Viabilitas Demi Embrio Sapi In Vitro Hasil Splitting Embrio Segar dan Beku
Viabilitas Demi Em brio Sapi I n Vitro Hasil Splitting Em brio Segar dan Beku
M.~ M R O N ' A.
, ROEDIONO~
dan 1. SUPRUTNA'~
'8ala1Ernhrio Ternak C~pelang.PO Box dB5 Bogor 16004
Email: mrnron@deptun.gcl.id
'~oXu11as
Kedolaernn ifcwan, lmrrrut Per~onianBogor
(Dltcr~madewan rcdah~1 I Maret ZDO7)
ABSTRACT
I M R O N . M.. A B~)~!I)IoNo
and I. SUPRIA'I-NA.
2007. Viahilily of bovir~cdcnli crnbryo aftcr splittlng of fresh and frozcn thawed
emhryu derived from in vrrco cmhyn produr\\nr~Jl7'1J 132). 1 18-123.
In vivn c m h ~ productiun
o
was limited by n u m k r of donor. widc variabil~tyrespond due lo supctovularion program and also
~rnmunoacr~li~y
of suprrovulation hormcne (FSH) Splilting technoluky could bbr an alternative to increase the numher of
rransferrahlc c n h n o l ; i n ~ rrcr
~ lplsn cows. Spiit~ingis done W I th cutting embryo hecoming nvo equal p~cces(called dcmi embrio)
base un ICM oricn~aiion. The ob~ecriveof this rtsearch was to dcrcrmine rhc viability of demi crnbryo ohta~nedfrom embryo
split~~ng
o:'lir.\h and f r w t n thawcd embryo 'The results showed [hat dcmi crnhryos which perrormed bl=~ococl recxpansiun 3
hours afler e1tthn.o sp11rti11gusing t'rcsh and frozen !hawed embryos ucre 76.9 and 76 2% respccl!vely. Base on cxistenlion of
inncr ccll mars {\Chi), thc number of demi entbpos dcvclopcd with ICM from fresh and frozen thawed cmbryos wcrc not
significm~lydin-crtnt (90.6 and 85.7% rcspcctivcly. The cell number of dcmi embryo from fresh embryos splitting was not
dilfercnt ctrmparcd u tth ~ h u wfrom Iroztn thawed ernbqos ( 3 6 . t and 35.9 I C S ~ C C L ~These
V ~ ~ ~finding
).
indica~cdthat embryo
s p l ~ i t ~ ncan
g br appllrd 10Iro7.m hawed embryos with certain condition as wcll as frcsh embryos.
Kcy Words In f r ~ t r I:mhryo,
c
Spl~ning,Demi Embryo, Cell Number
ARSTRAK
I m O N , M., A ROEDIONOdan I. S U P R I A ~ A 2007.
.
Viabilitas demi c m Q r ~ sapi
o
in vrrro basil splitling embrio s e g u dan bcku.
