Kombinasi perendaman dalam natrium hidroksida dan aplikasi kitin deasetilase terhadap kitin kulit udang untuk menghasilkan kitosan dengan berat molekul rendah
KOMB1NASI PERENDAMAN DALAM NATRIUM HIDROKSIDA DAN
APLIKASI KITIN DEASETILASE TERHADAP KITIN KULIT UDANG
UNTUK MENGHASILKAN KITOSAN DENGAN BERAT MOLEKUL
RENDAH
(Combination cf Soaking in Sodium Hydroxide and Chithin Deacetylase Apphcution on
Shrimp Chit in in Producing Low Molecular Weight Chitosan
Aswita Emmawati
1, Betty Sri Laksmi Jeni
2, Yusro Nuri Fawzya
3I) Laboratorium Mikrobiologi Program Studi Teknologi Hasil Pertanian,
Fakuilas Pertanian UniversitasMulawarman, JL Tanah Grogot Kampus Gunug Kelua
Samarinda 75123. 2)
Fakultas Teknologi Pertanian Instuut Pertanian Bogor, 3) Pusat Riset Pengolahan Produk
dan Sosiai Kkonomi Kelautann dan Perikanan Jakarta
Recieved 10 July 2007 accepted 27 July 2007
ABSTRACT
Thermostable chitin deacetylase produced by Bacillus K29-14 was used to produce
chitosan from shrimp chitin. Chemical treatment before the enzyme application on chitin
was conducted by soaking it in
60 %
NaOH solution, which led chitin to swell and change
the crystalline structure in order to allow the enzyme to penetrate and deacetylate it. The
enzyme had performed high deacetylation degree (72-99 %) following soaking at 60-75 °C
for 60-130 min. and then incubating with the enzyme at 55°C for 24 hours Deacetylation
degree increased when soaking temperature in NaOH was increased or soaking time in
NaOH was lenght, as well as by addition of enzyme. The chitosan had low molecular weight
and viscosity, indicated that depolymerization was occured, so that resulted oligomer
chitosan.
Keywords: chitin, chitosan, chitosan oligosaccharide, chitin deacetylase
PENDAHULUAN
Kitin merupakan polimer terbanyak kedua di alam, setelah selulosa. Secara luas, kitin
terdapat sebagai komponen eksoskeleton
Crustacea
(seperti udang dan kepiring),
Mo/lusca,
serangga, arthropoda, cacing, dan dinding sel fungi. Kitin bersifat tidak ianit air dan hanya
dapat lanit pada asam pekat, sehingga sulit diaplikasikan untuk berbagai keperluan praktis.
Deasetilasi kitin akan menghasilkan kitosan, yang dapat larut dalam asam encer, dan
dalam bentuk oligomernya, dapat larut air. Pemanfaatan kitosan sangat luas, sebagai
antibakteri,
edible coating,
film yang mudah terurai
(biodegradable),
untuk penyulingan air,
penjemihan dan deasidifikasi sari buah, peng-emulsi, pengental,. penstabil, dan untuk
enkap-sulasi. Kitosan juga dapat berfungsi sebagai serat makanan, menurunkan kadar kolestcrol dan
absorpsi lipid scrta sebagai prebiotik (Shahidi
et ah,
1999).
(2)
KOMBLNASI PERENDAMAN DALAM
NATRCUMHIDROKSIDA DAN
APLIKASl KITIN DEASETILASE TERHADAP KITIN
KULIT
UDANG
UNTUK MENGHASILKAN KITOSAN DENGAN
BERAT
MOLEKUL
RENDAH
I
'omhinu f ion of Soaktng inSodium
Hydruxrdc und Chrtm
Deocefylu.se Applt cut ionon
Shrimp C:l7itin In Produutng I,o w Illoiecu/ur We~ght C'Iliio.vunAswita ~ m m a w a t i ' , Betty Sri Laksmi ~enie', Yusro huri ~ a w z ~ a ~ I ) l~boratorr trm M~krobioloKi Prop-am Sf~rd~ lbkrwlop Has11 Per fur IIUI 1, I~ukultu.~ Perta~riui~
Ilt~iversrla.~ M;~Iawurmarr, JI. Iuttah <;rr>go~ Kaqnr.7 h t ~ u r r p ~ I I I L I .krmurttwh 751 23. 2) E'crkttltas 7ektrolup' Perr~urrutr I J I . T I I ~ I I ~ I'erlutltarr U o ~ u r , 3) I'II,WI
HI
W I Peir~oluhut~ Prrdrikdufr &.FIR/ M r l r l o r n t Kelarrtur; dun Perikurml Jukurru
Recievd 10 July 2007 accepted 27 July 2007
ABSTRACT
Thermostable chit in deacetylase produced by Bacillus K29-14 was used to produce chitosan from s h m p chitin. Chemical treatment before the enzyme application on chitin
was conducted by soaking it in 60 % NaOH solution, which led chirin to swell and change the crystalline structure in order to allow the enzyme to penetrzne and deacetylate it. The
enzyme had performed high deacetylation degree (72-99 %) foliowng s o k i n g at 60-75 O C
for 60-180 min. and then incubating with the enzyme at 5 5 "C for 24 hours Deacetyiation degree increased when soaking temperature in NaOH was increased or soaking time in NaOH was lenght, as well as by ddition of enzyme. The chitosan had low molecular
weight and viscosity, indicated that deplymerization was o a r e d , so that resulled
oliyomer chitosan.
Keyword: chit~t~, chtio.wt~, chilo.w~r oligosaccharrde. chrrrrt &acer).Iasf
PENDAHULUAN Produksi kirosm dilakukan di industri Kitin merupakan polimer terbanyak
kedua
dt
dam,setelah
selulosa. Secara has, kirin terdapat sebagai komponen eksoske- leton Crusracea (seperti udang dm kepiting),Mollusco, serangga, arthropods, cacing, clan dinding sel fungi. Kit in bersifat tidak larut air dm hanya &pat larut pada ssam pekat
sehingga sulit diaplikasikan untuk berbagai keperl uan p d i i s .
Deasetilasi kitin akan menghasilkan kitosan, yang dapat larut dalam asarn encer,
dan
dalam bentuk oligornerny& dapat farut air. Pemanfaatan kitosan sangat luas, sebegai antibakteri, edthle caaring, film yang rnudah terurai (biodegradable), untuk penyulingan air, penjemihm dm deasidifikasi saribuah,
peng-emuhi, pengental, penstabil,d m
untukeiikap-sulasi. Kitom juga dapat
berfungsi
sebagai serat makanan, menunrnkw kadar kole:teroldan
absorpsi lipid serta sebagai prebiotik (Shahidi et al., 199).secara ! m o h m i a menggunakan alkali kuat pada s k u tinggi. Hasil
dari
proses ini belum sepenuhnya memuaskan sebab kuaalitash
to-san yang dihasilkan rnasih beragam dalam berat molekd, viskosi tas dan derajar deasetilasi. Selain ity proses termokima juga membutuh-kan energi dalarn jurnlah besar untuli rnenghasilkan dan rnempert ahan-
kan
suhu tinggi smta menghasilkan limbah dan produk samping berupaalkali
dengan konsentnsi tingg yanp berpotensi toksik bagi lingkungan.Sebagai airematif, proses deasetilasi dapat dilakukan secara en t i m a t i s mengguna-
kan
kitin deasetilase (CDA). EnzLz ini di temukan pada bakteri, kapang,kamir,
cacing dan serangga yang manpunyai kandungan b r o m di hnding sel atau
di
eksoskeletonnya Proses enzimatis diharap- kan &an lebih mudah hkendalikan, lebih efisien, s p i fik dan meminimal kan praduk samping. Sejurnlah penelitian telah dllakukanmengisolasi, n~ernpurifikasi
dan
meng-karakterisasi kitin deasetilase dari sejurnlah mikroba. Aplikasi enzim ini berbagai jmis dan liondisi substrat memkikan
beragam
belurn memuaskan I'sigos al., 1.
Lntuk memperbaiki kualrtas kirosan
dl kari melalui enzimatis, dildukan pemberian perlakuan
substrat
mudah berpenetrasi dan beraksi substrat. Bebenpa perlakuan telah diberikan adalah inkubasi
asam dalarn wakb n~enyerupai terrnokirnia swara komersid, perlakuan fisik w~erti
pernapran tekanan
penggilingan. Perlakuan awai
substrat meng-
hasilkan berkualitas derajat deasetilasi Iebih demihan perlakuan sufii dm tekanan tinggi, sementara pengurangar
ukuran seperti penggi-lingan sejauh ini tidal mernbenkan h a i l memuaskan (Kolo. dziejska er at., 2000; Mukherjee,
BAHAN METODE
Kultur Media
Produksi enzim dilakukan dengar menggunakan kultur K29- 14 yani diperoleh Laboratorium Mikrobiolog clan Biokimia, Pusat Penelitian Bioteknolog IPB, memproduksi enzim secari "C, 8,O (Rahayu prduksi enzim mengacu komposisi media d k Sakai (1998), yaib
(NH&S04 %. K2HP04 0,1 %, NaCl 0.
