steril, didiamkan dalam
es selama 5 10 menit dan disentrifus dengan
kecepatan 6000 rpm pada suhu 4 oC selama 2
menit. Pelet diresuspensikan dengan 1 mL 0.1
M CaCl2 dingin lalu didiamkan di es selama
15 menit. Tabung disentrifus kembali dengan
kecepatan 6000 rpm pada suhu 4 oC selama 2
menit. Pelet disuspensikan kembali dengan
200 OL 0.1 M CaCl2 dingin dan disimpan
pada 20 oC.
Transformasi dilakukan dengan cara 200
L sel kompeten dimasukkan ke dalam tabung
mikro lalu ditambahkan 10 L plasmid
rekombinan hasil ligasi pGEM T
dengan
DNA insersi. Tabung segera dimasukkan ke
dalam es selama 30 menit dan diberi
perlakuan kejut panas (
() pada suhu
42 C selama 50 detik lalu diinkubasi dalam
es selama 10 menit. Selanjutnya, tabung
ditambahkan 800 RL campuran media LB dan
glukosa 20 mM tanpa antibiotik lalu
diinkubasi dalam inkubator bergoyang dengan
kecepatan 150 rpm pada suhu 37 oC selama 90
menit. Sel sebanyak 100 L (1/10) disebarkan
di atas media seleksi (media LB agar +
ampisilin + IPTG + X gal) dan sisanya
disentrifus pada 3000 rpm selama 5 menit,
supernatan dibuang dan disisakan sedikit lalu
disebar kembali pada media seleksi (9/10). Sel
diinkubasi selama 16 jam pada suhu 37 oC.
PCR Koloni
Proses PCR koloni diawali dengan lisis sel
oleh pemanasan pada suhu 96 oC selama 5
menit lalu suhu turun menjadi 50 oC yang
berlangsung selama 90 detik. Suhu naik
kembali menjadi 96 oC selama 90 detik dan
turun kembali pada suhu 45 oC selama 90
detik, selama 1 menit pada suhu 96 oC dan 40
o
C. Selanjutnya, campuran PCR (1.5 OL bufer
10X, 2.75 OL ddH2O, 0.3 OL dNTPs, 0.15 OL
primer /
dan
, serta 0.15 OL Taq
polimerase) ditambahkan pada setiap sampel.
Proses PCR dilanjutkan kembali dengan suhu
94 oC selama 30 detik, 57 oC selama 1 menit
dan 72 oC selama 1 menit. Suhu program ini
berulang hingga 30 siklus. Hasil PCR koloni
dianalisis dengan elektroforesis gel agarosa
1%.

Isolasi DNA Plasmid
Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan
menggunakan $
2 (Roche). Sebanyak 4 mL kultur bakteri
disentrifus pada kecepatan 8000 rpm selama 2
menit, supernatannya dibuang dan endapan
yang tersisa ditambahkan 250 RL
!
dan 250 RL +
!
. Isi tabung
dibolak balik sebanyak 6 kali kemudian
diinkubasi selama 5 menit pada suhu ruang.
Campuran ditambahkan 350 RL
!
!
dan disentrifus pada kecepatan
12000 rpm selama 10 menit. Selanjutnya, isi
tabung dipindahkan ke dalam kolom baru dan
disentrifus pada 12000 rpm selama 1 menit.
Supernatan dibuang dan endapan ditambahkan
500 RL 4
!
I lalu disentrifus kembali
pada 12000 rpm selama 1 menit. Supernatan
dibuang dan endapan ditambahkan 700 OL
4
!
II kemudian disentrifus 12000
rpm selama 1 menit. Endapan disentrifus
kembali pada 12000 rpm selama 1 menit
dalam keadaan kosong. Filter dipindahkan ke
dalam tabung mikro 1.5 mL dan ditambah 30
RL
!
lalu diinkubasi 1 menit pada
suhu ruang, disentrifus pada 12000 rpm
selama 1 menit. Hasil isolasi selanjutnya
diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa
1%.
Pengurutan Sekuen Gen
Pengurutan sekuen dilakukan di lembaga
Charoen Phokphand, Jakarta. DNA disekuen
secara dua arah yaitu
/
dan
dengan menggunakan primer M13 F dan
M13 R. Sekuen DNA yang diperoleh
selanjutnya dianalisis menggunakan program
BLAST untuk membandingkan sekuen
nukleotida yang diperoleh dengan sekuen
nukleotida pada basis data. Analisis
menggunakan
BLAST
bertujuan
mengidentifikasi kesesuaian urutan basa yang
didapatkan dengan urutan basa yang ada
dalam bank data.
Pemotongan Vektor pGEM T
dan
Vektor pYES2/CT
Plasmid pGEM T
yang mengandung
DNA rekombinan dipotong dengan enzim
restriksi
RI dan
I. Plasmid rekombinan
sebanyak 7 OL dicampur dengan 1 OL ddH2O,
1 OL bufer restriksi, 1 OL enzim
RI, dan 1
OL enzim
I lalu diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Hasil pemotongan dianalisis
dengan elektroforesis gel agarosa 1%.
Selanjutnya, gel yang mengandung gen
penyandi endoglukanase dipotong dengan
menggunakan skalpel untuk selanjutnya