JITVlZ(2). 118-123
Produlsi embrio in vivo temak sapi dipenemhi antara lain 01th respon sapi donor tethadap program supeerovulasi yang
sangat bervariasi. immunod~ifitashorrnon superovulasi (FSH) serm ktlerbaman jumlah sapi donor. Teknologi syiltting embrio
d~barapkandapat menjadi allematif untuk optimalisasi penambahan jumlah embrio ymg dapat ditransfcr ke resipien per embrio
uiuh. Tujuan penelilnn ini adalah untuk meneotukan vrabilita? demi embrio yang dlhasilkan setelah proscs spl~tting
mcnggunakan embrio in ripe segar dm beku. Spl~ningembrio dilakukan dengan membelah embrro menjadi dua bagian yang
sama (derni emhr~o)dengan mempert~mbangkankcberadmn ICM. Setelah dilakukan splitting embri? diperolth hasil bahwa
d e m ~clnbrio yang menunjukkan adanya reekspansi blastosoel tiga jam setelah xplittrng menggunakan cmbrio segar dm beku
tidak herhcda nyab (76,9 dan 76,2%) Berdasarkan keberadaan inner cell mass (ICM), lumfah demi embrio yang positif
mcmiliki ICM untuk crnbrio scgar dan beku tidak krbeda nyata (90.6 dm 85,7%). Demikian juga dtngan r a m jumlah sel
denti embrio segar dan beku (36,I dan 35,9) tidak berbeda nyala. I l a s i l ini mcngindikuihn ballva spitning embrio dapat
dilakukan pada em bna beku yang m e n i l i k ~hireria tertentd dengan kualitas hasi! setara dengan emhrio szgx
U a t a Kunci: Ernbrio In Viho. Splitring
Embrio, Demi Fmbrio, Jurnlah Sel
Aplikasi bioteknolagi ttproduksi pada tern& sapj di
Inddnesia dalarn beberapa dekade terakhir telah
mcnunjukkati petkcm bangan yang cuLup pcsat. 1Ial ini
ditnulai dengan pcnerapan tehologi inserninasi buatan
(IB) sekitar tahun 1970-an yang ditandai dengan
didirikannya Baiai lnscrninasi Buatan (BTB)Lembang.
Apl~kasi transfer embrio (TE) pada sapi mulai
dilaksanakarl diawal dekade 90-an yang ditandai dengan
didirikannya Balai Embrio Ternak (BET) di Desa
Cipelang,
Bogor.
Teknologi
TE memberikan
keunggulan lebih dibandingkan denean IB karena
peningkatan kualilas genetik dapat didckati baik dari
sisi pejantan riaupun dari sisi betinanya sehingga
percepatan mutu gcnetis ternak dapat dllakukan secar3
khih efis~en.
Produksi embrio sapi secara in vivo banyak
menemuf kendala antara lain karena respon sapi donor
tcrhadap program superovulasi sangat ben'ariasi,
keterbatasan jumlali sapi donor dan immunoaktifitas
hormon superovulasi VSH) yang tidak stabil sehingga
jumlah produksi err,brio irr v i v ~sulit dibuat target yang
pasti (ANUNIMOIIS,7,006; GONG el a/, 1993; KELLEK
dan TEEPKER,
1990; K n ~ r T zet al., 2003). Altematif
lain untuk produlsi embric? yang dapat dilakukan yaitu
dengan memproduksi en1 brio in vitro (1VF). Tetapi
karena oosit yang digunakan untuk JVF berasal dari
Rumah Pemotongan Hewan yang tidak jelas tetuanya.
mulu genelik cmbrio in vilrr? tidak dapat
dipertanggungjawahkan sehingga pcdet yang dlhasilkan
dari embrio in virro tldak dapat digunakan sebagai bib11
dasar.
Teknologi lain yang dapat digunakan unluk
optimalisasi produksi enibrio adalah dengan teknik
sp/irring yaitu memotong embr~omenjadi dua bagian
yang sama. Potongan embrio yang dihasilkm dalam
proses spliffing selanjutnya disebut "derni embrio".
Teknik splitring ernbrio dilaporkan telah dilakukan pada
ternak domha (WILLADSISN,19791, Lambing (Srov,
1987; NOWSII,indahkm ke media mPBS yang
rnengandung b e r h m t - m t 0,5 M dan 0,25 M sukrose
masing-masing selanla 5 menit. Setelail itu embrio
dicuci rnenggui~akanmPBS dan media kultur CRlaa.
Akl-irnya embrio di kcltur lebih lanjut dan diinkubasi
selama 24 jam dalam inkubator COz 5% pada suhu
38-5OC.
