Isolation and Identification of Manolytic Bacteria from Pari Island

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI MANOLITIK LAUT
DARI PULAU PARI

APRIDAH CAMELIAWATI DJOHAN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Isolasi dan Identifikasi Bakteri
Manolitik Laut dari Pulau Pari adalah karya saya dengan arahan dari komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir Tesis ini.

Bogor, September 2012

Apridah Cameliawati Djohan
NRP G851100061

ABSTRACT
APRIDAH CAMELIAWATI DJOHAN. Isolation and Identification of
Manolytic Bacteria from Pari Island. Under direction of LAKSMI AMBARSARI
and YOPI

Indonesia's tropical marine biodiversity of microorganisms have high
potential and commercial value. This study focused on the isolation and
identification of potential microbes which produce mannanase enzyme to
hydrolyze mannan and eventually produce manno-oligosaccharides. Sampling
was conducted in Pari island at Jakarta Bay area, the screening and observation of
mannanase enzyme activity from those marine biodiversity have been conducted.
The research succeed to collect 20 bacteria that could produce mannanase
enzyme, three of them have the most high activity from qualitative analysis based
on mannolytic index using congo red method for Pari 3, 4 dan 5 such as 4,33,
2,40, dan 2,60. Further quantitative analysis for these bacteria were conducted
such as activity of mannanase using dinitrosalicylic acid method and resulted the
highest activity is Pari 3 with 2,474 U/mL and Pari 4 with 1,193 U/mL both in the

second day of fermentation, whereas Pari 5 with 1,087 U/mL in the third day of
fermentation. Analysis 16S rRNA gene were showed that Pari 3, 4, and 5 are
domain Bacteria, filum Firmicutes, class Bacilli, ordo Bacillaceae and genus
Bacillus. For the spesific identification are using phylogenetic tree and concluded
that Pari 3 has similar sequence 91.1% with Bacillus safensis and 92% Bacillus
pumilus, from the both result showed the genetic relationship which is less than
97% in similarity therefore it was suggested that the bacteria Pari 3 is a new strain
and can be further investigated. Whereas The results of Pari 4 identification has
similar sequence 94.1% with Bacillus anthacis and 92.2% with the Bacillus
cereus in the genetic relationship. The results of Pari 5 identification has similar
sequence 97.1% with Bacillus anthracis and 95.2% with the Bacillus cereus in the
genetic relationship.
Keywords: Pari island, biodiversity microorganism, mannanase, marine bacteria,
16S rRNA

RINGKASAN
APRIDAH CAMELIAWATI DJOHAN Isolasi Dan Identifikasi Bakteri
Manolitik Laut Dari Pulau Pari. Dibimbing oleh LAKSMI AMBARSARI dan
YOPI

Biodiversitas mikroorganisme laut tropis Indonesia mempunyai nilai
potensi maupun komersial yang tinggi. Pengembangan ilmu bioteknologi memacu
teknik biomolekuler sebagai dasar penelitian yang bertujuan untuk
mengidentifikasi mikroorganisme yang telah diisolasi dari alam maupun dalam
melakukan rekayasa genetik yang dapat memodifikasi urutan basa sehingga dapat
diperoleh jenis enzim yang diinginkan. Sedangkan kemajuan teknik-teknik dalam
bidang enzimologi dapat dimanfaatkan untuk menganalisis kualitas enzim secara
kuantitatif untuk hasil yang lebih akurat.
Tesis ini terfokus pada identifikasi mikroba laut, pemanfaatan enzim laut
penghidrolisis senyawa polisakarida dan memperoleh bakteri manolitik potensial
penghasil enzim mananase. Sebagian besar enzim mananase komersial dihasilkan
dari mikroba yang berasal dari daratan sehingga adanya ketertarikan untuk
melakukan isolasi mikroba penghasil enzim mananase dari laut, tujuan melakukan
isolasi yaitu selain memanfaatkan kekayaan biodiversitas asli Indonesia juga
dapat melengkapi data mikroba potensial penghasil enzim mananase. Penelitian
ini bertujuan untuk mengeksplorasi, mengisolasi, skrining dan identifikasi bakteri
manolitik laut lokal dari pulau Pari Indonesia.
Pengambilan sampel dilakukan di kawasan pulau Pari teluk Jakarta,
proses identifikasi dan pengamatan aktivitas enzim mannanase dilakukan
menggunakan metode kualitatif dengan pewarnaan congo red. Sedangkan untuk

analisis kuantitatif untuk menentukan besarnya aktivitas mananase yang
dihasilkan oleh bakteri, digunakan metode asam dinitrosalisilat. Secara molekuler
bakteri manolitik potensial dapat diidentifikasi genus, spesies serta pohon
kekerabatannya dengan menganalisis gen 16S rRNA yang bersifat spesifik untuk
setiap bakteri.
Hasil isolasi dan skrining telah berhasil diperoleh 20 bakteri yang dapat
menghasilkan enzim mananase dan tiga diantaranya mempunyai aktivitas tertinggi
berdasarkan analisis congo red yaitu Pari 3, 4 dan 5, dengan indeks manolitik
berturut-turut 4,33; 2,40; dan 2,60. Hasil analisis aktivitas enzim mananase pada
isolat Pari 3 pada hari kedua menunjukkan aktivitas tertinggi sebesar 2,474 U/mL,
dengan tipe enzim yang disekresikan yaitu eksoenzim karena dari pola
pemanfaatan substrat mannan sesuai dengan pertumbuhan jumlah sel.
Pari 4 mempunyai aktivitas tertinggi di hari kedua sebesar 1,193 U/mL.
Sedangkan untuk Pari 5 menunjukkan aktivitas tertinggi pada hari ketiga
yaitu 1,087 U/mL. Untuk isolat Pari 4 dan Pari 5 mempunyai pola enzim yang
serupa yaitu pola endoenzim yang bersifat random dalam pembentukan gula
reduksi sehingga pada polanya menunjukkan bahwa pemanfaatan substrat manan
tidak terpengaruh dengan jumlah sel yang terbentuk. Analisis lebih lanjut yaitu
amplifikasi gen 16S rRNA telah berhasil dilakukan. Hasil analisis diperoleh
bakteri Pari 3 yang mempunyai hasil kekerabatan 91,1% dengan Bacillus safensis

dan 92% dengan Bacillus pumillus. Dari keduanya menyatakan presentase
kekerabatan yang kurang dari 93% dan 97%. oleh karena itu dapat diduga bahwa
bakteri Pari 3 merupakan strain baru dan dapat diteliti lebih lanjut. Hasil
identifikasi bakteri Pari 4 mempunyai hasil kekerabatan 94,1% dengan Bacillus
anthracis dan 92,2% dengan Bacillus cereus. Hasil identifikasi bakteri Pari 5
mempunyai hasil kekerabatan 97,1% dengan Bacillus anthracis
dan 95,2%
dengan Bacillus cereus. Menurut Schloss dan Handelsman 2004. bila kemiripan
maksimum ≥ λ7% maka dianggap satu spesies yang sama, maka dapat
disimpulkan bahwa bakteri Pari 4 dan 5 merupakan Bacillus anthracis.
Penelitian ini sebagai langkah awal pemanfaatan dan eksplorasi
biodiversitas mikroba laut lokal Indonesia sebagai sumber penghasil enzim pada
umumnya dan enzim mananase pada khususnya. Akan sangat baik jika bakteri
manolitik potensial yang telah diisolasi dapat pula diidentifikasi gen penyandi
enzim mananasenya untuk dikembangkan secara rekayasa genetika dalam
memproduksi enzim mananase untuk skala industri atau komersial.
Kata kunci: Pulau Pari, biodiversitas mikroorganisme, enzim mananase, bakteri
laut, 16S rRNA

