Analisis keragaman D-Loop Dna mitokondria mencit rumah (Mus Musculus Castaneus) di daerah Jakarta, Bandung dan Surabaya dengan Pcr-Rflp

ANALISIS KERAGAMAN D-LOOP DNA MITOKONDRIA
MENCIT RUMAH (Mus musculus castaneus)
DI DAERAH JAKARTA, BANDUNG DAN SURABAYA
DENGAN PCR-RFLP

Oleh :
Diana Yulianti
G04499071

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2005

2

ANALISIS KERAGAMAN D-LOOP DNA MITOKONDRIA
MENCIT RUMAH (Mus musculus castaneus)
DI DAERAH JAKARTA, BANDUNG DAN SURABAYA
DENGAN PCR-RFLP

Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains
pada Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Oleh :
Diana Yulianti
G04499071

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2005

3

ABSTRAK
DIANA YULIANTI. Analisis Keragaman D-loop DNA Mitokondria Mencit Rumah (Mus musculus
castaneus) di Daerah Jakarta, Bandung dan Surabaya dengan PCR-RFLP. Dibimbing oleh DEDY
DURYADI SOLIHIN dan RONNY RACHMAN NOOR.
Mencit rumah (Mus musculus) termasuk dalam kelas Mamalia, infrakelas Eutheria, ordo

Rodentia, subordo Myomorpha dan famili Muridae. Spesies tersebut dalam perkembangannya
terbagi menjadi subspesies Mus musculus domesticus, Mus musculus musculus, Mus musculus
castaneus dan Mus musculus bactrianus (Silver 1995). Subspesies yang tersebar di Indonesia
adalah Mus musculus castaneus (Boeadi et al.1982).
DNA mitokondria (mtDNA) sering digunakan sebagai penanda molekular sebagai salah satu
cara untuk mengetahui keragaman genetik. Keragaman genetik mtDNA dapat diketahui dengan
menggunakan metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Lenght
Polymorphism). Sepasang primer yang digunakan adalah CTDF dan CTDR. Sedangkan enzim
restriksi yang digunakan adalah HaeIII, AluI dan RsaI. Sampel yang digunakan berasal dari Jakarta
(10 ekor), Bandung (11 ekor) dan Surabaya (9 ekor) sehingga total sampel menjadi 30 ekor.
Dengan menggunakan metode PCR-RFLP ditemukan sembilan haplotipe pada ketiga puluh
sampel mencit rumah. Pada populasi Jakarta ditemukan tiga haplotipe, Bandung tujuh haplotipe
dan Surabaya lima haplotipe. Haplotipe lokal ditemukan di populasi Bandung (H-5 dan H-7) dan
Surabaya (H-8 dan H-9). H-3 merupakan haplotipe umum yang terdapat di semua populasi.

ABSTRACT
DIANA YULIANTI. Genetic Diversity Analysis of D-loop Mitochondrial DNA of House Mice (Mus
musculus castaneus) in Jakarta, Bandung and Surabaya. Supervisors : DEDY DURYADI SOLIHIN
and RONNY RACHMAN NOOR.
House mice ( Mus musculus) belongs to class Mammal, infraclass Eutheria, Order Rodentia,

suborder Myomorpha and family Muridae. This spesies divided into subspesies subspesies Mus
musculus domesticus, Mus musculus musculus, Mus musculus castaneus and Mus musculus
bactrianus (Silver 1995). Subspesies which spread all over Indonesia is Mus musculus castaneus.
Mitochondrial DNA (mtDNA) is often used as genetic marker to study genetic diversity. Genetic
diversity of mtDNA can be obtained using PCR-RFLP. The Primers used for analysis were CTDF
and CTDR. The restriction enzyme used were HaeIII, AluI and RsaI. The samples were from
Jakarta (10 mice), Bandung (11 mice) and Surabaya (9 mice) so the total amount of samples were
30 mice.
We generated pcr product 1384 bp in length using PCR-RFLP. Nine haplotype were found. In
Jakarta population there were three haplotype, Bandung seven haplotype and Surabaya five
haplotype. Local haplotypes were found in Bandung (H-5 and H-7) and Surabaya (H-8 and H-9).
The H-3 was common haplotype that were found in all population.

4

Judul

: ANALISIS KERAGAMAN D-LOOP DNA MITOKONDRIA MENCIT RUMAH
(Mus musculus castaneus) DI DAERAH JAKARTA, BANDUNG DAN
SURABAYA DENGAN PCR-RFLP.

: Diana Yulianti
: G04499071

Nama
NIM

Menyetujui,

Pembimbing I

Pembimbing II

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA

Dr. Ir. Ronny Rachman Noor, M.Rur.Sc

NIP. 131415134

NIP. 131624188

Mengetahui,
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, M.Si
NIP. 131473999

Tanggal Lulus :

5

PRAKATA

Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga karya
ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan
November 2004 ini adalah analisis keragaman D-loop DNA mitokondria

mencit rumah (Mus

musculus castaneus) Jakarta, Bandung dan Surabaya dengan PCR-RFLP.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA dan Dr. Ir.