O h , MgSOJ.7HZ0 0.01 %, ekstrak khami
0,05 bakto crypton
O,l
koloidal kh~ti~%, ditambah % kitin dari
punggung
Substrat
Kltirl diperoleh Dina
Peri Cirebon, Barat. Koloid
k ~ t i n dm kitin pracrrcal ( S i p Chemical
demean
metodeda:
Solotnon (1986). GlikoI kitindru
kitom (Sigma
Cherniml
denga metode Trudel dan Asselin(3)
M
NATRlUM HIDROKSIDA
WJADAP KITIN
KULIT
.N
BERAT MOLEKllL
1 I#
e rind C.'h rt rn IIeuc ~1)-/use Applicu f Moleculur 1Z.'rt,y/71 C :hr tu,~un
:epted 7607
K29- uscd
tioa led ro
dmcetylate
folbwiny 'C
.yme O C Deacetylation
nzyme. chitosan had
:rimtion o a r e d ,
Prduksi kitosan industri xara ? m o h ~ a alkali uat ada sthu tinw Hasil ini belum
venuhnya memuaskan
sebab
kuali tas kito- in dihasikan beragammt molekul viskositas dan derajat
mtiiasi. Selain iiq termokimia Iga membutuh-kan dalarn jurnlah
mr untuk rnenghasilkan dan mernpertahan- UI serra menghasilkan limbah
~n produk sarnping berupa dengan
~nxntrasi berpotensi igi lingkungan.
Sebagai allematif, deasetilasi ipat ditakulian enzirnaris mengguna-
m deasetilase E m n ini
temukan baktai, kapang, kamir, cing dan scrangga mempunyai ndungan htosan dinding sel
soskeletonnya enzimatis diharap- akan mudah d k e n d a l i k ~ sien, s p i f i l , dan memini~nalkan produk
Seiumlah penelitim hlakukan
un
tuk mengisolasi, rnernpurifikasidan
meng- karaktmisasi kitin deasetilase dari sejumlah mikroba. Aplikasi enzim ini pada berbagai jenis dan kondisi substrat masih memberikan hail yang beragam dengan parameter hasil yang belum memuaskan (Tsigos er ul.,2000).
Untuk mernperbaiki kualitas kitowl
yang dihasilkarl rnelalui proses enzimatis, dilakukan pemherian perlakuiul awal
terhadap substrat agar entirn dapat lebih mudah berpenetmsi dan beraksi pada substrat. Beberapa perlakuan awal yang telah dibenkan adalah berupa inkubasi awal dengan alkali atau asam kuat dalam waktu lama, yang menyerupai proses tennokimia secara komersial, atau perlakuan fisik seyerti perrlaparan pada suhu tinggi, tekanan tinggi,
atau proses penggilingan. Perlakuan awal terhadap substrat secara kimia dapat m a g - hasilkan kitosan berkualitas lebih baik dengan derajat deasetilasi yang
lebib
tinggi,demiluan pula perlakuan awal deagan d u
dan tekanan tinggi, sementara pengurangan ukuran seperti penggi-lingan sejauh ini
tidak
rnembenkanhasil
yang memuaskan (Kolo-dziejska
et a!., 2000; Mukherjee, 2002).BAHAN DAN METODE Kultur dan Media
Produksi enzim dilakukan dengan menggunakan kultur Rocillus K29- 14 yang diperoleh
dari
Laboratarium Mikrobiologid m
Biokirnia, Pusat Penelitian BiatehobgIPB, yang memproduksi e n z h secara
optimal pada suhu 55 "C, pH 8,O (Rahayu, 2000). Media produksi enrjm mengacu pada kompos~s~ media dari Sakai (1998), yaitu (NKhSOj 0,7 %,
K2HP04
0,lYo,
NaCl 0,1 %. MgS0,.7H20 0,01 %. ekstrak Wlamir 0,05 %, bakto w t o n 0,l %, koloidal khitin 0,5 %, ditarnbah dengan 1 % kitin dari kulitP w W w
udmg.Substrat
k t i n kulit udang diperoleh dari Dinas Perikanan Cirebon, Jawa Barat. Koloidal kitin dibuat dari kitin prac~ical grade (Sigma
Chemial Co) denpan rnetode Arnold clan Solomon ( 1986). Glikol kitin dibuat
dan
glikol
krtosan (Sigma Chemical Co)dengan
metode Trudel dm Asselin (1989).
Pereabi Kimia
S
tandar Bovine Serum Albumin (BS A), glihol lulosan dan standar glukosmin d~peroleh dari Sigma Chemical Co. Indol,HCI dan bahan-bahan kimia lain yang
d~gunakan dalarn produksi dan penentuan At] wtas enzi~n diperoleh dan Merck.
Produksi Kitin Deasetilase
Lultur bakteri di fementasi dalan media produksi enzim selama 2 hari pada 5 5 "C. Enzlm dipanen dengan cara sentrifu- gasi pada 8000 rpm selama 15 menit pada
s u h u 4 "C untuk mcrnisahkan dari sel bakteri dan sisa media. Ke dalam supematan ditam-
bahkan amoniurn sul fat sampai kejenuhan
80 % sambil distirrer. Campuran diendapkan semalarn pada subu 4
"C
laIu disentrihgasi pada 8000 rpm selama 15 menit. Filtrat dilarutkan dalam 0,02 M buffer b r a tpH
8 dan dishpan pa& suhu 4 "C. Kadar protein enzim diuji dengan metode Lowry (Cope- land, 2000) menggunakan standar BSA dan aktivitas enzirn ditenrukan dengan metode Tokuyasu (1996).Perendaman dalam NaOH
60
%Tepung lutin direndarn dalarn NaOH
b0 ?G (I110 wlw) pada berbagaj, suhu dm waktu. Perendaman dilakukan pada suhu 60
dan 75 "C. Pada suhu 60 "C, waktu peren- darnan kitin
adalah
60, 90, 120 dan 180menrt sedangkan pada s ~ h u 75 "C, waktu perendaman &ah 30 dm 60 menit. Kitin yang telah direndam
dibilas
dengan air sampai pH netral dan dkeringkan pada suhu60 OC %lama 1 malam kemudian ditentukan
derajat deasetilasinya. Deasetilasi enzimstis
Kitin hasil perendaman dengan NaOH 60 % dilarutkan dalam asam asetat 0 , l M . Sejurnlah 10 mL larutan diinkubasi dengm
10, 20 dm 30
mU
ekstrak enzim selama
24 jam. ECltin yang tldak larut disarirlg dan htimbang. 3 t o s m yang dhsilkan dimalisis derajat dmetilasi, viskositas dan berat mole- kul. Derajat deasetilasl ditenhlkan denganF~rsl l?eriva/rve Uf (FDUV) Absor-bance
(Muzzarelli, 1997) menggunakan spektro-
meter Perkin Elmer Lambda 25 UVIVIS. Viskosjtas ditentukan dengan
Ubbelohde
dilui~on vrscomerer dengan pelarut asam asetat O,1
M
/ sodium asetat 0.2 5M
dan berat(4)
molekul ditentukan dan viskositas intrinsik dengan permaan Mark-Houwink (Hwmg,
1997).
HASIL
DAN
PEMBAHASAN Deasetilasi KirniaP a d a m a n dalam lamtan NaOH
bertuj uan untuk mengubah kon fomasi kris- taljn kitin yang rapat sehingga enzim lebih mudah berpenetrasi untuk mendeasetilasi polirner kitin (Martinou er ol., 1995). Akan tetapi perendarnan dalam NaOH akan me- ningkatkan derajat deasetilasi dan mengaki- batkan terjadinya depolini~~ isasi.
Oleh
kare- na itu perendaman dilakukan pada suhu yang tidak terlaIu tingg~ dan waktu yang singkat.Konsentrasi NaOH yang digunakan
adalah 60 %. Kansentrasi NaOH akan mem-
pengandu laju dmctilasi. Semakin tinggi konsentrasi NaOH yang digunakan, laju deasetilasi akan sernakin cepat. Akan tetapi
konsenuasi NaOH yang tinggi juga akan meningka~kan laju depolimerisasi
(No
danM y e r , 1997). Chang el a1 (1997) menemu-
km bahwa laju deasetilasi optimum akan diperoleh jika konsentrasi NaOH yang
digunakan sebesar 60 %. Konsentrasi GO %
juga maghasilkan
deasetilasi
lebih balk jika deasetilasi akan dilakukan pada suhu y ang rendah.Perendaman dalam alkali dilakukan terhadap sarnpel kitin ddam bentuk tepung. Penepungan dilakukan agar proses deasetilasi dapat berlangsung lebih cepat dan sempurna, karena semakin luasnya p m u k a a n yang dapat &akses oleh larutan alkali
(No
danM
eyers, 1 997). Deasetilasi akan berlangsung mulaidari
permu-kaan kim lalu rnemasuki wilayah amorf clan ki tin clan S a r a bertahap deasetilasi ter~ad~ sampai ke wilayah kristalinkitin (Chang ef al., 1 997).