Tabel 1. Komposisi media v i t r i t i h i yang digunakan untik pernbckuan ernbrio
Media
Glycrrdl(%)
EtiIrn pliko) (Ye1
Sucrc~se1M)
Xvlosc (MI
Poly etilen alikul I % )
cueuilp
u ~ r ~ q e ~ ~ueepaq~ad
ad
yaio ueqleq!ye!p
ueu!y3unway !u! 11st:y umpaqlad nyaq olAquIa
'02' E 1
rruap uc3usp r~eqSu!puuqrp !Z;7u!l q!qal ~ 1 e . hSu!qureq asea[aa
q~~!u!~
eq!isrlefi
y
alehyos ueyaun88uaur
L
rq~ed~ e h Us I J ~ U I ~!w3p sel![!qv!r, e.nqeq ueqeieiuaru
(866 I ' a ~ v n ~ s ~!id!l?jsap
o~)
olesas t!n~p ueny q ~ a d
ZUPX Ic h I)~ ~ ~ l o 1uep
1 I ~ V ls.niq
I
qa[o ueqllqeI!p
lelue I!sz?r[ ueepaqlad ,(JVH) deq2us1 qe3e UEZUE~UPJ
2uv.i UI~II [auld u ~ 3 u a pvpaqlaq I U I I!seI 1 ~ e S a so!Jqrua
lesep ue~eun32uaur ue2uap es!leue!p e l e n
111:5uap~ixydu~puvq!p
mues J I ~ U I E I~~ B I B ~nyaq
~ : OlJqUa
~ I ~ I ! u ~ I ? ~S~' ILJII ~~ I Iuq!wqlJqay
~JS
Ei ~ y q
wq! p a l (:
I q I i . ) (%9'06) bZ urrp ( ~ ~ ' 5 8OE) qqepe w n l - l n ~ n u a q
r d a s O ! J ~ LUCP
U ~f l y ~ q0!~qu13~ q e u n l i 5 i z a i l l! J E ~ ~ I S ! ~ D
Zu111lds viala.; ~ m s a so!rqrua !rrraa ( 3 ,nlrqtuJ
!eSeqas ~ 3 J1 C ~ O
U ! ~J ~ L U3u!l~rlds
~
uel!ssylaqaX
Xu'vlr~~ll.IS
(q :(11euud epucl) y a d w.wa msep cped
uayepaqlp iedvp s q a ( wessc ?UP,{ s e l q o d n ~ l
1 t q mm:s;llrv) (r! -ouqma X~rr~r~ltls
saso~dr n , i ~ [ l e . [ - 1 l e q l u e 3
u ~ h.1~
p
Guynjugq~~1
ueqynrunuaur wsf pz-c ~ ~ ~ 1 3 s
Jnl[n y q q n l a s Jrr!qwey n!Jq 1~1; eped Y r t ! ~ i ~ l i ldelep
s
u ~ y ~ ! s c y al p' u v i o!JquIa !wap v:.\qrq ueyndrr[aw ( 5 0 0 ~ )
o x o l a g o a ,ua!disal !des a y ~ a j s u t ? ~ l !qnlun
p
dels uep
] S ~ D ! A ' l e w o u a m a s Suequ~ayraqyela1 o!lqlua ! u a p
eMyeq ueyl~seuraurqmun dnyn:, d ~ H u e ! pu r ~Ef surelas
l n l l n q efiqeq uc~uwskuaur t u ~ Itset1 'o!Jqua y a p
ucqrpr~!uradsasold wqep ue>tl![n.Ctraur vSSu!qas lni[nq
c!paiu m q e p lnynyoy !e4cqns ueq~un3!pSueL sn[nurny -.