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2012
Hak Cipta dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutian tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak bagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI MANOLITIK LAUT
DARI PULAU PARI

APRIDAH CAMELIAWATI DJOHAN

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012

Judul Tesis
Nama
NRP

: Isolasi dan Identifikasi Bakteri Manolitik Laut dari Pulau Pari
: Apridah Cameliawati Djohan
: G851100061

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Laksmi Ambarsari, MS.
Ketua

Dr. Yopi

Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS.

Dr. Ir. Dahrul Syah, MS

Tanggal Ujian : 27 Agustus 2012

Tanggal Lulus:

Penguji Luar Komisi Pada Ujian Tesis : Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc

PRAKATA
Segala puji syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Pengasih

atas kasih karunia-Nya sehingga tesis yang berjudul “Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Manolitik Laut dari Pulau Pari” ini telah dapat diselesaikan. Tesis ini
dibuat sebagai salah satu syarat mahasiswa pascasarjana program S2 untuk meraih
gelar Magister pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Penyusunan
tesis ini melalui proses penelitian dan penulisan yang membutuhkan banyak
dukungan serta bantuan secara intelektual dan teknisnya, untuk itu melalui
kesempatan ini penulis menyampaikan terimakasih kepada berbagai pihak.
Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya penulis haturkan kepada :
1. Tim komisi pembimbing yang terdiri: (1) Dr. Laksmi Ambarsari, MS., sebagai
ketua komisi pembimbing yang telah banyak memberikan perhatian, bantuan,
dan meluangkan waktu untuk membimbing, dan berdiskusi. (2) Dr. Yopi,
sebagai anggota komisi pembimbing serta pembimbing selama melakukan
penelitian di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi di Pusat penelitian
Bioteknologi LIPI Cibinong.
2. Bapak Dr. Ir. I Made Artika, M. App. Sc., yang telah meluangkan waktu dan
berkenan menjadi penguji luar komisi serta memberi saran yang sangat
bermanfaat bagi penulis.
3. Ibu Prof. Dr. Maria Bintang, MS., selaku ketua program studi S2 Biokimia
yang telah meluangkan waktu dan berkenan menjadi moderator dalam ujian
siding tesis dan untuk segala doa, bantuan dan dukungan selama penulis

melaksanakan studi di program Magister Biokimia IPB.
4. Rekan-rekan di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat Penelitian
Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) di Cibinong,
Ahmad Thontowi, M.Si., Nanik Rahmani, M.Si., Ade Andriani S.Si.,
Alex Prima, S.Si., dan Awan Purnawan, S.Si., terimakasih atas senyum,
semangat, dukungan dan saran yang sangat membantu dalam menyelesaikan
tesis ini.
5. Dekan Sekolah Pascasarjana IPB beserta staf pegawai Pascasarjana IPB,
Ketua PS Biokimia atas perkenaan menerima dan membantu penulis selama
menjalani pendidikan S2 IPB.

6. Dosen-dosen IPB, terutama pada program studi Biokimia, Terimakasih atas
sumbangan ilmu pengetahuan yang sangat bermanfaat bagi penulis.
7. Teman-teman Biokimia angkatan 2010, Sri Anggarini Rasyid, Elizabeth
Situmorang, Martha Sari, Noni Mardian Trizana, dan Adios Boby serta temanteman yang tidak sempat penulis sebutkan namanya satu persatu, Terimakasih
atas persahabatan yang indah semasa menjadi mahasiswa Biokimia.
8. Terimakasih yang khusus dan mendalam penulis sampaikan kepada kedua
orang tua penulis, papi Djohan Hartanto (alm) dan mami Lili Suhartini, atas
segala doa, kasih sayang, dan dukungan selama membesarkan dan mendidik
penulis sehingga berhasil menempuh pendidikan hingga jenjang Magister.

9. Kakak tersayang Felinawati Djohan, Djeppy Hartono Djohan dan Frangky
Hartono Djohan atas segala doa dan dukungannya selama penulis mengikuti
pendidikan Magister di IPB.
10. Terimakasih untuk sahabat-sahabat terbaik dan terkasih, Michael H.B
Lumintang, Lidya Huang Huang, Swastika Praharyawan dan Ashif Irvan
Yusuf atas segala doa, dukungan serta semangatnya selama penulis
menempuh pendidikan Magister di IPB.
Penulis menyadari dalam penulisan serta penyusunan tesis ini masih
banyak kekurangan dan keterbatasan dari segi materi maupun segi sistematika,
oleh karena itu penulis dengan segala kerendahan hati terbuka untuk menerima
kritik dan saran yang bersifat membangun demi penyempurnaan penyusunan tesis
ini. Akhirnya semua budi baik yang diberikan kepada penulis semoga diterima
dan dibalas berlipat ganda oleh Tuhan Yang Maha Esa. Penulis menyampaikan
permohonan maaf apabila penulis melakukan kesalahan baik yang disengaja
maupun tidak semasa menyelesaikan studi magister ini. Semoga tesis ini dapat
bermanfaat bagi penulis khususnya maupun bagi rekan-rekan mahasiswa.

Bogor, September 2012

Apridah Cameliawati Djohan

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 17 April 1983 dari ayah Djohan
Hartanto (alm) dan ibu Lili Suhartini. Penulis merupakan Putri bungsu dari empat
bersaudara. Pada tahun 2006 penulis lulus dari program studi Kimia di Sekolah
Tinggi Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Bogor. Pada Tahun 2006 hingga
saat ini penulis bekerja di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi di Pusat
Penelitian Bioteknologi Lembaga ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) sebagai
peneliti. Pada Tahun 2010, penulis mendapatkan kesempatan untuk menempuh
Program Magister Sains di IPB. Penulis memilih program studi Biokimia dalam
melanjutkan studinya. Saat ini penulis aktif melakukan penelitian khususnya di
bidang enzimologi dan fermentasi yang mencakup tema tentang Biorefinery
dengan memanfaatkan mikroorganisme seperti bakteri, ragi, dan kapang.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAM AR ………........................................................................

i

DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................

ii

PENDAHULUAN.........................................................................................

1

Latar Belakang.............................................................................
Hipotesis ……………………………………………………….
Tujuan Penelitian ........................................................................
Manfaat Penelitian ……………………………………………..