Rasio larutan NaOH terhadap
kr
tinyang hgunakan
adalah
sebesar 1: 10 blv. Menurut No dan Meyer ( 1 9971, rsio 1 : 10maghasilkan peni ngkatan laju deasetilasi lebh cepat, akan tetapi Chang el 01 (1W7)
rnenyatakan bahwa pengaruh rasio larutan NaOH terhadap lcltin tidak signifikan pada laju deasetilasi .
h j a t deasetilasi menunjukkan peningkatan dengan rneningkatny~ suhu dm waktu perendarnan (Takl 1). Peningkatan
derajat deasetilasi yang signifikpu~ terjadi setelah perendarnan selama 180 menit pada 60 "C (97,O %) dm 60 menit pada 75 "C
(96,O 96). Hasil serupa juga diperoleh oleh Kolodnejska er al. (2000) yang rnenyatakan derajat deasetilasi produk kitosannya yang direndam dengan NaOH 50 % pada suhu 60 "C selarna 90 menit adalah 6 s % dan 76 %
untuk perendaman selama 180 menit. Perbe-
daan
ini mungkin karma konse~itrasi NaOHyang digunakan lebih rendah ( 5 0 %) dan
metode pengukura~ yang berbeda, yaitu
menggunakan ti trasi potcnsio-metri. Kondisi awal kitin, seperti derajat deasctilasi awal- nyq juga berpengmh terhadap perbedaan derajat deasetilasi akhir. Dalam ha1 ini, t~dak disebutkan kond~si awal kitin yang digu-
nakan, snnentara dalam penelitian ini. digunakan kitin dengan derajat deasetilasi awal sud& cukup besar, yaitu 42,2 %.
Deasetilasi Enzirnatis
Setelah dicuci dm dikeringkan, kito- san pasca perlakuan kimia dilarutkan dalam asam =tat dengan konsentrasi 1 % kitosan ddam 0, I h.1
asam
asetat. Nilai pH larutanhtosaii iai dibuat menjad 6 dengan penam-
hahan 0,25
M sodium
asetat. Selanjutnya larutan inilah yang akan diinkubasi bersarna enzirr!Penambahan 0,25 M sodium asetat
diper-lukan untuk peningkatan pH larutan. Larutan kitosan
dalarn
0,l M asam asetat akan rnemiliki pH di sekitar 4, sementara kebanyakan protein a k a mengendap pada pH 4, demikian juga CDA yang digunakan dalam penelitian ini. Peningkatan pH juga diperlukan agar enzirn dapat bekerja lebih a h f . Peningkatan pH hanya diusahakan sarnpai pH 6 walaupun CDA y ang digunakan bekerja optimum pada pH 8, karena pH 6merupakan pH optimum kelarutan kitosan. Pada pH yang lebih tinggi, kitosan yang telah dilarutkan akan mengendap
kernbali.
Penam-bahan sodium asetat drketal~ui tidak meng-
harnbat aktivitas CDA
dan
Bacillus K29-14dm pada pH 6, CDA
dari
Bacillus K29- 14rnasih cukup aktif (Rahalu, 2000).
Deasetilasi enzimalis dilakukan terha- dap larutan kitosan b d a n tepung kttosan.
Dalrun bentuk larutan, deasetilasi akan ber-
1angsu;:g lebih mudall reaksi akan terjadi lebih ho~nogen di setiap baglan larutan
karena kelarutan seragam. Koldjzi- el al. (2000) melakukan deaseti- lasi enzimatis rerhadap kitinlkitosan dalam bentuk larutan mencapai derajat deaxt~lasi %. Sebaliknya,
enzirnat~s kltin &lam
tal~n dan amorf sedikit meningkatkan derqjat y a m rnas~ng-masing
dm 9,s % asal M. rowcir
(Martlnou el ol., 1995) 0,s dan % asal C. irndcmurhlanunr (Tsigos dan Bouriotis, 1995). Benruk
rapat sehingga
berpcnetrasi kitin. Bentuk amorf renggang memugkinkan reaksi enzim
deasetilasinya rendah.
Emhn merupa-
kan hasil pengendapan Jumlah d~tarn-bahkan 10: dan m u
10 mi 1 % larutan Kolodjziejska el 01. rnenggunakan m u per mL
larutan kitosan, berupa eksb-ak
kasar.
dasetilasi emmatis meni ng-
katkan 5 -3 %, tergantung deasetilasi (Tabel 1). Semakin tingg deasetilasi
semakin kecil peningkatan derajat d m t i l a s i t c r j d . Derajat deasetllasi atas 90 %
dapar d q w sampel deraJat deasetilasi di atas %
Tablrl. Ducrtyhtion d e g m
hydroxide of 9 cbitin dmcetytasc from BQI
'A Temo CC) Time (rnin.)
Perat Molekul
Nilai dinyatakan dalam spesifik.
dan
inh-insik. fik ditentukan mern-(5)
S ' L 6 1 '86 1 -66 0.96 09
L ' L L 6'CL 8 . U 8'9s OE SL
6'66 9'86 t 86 O L6 08 1
.oh S L WE ~p ~EME !m[yamp w r w p
ue8uap l a d m e p ~ d @mp lwdq ellmy % 06 ssle
!p
~selpaseap IE@JW . r p f i a l 8mArsaplasmp i+ap ueley%u~ad p a y u q u m ~
'~IZMB 1mIqaS8ap 1~@mp
q u q
~ E W S
4 1 1qQ.l) pfie !=lq-P
IECUP
~ p ~ d%rn=%w
'o/, 05-s !SaIymap i~Ce~ap w y v q-8Il!USUl S!JEUI!ZUa lW[!Jmp SaSOld
-Rmy qwsya t a d q qmul
BueA
' m o t 3 rrelnre~ ?mr
Jad
nm
09 u e > l s ~ ~ ~ w ~ (0002) 'lola eysra!zrpoloy . m o ~ ! q W ~ % I I p 01 lad
nu
OE lmP 0 t '01vwe
~ w q - - l ! PBmIZ qqurnr .jej~ns uedepua%uad l!seq my
-edruaw m ~ u " 9 ! p BmA
va3
-yzpual q~seru 83nT aXu!se~!laseap ieCe~ap wyFuay tdrr~a; !S-J Wun mryu!$lmwur qlqa( SutrSual ylqq %mlC
pours qnluaa .uu!y WIEP ay t w * q
tdq ynlun ui!zua !3trq u p s a%u!qas 1 ~ d ~ 1 r1!9a[ ulleB!q WuW -(5661 'SYoFoa
s o @ s ~ ) runuot 41 r~ru;lpurl *3 ~ESE
v(--J
3 m8uap% E'P
"P
5'0 euas (5661 "lo noulwty)!i.mo~ -W [ese
va3
us8uap % 5'6 m p 5'0 gu!seur-%u!mru nl!eiC '!se(qasmp i ~ @ ~ a pmq$ey%utuam ~!ypcx e h y p o w w p u ~ p ) -s!q y n w q u r e ~ ~ p ug!y depeqlai sqeur~zua
!sqy-p %Au~!leqas '% 6 - 3 8 !sel!lmap le!iimp iedemaur i e d q
mm[
ywwq m@p molryluy~y d ~ q ~ a i ye- !se[-9map ueynyeraur
3mA (0002) ' 1 ~ ra eysra -uT~oloy -w%m %mil wlwlaq euamy(6)
Nilai viskositas intrinsik dapat
menunjukkan
secara
lebih jelas pengaruhperlakuan
kimia
dan enzimatis daripada viskositas spesifik dm kinematik. Viskositas intrinsik menunjukkan kemampuan polimer untuk meningkatkan viskositas lamtan. Viskositas intrinsik diperoleh d m kurva qSdC yang diekstrapolasi hingga C mende- kati 0, sehingga ~neniadakan p e n g dkonsentrasi (Hwang el ol., 1997). N i b
konsentrasi larutan kitosan yang sangat rnempengaruhi viskositas spesi
fik
dan kinernatik tidak berpengaruh pada viskosi tas i n ~ i n s i k .Untuk mengamat i hubungan antara perlak-ELII perendaman dengan NaOH terhadap viskositas
dan
h a t molekul, dipilih dua sampel yai tu kitosan hasil perendaman pada suhu 60 "C dengan waktu 90 dan 180 menit. Kedua sampel dipilih karena derajat deasetilasi yang tinggi (di atas 80 %) danadanya perbedaan yang signi fikan antara k t duanya dalam hal derajat deasetilasi dan keI arutan .