[as-[as ues!del u ~ % u a pru~Auauruep IrrlIny !nad UEMW
lescp eped [adruauatu r r a v o!Jqrua !w2p 13s-13s .ue[
I
!srirdsy.>ar !pcr~ai
- 5 t r 1 1 1 t j O i sahod Llr:I>I>\ iuri
erue(as: dnpiy [as i(r?lu11-1!'
nl1e.i ~ I ~ O [ O J J O U I wesac l l r l ~ l i ~ q l l l . 3 ~ I~L3I I ~d: I P ~ U J U I
uep Ix>~t~~sr:ILl
!si~eclc.+a.>l inlqojorl '~q31U \ ! I : I ~ : J J ~ . I Y
L I V I ~ I o!Jqiua I U I J ~Lh'!tt~;~+!l>.3\0.1~! t ~ i > l . > i ~LUVC
s
E ~ 1,I :z
.o!lqura ylr)u>q niru.i u!lqwa !wap I-~O~OJJOLIJ d l ' p c ~ ~ ~ l
ur?!3eq z ~ c q u l c g )o!lqu!n du~~louraur
lpes e p d rJd y r r r r
nyrls eppd o i l ; '02
trvs!d iIcuey31 qnrr?5rlnd I ? u a m j ;uolunl e < u y r ~ ~ u a q u ~ y 1 i y q ! p riel~:u~cdund--J,S'YC
~ r > l c q ~ ~ qI(IUIF?P
u!
r s ~ q ~ i ~ uI!I U! Pp ucl
~ r u ~ n~ y! p s u ~
~ u , I J J ! III ~F ?>~~~ A Sl w s x o!lqu13 !uI.>(~;JL?CJLUF!) eyed
uv;-iunp ! ~ n . ~ !Xur~~!jrls
p
[ ! s v q uuqlua luau '(1 ~eqru~:))
lcr[!lrp ledep S t r t j l t / r l c tlcjlras ~ u ecl uap ;i~r!,,i/dsqplalas
kccsas otJqula ! l i ~ ~ ps!Sn[tq~tllu rrcdu~ptreq~n,~ isor);) O N ~ I U . I O H ~ J I U uey~udr:l~pqel-71 Zuei apoiaul
i~eduap !arlsas ue.jllyellp n!Jqrua &i!~rrlds.UE~~I[JU.ILI
1"qe.L)
qenq ( ~ 2 ' 9 2:
~ ) qe.iurqas o!lquIa !Map ueql!seqSuscu !nietu !~3erlacuvljeunS!p SUE,i uu!lauauuad uos!~edmo3
M.~ M R O N ' A.
, ROEDIONO~
dan 1. SUPRUTNA'~
'8ala1Ernhrio Ternak C~pelang.PO Box dB5 Bogor 16004
Email: mrnron@deptun.gcl.id
'~oXu11as
Kedolaernn ifcwan, lmrrrut Per~onianBogor
(Dltcr~madewan rcdah~1 I Maret ZDO7)
ABSTRACT
I M R O N . M.. A B~)~!I)IoNo
and I. SUPRIA'I-NA.
2007. Viahilily of bovir~cdcnli crnbryo aftcr splittlng of fresh and frozcn thawed
emhryu derived from in vrrco cmhyn produr\\nr~Jl7'1J 132). 1 18-123.
In vivn c m h ~ productiun
o
was limited by n u m k r of donor. widc variabil~tyrespond due lo supctovularion program and also
~rnmunoacr~li~y
of suprrovulation hormcne (FSH) Splilting technoluky could bbr an alternative to increase the numher of
rransferrahlc c n h n o l ; i n ~ rrcr
~ lplsn cows. Spiit~ingis done W I th cutting embryo hecoming nvo equal p~cces(called dcmi embrio)
base un ICM oricn~aiion. The ob~ecriveof this rtsearch was to dcrcrmine rhc viability of demi crnbryo ohta~nedfrom embryo
split~~ng
o:'lir.\h and f r w t n thawcd embryo 'The results showed [hat dcmi crnhryos which perrormed bl=~ococl recxpansiun 3
hours afler e1tthn.o sp11rti11gusing t'rcsh and frozen !hawed embryos ucre 76.9 and 76 2% respccl!vely. Base on cxistenlion of
inncr ccll mars {\Chi), thc number of demi entbpos dcvclopcd with ICM from fresh and frozen thawed cmbryos wcrc not
significm~lydin-crtnt (90.6 and 85.7% rcspcctivcly. The cell number of dcmi embryo from fresh embryos splitting was not
dilfercnt ctrmparcd u tth ~ h u wfrom Iroztn thawed ernbqos ( 3 6 . t and 35.9 I C S ~ C C L ~These
V ~ ~ ~finding
).
indica~cdthat embryo
s p l ~ i t ~ ncan
g br appllrd 10Iro7.m hawed embryos with certain condition as wcll as frcsh embryos.