1
3
3
3

TINJAUAN PUSTAKA................................................................................

5

Manan..........................................................................................
Enzim Mananase..........................................................................
Mikroba Manolitik......................................................................
Manfaat Enzim Mananase...........................................................
ioinformatika……………………………................................
16 rRNA……….......................................................................
Identifikasi 16S rRNA dengan Metode PCR..............................
Ribosomal Database Project (RDP) ………...............................

5
6
8
10
12
12
14
15

METODOLOGI…………............................................................................

17

Waktu dan Tempat penelitian.....................................................
Cara Kerja…………...................................................................

17
17

HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................................
Isolasi dan Purifikasi akteri manolitik Laut…..........................
Aktivitas Enzim Mananase…………………………………......
DNA Genom...............................................................................
Amplikon Gen 16S rRNA...........................................................
Pohon Filogenetik Pari 3…………………...…..........................
Pohon Filogenetik Pari 4 dan 5...................................................
SIMPULAN DAN ARAN ……………………………………………….

23
23
27
30
31
32
33
37

Simpulan …………………………………………………….…
Saran …………………………………………………………...

37
38

DAFTAR PUSTAKA....................................................................................

39

LAMPIRAN………………………………………………………………..

43

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1. Hemiselulosa.......................................................................................
2. Pemotongan Heteromannan oleh Komplek Enzim Mananase............
3. Lokasi Sampling di Pulau Pari Kepulauan Seribu DKI Jakarta.........
4. Bakteri Manolitik Laut Potensial Penghasil Enzim Mananase...........
5. Hasil Analisis Kualitatif Bakteri Manolitik Metode Congo Red …..
6. Aktivitas Mananase dan Jumlah Sel Bakteri Pari 3…………….…...
7. Aktivitas Mananase dan Jumlah Sel Bakteri Pari 4............................
8. Aktivitas Mananase dan Jumlah Sel Bakteri Pari 5............................
9. Elektroforegram Genom Bakteri Manolitik Laut ….........................
10. Elektroforegram Amplikon Hasil Identifikasi 16S rRNA...................
11. Pohon Filogenetik Bakteri Manolitik Laut Pari 3..............................
12. Pohon Filogenetik Bakteri Manolitik Laut Pari 4 dan 5……............

i

5
7
23
24
25
28
29
29
30
31
33
34

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1. Diagram Alir Penelitian ......................................................................
2. Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 3………………………….
3. Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 4………………………….
4. Hasil Contiq Bakteri Manolitik Laut Pari 5………………………….
5. Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 3………………………...
6. Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 4………………………...
7. Kromatogram Bakteri Manolitik Laut Pari 5………………………...
8. Analisis Identifikasi Bakteri Manolitik Laut Pari 3.............................
9. Analisis Identifikasi Bakteri Manolitik Laut Pari 4.............................
10. Analisis Identifikasi Bakteri Manolitik Laut Pari 5.............................

ii

43
44
45
46
47
48
49
50
51
52

1

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan negara bahari yang mempunyai kekayaan biodiversitas
mikroorganisme laut yang potensial untuk pengembangan ilmu pengetahuan
maupun nilai komersial dalam meningkatkan industri dalam negeri. Kemajuan
bidang bioteknologi menstimulasi berkembangnya penelitian dan eksplorasi
kekayaan biodiversitas mikroorganisme laut asli Indonesia untuk melengkapi
database mikroorganisme potensial yang saat ini belum banyak dilakukan.
Pemanfaatan biodiversitas mikroba laut semakin diharapkan secara maksimal
untuk menghasilkan terobosan baru melalui produk hasil metabolisme, bioproses
maupun kemampuannya menghasilkan jenis enzim yang spesifik. Tingginya
permintaan pasar akan produk-produk baru dan mempunyai tingkat efisiensi yang
tinggi dalam proses produksi sangat dibutuhkan dalam bidang industri seperti
pangan fungsional, farmasi, peternakan, bioenergi, lingkungan dan kesehatan. Saat
ini pemanfaatan teknologi enzimatik dalam dunia industri sedang pesat dilakukan,
salah satu enzim yang mempunyai peranan penting tersebut adalah enzim
mananase. Enzim mananase merupakan enzim yang dapat mengkatalisis reaksi
hidrolisis dari ikatan β-1,4-manosidik dari rantai manan, glukomanan, dan
galaktomanan. Enzim mananase dapat digunakan dalam aplikasi teknologi enzim
pada industri yang beragam seperti makanan, pakan, farmasi, kertas maupun dalam
industri gas sebagai stimulasi maupun perlakuan awal terhadap biomasa
lignoselulosa sebagai bahan untuk biofuel generasi kedua (Songsiriritthigul et al.
2010).

Penelitian mengenai mikroorganisme penghasil enzim mananase dari darat,
seperti actinomycetes, kapang, aspergillus, fungi dan bakteri telah banyak
dilakukan sehingga informasi tentang gen yang menyandi enzim mananase yang
telah dikloning maupun disekuen berasal dari mikroba darat dapat diperoleh, jenis
enzim ini mempunyai kemampuan untuk mengikat β-manan dan aktivitas katalitik
yang tinggi dalam mendepolimerisasi substrat polisakarida (Tanaka et al. 2009).
Oleh sebab itu timbul ketertarikan untuk melakukan penelitian, eksplorasi dan
isolasi mikroorganisme potensial penghasil enzim mananase dari perairan laut

2

Indonesia yang masih jarang dilakukan. Mikroba mannolitk adalah mikroba yang
dapat menghasilkan enzim mananase yang dapat menghidrolisis polisakarida
kompleks menjadi molekul sederhana seperti manno-oligosakarida dan mannosa.
Pada umumnya enzim mananase dihasilkan dari mikroorganisme seperti bakteri,
namun adapula yang dihasilkan dari tanaman dan hewan. Enzim mananase yang
dihasilkan oleh mikroorganisme mempunyai keunggulan tersendiri yaitu bersifat
lebih ekonomis, mudah dan efisien dalam memproduksinya. Proses karakterisasi
dan fermentasi enzim mananase dari mikroba mempunyai waktu proses yang lebih
cepat dibandingkan dengan enzim dari tanaman dan hewan.
Senyawa polisakarida yang terdapat di perairan laut sangat bervariasi karena
sesuai dengan jenis monomer yang menyusunnya yaitu agar, kitin, manan, xylan
dan selulosa. Pemanfaatan produk polisakarida dalam negeri sangat terbatas
walaupun sumbernya berlimpah karena Indonesia merupakan negara tropis yang
kaya akan biodiversitas tanaman tropis, tingginya biaya pengembangan produk
polisakarida dan sistem pengolahan yang tradisional menyebabkan Indonesia
seringkali menjual bahan mentah dan mengimpor produk yang sudah jadi dengan
harga impor yang lebih mahal dari ekspor bahan mentah. Diharapkan dari
penelitian ini dapat mengembangkan potensi mikroba lokal dan menghasilkan
enzim potensial untuk industri serta mulai memanfatkan teknologi rekayasa
genetik dan teknologi enzimatis sehingga dapat dengan maksimal memanfaatkan
biomassa polisakarida, karena selain bersifat renewable, teknologi di atas lebih
ramah lingkungan.
Enzim dari mikroba laut lokal belum banyak diteliti maupun dikembangkan
pada tingkat laboratorium maupun komersial. Enzim laut memiliki karakter
berbeda dengan enzim dari mikroba biasa sehingga penelitian biodiversitas
mikroba laut dan karakter enzim penghidrolisis polisakarida laut menjadi hal yang
menarik untuk dikaji. Biomassa juga mempunyai peranan penting dalam proses
produksi enzim yaitu sebagai sumber karbon sedangkan pemanfaatan biomassa
yang spesifik dapat mengetahui kemampuan mikroba untuk menghasilkan enzim
yang spesifik pula. Penelitian yang dilakukan sebelumnya telah menghasilkan
enzim mananase termofilik laut dari bakteri Rhodothermus marinus, mikroba ini
diisolasi dari perairan laut yang mempunyai suhu tinggi sehingga mempunyai