9

dilakukan proses purifikasi. Vektor ekspresi
pYES2/CT juga dipotong dengan enzim
restriksi yang sama untuk menghasilkan ujung
lengket yang sesuai.
Penyisipan Gen Penyandi Endo 1,4 β
glukanase ke dalam Vektor pYES2/CT
Sebelum dilakukan pengklonan ke vektor
pYES2/CT, terlebih dahulu dilakukan ligasi
gen penyandi endo 1,4 β glukanase dengan
vektor pYES2/CT (Invitrogen). Ligasi
dilakukan dengan menggunakan T4 DNA
ligase dan diinkubasi selama 16 jam pada
suhu 4 oC (Sambrook & Russell 2001). Vektor
kemudian dimasukkan ke dalam
XL1
'
yang telah dibuat kompeten. Metode
transformasi sama seperti yang sudah
dijelaskan sebelumnya.
rekombinan
kemudian disebar dalam media LB agar yang
mengandung 100 ppm ampisilin. Sel yang
bukan rekombinan akan mati akibat perlakuan
ampisilin. Selanjutnya, sebanyak 10 klon
diambil dan dianalisis dengan PCR koloni.
Hasil PCR koloni diverifikasi dengan
elektroforesis gel agarosa 1%.
Plasmid dari
rekombinan diisolasi
dengan menggunakan $
2
(Roche). Isolasi dilakukan
sebagaimana yang terurai dalam .
%
Roche. Hasil isolasi DNA plasmid
diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa
1%.
Penentuan Kadar Protein dengan Metode
Lowry (Lowry
1951)
Pengujian kadar protein dan aktivitas
endoglukanase dilakukan terhadap pelet dan
supernatan sel rekombinan. Sebanyak 25 mL
sel
yang telah ditumbuhkan selama
semalam pada suhu 37 oC dipanen dan
disentrifus dengan kecepatan 10000 rpm
selama 10 menit 4 oC. Supernatan dipisahkan
dari peletnya untuk dilakukan uji kadar
protein
dan
aktivitas
endoglukanase,
sedangkan pelet ditambahkan 1 mL bufer lisis
(50 mM Tris HCl pH 8.0, 5 mM EDTA, 10
mM NaCl) dan digerus dengan mortar lalu
disentrifus dengan kecepatan 12000 rpm
selama 10 menit 4 oC. Supernatan diambil dan
disimpan dalam
&
untuk dilakukan
analisis kadar protein dan aktivitas
endoglukanase.
Sebanyak 50 RL sampel dimasukkan ke
dalam Eppendorf lalu ditambahkan 300 RL
reagen C. Campuran divorteks dan didiamkan
selama 10 menit. Selanjutnya, campuran
ditambahkan 100 RL reagen D kemudian
divorteks kembali dan didiamkan selama 30

menit. Campuran dibaca serapannya pada
panjang gelombang 750 nm. Pengukuran
dilakukan secara triplo dan larutan standar
yang digunakan adalah standar BSA (!
'
).
Pengukuran Aktivitas Endoglukanase
dengan Metode DNS (Modifikasi Ghose
1987)
Sebanyak 50 RL ekstrak enzim kasar yang
telah diisolasi dimasukkan ke dalam tabung
reaksi lalu ditambahkan 250 RL larutan CMC
(karboksimetil selulosa) 2% dan 200 RL bufer
fosfat pH 4.8 hingga volume akhir campuran
500 RL. Campuran ditutup dengan aluminum
foil kemudian dikocok dengan vorteks.
Selanjutnya campuran diinkubasi pada suhu
48 oC selama 60 menit dan dipanaskan
kembali 100 oC selama 10 menit untuk
menghentikan
reaksinya.
Campuran
ditambahkan reagen DNS sebanyak 1.5 mL
lalu dipanaskan pada suhu 100 oC selama 15
menit. Campuran didinginkan selama 20
menit dan serapannya dibaca pada panjang
gelombang 575 nm. Pengukuran dilakukan
secara triplo. Media LB digunakan sebagai
blanko untuk ekstrak enzim kasar dari
supernatan, sedangkan blanko untuk ekstrak
enzim kasar dari pelet menggunakan bufer
lisis. Nilai konsentrasi gula pereduksi yang
dihasilkan dikonversi dari nilai absorban yang
terbaca melalui kurva standar, dengan glukosa
sebagai larutan standar. Satu unit aktivitas
enzim endoglukanase sebanding dengan satu
Rmol glukosa yang dihasilkan per menit,
dengan perhitungan:

.