Nilai iskczitas
inttinsik
akan
meningkat dengan semakin tingginya daajai
deasetilasi
(Tabel 2).Nilai
viskositas inbin- sik dipengaruhioleh
derajat deasetilasi, k ~ n s e n n a s i ~ ' h a t molekul, kekuatan ion, pHdan
suhu
saat pengukurm (Dunn el a!.,1997). Wang (199 1) menunjukkan bahwa pada kitosan dengan berat molekul sarna, viskositas intrinsik akan meningkat dengan meningkatny a derajat deasetilasi. Diduga ha1 ini berhubungan dengan efek kitosan yang bersifat sebagai polielektrolit dalarn lanrtan. htosan merupakan polikation yang di dalan
larutan &an bertindak sebagai polielektrolit. Muatan positif kitosan berasal d a r ~ residu
arninany a. Sernaktn tinggi deraj at deasetilasi, residu amina semalun banyak, muatan positif kitosan juga akan semakin banyak. Di dalarn larutan, tinggnya muatan positif &an
menghasilkan gaya tolak menolak, ymg akan rne~nbuat polher lutosan yang sebelumnya berbentuk gulmgan, membuka menjadi rantai l m s . Sebagai Abatnya, viskositas
larutan akan meningkat.
Viskositas intrinsik akan meningkat dengan meningkamya berat molekul (Tabel 2). Berat molekul berhubungan dengan derajat polirnerisasi. Polimer rantai lurus seperti
kitosan akan menunjukkan pening-katan densitas ji ka derajat polirnerisasi bertarnbah. Dengan derni kian, viskositas intrinsk j uga
&an meningkat. Wang er al. (1991) menunjukkan hubungan linier antara nilai log viskositas intrinslk dengan
nilai
log berat molekul, untuk larutan lutosan dengan derajat deasetilasi sarna.Tabtt 2. Chnctcristic of chitosan produced by combination of chemical and enzymatic
deacetylation
Chemical deacetylalioo After e q m a t a deacetylation chemical deacetylation following
Condition hcetylation Intrinsic Mol. Weigh Deacet? lathon Inninsic Mot. Weight
d e q e visctlsity (s lo3 Da) degree (%) viscosity (x 1
o3
Da)Soaking in NaQH of 60 % 80.3 % 31.7 d g-l 45.26 88.5 % 3.6 rnL g-' 4.25
at 60 "C for 90 mio.
SuakinginNaOHofM)% 97.0% 3 5 5 . 6 m ~ ~ " 615.73 98.2% 11.4mLg1 15.09 at 60 OC for 180 min.
P!c:e: Enqmatic deaEetylaliw by 10 mu of chitin hcetylaiion for 22 h
Deasetilasi enzimatis meningkatkan yang juga menurun selama deasetilasi derajat dmetilasi kitosan tetapi menurunkan enzimatis.
viskositas intrinsik (Tabel 2). Penurunan P e n m a n viskosiras setelah deaseti- viskositas hanya rnungkin terjadi
jika
selama
lasi enzimatis juga dilaporkan oleh inkubasi denganenzim
terjadidw&i
Kolodziej ska er al. (2000). Viskositas larutan rantai polher atau depolimerisasi. Dugaan htosan menurun sebesar satu log setelah ini ddionfirn~asi oleh nilai berat molekul initubasi dengan enzimselama
16 jam. Akantetapi Kolodziejska el al. (2000) tidak
penen tuan berat sehing- ga @at lakukan pembandingan. Depolimerisasi karena adanya enzirn- enzi pendegradasi itin dan
di dalam ekstrak
dan
Boc11lu.s K29- 14. Rahayu telah mmgisolasi kitinase Racillu,~ K29-14
selan dm juga
I;] tosanase.
Penggunaan telah
dimurnikm hanya berisi
terjadinya depolimerisasi dan
dan berat molekd Penelitian ini han !a pemurnian
pengendapan menggunakan arnonium sul
Dalam ini adalah
pengendapan semua
dan komponen
dal ekstrak kasar terendapkan.
Lntuk memisahkan enzim-enzim
harus drlakukan langkah pemur- nian h lanjuc sepem kromatografi atau elektroforesis. Fraksi mempunyai aktivitas tertinggi &pat
dtaplikasikan deasetilasi endmatis
kitin
Variasi waktu
dan
perendaman alkali tedmhp kitin dapat menghasilkanh
tosan deasetiberkda-beda dpilth &an
rergan tung tujud apli k a s ~ tosan. h,iasing-masing bentuk aplikasi membutuh-
kan kard-teristik
berbda-beda. Kitosan
dari
%,dan
berat molehul rendah dibutuhkan sebagaiA-teri, antioksidan, clan
~nmrunoenhoncrng. Untuk aplikasi
sebagai
mem pengemas dibutuhkan
dengan derajat
d d l a s i
sekitar danh a t
Peneli tian ini rnenghasi lkan
herat rendah. B e h a p a penelitian rnenunjukkan bahwa kito&
berat rendah mempunyai besar antibakteri, anti-
antidiabetes, hipakolesterolemik anti- demiluan rr~anpunyai mapfaat Sesar daplikasikan d a l m pengolahan pangan hasil
(7)
( ) menunjukkan bahwa pada
kitosan
dengan berat malekul sarna, meningkatnya D~duga ha1 berhubungan efek ljrosar~ yang bersr polielektroli I ddam larutan. htosan merupakan poljkation dalarnlarutan bertindak
Muatan positif dari
aminanya. Semakin tingg~
arnina semakin banyak, muatan positif lutosanJuga &an w n a h n banyak. Di dalam larutan, tingginya muatan positif &an
menghasilkan rolak mcnolak, yang membuat polimer sebelumnya berbentuk gulungan, membuka menjadi rantai lunrs. Sebagai akibablya, viskosirs lamtan &an rneningkat.
intrinsik meningkar dengan meningkatnya berat (Tabel Berat
dengm polunerisasi. Polimer rantai l urus
kitosan menmjukkan pening-katan densitas jika polimerisasi bertambah.
Dengan demikian, inmnsik
&an
Wang 01.nenunjukkan bubungan 1 inier antara nilai iskositas intrinslk dengan niIai berat nolekd, untuk larutan kitosan
laajat daSehIasi sarna. chemical
-
chemical deacctylat~on --
- Charac~ms~rc
MoI. Wkght Dcacetylation Intrins~c Mol Wchght (x 10' Da) dtgrec (%) viscwlty (x 10' Da)
-
mL g"
mg juga menurun selama uirnalis.
Penurunan setelah deaseti- enzimahs juga dilaporkan oleh olodaejska ef al. larutan
t o m menurun
sebesar
satu setelah Kubasi enzim xlarna ~ k a nKolohejska er al.
Aswita E m m m t i et a[ Codination .fSm&.lng in Sodium H$roqdt? a m f ~ f t i f 1rt Deacetyl;rse3pp6
melakdan p e n m a n berat molekul sehing- ga tidak dapat dilakukan pembandingan.
Depolimuisasi diduga
karma
adanya enzirn-enzim pendegradasi kitin dan kitosan yang
lain di dalam ekstrak enzim CDA
dan
Aacrllus K29- 1 4. Raha~u (2000) telah mengisolasi kitinase dari Hacrllu,~ K29-14
selain CDA dan mungkin juga terdapat
kitosanase.
Penggunaan enzim yang telah dimurnikan sehingga hanya berisi CDA &an dapat meminitnkan terjadinya depolimerisasi dan menghasilkan kitosan dengan viskositas dan berat molekul lebih tinggi. Penelitian lni hanya melakukan pemurnian CDA dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat.
Dalam proses ini yang terjadi adalah
pengendapan prolein, sehingga semua enzirn
dan
komponen protein lain yang terdapat dalarn eksrtak kasar enzim akan terendapkan. Untuk memisahkan CDA dan enzirn-enzim yang lain, harusdilakukan
langkah pernur-nlan lebi h lanjut, seperti dengan krornatografr atau dengan elekwoforesis. Fraksi yang mempunyai aktivitas CDA tertinggi dapat diapl ikasikan untuk
deasetilasi
enzimatis kitin.Variasi waktu
dm lama
perendaman alkali terhadapkitin
&pat menghasilkan htasan dengan derajat deasetilasi yangberbeda-be&. Proses yang hpillh &an tergantung pada tuju-iul aplikasi kitosan. Masing-mrtsing
bentuk
aplikasi membutuh- kan htosan dengan karaheristik y a w berkh-beda. Kitosan dengan derajat deasetilasi tinggi,lebih
dari 85 %, dan beratmolelad
rendah
dibutuhkan sebagai anti-bA-eri,
antifungi, antiaksidan, antitumor dmimniunoenhancing. Untuk aplikasi sebagai
membran dan pengemas dibutuhkan kitosan
KESLMPULAN
Kombinasi deasetilasi kimia dan
enzirnatis akan meningkatkan derajat
deasetilasi kitosan lebih tinggi daripada
pwlakuan kitnia saja. Deasetilasi kimia menlngkatkan derajat deasetilasi sebesa 6- 55 %. Kombinasi deasetilasi kimia dan enzimatis akan meningkatkan dera-iat deaseti-
lasi
16-58 %. Produk kitosan yang dihasilkan mempunyai derajat deasetilasi 77-99 %, viskositas intrinsik 3,6-1 1,4mL
g'
dan berat molekul 4,2x103-1 1,1xl0~ Da.UCAPAN T E R M A KASIH
Terima kasih disarnpaikar! kepada Pusat Riset Pengolahan
Produk
dan
SosialEkonomi Kelautan dan Perikanan Jakarta atas bantuan dana dan fasilitas szlama penditian.