Kcy Words In f r ~ t r I:mhryo,
c
Spl~ning,Demi Embryo, Cell Number
ARSTRAK
I m O N , M., A ROEDIONOdan I. S U P R I A ~ A 2007.
.
Viabilitas demi c m Q r ~ sapi
o
in vrrro basil splitling embrio s e g u dan bcku.
JITVlZ(2). 118-123
Produlsi embrio in vivo temak sapi dipenemhi antara lain 01th respon sapi donor tethadap program supeerovulasi yang
sangat bervariasi. immunod~ifitashorrnon superovulasi (FSH) serm ktlerbaman jumlah sapi donor. Teknologi syiltting embrio
d~barapkandapat menjadi allematif untuk optimalisasi penambahan jumlah embrio ymg dapat ditransfcr ke resipien per embrio
uiuh. Tujuan penelilnn ini adalah untuk meneotukan vrabilita? demi embrio yang dlhasilkan setelah proscs spl~tting
mcnggunakan embrio in ripe segar dm beku. Spl~ningembrio dilakukan dengan membelah embrro menjadi dua bagian yang
sama (derni emhr~o)dengan mempert~mbangkankcberadmn ICM. Setelah dilakukan splitting embri? diperolth hasil bahwa
d e m ~clnbrio yang menunjukkan adanya reekspansi blastosoel tiga jam setelah xplittrng menggunakan cmbrio segar dm beku
tidak herhcda nyab (76,9 dan 76,2%) Berdasarkan keberadaan inner cell mass (ICM), lumfah demi embrio yang positif
mcmiliki ICM untuk crnbrio scgar dan beku tidak krbeda nyata (90.6 dm 85,7%). Demikian juga dtngan r a m jumlah sel
denti embrio segar dan beku (36,I dan 35,9) tidak berbeda nyala. I l a s i l ini mcngindikuihn ballva spitning embrio dapat
dilakukan pada em bna beku yang m e n i l i k ~hireria tertentd dengan kualitas hasi! setara dengan emhrio szgx
U a t a Kunci: Ernbrio In Viho. Splitring
Embrio, Demi Fmbrio, Jurnlah Sel
Aplikasi bioteknolagi ttproduksi pada tern& sapj di
Inddnesia dalarn beberapa dekade terakhir telah
mcnunjukkati petkcm bangan yang cuLup pcsat. 1Ial ini
ditnulai dengan pcnerapan tehologi inserninasi buatan
(IB) sekitar tahun 1970-an yang ditandai dengan
didirikannya Baiai lnscrninasi Buatan (BTB)Lembang.
Apl~kasi transfer embrio (TE) pada sapi mulai
dilaksanakarl diawal dekade 90-an yang ditandai dengan
didirikannya Balai Embrio Ternak (BET) di Desa
Cipelang,
Bogor.
Teknologi
TE memberikan
keunggulan lebih dibandingkan denean IB karena
peningkatan kualilas genetik dapat didckati baik dari
sisi pejantan riaupun dari sisi betinanya sehingga
percepatan mutu gcnetis ternak dapat dllakukan secar3
khih efis~en.