4 (

( '

[# ( ] (
!%
(

)
)

&

( +)

"

Aktivitas spesifik enzim dihitung dengan
rumus:
.

/

(
2

(
(

/ +)
/ +)

Analisis Data Aktivitas Enzim
Rancangan percobaan yang digunakan
dalam penelitian ini yaitu RAL (rancangan
acak lengkap) dua faktor (Mattjik &
Sumertajaya 2002) dengan model linear
sebagai berikut:
Yij= O + Ai + Bj + (AB)ij
Keterangan:

10

= pengamatan aktivitas endoglukanase
pada perlakuan sumber enzim ke i
dan jenis plasmid ke j.
O
= rataan umum
Ai
= pengaruh perlakuan sumber enzim
ke i.
= pengaruh perlakuan plasmid ke j
Bj
(AB)ij = pengaruh interaksi perlakuan sumber
enzim ke i dan perlakuan jenis
plasmid ke j.
i
= supernatan, pelet
j
= kontrol, pGEM T, pYES
Yij

Bentuk hipotesis yang diuji:
Pengaruh utama faktor A:
H0 = A1 = … = Aa = 0 (faktor A tidak
berpengaruh)
H1 = paling tidak ada satu i dimana Ai≠0
Pengaruh utama faktor B:
H0 = B1 = … = Bb = 0 (faktor B tidak
berpengaruh)
H1 = paling tidak ada satu i dimana Bj≠0
Pengaruh sederhana (interaksi) faktor A dan
faktor B:
H0 = (AB)11 = … = (AB)ab = 0 (interaksi
faktor A dengan faktor B tidak
berpengaruh)
H1 = paling tidak ada sepasang (ij) dimana
(AB)ij≠0
Hipotesis diuji dengan ANOVA dengan
nilai α= 0.05. Nilai H0 ditolak bila nilai p
kurang dari α. Hasil analisis sidik ragam
dilanjutkan dengan uji Duncan.

1.86 2.01, sedangkan rasio A260/230 berkisar
antara 1.39 1.75. Rasio A260/280 menunjukkan
kemurnian RNA terhadap kontaminan protein,
sedangkan rasio A260/230 menunjukkan
kemurnian RNA terhadap polisakarida.
Menurut Sambrook & Russell (2001), RNA
memiliki kemurnian yang tinggi jika rasio
A260/280 sebesar 1.80 2.00. Berdasarkan Tabel
1, dapat diketahui bahwa sampel memiliki
kemurnian yang tinggi terhadap kontaminan
protein.
Secara umum, tahapan isolasi RNA
meliputi
pemecahan
dan
solubilisasi
membran, isolasi dan pemurnian RNA, serta
pemekatan RNA. Pemecahan sel kapang
dilakukan dengan cara digerus di dalam
mortar dengan penambahan nitrogen cair.
Penambahan nitrogen cair ini bertujuan untuk
menjaga RNase dalam keadaan tidak aktif
sehingga RNA yang diisolasi tidak mengalami
degradasi oleh RNase. Selain itu, pembekuan
sampel dengan penambahan nitrogen cair
memudahkan dalam proses penggerusan.
Bufer RLT yang terdapat pada 1
% 2 mengandung guanidin
tiosianat yang berfungsi untuk melisis sel dan
mengendapkan
protein.
Bufer
RW1
mengandung etanol dan guanidin tiosianat
dalam jumlah sedikit untuk menghambat
aktivitas nuklease (Qiagen 2006). Tahap
ekstraksi sel dilakukan dengan penambahan β
merkaptoetanol sebagai antioksidan agar RNA
tidak rusak. Sementara itu, bufer RPE
berfungsi sebagai bufer pencuci untuk
menghilangkan membran (Qiagen 2006).
Tahap pemekatan RNA dilakukan dengan cara
pengendapan menggunakan etanol 96%.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi RNA Total
RNA total dari
dan
telah berhasil diisolasi dengan
menggunakan 1
% 2 .
Hal ini dapat dilihat pada Gambar 5. Hasil
elektroforesis gel agarosa 1% menunjukkan
bahwa RNA dari kapang
dan
telah berhasil diisolasi. Hal ini dapat
dilihat dengan adanya dua pita yang utuh
berupa rRNA yang berukuran 28S dan 18S.
Sambrook & Russell (2001) menjelaskan
bahwa
adanya
kedua
pita
tersebut
mengindikasikan bahwa RNA tersebut
memiliki integritas yang baik.
Kuantitas RNA yang telah diisolasi diukur
dengan metode spektrofotometri. Hasil
pengukuran kuantitas RNA yang diperoleh
dari perbandingan A260/280 berkisar antara