3

aktivitas enzim mananase yang cukup unik dalam mendegradasi sumber manan
seperti galaktomannan pada substrat locust bean gum, mikroba manolitik laut ini
telah diketahui menghasilkan enzim mananase glikosidasi famili 26 yang bersifat
termofilik yaitu tahan hingga temperatur 85°C setelah melalui proses karakterisasi
enzim dan analisis sekuen DNA (Politz et al. 2000). Mikroba penghasil enzim
mananase dari darat dapat berupa aktinobakteri seperti Cellulomonas fimi,
actinomicetes dari kelompok streptomicetes seperti Streptomyces galbus dan
Streptomyces lividans yang mempunyai karakterisitik enzim yang unik karena
dapat mendegradasi berbagai jenis substrat manan (Stoll et al. 1999).

Tujuan Penelitian
Tujuan umum dari penelitian ini adalah untuk mengeksplorasi kekayaan
biodiversitas mikroorganisme laut lokal Indonesia. Tujuan khusus penelitian ini
antara lain 1) Mengetahui apakah mikroorganisme laut khususnya bakteri laut
mempunyai kemampuan untuk menghasilkan enzim mananase potensial. 2)
Mengisolasi, skrining dan mengidentifikasi bakteri manolitik laut lokal dari pulau
Pari Indonesia. 3) Melengkapi data base mikroba potensial penghasil enzim
mananase.
Hipotesis
Kekayaan biodiversitas mikroorganisme laut lokal Indonesia dapat
menghasilkan enzim mananase potensial.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan enzim mananase potensial
dari mikroba lokal untuk kebutuhan penelitian maupun industri dan mendapatkan
informasi data base mikroba laut lokal potensial penghasil enzim mananase.

4

5

TINJAUAN PUSTAKA

Manan
Manan merupakan senyawa hemiselulosa yang terdapat di alam dan
merupakan polisakarida kedua yang sangat melimpah setelah selulosa. Manan
dapat diklasifikasikan menjadi macam tipe dari mannopolisakarida yaitu linier
manan, galaktoglukomanan, galaktomanan, dan glukomanan (Zahura et al. 2011).
Manan terdiri atas susunan gula sederhana manosa, galaktomanan terdiri atas
manosa dan galaktosa, glukomanan terdiri atas manosa dan glukosa, sedangkan
galaktoglukomanan tersusun dari manosa, galaktosa dan glukosa (Sachselehner et
al. 2000). Struktur manan berbentuk linier atau bercabang yang dapat pula
ditemukan sebagai heteroglikan pada tumbuhan tingkat tinggi, variasi struktur
senyawa kompleks hemiselulosa mannan (Gambar 1).

Gambar 1.

Kelompok Hemiselulosa: (a) Manan (b) Galaktomanan (c)

Glukomanan (d) Galaktoglukomanan (Dhawan et al. 2007)

6

Manan terutama terdapat pada kayu lunak, endosperma kopra, kelapa
sawit, kopi, dan locust bean gum. Locust bean gum adalah substrat yang
mengandung galaktomanan yang berasal dari tanaman Ceratonia siliqua. Locust
bean gum dapat menginduksi sekresi enzim mananase yang dapat menghidrolisis
rantai tulang punggung galaktomanan maupun rantai sampingnya. Locust bean
gum terdiri atas komponen galakto-D-manoglikan 88%, pentan 4%, protein 6%,
selulosa 1%, dan mineral 1% (Sumardi 2004).

Enzim Mananase
Enzim adalah biokatalisator yang berfungsi untuk mempercepat laju reaksi
kimia dalam suhu dan derajat keasaman yang spesifik. Enzim juga dapat berupa
protein sederhana atau protein yang terikat pada gugus non-protein, enzim bersifat
spesifik untuk substrat tertentu. Enzim dapat diklasifikasikan berdasarkan
beberapa reaksi seperti reaksi oksidasi-reduksi, perpindahan komponen kimia,
hidrolisis, pengurangan atau penambahan suatu zat kimia, isomerasi, dan adanya
unit substrat yg berikatan (polimerasi) (Lehninger et al. 2004).
Enzim merupakan biokatalisis yang penggunaannya dibatasi oleh suhu,
tekanan, pH, dan kekuatan ion. Enzim juga merupakan zat yang dapat bereaksi di
dalam sel hidup, enzim mengkatalisis semua aspek metabolisme sel seperti dalam
proses pencernaan makanan yang meliputi hidrolisis senyawa protein,
karbohidrat, dan lemak menjadi molekul yang lebih kecil; penyimpanan dan
perpindahan

energi

kimia

serta

pembentukkan

struktur

penyusun

sel

(Purawadaria et al. 1994).
Enzim mananase merupakan enzim pengurai heteromanan menjadi
manosa, glukosa, dan galaktosa. Enzim Mananase adalah enzim yang berfungsi
untuk mengkatalisis proses hidrolisis manan yang merupakan senyawa
polisakarida. Degradasi manan oleh bakteri, fungi, cendawan dan tanaman
memerlukan variasi enzim seperti β-Mananase (EC 3.2.1.78) yang dapat
menghidrolisis β-1,4-D manopiranosil pada kerangka utama polimer manan
seperti pada galaktomanan dan glukomanan untuk menghasilkan rantai pendek
manooligosakarida. Selanjutnya senyawa tersebut dihidrolisis oleh kerja enzim βmanosidase (EC 3.2.1.25) dan α-galaktosidase (EC 3.2.1.22) menghasilkan

7

manosa dan galaktosa (Duffaud et al. 1997). Proses hidrolisis dari senyawa
heteromanan galaktomanan memerlukan komplek enzim mananase yaitu enzim
galaktosidase untuk memotong rantai ikatan galaktosa dengan manosa dan enzim
mananase untuk memotong rantai ikatan manosa dengan manosa. Pada senyawa
glukomanan diperlukan komples enzim mananase glukosidase dengan mananase
untuk menghasilkan gula sederhana. Enzim glukosidase berfungsi untuk
memotong ikatan rantai glukosa dengan manosa sehingga hasil akhir hidrolisis
berupa glukosa dan manosa (Gambar 2).