DAFTAR PUSTAKA
Arnold LD, Solomon NA (1966) Manual of Industrial Microbiology
dan
Biotech- nology.Am
Society for Microbial. ChangKLB,
Tsai G, Lee J, Fu W (1997)Heterogenous N-deacetylation of
chi-
tin
in alkaline salution. Carbohydr Res303: 327-332.
Copeland RA (2000) Methods for Protein Analysis: A Practical Guide to Labo- ratory Protocols.
Chapman
and Hall,New
York.
Dunn ET,
Grandmaison
EW, Goom MFA (1997) Aplicationsand
propertiesof
chitosan. Dulam: G m ~ n MFA (ed) Applications of Chltinand
Chitosan. Technomic Pub1Co
Inc, Basel..
-
dengan derajat deaseiilasi sehta 70 % d m H-g J, Hang
S,
h n
C (1997) Effect of berat molekul tinggi. molecular weight and NaClconcen-
Penelitianini menghasi
lkanki
tosan tration on dilute solution properties of dengan berat molekul rendah. B e m achitosan.
J Food Sci Nutr, 2: 1-5.tian rnenunjukkan bahwa kitosan
drnem bcrar molckul mmpunYai K01~'icjska 1, Wojrasz-Pajak A, Ogonowr- potensi lebi h besar sebagai anti bakteri, anti-
ka
G , Sikorsh ZE (2000) Deacetyla-fungi. antidiabetes, hipokolestmlemik anti- tion of clutin
in
a two-stage chemicalolisidan atau antitumor, dengan demikian and enzymatic process. Bul Sea akan mzrnpunyai
mapfaat
lebih k s a r untuk Fisheries lnst 2(150): 15-24.(1)
M
NATRlUM HIDROKSIDA
WJADAP KITIN
KULIT
.N
BERAT MOLEKllL
1 I#
e rind C.'h rt rn IIeuc ~1)-/use Applicu f Moleculur 1Z.'rt,y/71 C :hr tu,~un
:epted 7607
K29- uscd
tioa led ro
dmcetylate
folbwiny 'C
.yme O C Deacetylation
nzyme. chitosan had :rimtion o a r e d ,
Prduksi kitosan industri xara ? m o h ~ a alkali uat ada sthu tinw Hasil ini belum
venuhnya memuaskan
sebab
kuali tas kito-in dihasikan beragam
mt molekul viskositas dan derajat mtiiasi. Selain iiq termokimia Iga membutuh-kan dalarn jurnlah
mr untuk rnenghasilkan dan mernpertahan- UI serra menghasilkan limbah ~n produk sarnping berupa dengan
~nxntrasi berpotensi
igi lingkungan.
Sebagai allematif, deasetilasi ipat ditakulian enzirnaris mengguna-
m deasetilase E m n ini temukan baktai, kapang, kamir, cing dan scrangga mempunyai ndungan htosan dinding sel
soskeletonnya enzimatis diharap- akan mudah d k e n d a l i k ~ sien, s p i f i l , dan memini~nalkan produk
Seiumlah penelitim hlakukan
un
tuk mengisolasi, rnernpurifikasidan
meng- karaktmisasi kitin deasetilase dari sejumlah mikroba. Aplikasi enzim ini pada berbagai jenis dan kondisi substrat masih memberikan hail yang beragam dengan parameter hasil yang belum memuaskan (Tsigos er ul., 2000).Untuk mernperbaiki kualitas kitowl yang dihasilkarl rnelalui proses enzimatis, dilakukan pemherian perlakuiul awal
terhadap substrat agar entirn dapat lebih mudah berpenetmsi dan beraksi pada substrat. Beberapa perlakuan awal yang telah dibenkan adalah berupa inkubasi awal dengan alkali atau asam kuat dalam waktu lama, yang menyerupai proses tennokimia secara komersial, atau perlakuan fisik seyerti perrlaparan pada suhu tinggi, tekanan tinggi, atau proses penggilingan. Perlakuan awal terhadap substrat secara kimia dapat m a g - hasilkan kitosan berkualitas lebih baik dengan derajat deasetilasi yang
lebib
tinggi, demiluan pula perlakuan awal deagan d u dan tekanan tinggi, sementara pengurangan ukuran seperti penggi-lingan sejauh initidak
rnembenkanhasil
yang memuaskan (Kolo-dziejska
et a!., 2000; Mukherjee, 2002).BAHAN DAN METODE Kultur dan Media
Produksi enzim dilakukan dengan menggunakan kultur Rocillus K29- 14 yang diperoleh
dari
Laboratarium Mikrobiologid m
Biokirnia, Pusat Penelitian BiatehobgIPB, yang memproduksi e n z h secara optimal pada suhu 55 "C, pH 8,O (Rahayu,
2000). Media produksi enrjm mengacu pada kompos~s~ media dari Sakai (1998), yaitu (NKhSOj 0,7 %,
K2HP04
0,lYo,
NaCl 0,1%. MgS0,.7H20 0,01 %. ekstrak Wlamir 0,05 %, bakto w t o n 0,l %, koloidal khitin 0,5 %, ditarnbah dengan 1 % kitin dari kulit
P w W w
udmg.Substrat
k t i n kulit udang diperoleh dari Dinas Perikanan Cirebon, Jawa Barat. Koloidal kitin dibuat dari kitin prac~ical grade (Sigma Chemial Co) denpan rnetode Arnold clan Solomon ( 1986). Glikol kitin dibuat
dan
glikol
krtosan (Sigma Chemical Co)dengan
metode Trudel dm Asselin (1989).Pereabi Kimia
S
tandar Bovine Serum Albumin (BS A), glihol lulosan dan standar glukosmin d~peroleh dari Sigma Chemical Co. Indol,HCI dan bahan-bahan kimia lain yang
d~gunakan dalarn produksi dan penentuan At] wtas enzi~n diperoleh dan Merck.
Produksi Kitin Deasetilase
Lultur bakteri di fementasi dalan media produksi enzim selama 2 hari pada 5 5 "C. Enzlm dipanen dengan cara sentrifu- gasi pada 8000 rpm selama 15 menit pada
s u h u 4 "C untuk mcrnisahkan dari sel bakteri dan sisa media. Ke dalam supematan ditam-
bahkan amoniurn sul fat sampai kejenuhan 80 % sambil distirrer. Campuran diendapkan semalarn pada subu 4
"C
laIu disentrihgasi pada 8000 rpm selama 15 menit. Filtrat dilarutkan dalam 0,02 M buffer b r a tpH
8 dan dishpan pa& suhu 4 "C. Kadar protein enzim diuji dengan metode Lowry (Cope- land, 2000) menggunakan standar BSA dan aktivitas enzirn ditenrukan dengan metode Tokuyasu (1996).Perendaman dalam NaOH
60
%Tepung lutin direndarn dalarn NaOH
b0 ?G (I110 wlw) pada berbagaj, suhu dm waktu. Perendaman dilakukan pada suhu 60
dan 75 "C. Pada suhu 60 "C, waktu peren- darnan kitin
adalah
60, 90, 120 dan 180menrt sedangkan pada s ~ h u 75 "C, waktu perendaman &ah 30 dm 60 menit. Kitin yang telah direndam
dibilas
dengan air sampai pH netral dan dkeringkan pada suhu 60 OC %lama 1 malam kemudian ditentukan derajat deasetilasinya.Deasetilasi enzimstis
Kitin hasil perendaman dengan NaOH 60 % dilarutkan dalam asam asetat 0 , l M . Sejurnlah 10 mL larutan diinkubasi dengm 10, 20 dm 30
mU
ekstrak enzim selama
24 jam. ECltin yang tldak larut disarirlg dan htimbang. 3 t o s m yang dhsilkan dimalisis derajat dmetilasi, viskositas dan berat mole- kul. Derajat deasetilasl ditenhlkan denganF~rsl l?eriva/rve Uf (FDUV) Absor-bance
(Muzzarelli, 1997) menggunakan spektro- meter Perkin Elmer Lambda 25 UVIVIS. Viskosjtas ditentukan dengan
Ubbelohde
dilui~on vrscomerer dengan pelarut asam asetat O,1M
/ sodium asetat 0.2 5M
dan berat(2)
molekul ditentukan dan viskositas intrinsik dengan permaan Mark-Houwink (Hwmg,
1997).