F
N
Gambar 5 Hasil elektroforesis RNA total
(F) dan
(N).
Tabel 1 Konsentrasi dan kemurnian RNA
hasil isolasi
[RNA]
Sampel
A260/280
A260/230
Og/mL
F

2.01

1.75

1100

N

1.86

1.39

920

11

Kuantitas dan kualitas RNA yang baik
akan mempengaruhi keberhasilan sintesis
cDNA. Hal ini dikarenakan proses RT PCR
yang melibatkan sintesis cDNA membutuhkan
RNA dengan kemurnian yang tinggi. Menurut
Budiani
(2004), selain spesifitas primer,
suhu penempelan dan konsentrasi MgCl2,
keberhasilan reaksi RT PCR juga sangat
ditentukan oleh kualitas dan kuantitas RNA
yang digunakan.

Perancangan Primer
Sekuen primer yang digunakan untuk
amplifikasi PCR dapat mempengaruhi
spesifitas dan sensitivitas reaksi. Perancangan
primer dilakukan pada daerah terkonservasi
dari sekuen gen penyandi endoglukanase yang
terdapat pada situs NCBI dengan nomor akses
XM 745547 untuk
Af293 dan AF331518 untuk
.
Primer
dirancang
dengan
memperhatikan beberapa parameter, meliputi
panjang primer, %G+C, suhu penempelan dan
Tm (
), kestabilan ujung
basa 5’ dan spesifitas ujung basa 3’ (Abd
Elsalam 2003). Kriteria primer yang
digunakan untuk amplifikasi yaitu panjangnya
berkisar antara 18 25 pasang basa, panjang
sepasang primer tidak lebih dari 3 pasang
basa, memiliki jumlah basa G+C 40 60%,
pasangan primer
/
dan
tidak
saling komplemen, tidak terjadi primer dimer
antara
/
dan
, pada ujung 3’
tidak mempunyai basa nukleotida T, dan
memiliki
(Tm) tidak
melebihi 70 oC (Sambrook & Russell 2001).
Sekuen primer
/
dianalisis
menggunakan sekuen daerah
dengan
urutan
basa
5′
ATGAAATTCGGTAGCATTGTGC 3′ dan
daerah
dengan urutan basa 5′
CGCATGAAGTTTCAGAGCAC 3′ (Tabel
2). Sekuen primer
untuk daerah
dan
masing masing adalah

Tabel 2 Karakteristik pasangan primer

5’ TCAACCCAGGTAGGGCTCCA 3‘ dan
5‘ CCAGACCTCAAAGATATGCC 3’.

Amplifikasi Gen Penyandi Endo β 1,4
glukanase
Amplifikasi gen dilakukan dengan
menggunakan teknik RT PCR. Sintesis cDNA
merupakan tahap awal untuk memulai
amplifikasi gen dari sampel RNA. Reaksi
sintesis
*
cDNA membutuhkan
sebuah primer. Primer yang digunakan adalah
oligo (dT) dengan tujuan agar mudah
terhibridisasi dengan poli(A) pada ujung 3’
yang umum dijumpai pada mRNA sel
eukariot (Invitrogen 2003). Konsentrasi yang
digunakan untuk sintesis
adalah 2
ng/OL dan hasil cDNA yang diperoleh
berjumlah seragam. Prinsip dari proses ini
adalah transkripsi balik dengan menggunakan
enzim
yang memiliki
aktivitas RNA
DNA polimerase,
DNA
DNA polimerase, dan RNase
H (Sambrook & Russell 2001). RNase H
ini akan mendegradsi RNA dari molekul
RNA cDNA hibrida yang terbentuk setelah
cDNA terbentuk.
Setelah diperoleh utas cDNA, selanjutnya
dilakukan
proses
PCR
konvensional
menggunakan primer spesifik
Dengan
mengoptimasi kondisi PCR, pada awalnya
suhu penempela