Gambar

2.

Pemotongan

heteromanan

(Kurakake et al. 2001).

oleh

komplek

enzim

mananase

8

Enzim Mananase merupakan kelompok enzim glikosida hidrolase yang
dapat mendegradasi manan dan heteromanan. Enzim glikosida hidrolase
(E.C 3.2.1) merupakan kelompok enzim yang telah diketahui dapat menghidrolisis
ikatan glikosidik pada oligo-dan polisakarida. Untuk menghidrolisis substrat
karbohidrat yang mempunyai struktur kompleks maka dibutuhkan kombinasi
berbagai

macam

enzim

untuk

dapat

mendegradasi

menjadi

senyawa

manooligosakarida. Enzim yang termasuk dalam kelompok glikosida hidrolase
mempunyai sumber yang berbeda-beda yaitu bakteri, kapang maupun jamur
sehingga enzim tersebut dapat diklasifikasikan menjadi kelas yang berbeda
menurut urutan sekuen asam amino dan struktur tiga dimensi molekul enzimnya
(Dhawan et al. 2007).
Perbandingan hasil sekuen dari enzim β-mananase menunjukan bahwa ada
dua famili yaitu famili 5 dan 26. Famili 5 merupakan perbandingan dari hasil
sekuen bakteri Caldocellum saccharolyticum, Caldibacillus, Vibrio, Aspergillus
aculeatus, Trichoderma reesei dan Agaricus bisporus dan mananase dari
kelompok eukariotik seperti Lycopersicon esculentum dan Mytilus edulis. Famili
26 terdiri atas hasil sekuen mananase dari Bacilli sp., Cellvibrio japonicus,
Pseudomonas fluorescens dan Rhodothermus marinus. Adapun enzim mananase
dari bakteri dan eukariotik terdapat dalam daftar famili 5 dengan suatu
pengecualian untuk beberapa fungi anaerobik, sedangkan untuk famili 26
sebagian besar terdiri atas bakteri origin. Namun dalam beberapa hal tertentu,
enzim mananase yang dihasilkan dari mikroorganisme yang bergenus sama dapat
diklasifikasikan pada kedua famili 5 dan 26 (Dhawan et al. 2007).
Mikroba Manolitik
Perairan laut merupakan ekosistem terbesar di bumi karena lebih dari 90%
biosfer terdiri atas sejumlah mikroorganisme laut bertanggung jawab atas 50%
produksi bahan-bahan utama untuk memenuhi kebutuhan ekosistem laut sebagai
kebutuhan makanan serta energi untuk mlakukan metabolisme bagi habitat yang
lain. Dalam lingkungan perairan laut, bakteri mempunyai peranan penting sebagai
pengatur siklus biogeokimia agar selalu bersifat konstan seperti proses asimilasi,
pengendapan, transformasi, perpindahan, dan remineralisasi unsur karbon yang

9

berada pada laut. Tingkat aktivitas mikroba laut dalam mendegradasi unsur
karbon dapat diteliti berdasarkan keberadaan nutrisi yang tersedia di habitatnya.
Karakteristik bakteri laut memerlukan air laut atau kadar garam, sehingga bakteri
laut digolongkan ke dalam kelompok bakteri halofilik, diantaranya bakteri
halofilik

moderat

yang

membutuhkan

1%

hingga

20%

NaCl

untuk

pertumbuhannya dan bakteri halofilik ekstrem yaitu memerlukan 15%
hingga 31% NaCl untuk pertumbuhannya (Ruyitno 2004).
Nutrisi karbon yang terdapat pada laut tidak seragam karena luasnya area
perairan menyebabkan nutrisi yang terkandung mempunyai tingkat konsentrasi
yang berbeda-beda. Tingkat kedalaman juga mempengaruhi jenis nutrisi yang
terkandung pada bagian laut tertentu, misalnya pada laut dalam hanya dihasilkan
nutrisi karbon yang berasal dari hasil degradasi mikroba yang berada pada
endapan tanah dan tidak mempunyai aktivitas terhadap sinar matahari. Sedangkan
untuk perairan laut dangkal mempunyai nutrisi yang lebih kaya karena mikroba
mendapatkan energi dari sinar matahari untuk melakukan aktivitas metabolisme
dan adanya interaksi dari fitoplankton yang dapat mendegradasi senyawa organik.
Oleh sebab itu mikroba pada permukaan air laut mempunyai kemampuan yang
lebih beragam dalam mendegradasi sumber karbon (Lauroa et al. 2009).
Dasar dari ketertarikan untuk melakukan eksplorasi mikroba laut untuk
memperkaya jenis enzim mananase karena selama ini eksplorasi lebih banyak
dilakukan untuk mikroba darat. Penelitian yang dilakukan sebelumnya telah
menghasilkan enzim mananase termofilik laut dari bakteri

Rhodothermus

marinus, mikroba ini diisolasi dari perairan laut yang mempunyai suhu tinggi
sehingga mempunyai aktivitas enzim mananase yang cukup unik dalam
mendegradasi sumber manan seperti galaktomannan pada substrat locust bean
gum, mikroba manolitik laut ini telah diketahui menghasilkan enzim mananase
glikosidasi famili 26 yang bersifat termofilik yaitu tahan hingga suhu 85° C
setelah melalui proses karakterisasi enzim dan analisis sekuen DNA
(Politz et al. 2000).
Enzim pendegradasi polisakarida seperti selulase (β-1,4-glukanase) dan β1,4-xilanase memiliki struktur modul yang terdiri atas modul katalitik dan modul
pengikat karbohidrat (CBM). Berdasarkan pada kesamaan homologi hasil sekuen

10

asam amino, enzim glikosida hidrolase (GH) dan CBM diklasifikasikan menjadi
famili 112 dan 52. Sistem klasifikasi membagi enzim β-mananase menjadi dua
famili yaitu GH 5 dan 26. Enzim β-mananase telah diisolasi dari berbagai jenis
tanaman, fungi dan bakteri sehingga banyak pula literatur tentang gen yang
menyandi enzim mananase yang telah dikloning maupun disekuen berasal dari
mikroba darat, namun telah diketemukan mikroba laut Vibrio sp. Strain MA-138
penghasil enzim mananase yang telah dimurnikan dan diketahui memiliki enzim
mananase terbaru yaitu famili 27 berdasarkan modul pengikat karbohidratnya
yang menyandi enzim Man5C yaitu mempunyai wilayah terminal karbohidrat
pada spesifik domain, jenis enzim ini mempunyai kemampuan untuk mengikat βmanan dan aktivitas katalitik yang tinggi dalam mendepolimerisasi substrat
polisakarida (Tanaka et al. 2009).