HASIL
DAN
PEMBAHASAN Deasetilasi KirniaP a d a m a n dalam lamtan NaOH
bertuj uan untuk mengubah kon fomasi kris- taljn kitin yang rapat sehingga enzim lebih mudah berpenetrasi untuk mendeasetilasi polirner kitin (Martinou er ol., 1995). Akan tetapi perendarnan dalam NaOH akan me- ningkatkan derajat deasetilasi dan mengaki- batkan terjadinya depolini~~ isasi.
Oleh
kare- na itu perendaman dilakukan pada suhu yang tidak terlaIu tingg~ dan waktu yang singkat.Konsentrasi NaOH yang digunakan adalah 60 %. Kansentrasi NaOH akan mem- pengandu laju dmctilasi. Semakin tinggi konsentrasi NaOH yang digunakan, laju deasetilasi akan sernakin cepat. Akan tetapi konsenuasi NaOH yang tinggi juga akan meningka~kan laju depolimerisasi
(No
danM y e r , 1997). Chang el a1 (1997) menemu- km bahwa laju deasetilasi optimum akan diperoleh jika konsentrasi NaOH yang digunakan sebesar 60 %. Konsentrasi GO %
juga maghasilkan
deasetilasi
lebih balk jika deasetilasi akan dilakukan pada suhu y ang rendah.Perendaman dalam alkali dilakukan terhadap sarnpel kitin ddam bentuk tepung. Penepungan dilakukan agar proses deasetilasi dapat berlangsung lebih cepat dan sempurna, karena semakin luasnya p m u k a a n yang dapat &akses oleh larutan alkali
(No
danM
eyers, 1 997). Deasetilasi akan berlangsung mulaidari
permu-kaan kim lalu rnemasuki wilayah amorf clan ki tin clan S a r a bertahap deasetilasi ter~ad~ sampai ke wilayah kristalin kitin (Chang ef al., 1 997).Rasio larutan NaOH terhadap
kr
tinyang hgunakan
adalah
sebesar 1: 10 blv. Menurut No dan Meyer ( 1 9971, rsio 1 : 10 maghasilkan peni ngkatan laju deasetilasi lebh cepat, akan tetapi Chang el 01 (1W7)rnenyatakan bahwa pengaruh rasio larutan NaOH terhadap lcltin tidak signifikan pada laju deasetilasi .
h j a t deasetilasi menunjukkan peningkatan dengan rneningkatny~ suhu dm waktu perendarnan (Takl 1). Peningkatan
derajat deasetilasi yang signifikpu~ terjadi setelah perendarnan selama 180 menit pada 60 "C (97,O %) dm 60 menit pada 75 "C (96,O 96). Hasil serupa juga diperoleh oleh Kolodnejska er al. (2000) yang rnenyatakan derajat deasetilasi produk kitosannya yang direndam dengan NaOH 50 % pada suhu 60 "C selarna 90 menit adalah 6 s % dan 76 %
untuk perendaman selama 180 menit. Perbe-
daan
ini mungkin karma konse~itrasi NaOHyang digunakan lebih rendah ( 5 0 %) dan
metode pengukura~ yang berbeda, yaitu
menggunakan ti trasi potcnsio-metri. Kondisi awal kitin, seperti derajat deasctilasi awal- nyq juga berpengmh terhadap perbedaan derajat deasetilasi akhir. Dalam ha1 ini, t~dak disebutkan kond~si awal kitin yang digu-
nakan, snnentara dalam penelitian ini. digunakan kitin dengan derajat deasetilasi awal sud& cukup besar, yaitu 42,2 %. Deasetilasi Enzirnatis
Setelah dicuci dm dikeringkan, kito- san pasca perlakuan kimia dilarutkan dalam asam =tat dengan konsentrasi 1 % kitosan ddam 0, I h.1
asam
asetat. Nilai pH larutanhtosaii iai dibuat menjad 6 dengan penam- hahan 0,25
M
sodium asetat. Selanjutnya larutan inilah yang akan diinkubasi bersarna enzirr!Penambahan 0,25 M sodium asetat diper-lukan untuk peningkatan pH larutan. Larutan kitosan
dalarn
0,l M asam asetat akan rnemiliki pH di sekitar 4, sementara kebanyakan protein a k a mengendap pada pH 4, demikian juga CDA yang digunakan dalam penelitian ini. Peningkatan pH juga diperlukan agar enzirn dapat bekerja lebih a h f . Peningkatan pH hanya diusahakan sarnpai pH 6 walaupun CDA y ang digunakan bekerja optimum pada pH 8, karena pH 6merupakan pH optimum kelarutan kitosan. Pada pH yang lebih tinggi, kitosan yang telah dilarutkan akan mengendap
kernbali.
Penam-bahan sodium asetat drketal~ui tidak meng- harnbat aktivitas CDA
dan
Bacillus K29-14 dm pada pH 6, CDAdari
Bacillus K29- 14 rnasih cukup aktif (Rahalu, 2000).Deasetilasi enzimalis dilakukan terha- dap larutan kitosan b d a n tepung kttosan.
Dalrun bentuk larutan, deasetilasi akan ber- 1angsu;:g lebih mudall reaksi akan terjadi lebih ho~nogen di setiap baglan larutan
karena kelarutan seragam. Koldjzi-
el al. (2000) melakukan deaseti-
lasi enzimatis rerhadap kitinlkitosan dalam bentuk larutan mencapai derajat deaxt~lasi %. Sebaliknya,
enzirnat~s kltin &lam
tal~n dan amorf sedikit meningkatkan derqjat y a m rnas~ng-masing
dm 9,s % asal M. rowcir
(Martlnou el ol., 1995) 0,s dan % asal C. irndcmurhlanunr (Tsigos dan Bouriotis, 1995). Benruk
rapat sehingga
berpcnetrasi kitin. Bentuk amorf renggang memugkinkan reaksi enzim
deasetilasinya rendah.
Emhn merupa-
kan hasil pengendapan Jumlah d~tarn-bahkan 10: dan m u
10 mi 1 % larutan Kolodjziejska el 01. rnenggunakan m u per mL larutan kitosan, berupa eksb-ak
kasar.
dasetilasi emmatis meni ng- katkan 5 -3 %, tergantung
deasetilasi (Tabel 1). Semakin tingg deasetilasi
semakin kecil peningkatan derajat d m t i l a s i t c r j d . Derajat deasetllasi atas 90 %
dapar d q w sampel deraJat deasetilasi di atas %
Tablrl. Ducrtyhtion d e g m hydroxide of 9 cbitin dmcetytasc from BQI
'A Temo CC) Time (rnin.)
Perat Molekul
Nilai dinyatakan dalam
spesifik.