Ronny Rachman Noor, M.Rur.Sc selaku pembimbing dan penyandang dana penelitian ini. Di
samping itu, penghargaan penulis sampaikan

kepada seluruh keluarga besar zoologi, Bapak

Achmad, Ibu Rika, Ibu Wita, Bapak Bambang dan Ibu Taruni untuk semua saran dan dukungannya.
Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Bapak Heri dan Bapak Nunu yang telah membantu
dalam masalah tehnik laboratorium serta rekan-rekan kerja di laboratorium biologi molekuler Pusat
Studi Ilmu Hayat IPB, Ibu Rini, Bapak Sarbaini, Bapak Jakaria, Evie, Virgo dan Ari untuk semua
saran, nasehat dan jalan keluar setiap masalah yang penulis hadapi. Terima kasih juga penulis
ucapkan kepada sahabat-sahabat tercinta Pepen, Ucup, Yayak dan Bank 4di3 yang telah
membantu selama pengumpulan sampel dan atas waktu luangnya menemani penulis dalam suka
dan duka serta Kanthi, Gia, Marin, Andre, Agus, Chie, 14 dan Wina atas segala bentuk dorongan
dan perhatiannya. Tak lupa kasih dan sayang kepada keluarga besar TM 7 dan teman-teman
angkatan 36. Segala cinta dan terima kasih penulis ungkapkan kepada Papa, Mama dan adikku
untuk dukungan moral, material, kesabaran, doa dan kasih sayangnya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, April 2005
Diana Yulianti

6

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 01 Juli 1981 dari ayah Ismail dan ibu Nurhasanah.
Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara.
Pada tahun 1999 penulis lulus dari SMUN 21 Jakarta dan pada tahun yang sama lulus seleksi
masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih Departemen Biologi,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah aktif di Himpunan Profesi Departemen Biologi
(HIMABIO) sebagai anggota Departemen Informasi dan komunikasi pada periode tahun
1999/2000. Penulis melaksanakan praktik lapang selama dua bulan di Gelanggang Samudra Jaya
Ancol, Jakarta. Penulis pernah menjadi asisten mata kuliah Biologi Dasar pada tahun ajaran
2001/2002, Struktur dan Perkembangan Hewan tahun ajaran 2002/2003, Zoologi Vertebrata pada
tahun ajaran 2003/2004, dan 2004/2005.

7

DAFTAR ISI
Halaman

DAFTAR TABEL....................................................................................................................

vi

DAFTAR LAMPIRAN.............................................................................................................

vi

PENDAHULUAN....................................................................................................................

1

BAHAN DAN METODE..........................................................................................................

2

Bahan................................................................................................................................

2

Metode..............................................................................................................................

2

Pengambilan Sampel...................................................................................................

2

Ekstraksi dan Isolasi DNA............................................................................................

2

Uji Kualitas DNA...........................................................................................................

2

Amplifikasi Daerah D-loop............................................................................................

2

Pemotongan dengan Enzim Restriksi..........................................................................

3

Analisis Hasil PCR-RFLP.............................................................................................

3

Analisis Keragaman.....................................................................................................

3

HASIL DAN PEMBAHASAN..................................................................................................

3

Hasil..................................................................................................................................

3

Amplifikasi Daerah D-loop............................................................................................

3

Keragaman Fragmen D-loop dengan Menggunakan Enzim restriksi..........................

3

Pemotongan dengan HaeIII....................................................................................

4

Pemotongan dengan AluI.......................................................................................

4

Pemotongan dengan RsaI......................................................................................

4

Analisis Keragaman Haplotipe...............................................................................................

4

Pembahasan.....................................................................................................................

5

SIMPULAN DAN SARAN.......................................................................................................

8

DAFTAR PUSTAKA...............................................................................................................

8

LAMPIRAN.............................................................................................................................

10

8

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Pola Pemotongan dengan Enzim Restriksi.......................................................................

4

2 Haplotipe dan Penyebarannya..........................................................................................

5

3 Perbandingan hasil PCR-RFLP dengan sekuens acuan..................................................

5

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Penyebaran Mus musculus di dunia.................................................................................

11

2 Daftar Sampel...................................................................................................................

12

3 Hasil BLAST primer forward pada Mus musculus castaneus...........................................

13

4 Hasil BLAST primer reverse pada Mus musculus castaneus...........................................

14

5 Sekuen Mus musculus castaneus acuan..........................................................................

15

6 Hasil dan pola pemotongan dengan HaeIII.....................................................................

16

7 Hasil dan pola pemotongan dengan AluI..........................................................................

17

8 Hasil dan pola pemotongan dengan RsaI.........................................................................

18

9 Hasil PAGE 5.5% dengan silver staining..........................................................................

19

Mencit dapat digunakan sebagai hewan

PENDAHULUAN

model dalam penelitian bidang kedokteran dan
Mencit rumah (Mus musculus) termasuk
dalam kelas Mamalia, infrakelas Eutheria,
ordo Rodentia, subordo Myomorpha dan famili
Muridae. Famili Muridae awalnya diperkirakan
berasal dari daerah India dan Asia Tenggara.
Berdasarkan data paleontologi dan filogeni
diperkirakan bahwa tikus berasal dari nenek
moyang yang hidup 10-15 juta tahun SM.
Sekitar enam juta tahun SM genus Mus
ditemukan, kemudian berkembang menjadi
beberapa spesies yang tersebar di sekitar
India dan ke benua lain (Silver 1995).
Pada 10.000 tahun lalu, Mus musculus
telah mengalami pembagian menjadi empat
populasi yang terpisah dan tidak mengalami
tumpang tindih area di India dan benua lain.
Spesies tersebut dalam perkembangannya
terbagi menjadi subspesies Mus musculus
domesticus, Mus musculus musculus, Mus
musculus