Manfaat Enzim Mananase
Pemanfaatan enzim mananase pada dunia industri sangat beragam karena
enzim ini mempunyai daya hidrolisis yang tinggi dan cukup stabil pada suhu
tinggi karena bersifat termostabil. keunggulan yang dimiliki oleh enzim mananase
membuatnya cukup populer, namun selain keunggulan enzim tersebut adapula
kekurangannya yaitu produksi enzim mananase cenderung membutuhkan biaya
produksi yang tinggi. Hal ini pula yang menyebabkan para peneliti berusaha untuk
mencari solusi untuk menekan biaya produksi dengan memanfaatkan mikroba
potensial yang dapat menghasilkan enzim mananase dengan tingkat produksi yang
tinggi dan kemurnian yang baik.
Penggunaan enzim mananase sebagai zat penambah pakan menunjukkan
beberapa pengaruh yang menguntungkan. Keuntungan tersebut terlihat dalam
kombinasi dengan bahan pakan lain seperti guar gum, kopra, alfalfa, bungkil
sawit dan kedelai yang mengandung manan dengan jumlah yang signifikan.
Untuk ternak monogastrik seperti unggas dan babi, manan merupakan komponen
pakan yang tidak dapat dicernakan karena beraksi sebagai faktor antinutrisi.
Pengaruh negatif manan telah dilaporkan mengurangi pertumbuhan ternak,
efisiensi penggunaan dan nilai nutrisi dalam pakan. Sebaliknya mananase ketika
ditambahkan dalam diet corn-soybean meal untuk ayam petelur dapat

11

meningkatkan produksi telur dan berat telur. Enzim mananase juga digunakan
sebagai pakan ternak yang dikombinasi dengan karbohidrat dalam diet ternak.
Hasilnya menunjukkan perbaikan terhadap tingkat pertumbuhan dan daya cerna
nutrisi (Dahwan et al. 2007).
Dalam industri makanan enzim mananase digunakan untuk produksi kopi
instan karena enzim ini dapat mengurangi viskositas ekstrak kopi sehingga
memudahkan proses hidrolisis manan kopi. Hal ini menyebabkan pengurangan
biaya energi dalam proses pengeringan dalam produksi kopi instan, karena air
yang terikat pada manan akan terlepas karena adanya degradasi enzim mananase.
Selain itu mananase digunakan untuk menghasilkan monooligomer spesifik yang
penting sebagai bahan pangan fungsional, seperti monooligomer yang berfungsi
sebagai prebiotik (Sachslehner et al. 2000).
Enzim mananase juga digunakan dalam detergen, berfungsi dalam
menfasilitasi penghilangan sisa kotoran dan kosmetika dari zat warna dan tanah.
Mananase pada detergen dapat berfungsi pula sebagai penstabil, pengembang dan
penghalus. Untuk beberapa jenis detergen, aplikasi mananase juga dapat
dikombinasikan dengan enzim-enzim lainnya seperti amilase, selulase, lipase,
pektinase, protease dan endoglukanase (Kensch et al. 2008).
Enzim mananase berfungsi sebagai zat pemutih pada bubur kertas.
Efektifitas enzimatis yang terjadi pada proses pemutihan selalu berdasarkan pada
jenis kayu yang digunakan dan metode pembuburan kertas, karena enzim
mananase hanya dapat bekerja apabila kadar ligninnya rendah (Zhang et al. 2000).
Enzim mananase pada industri minyak dan gas dapat diaplikasikan sebagai
stimulator untuk proses pematahan hidrolik, hal ini disebabkan sifat termostabil
dari enzim yang cukup baik. Sistem kerja enzim ini ialah mengurangi tingkat
viskositas larutan pada saat berlangsungnya proses pematahan hidrolik minyak
dan gas pada suhu tinggi (Dhawan et al. 2007).
Aplikasi yang lainnya digunakan dalam bidang pengolahan pangan dan
pakan yaitu untuk produksi manno-oligosakarida sebagai prebiotik penting pada
bungkil kelapa sawit baik untuk pangan maupun pakan. Produk prebiotik dapat
diperoleh dengan melakukan proses hidrolisis mananase terhadap bungkil kelapa
sawit atau galaktomanan yang kaya akan kandungan manno-oligosakarida dan D-

12

mannosa. Manno-oligosakarida dapat memacu pertumbuhan probiotik (seperti
Bifidobacteria

dan

Lactobacillus

sp),

dan

menghambat

pertumbuhan

enterobacteria Salmonella, serta menetralkan sifat-sifat antinutrisi dari lectin
(Yopi et al. 2007).
Bioinformatika
Bioinformatika merupakan ilmu yang dapat menghubungkan informasi
yang meliputi biologi molekular, struktur biokimia, enzimologi, biologi sel,
fisiologi dan patologi dengan menggunakan sistem komputerisasi berdasarkan
data yang telah dikumpulkan. Definisi bioinformatika adalah ilmu yang dapat
mengorganisir dan menganalisis data kompleks dengan ilmu biologi molekular
dan biokimia modern berdasarkan pada informasi yang tersimpan di dalam sekuen
nukleotida-DNA, sebagai dasar tersusunnya molekul kehidupan yaitu protein.
National Center for Biotechnology Information (NCBI) merupakan organisasi
yang diperkenalkan pada tahun 1988 di Serikat yang bertujuan untuk memproses
data secara komputerisasi dalam bidang biomedical dan biokimia. Pada saat itu
NCBI berada di dalam National Library of Medicine (NLM), yaitu badan yang
menangani data base biomedikal. NCBI sendiri secara spesifik bergerak dalam
bidang pengembangan alat analisis untuk membantu dalam mengerti proses
genetik dan molekular maupun sifat-sifat patogenik. Organisasi NCBI mempunyai
tujuan pokok, yaitu meliputi 1) menciptakan mekanisme otomatis yang dapat
menganalisis dan menyimpan data yang berhubungan dengan biologi molekular,
genetik dan biokimia. 2) memfasilitasi penggunaan data base dan perangkat lunak
yang tersedia kepada komunitas sains, seperti peneliti, pekerja dalam bidang
kesehatan maupun mahasiswa. 3) mengkoordinasi komunitas sains global di
seluruh dunia untuk mengumpulkan data genetik dan 4) melakukan penelitian
baru yang berhubungan dengan analisis struktur dan hubungan fungsional antara
molekul biologis secara komputerisasi (Rashidi et al. 2000).
16S rRNA Ribosom
RNA ribosom (rRNA) merupakan komponen inti zat pembentuk protein
pada suatu makhluk hidup. Molekul rRNA bersifat ubikuitus dengan fungsi yang