Produksi embrio sapi secara in vivo banyak
menemuf kendala antara lain karena respon sapi donor
tcrhadap program superovulasi sangat ben'ariasi,
keterbatasan jumlali sapi donor dan immunoaktifitas
hormon superovulasi VSH) yang tidak stabil sehingga
jumlah produksi err,brio irr v i v ~sulit dibuat target yang
pasti (ANUNIMOIIS,7,006; GONG el a/, 1993; KELLEK
dan TEEPKER,
1990; K n ~ r T zet al., 2003). Altematif
lain untuk produlsi embric? yang dapat dilakukan yaitu
dengan memproduksi en1 brio in vitro (1VF). Tetapi
karena oosit yang digunakan untuk JVF berasal dari
Rumah Pemotongan Hewan yang tidak jelas tetuanya.
mulu genelik cmbrio in vilrr? tidak dapat
dipertanggungjawahkan sehingga pcdet yang dlhasilkan
dari embrio in virro tldak dapat digunakan sebagai bib11
dasar.
Teknologi lain yang dapat digunakan unluk
optimalisasi produksi enibrio adalah dengan teknik
sp/irring yaitu memotong embr~omenjadi dua bagian
yang sama. Potongan embrio yang dihasilkm dalam
proses spliffing selanjutnya disebut "derni embrio".
Teknik splitring ernbrio dilaporkan telah dilakukan pada
ternak domha (WILLADSISN,19791, Lambing (Srov,
1987; NOWSII,indahkm ke media mPBS yang
rnengandung b e r h m t - m t 0,5 M dan 0,25 M sukrose
masing-masing selanla 5 menit. Setelail itu embrio
dicuci rnenggui~akanmPBS dan media kultur CRlaa.
Akl-irnya embrio di kcltur lebih lanjut dan diinkubasi
selama 24 jam dalam inkubator COz 5% pada suhu
38-5OC.
Tabel 1. Komposisi media v i t r i t i h i yang digunakan untik pernbckuan ernbrio
Media
Glycrrdl(%)
EtiIrn pliko) (Ye1
Sucrc~se1M)
Xvlosc (MI
Poly etilen alikul I % )
cueuilp
u ~ r ~ q e ~ ~ueepaq~ad
ad
yaio ueqleq!ye!p
ueu!y3unway !u! 11st:y umpaqlad nyaq olAquIa
'02' E 1
rruap uc3usp r~eqSu!puuqrp !Z;7u!l q!qal ~ 1 e . hSu!qureq asea[aa
q~~!u!~
eq!isrlefi
y
alehyos ueyaun88uaur
L
rq~ed~ e h Us I J ~ U I ~!w3p sel![!qv!r, e.nqeq ueqeieiuaru
(866 I ' a ~ v n ~ s ~!id!l?jsap
o~)
olesas t!n~p ueny q ~ a d
ZUPX Ic h I)~ ~ ~ l o 1uep
1 I ~ V ls.niq
I
qa[o ueqllqeI!p
lelue I!sz?r[ ueepaqlad ,(JVH) deq2us1 qe3e UEZUE~UPJ
2uv.i UI~II [auld u ~ 3 u a pvpaqlaq I U I I!seI 1 ~ e S a so!Jqrua
lesep ue~eun32uaur ue2uap es!leue!p e l e n
111:5uap~ixydu~puvq!p
mues J I ~ U I E I~~ B I B ~nyaq
~ : OlJqUa
~ I ~ I ! u ~ I ? ~S~' ILJII ~~ I Iuq!wqlJqay
~JS
Ei ~ y q
wq! p a l (:
I q I i . ) (%9'06) bZ urrp ( ~ ~ ' 5 8OE) qqepe w n l - l n ~ n u a q
r d a s O ! J ~ LUCP
U ~f l y ~ q0!~qu13~ q e u n l i 5 i z a i l l! J E ~ ~ I S ! ~ D
Zu111lds viala.; ~ m s a so!rqrua !rrraa ( 3 ,nlrqtuJ
!eSeqas ~ 3 J1 C ~ O
U ! ~J ~ L U3u!l~rlds
~
uel!ssylaqaX
Xu'vlr~~ll.IS
(q :(11euud epucl) y a d w.wa msep cped
uayepaqlp iedvp s q a ( wessc ?UP,{ s e l q o d n ~ l
1 t q mm:s;llrv) (r! -ouqma X~rr~r~ltls
saso~dr n , i ~ [ l e . [ - 1 l e q l u e 3
u ~ h.1~
p
Guynjugq~~1
ueqynrunuaur wsf pz-c ~ ~ ~ 1 3 s
Jnl[n y q q n l a s Jrr!qwey n!Jq 1~1; eped Y r t ! ~ i ~ l i ldelep
s
u ~ y ~ ! s c y al p' u v i o!JquIa !wap v:.\qrq ueyndrr[aw ( 5 0 0 ~ )
o x o l a g o a ,ua!disal !des a y ~ a j s u t ? ~ l !qnlun
p
dels uep
] S ~ D ! A ' l e w o u a m a s Suequ~ayraqyela1 o!lqlua ! u a p
eMyeq ueyl~seuraurqmun dnyn:, d ~ H u e ! pu r ~Ef surelas
l n l l n q efiqeq uc~uwskuaur t u ~ Itset1 'o!Jqua y a p
ucqrpr~!uradsasold wqep ue>tl![n.Ctraur vSSu!qas lni[nq
c!paiu m q e p lnynyoy !e4cqns ueq~un3!pSueL sn[nurny -.
[as-[as ues!del u ~ % u a pru~Auauruep IrrlIny !nad UEMW
lescp eped [adruauatu r r a v o!Jqrua !w2p 13s-13s .ue[
I
!srirdsy.>ar !pcr~ai
- 5 t r 1 1 1 t j O i sahod Llr:I>I>\ iuri
erue(as: dnpiy [as i(r?lu11-1!'
nl1e.i ~ I ~ O [ O J J O U I wesac l l r l ~ l i ~ q l l l . 3 ~ I~L3I I ~d: I P ~ U J U I
uep Ix>~t~~sr:ILl
!si~eclc.+a.>l inlqojorl '~q31U \ ! I : I ~ : J J ~ . I Y
L I V I ~ I o!Jqiua I U I J ~Lh'!tt~;~+!l>.3\0.1~! t ~ i > l . > i ~LUVC
s
E ~ 1,I :z
.o!lqura ylr)u>q niru.i u!lqwa !wap I-~O~OJJOLIJ d l ' p c ~ ~ ~ l
ur?!3eq z ~ c q u l c g )o!lqu!n du~~louraur
lpes e p d rJd y r r r r
nyrls eppd o i l ; '02
trvs!d iIcuey31 qnrr?5rlnd I ? u a m j ;uolunl e < u y r ~ ~ u a q u ~ y 1 i y q ! p riel~:u~cdund--J,S'YC
~ r > l c q ~ ~ qI(IUIF?P
u!
r s ~ q ~ i ~ uI!I U! Pp ucl
~ r u ~ n~ y! p s u ~
~ u , I J J ! III ~F ?>~~~ A Sl w s x o!lqu13 !uI.>(~;JL?CJLUF!) eyed
uv;-iunp ! ~ n . ~ !Xur~~!jrls
p
[ ! s v q uuqlua luau '(1 ~eqru~:))
lcr[!lrp ledep S t r t j l t / r l c tlcjlras ~ u ecl uap ;i~r!,,i/dsqplalas
kccsas otJqula ! l i ~ ~ ps!Sn[tq~tllu rrcdu~ptreq~n,~ isor);) O N ~ I U . I O H ~ J I U uey~udr:l~pqel-71 Zuei apoiaul
i~eduap !arlsas ue.jllyellp n!Jqrua &i!~rrlds.UE~~I[JU.ILI
1"qe.L)
qenq ( ~ 2 ' 9 2:
~ ) qe.iurqas o!lquIa !Map ueql!seqSuscu !nietu !~3erlacuvljeunS!p SUE,i uu!lauauuad uos!~edmo3