dan
inh-insik. fik ditentukan mern- bandingkari secara langsung kecepatan aliran(3)
S ' L 6 1 '86 1 -66 0.96 09
L ' L L 6'CL 8 . U 8'9s OE SL
6'66 9'86 t 86 O L6 08 1
.oh S L WE ~p ~EME !m[yamp w r w p
ue8uap l a d m e p ~ d @mp lwdq ellmy % 06 ssle
!p
~selpaseap IE@JW . r p f i a l 8mA rsaplasmp i+ap ueley%u~ad p a y u q u m ~'~IZMB 1mIqaS8ap 1~@mp
q u q
~ E W S
4 1 1qQ.l) pfie !=lq-P
IECUP
~ p ~ d%rn=%w
'o/, 05-s !SaIymap i~Ce~ap w y v q-8Il!USUl S!JEUI!ZUa lW[!Jmp SaSOld
-Rmy qwsya t a d q qmul
BueA
' m o t 3 rrelnre~?m
r
Jad nm
09 u e > l s ~ ~ ~ w ~ (0002) 'lola eysra!zrpoloy . m o ~ ! q W ~ % I I p 01
lad
nu
OE lmP 0 t '01vwe
~ w q - - l ! P BmIZ qqurnr .jej~ns uedepua%uad l!seq my -edruaw m ~ u " 9 ! p BmAva3
-yzpual q~seru 83nT aXu!se~!laseap ieCe~ap wyFuay tdrr~a; !S-J Wun
mryu!$lmwur qlqa( SutrSual ylqq %mlC pours qnluaa .uu!y WIEP ay t w * q
tdq ynlun ui!zua !3trq u p s a%u!qas 1 ~ d ~ 1 r1!9a[ ulleB!q WuW -(5661 'SYoFoa
s o @ s ~ ) runuot 41 r~ru;lpurl *3 ~ESE
v(--J
3 m8uap% E'P
"P
5'0 euas (5661 "lo noulwty) !i.mo~ -W [eseva3
us8uap % 5'6 m p 5'0 gu!seur-%u!mru nl!eiC '!se(qasmp i ~ @ ~ a pmq$ey%utuam ~!ypcx e h y p o w w p u ~ p ) -s!q y n w q u r e ~ ~ p ug!y depeqlai sqeur~zua
!sqy-p %Au~!leqas '% 6 - 3 8 !sel!lmap le!iimp iedemaur i e d q
mm[
ywwqm@p molryluy~y d ~ q ~ a i ye- !se[
-9map ueynyeraur
3mA (0002) ' 1 ~ ra eysra -uT~oloy -w%m %mil wlwlaq euamy(4)
Nilai viskositas intrinsik dapat
menunjukkan
secara
lebih jelas pengaruh perlakuankimia
dan enzimatis daripada viskositas spesifik dm kinematik. Viskositas intrinsik menunjukkan kemampuan polimer untuk meningkatkan viskositas lamtan. Viskositas intrinsik diperoleh d m kurva qSdC yang diekstrapolasi hingga C mende- kati 0, sehingga ~neniadakan p e n g d konsentrasi (Hwang el ol., 1997). N i b konsentrasi larutan kitosan yang sangat rnempengaruhi viskositas spesifik
dan kinernatik tidak berpengaruh pada viskosi tas i n ~ i n s i k .Untuk mengamat i hubungan antara perlak-ELII perendaman dengan NaOH terhadap viskositas
dan
h a t molekul, dipilih dua sampel yai tu kitosan hasil perendaman pada suhu 60 "C dengan waktu 90 dan 180 menit. Kedua sampel dipilih karena derajat deasetilasi yang tinggi (di atas 80 %) dan adanya perbedaan yang signi fikan antara k t duanya dalam hal derajat deasetilasi dan keI arutan .Nilai iskczitas
inttinsik
akan
meningkat dengan semakin tingginya daajaideasetilasi
(Tabel 2).Nilai
viskositas inbin- sik dipengaruhioleh
derajat deasetilasi, k ~ n s e n n a s i ~ ' h a t molekul, kekuatan ion, pH dansuhu
saat pengukurm (Dunn el a!.,1997). Wang (199 1) menunjukkan bahwa pada kitosan dengan berat molekul sarna, viskositas intrinsik akan meningkat dengan meningkatny a derajat deasetilasi. Diduga ha1 ini berhubungan dengan efek kitosan yang bersifat sebagai polielektrolit dalarn lanrtan. htosan merupakan polikation yang di dalan
larutan &an bertindak sebagai polielektrolit. Muatan positif kitosan berasal d a r ~ residu
arninany a. Sernaktn tinggi deraj at deasetilasi, residu amina semalun banyak, muatan positif kitosan juga akan semakin banyak. Di dalarn larutan, tinggnya muatan positif &an menghasilkan gaya tolak menolak, ymg akan rne~nbuat polher lutosan yang sebelumnya berbentuk gulmgan, membuka menjadi rantai l m s . Sebagai Abatnya, viskositas larutan akan meningkat.
Viskositas intrinsik akan meningkat dengan meningkamya berat molekul (Tabel 2). Berat molekul berhubungan dengan derajat polirnerisasi. Polimer rantai lurus seperti
kitosan akan menunjukkan pening-katan densitas ji ka derajat polirnerisasi bertarnbah. Dengan derni kian, viskositas intrinsk j uga &an meningkat. Wang er al. (1991) menunjukkan hubungan linier antara nilai log viskositas intrinslk dengan
nilai
log berat molekul, untuk larutan lutosan dengan derajat deasetilasi sarna.Tabtt 2. Chnctcristic of chitosan produced by combination of chemical and enzymatic deacetylation
Chemical deacetylalioo After e q m a t a deacetylation chemical deacetylation following
Condition hcetylation Intrinsic Mol. Weigh Deacet? lathon Inninsic Mot. Weight
d e q e visctlsity (s lo3 Da) degree (%) viscosity (x 1
o3
Da)Soaking in NaQH of 60 % 80.3 % 31.7 d g-l 45.26 88.5 % 3.6 rnL g-' 4.25
at 60 "C for 90 mio.
SuakinginNaOHofM)% 97.0% 3 5 5 . 6 m ~ ~ " 615.73 98.2% 11.4mLg1 15.09
at 60 OC for 180 min.
P!c:e: Enqmatic deaEetylaliw by 10 mu of chitin hcetylaiion for 22 h
Deasetilasi enzimatis meningkatkan yang juga menurun selama deasetilasi derajat dmetilasi kitosan tetapi menurunkan enzimatis.
viskositas intrinsik (Tabel 2). Penurunan P e n m a n viskosiras setelah deaseti- viskositas hanya rnungkin terjadi
jika
selama
lasi enzimatis juga dilaporkan oleh inkubasi denganenzim
terjadidw&i
Kolodziej ska er al. (2000). Viskositas larutan rantai polher atau depolimerisasi. Dugaan htosan menurun sebesar satu log setelah ini ddionfirn~asi oleh nilai berat molekul initubasi dengan enzimselama
16 jam. Akantetapi Kolodziejska el al. (2000) tidak
penen tuan berat sehing- ga @at lakukan pembandingan. Depolimerisasi karena adanya enzirn- enzi pendegradasi itin dan
di dalam ekstrak
dan
Boc11lu.s K29- 14. Rahayu telah mmgisolasi kitinase Racillu,~ K29-14
selan dm juga
I;] tosanase.
Penggunaan telah
dimurnikm hanya berisi
terjadinya depolimerisasi dan
dan berat molekd Penelitian ini
han !a pemurnian
pengendapan menggunakan arnonium sul
Dalam ini adalah
pengendapan semua
dan komponen
dal ekstrak kasar terendapkan.
Lntuk memisahkan enzim-enzim
harus drlakukan langkah pemur- nian h lanjuc sepem kromatografi atau elektroforesis. Fraksi mempunyai aktivitas tertinggi &pat dtaplikasikan deasetilasi endmatis kitin
Variasi waktu
dan
perendaman alkali tedmhp kitin dapat menghasilkanh
tosan deasetiberkda-beda dpilth &an
rergan tung tujud apli k a s ~ tosan. h,iasing-masing bentuk aplikasi membutuh-
kan kard-teristik
berbda-beda. Kitosan
dari
%,dan
berat molehul rendah dibutuhkan sebagaiA-teri, antioksidan, clan
~nmrunoenhoncrng. Untuk aplikasi
sebagai
mem pengemas dibutuhkandengan derajat
d d l a s i
sekitar danh a t
Peneli tian ini rnenghasi lkan
herat rendah. B e h a p a penelitian rnenunjukkan bahwa kito&
berat rendah mempunyai besar antibakteri, anti- antidiabetes, hipakolesterolemik anti- demiluan rr~anpunyai mapfaat Sesar daplikasikan d a l m pengolahan pangan hasil
(5)
( ) menunjukkan bahwa pada
kitosan
dengan berat malekul sarna,meningkatnya D~duga ha1
berhubungan efek ljrosar~ yang bersr polielektroli I ddam larutan. htosan merupakan poljkation dalarn
larutan bertindak
Muatan positif dari
aminanya. Semakin tingg~
arnina semakin banyak, muatan positif lutosanJuga &an w n a h n banyak. Di dalam larutan, tingginya muatan positif &an menghasilkan rolak mcnolak, yang
membuat polimer sebelumnya
berbentuk gulungan, membuka menjadi rantai lunrs. Sebagai akibablya, viskosirs lamtan &an rneningkat.
intrinsik meningkar dengan
meningkatnya berat (Tabel Berat dengm
polunerisasi. Polimer rantai l urus
kitosan menmjukkan pening-katan densitas jika polimerisasi bertambah. Dengan demikian, inmnsik
&an
Wang 01. nenunjukkan bubungan 1 inier antara nilai iskositas intrinslk dengan niIai berat nolekd, untuk larutan kitosanlaajat daSehIasi sarna. chemical
-
chemical deacctylat~on
--
- Charac~ms~rc
MoI. Wkght Dcacetylation Intrins~c Mol Wchght (x 10' Da) dtgrec (%) viscwlty (x 10' Da)
-
mL g"
mg juga menurun selama uirnalis.
Penurunan setelah deaseti- enzimahs juga dilaporkan oleh olodaejska ef al. larutan t o m menurun
sebesar
satu setelah Kubasi enzim xlarna ~ k a nKolohejska er al.