13

identik pada seluruh organisme. Ribosom merupakan kompleks ribonukleoprotein
yang terdiri atas dua subunit yaitu subunit kecil (small subunit) dan subunit besar
(large subunit). Terdapat tiga jenis RNA dalam ribosom prokariotik berdasarkan
nilai koefisien sedimentasi, yaitu 5S, 16S, dan 23S rRNA. Gen 16S rRNA
merupakan bagian dari subunit kecil ribosom dan berperan penting dalam
pengenalan ujung 5’–mRNA serta memposisikan pada letak yang tepat dalam
ribosom (Clarridge, 2004).
RNA ribosom pada semua sel memiliki daerah yang urutan basanya sangat
lestari dan beberapa daerah yang urutan basanya variatif. Perbandingan urutan
basa yang lestari berguna untuk mengkonstruksi pohon filogenetik karena
mengalami perubahan dengan relatif lambat dan mencerminkan kronologi evolusi
bumi. Sebaliknya, urutan basa yang bersifat variatif dapat digunakan untuk
melacak keragaman dan menempatkan galur-galur dalam satu spesies (Pangastuti,
2006).
Dari tiga jenis rRNA yang dimiliki prokariot, gen penyandi 16S rRNA
paling sering digunakan sebagai penanda molekular karena memiliki ukuran basa
yang paling ideal dari segi analisis statistika dibandingkan gen penyandi 5S rRNA
dan 23S rRNA. Molekul 5S rRNA memiliki ukuran basa yang terlalu pendek
sehingga tidak ideal untuk analisis statistika, sementara molekul 23S rRNA
memiliki struktur sekunder dan tersier yang cukup panjang sehingga menyulitkan
analisis. Tingkat kelestarian yang tinggi dan kemudahannya untuk mengukur
variasi dari 16S rRNA menjadikan gen penyandi 16S rRNA secara luas digunakan
pada penentuan taksonomi, filogeni (hubungan evolusioner), dan memperkirakan
laju penyebaran bakteri (Weisburg et al. 2001). Penelitian mengenai kekerabatan
evolusioner di antara mikroorganisme berdasarkan perbandingan urutan basa 16S
rRNA dipelopori oleh Carl Woese (Krane dan Raymer, 2003). Berdasarkan urutan
basa 16S rRNA, Woese mengajukan tiga domain dalam sistem klasifikasi yaitu
Archaea, Bacteria dan Eucarya. Dua bakteri dapat dikelompokkan dalam satu
genus bila memiliki kemiripan maksimum (maximum identity) ≥ λ3%. Sementara
dua

bakteri

dianggap

sebagai

satu

maksimum ≥ λ7% (Hagstrom et al. 2002),

spesies

bila

memiliki

kemiripan

14

Identifikasi 16S rRNA dengan Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
Identifikasi

molekuler

digunakan

untuk

mempelajari

kesamaan

deoxyribonucleic acid (DNA) atau homologi genetik diantara organisme.
Kesamaan DNA dapat dipelajari dengan sekuensing terhadap basa DNA atau
RNA dan hibridisasi DNA (Malik 2006). Penggunaan untai gen ribosomal RNA
untuk klasifikasi mikroorganisme saat ini merupakan salah satu analisis yang
cukup

akurat

untuk

menentukan

kekerabatan

diantara

mikroorganisme

(Suryadi 2002). Situs DNA molekul 16S rRNA dikenal mempunyai informasi
genetik yang cukup lengkap untuk melihat kekerabatan bakteri (Leblond et al.
1996).
Identifikasi 16S rRNA dapat dilakukan dengan metode Polymerase Chain
Reaction (PCR). PCR merupakan suatu metode untuk membuat salinan segmen
spesifik dari suatu DNA. Metode ini jauh lebih cepat daripada pengklon gen
dengan DNA plasmid atau DNA faga dan seluruhnya dilakukan in vitro
(Campbell 2002).
Gen pengkode 16S rRNA terdapat bagian penyimpan yang berguna untuk
mendisain primer universal PCR yang mampu memperbanyak beberapa fragmen
16S rRNA dari semua bakteri pathogen dan nonpatogen. Fragmen ini termasuk
bagian hipervariable yang tidak mudah termutasi dan mengandung tanda urutan
spesifik spesies yang berguna untuk mengidentifikasi bakteri hingga ke level
spesies (Israhmadini 2008).
Proses PCR merupakan proses siklus yang berulang meliputi denaturasi,
annealing dan ekstensi oleh enzim DNA polymerase. Setiap siklus dikondisikan
pada temperature berbeda yang telah diprogram oleh mesin yang disebut thermal
cycler. Dasar siklus PCR ada 30-35, siklus ini meliputi: denaturasi (95°C) untaian
ganda DNA dipisahkan, annealing (55-60°C) primer dibiarkan berikatan dengan
ujung-ujung urutan target yang spesifik, dan ekstensi (72°C). Taq polimerase
menambahkan nukleotida pada ujung 3’ primer dengan menggunakan untai DNA
yang lebih panjang sebagai cetakannya (Kuchel et al. 1998). Sedangkan untuk
waktu tergantung pada panjang pendeknya ukuran DNA yang diinginkan sebagai
produk amplifikasi. Campuran reaksi PCR terdiri atas komponen-komponen yaitu

15

template DNA, buffer, dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), primer dan unit taq
polimerase.
Ribosomal Database Project (RDP)
Metode Ribosomal Database Project (RDP) adalah program yang
menggunakan pengukuran gen berdasarkan program algoritma. Kesesuaian
susunan yang diperoleh dapat dibandingkan dengan gen yang sudah ada
sebelumnya. RDP, menyediakan metode untuk pencarian database nukleotida dan
protein secara cepat dan akurat. RDP juga dapat digunakan untuk mengetahui
hubungan fungsional dan evolusioner dari spesies yang berhubungan. Secara
umum perangkat lunak RDP dpat diaplikasikan secara online melalui
http://www.rdp.com yaitu meliputi memasukan data sekuen hasil bioedit, memilih
program dan data base yang diinginkan, memilih format output dan melakukan
pencarian database dan menyimpan hasilnya. Sedangkan untuk melakukan
perbandingan

pohon

(Cole et al. 2009).

kekerabatan

dapat

menggunakn

program

MEGA5

16

17

METODOLOGI

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan dari bulan Agustus 2011 sampai Maret 2012
di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi pada Pusat Penelitian Bioteknologi
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong-Bogor.
Bahan dan Alat
Alat yang digunakan adalah tabung analisis, cawan petri, oze, bunsen,
kapas, gelas piala, mikrotips, erlenmeyer, neraca analitik, sentrifuge, mikropipet,
tabung Eppendorf, thermometer, penangas air, pH meter Jenway 3505, magnetic
stirer, hot stirer IKA RH basic 2, shaker incubator TAITEC Bioshaker BR-23FP,
laminar air flow Bioclean Bench Sanyo, autoclave Tommy SX-500, spreader,
inkubator bakteri SANYO, PCR ASTEC, elektroforesis Nyx Technik MIR-153,
UV gel doc Scope WD, Freezer SANYO Ultra low. Bahan yang digunakan
adalah sample air laut dengan media untuk proses pengkayaan dan identifikasi
kualitatif menggunakan aquades, Artificial Sea Water, agar powder, substrat
(Locust bean gum), pepton, ekstrak khamir, (NH4)2.SO4, KH2PO4, MgSO4.7H2O,
CO (NH2)2, CaCl2, FeSO4.7H2O, MnSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, CoCl2, HCl,
NaOH, NaCl, pewarna congo red. Bahan yang digunakan dalam proses analisis
enzim mananase secara kuantitatif adalah Reagen berupa reagen dinitrosalisilat
(DNS) yang terdiri atas DNS, NaOH padat, fenol, Na2SO3, dan Kalium Natrium
Tartrat (KNa-tartrat). Bahan yang digunakan dalam proses identifikasi
gen 16S rRNA dan kloning adalah strain bakteri potensial penyandi mananase,
InstaGene

TM

Matrix Biorad, agarosa, TAE (Tris Asetat EDTA), Etidium

bromida, go taq®green master mix, primer 9F, primer 1510R.

