a. Ekstrasi RNA Lampiran 2, 3, dan 4
1 Homogenasi
Homogenasi dilakukan dengan menggunakan 1 ml reagen TRIzol untuk 1 g jaringan dengan memakai power homogenizer. Volume sampel tidak lebih
dari 10 volume reagen TRIzol. Homogenasi dilakukan dengan kecepatan 12,000 x g selama 10 menit, diulang 3 kali, hingga seluruh jaringan hancur.
2 Fase Separasi
a Sampel yang sudah dihomogenasi diinkubasi selama 5 menit pada suhu
ruang agar kompleks Nukleoprotein terdisosiasi secara sempurna. b
Kloroform sebanyak 0,2 ml per 1 ml reagen TRIzol dimasukkan ke dalam tabung.
c Tabung ditutup dengan kencang dan dikocok secara kuat selama 15
detik. d
Tabung diinkubasi pada suhu ruang selama 3 menit. e
Sentrifugasi sampel tidak lebih dari 12.000 x g selama 15 menit pada suhu 2
C. f
Selama sentrifugasi, campuran akan terpisah menjadi berwarna merah pada bagian bawah, fase fenol-kloroform, interfase, dan paling atas
adalah aqueous yang tidak berwarna. Volume dari fase aqueous sekitar 60 dari total volume TRIzol yang digunakan untuk homogenisasi.
3 Presipitasi RNA
a Fase aqueous dipindahkan ke tabung yang baru.
b Presipitasi RNA dari fase aqueous dengan mencampurkannya dengan
alkohol isopropil. c
Alkohol isopropil yang digunakan sebanyak 0,5 ml tiap 1 ml reagen TRIzol.
d Sampel diinkubasi pada suhu ruang selama 10 menit dan disentrifugasi
pada 12.000 x g selama 10 menit pada suhu 2 C.
e Presipitat RNA sering tidak terlihat sebelum sentrifugasi, bentuknya gel
seperti pelet pada tepi dan dasar tabung. 4
Pencucian RNA a
Supernatan diambil. b
Pelet RNA dicuci sekali dengan etanol 75 1 ml etanol 75 untuk tiap 1 ml reagen TRIzol.
c Sampel diaduk dan disentrifugsi pada 7500 x g selama 5 menit pada suhu
2 C.
5 Pemisahan RNA
a Pelet RNA dikeringkan selama 5-10 menit dengan membiarkannya di
udara atau menggunakan vacum. Pengeringan RNA dilakukan secara perlahan-lahan.
b Saring RNA dalam larutan 0,5 SDS dengan cara melewatkan larutan
beberapa saat melalui pipette tip dan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 55
C.
6. Penentuan konsentrasi RNA menggunakan spektrofotometer dengan OD
260
didapatkan konentrasi RNA 40 µ gµ l.
b. RT-PCR
Kategori