Aswita E m m m t i et a[ Codination .fSm&.lng in Sodium H$roqdt? a m f ~ f t i f 1rt Deacetyl;rse3pp6
melakdan p e n m a n berat molekul sehing- ga tidak dapat dilakukan pembandingan.
Depolimuisasi diduga
karma
adanya enzirn-enzim pendegradasi kitin dan kitosan yang lain di dalam ekstrak enzim CDA
dan
Aacrllus K29- 1 4. Raha~u (2000) telah mengisolasi kitinase dari Hacrllu,~ K29-14 selain CDA dan mungkin juga terdapat kitosanase.Penggunaan enzim yang telah dimurnikan sehingga hanya berisi CDA &an
dapat meminitnkan terjadinya depolimerisasi dan menghasilkan kitosan dengan viskositas dan berat molekul lebih tinggi. Penelitian lni
hanya melakukan pemurnian CDA dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat. Dalam proses ini yang terjadi adalah pengendapan prolein, sehingga semua enzirn
dan
komponen protein lain yang terdapat dalarn eksrtak kasar enzim akan terendapkan. Untuk memisahkan CDA dan enzirn-enzim yang lain, harusdilakukan
langkah pernur- nlan lebi h lanjut, seperti dengan krornatografr atau dengan elekwoforesis. Fraksi yang mempunyai aktivitas CDA tertinggi dapat diapl ikasikan untukdeasetilasi
enzimatis kitin.Variasi waktu
dm lama
perendaman alkali terhadapkitin
&pat menghasilkan htasan dengan derajat deasetilasi yang berbeda-be&. Proses yang hpillh &an tergantung pada tuju-iul aplikasi kitosan. Masing-mrtsingbentuk
aplikasi membutuh- kan htosan dengan karaheristik y a w berkh-beda. Kitosan dengan derajat deasetilasi tinggi,lebih
dari 85 %, dan berat moleladrendah
dibutuhkan sebagai anti-bA-eri,
antifungi, antiaksidan, antitumor dm imniunoenhancing. Untuk aplikasi sebagai membran dan pengemas dibutuhkan kitosanKESLMPULAN
Kombinasi deasetilasi kimia dan enzirnatis akan meningkatkan derajat deasetilasi kitosan lebih tinggi daripada
pwlakuan kitnia saja. Deasetilasi kimia menlngkatkan derajat deasetilasi sebesa 6-
55 %. Kombinasi deasetilasi kimia dan enzimatis akan meningkatkan dera-iat deaseti-
lasi
16-58 %. Produk kitosan yang dihasilkan mempunyai derajat deasetilasi 77-99 %, viskositas intrinsik 3,6-1 1,4mL
g'
dan berat molekul 4,2x103-1 1,1xl0~ Da.UCAPAN T E R M A KASIH
Terima kasih disarnpaikar! kepada Pusat Riset Pengolahan
Produk
dan
Sosial Ekonomi Kelautan dan Perikanan Jakarta atas bantuan dana dan fasilitas szlama penditian.DAFTAR PUSTAKA
Arnold LD, Solomon NA (1966) Manual of Industrial Microbiology
dan
Biotech- nology.Am
Society for Microbial.Chang
KLB,
Tsai G, Lee J, Fu W (1997) Heterogenous N-deacetylation ofchi-
tin
in alkaline salution. Carbohydr Res303: 327-332.
Copeland RA (2000) Methods for Protein Analysis: A Practical Guide to Labo- ratory Protocols.
Chapman
and Hall,New
York.
Dunn ET,
Grandmaison
EW, Goom MFA (1997) Aplicationsand
propertiesof
chitosan. Dulam: G m ~ n MFA (ed) Applications of Chltinand
Chitosan. Technomic Pub1Co
Inc, Basel..
-
dengan derajat deaseiilasi sehta 70 % d m H-g J, Hang
S,
h n
C (1997) Effect ofberat molekul tinggi. molecular weight and NaCl
concen-
Penelitian
ini menghasi
lkanki
tosan tration on dilute solution properties of dengan berat molekul rendah. B e m achitosan.
J Food Sci Nutr, 2: 1-5.tian rnenunjukkan bahwa kitosan
drnem bcrar molckul mmpunYai K01~'icjska 1, Wojrasz-Pajak A, Ogonowr- potensi lebi h besar sebagai anti bakteri, anti-
ka
G , Sikorsh ZE (2000) Deacetyla- fungi. antidiabetes, hipokolestmlemik anti- tion of clutinin
a two-stage chemicalolisidan atau antitumor, dengan demikian and enzymatic process. Bul Sea akan mzrnpunyai
mapfaat
lebih k s a r untuk Fisheries lnst 2(150): 15-24.(6)
Martinou A, Kafebopoulos
D,
BouriotisV
(1 995) C h i h deacety lation by enzy-
matic means: monitoring of d-la- tion processes. Carbohydr Res 273:
235-242.
Mukherjee
DP
(2002) Method for Producing Chitin or Chitosan. US Patent Applica- tion no 20020055629.9 May 2002. Muzzarelli R A G Rochetti R, Stanic V,W e c k
M
(1997) Methods for the determination of the degree of acetylationof
chitin and chitosan. h l a m : Muzzarelli RAA, Peter MGfed) Chitin Handbook. European Chitrn Soc, Grottarnare.
No HK, Meyers
S F
(1997) Preparation ofclutin and chtosan. Dalam: Muzzarelli RAA, Peter MG (ed) Chitin Handbook. European Chitin Soc, Grottamare.
Rahayu
S
(2000) Karakttisasi dan pemur- nian en- htinasedan
kitin deasefilase termostabil dari BaciIlussp.
K29-14
asal
Kawah Kamojang, Jawa Barat. Tesis SekolahPasca-
sarjana IPB.Roberts GAF (1997) Determination of the degree of N-acetylation of chitin and chitosan. Di Dalam Muzzarelli RAA, Peter MG
(ed)
Chitin Handbook. Europan Chitin Soc, Grottamare. Sakai K, Yokota A, KurokawaH,
WakayamaM,
MoriguchM (1998)
Purificationand characterization of thrw thermo- stable endochitinase. Ap?I Environ
Microbiol64: 3397-3340.
Shahidi F, Arachch J K V, J eon
YJ
( 1 999 jFood
applications of chitin and ch~to-sans. Trends in Food Sci Techno1 10:37-5 1.
Tokuyasy K, Ohnishi-Kameyama M, tiaya- shi K (1996) Pur~fication and charac- terization of extracellular chit~n deace- tylation from C'olle~ovrclnrnr I~nlieltru- rhiunum Btosc~ Biotech Biochetn 60.
1598- 1601
Trudel J, Asselin A (1989) Detecnon of chitinase activity with polyacrylarn~de gel electrophoresis. Analpcal 610-
chem, 178: 362-366.
Tsigos I, Bouriotis V (1995) Purification and characterization
of
chitin deasetiiase from Collerotrrchum hndemu lhranum. J Biol Chem, 270: 26286-2629 1. Tsigos I, Martinou A, Kafetzopoulos D,Bouriotis V (2000) Chitin deacetyla-
ses: new, versatile tools in biotechno- logy.
TIBTECH
18: 305-3 12.Wang W, 80
S,
Li S, Qin W (1991) Determi- nation of the Mark-Houwink equation for chitosans with different degrees o f deacetylation. Int J Biol Macromol 13:281-285.
JSOLASI
PENGHASU.
RAN
~ u l i a n i ' , Chusnul 1) Sttdi fikr~olog~ Hasil Yertrtjad
Jl. II.uttah Grrgut, Samari~da
I'erfareutr Eaktil/u.~ Teh~olupr Pertmratr H~rlaks~~rnt, Recieved 2(
n tranmterification
curr stnrctu
&out Int
Indo1 lip-prducing m l d s fio
their
eenu s i Rhizops, Petiicilium, A ~ r g ~ l l t
olrgupm~s, h m
Iipase
50 O C . activity fro1
SO
"C
Kqwvrds: Lipcue praiuci~ig f i B b
Ak hir-akhi r ini produk baru berupa
tmmkw,
terutama terstmktu spesifik, memperoleh perhatian besarhbidang
teknologi pangandan
gizi.Reaksi
utama dalam sintesis terstrukturadalah
transesteri fikasi seringesterifikasi. Modifikasi meng- hasilkan terstruktur dilakukan rnelalui
reaksi
dikatdisis
(Yesilogludan
Kilic, Met& modifrkaslini
telah &laporkanpada
banyak publikasi &lam satu dekadeterakhir.
Namundemikian
hasil
penelitian berhltsil diaplikrlsikan d a r n industri sangat sedikit. Salal: u alasannya adalah harga komersidmahd er a!. 2002).
Lipase (t~iasilgliserol
hidrolase
3.1.1.3 mengkataljsis ludrolisaikatan
esta dan triasilgliserol dan tertentldapat mensintesis melalu