Cara Kerja
Isolasi Mikroba Laut
Mikroba laut yang digunakan dalam penelitian berasal dari Pulau Pari
Teluk Jakarta, disampling dengan menggunakan metode sea water direct

18

sampling (sampel berupa air laut). Bakteri penghasil mananase diisolasi dengan
teknik pengayaan mengikuti Mandels dan Stemberg (1976) dengan memodifikasi
sumber karbon. Komposisi media pengayaan, skrining, purifikasi dan identifikasi
secara lengkap seperti berikut: Substrat Locust bean gum 0,5%; Pepton 0,075%;
Ekstrak khamir 0,05%; Mineral (NH4)2.SO4 0,14%; KH2PO4 0,2%; MgSO4.7H2O
0,03%; CO (NH2)2 0,03%; CaCl2 0,03%; FeSO4.7H2O 0,0005%; MnSO4.7H2O
0,00016%; ZnSO4.7H2O 0,00014%; CoCl2 0,0002% dan pH media 6.0. Mikroba
mannolitik diisolasi dari kultur pengkayaan dengan locust bean gum sebagai
sumber substrat (sumber karbon berupa manan). Kultur pengkayaan yang telah
diinokulasikan air laut hasil sampling diinkubasi dalam shaker incubator selama
satu minggu, kecepatan putar 150 rpm pada suhu ruang. Proses isolasi dilakukan
dengan cara menginokulasikan hasil kultur pengayaan sebanyak 20 µL dengan
faktor pengenceran 10-4 dan 10-5 pada media padat dengan cara disebar dengan
menggunakan spreader kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang.
Proses pemurnian isolat dilakukan dengan cara pick –up koloni tunggal yang telah
tumbuh pada media isolasi dan ditumbuhkan pada media padat untuk proses
identifikasi (Mandels dan Sternberg, 1976).

Uji Bakteri Manolitik Potensial
Identifikasi bakteri potensial penghasil enzim mananase dengan cara uji
kualitatif dengan pewarnaan menggunakan metode congo red. Bakteri laut yang
telah murni diinokulasikan pada media padat (komposisi media pengayaan
dengan konsentrasi agar 1,5%) yang mengandung substrat manan (Locust Bean
Gum 0,5%), kemudian diinkubasi selama 48 jam. Setelah itu ditambahkan larutan
pewarna congo red dengan konsentrasi 0,2% dan diinkubasi

selama

15-30 menit pada suhu ruang, kemudian dilakukan pencucian sebanyak 3 kali
dengan menggunakan larutan NaCl dengan konsentrasi 2%. Bakteri mannolitik
potensial yang dapat menghasilkan enzim mananase dapat diketahui secara visual
yaitu dengan nampaknya zona bening disekitar zona tumbuh koloni (Yopi et al.
2007).

19

Uji Aktivitas Enzim Mananase
Aktivitas enzim mananase diuji dengan memipet sebanyak 0,5 mL substrat
locust bean gum 0,5% direaksikan dengan 0,5 mL enzim mananase lalu
diinkubasi selama 30 menit pada suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 1,5 mL reagen dinitrosalisilat (DNS). Perlakuan kontrol dengan cara
substrat direaksikan dengan DNS lalu ditambahkan enzim. Sampel dan kontrol
dididihkan selama 15 menit lalu didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks
dan diukur absorbansinya pada

= 540 nm (Miller 1959). Pembuatan kurva

standar dilakukan dengan mereaksikan berbagai konsentrasi manosa dari 0-10
mg/ml sebanyak 1 mL dengan 1,5 mL DNS lalu dididihkan selama 15 menit dan
didinginkan. Setelah dingin suspensi divorteks dan diukur absorbansinya
pada = 540 nm. Satu unit aktivitas enzim mananase (U) didefinisikan sebagai
sejumlah enzim yang dapat mengkatalisis konversi dari 1 mol substrat manan
menjadi manosa dalam 1 menit (Bintang 2010).
Identifikasi Mikroba berdasarkan Analisis Gen 16S-rRNA
Isolasi Genom Total
Identifikasi bakteri manolitik diawali dengan mengisolasi DNA genom
total menggunakan metode dari kit InstaGene

TM

Matrix BioRad. Koloni isolat

murni sebanyak satu ose dengan 250 µ L mili Q steril dan disentrifuge
selama 1 menit dengan kecepatan 10,000 rpm. Supernatan dibuang sedangkan
pelet ditambahkan kit InstaGene

TM

Matrix BioRad sebanyak 50 µL, kemudian

larutan diinkubasi pada suhu 56ºC selama 15-30 menit dan divortex dengan
kecepatan 100 rpm selama 10 detik dan selanjutnya dipanaskan pada suhu 100ºC
selama 8 menit. Tahap akhir ekstraksi DNA yaitu memisahkan DNA (Supernatan)
dari komponen lainnya (pelet) dengan sentrifuge pada kecepatan 10,000 rpm
selama 2 menit. Template DNA siap diamplifikasi dengan PCR, jika template
tidak langsung dipergunakan maka harus disimpan pada suhu -20°C.

20

Analisis PCR
DNA Template diamplifikasi dengan mengambil 2 µL (60 ng/1µL)
template yang dicampur dengan 25 µ L “Gotaq”. Gotaq adalah campuran dNTP,
primer dan buffer PCR. Selanjutnya ditambahkan masing-masing 1 µL primer
forward 9F 50 µLM (5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-) dan 1 µL primer reverse
1510R 50 µLM (5’-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-) dan ditambahkan milli-Q
steril hingga mencapai volume 50 µL. Amplifikasi dilakukan dalam thermocycler
dengan tahap pre denaturasi awal selama 2 menit pada suhu 95ºC, tahap
denaturasi selama 30 menit pada suhu 95ºC tahap annealing selama 1 menit pada
suhu 55ºC dan tahap extension selama 2 menit pada suhu 72°C. Banyaknya siklus
amplifikasi yang digunakan yaitu 30 siklus.
Elektroforesis Hasil PCR
Proses amplifikasi dengan PCR telah selesai maka