castaneus

dan

Mus

musculus

bactrianus (Silver 1995).
Diperkirakan penyebaran M.m domesticus
terfokus di pinggir wilayah Pakistan dan di
India bagian barat. Sedangkan M.m musculus
berada di utara india . M.m castaneus berada
di daerah Bangladesh dan M.m bactrianus
tetap berada di India (Silver 1995)(Lampiran
1). Subspesies yang tersebar di Indonesia
adalah Mus musculus castaneus (Boeadi et
al.1979).
M.m castaneus berukuran kecil dan lincah.
Hampir seluruh tubuhnya ditumbuhi oleh
rambut bertekstur lembut dengan warna pada
bagian dada tidak putih dan punggungnya
coklat kelabu. Mencit ini memiliki ekor lebih
panjang

dari

panjang

badannya

dengan

bentuk yang meruncing. Ekornya memiliki
anulasi yang cukup jelas dan ditumbuhi oleh
sedikit rambut. Formula puting susu yang
dimiliki adalah tiga pasang di dada dan dua
pasang di perut (Boeadi et al. 1979).

genetika karena memiliki banyak kelebihan
antara lain waktu generasi
kemampuan

adaptasi

yang

kemampuan

ratusan

gen

yang cepat,
tinggi

dan

tunggalnya

bermutasi (Hartwell et al. 2000).
Penggunaan

penanda

molekular

merupakan salah satu cara untuk mengetahui
keragaman

genetik.

DNA

mitokondria

(mtDNA) sering digunakan sebagai penanda
molekular karena memiliki banyak kelebihan
antara lain jumlah kopi yang tinggi, ukuran
yang relatif kecil (14-39 kb) dan pada bagian
tertentu dari genom mitokondria berevolusi
dengan kecepatan yang berbeda (Duryadi
1994).
Mitokondria DNA terdiri dari 13 gen
penyandi polipeptida, 22 gen tRNA dan 2 gen
rRNA.

Urutan gen-gen mitokondria pada

umumnya

relatif

conserved

pada

semua

vertebrata (Brown 1980). Gen-gen tersebut
tersusun dalam 2 utas yaitu utas Heavy (H)
dan utas Light (L). Selain daerah penyandi,
mtDNA juga memiliki daerah noncoding yang
disebut D-loop.
Brown 1980 mengatakan bahwa daerah
D-loop bersifat hipervariabel, karena memiliki
laju evolusi tertinggi. Dapat mencapai 5-10 kali
lebih cepat dibandingkan dengan DNA inti.
Keragaman

genetik

mtDNA

dapat

diketahui dengan reaksi perbanyakan DNA
secara in vitro

pada sekuen target dengan

memanfaatkan cara replikasi DNA dengan
bantuan

enzim

DNA

polimerase

dan

perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu.
Metode ini dikenal sebagai Polymerase Chain
Reaction (PCR) (Saiki et al.1986).
Produk
menggunakan

PCR
enzim

kemudian

dipotong

restriksi

(restriction

endonuclease). Sebuah enzim restriksi akan
memotong DNA secara spesifik, terbatas pada
urutan basa nukleotida yang dikenalinya.

10

restriksi

kemudian divortex. 500 ì l digestion buffer

(Sambrook & Russel 2001). Variasi yang

ditambahkan pada tabung dan dikocok hingga

Urutan

basa

ini

disebut

situs

dihasilkan oleh perbedaan panjang fragmen

homogen lalu diinkubasi semalam pada suhu

yang dipotong oleh enzim restriksi ini dikenal

55 C. Kemudian 500 ì l fenol ditambahkan dan

sebagai

dikocok selama ± 20 menit lalu disentrifuse 3

Restriction

Polymorphism

Fragment

(RFLP)

Lenght

(Duryadi

1994).

o

menit

pada

13.000

rpm.

Supernatan

Gabungan kedua metode tersebut dikenal

dipindahkan ke tabung baru lalu ditambahkan

dengan PCR-RFLP.

500 ì l Chloroform isoamil alkohol (CIAA)

Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis

kemudian dikocok selama ± 20 menit. Lalu

M.m

disentrifuse 13.000 rpm selama 3 menit.

castaneus di Jakarta, Bandung dan Surabaya

Supernatan dipindahkan ke tabung baru. Jika

menggunakan metode PCR-RFLP.

sampel berasal dari otot, maka perlakuan

keragaman

genetik

mencit

rumah

Penelitian ini dilaksanakan mulai Bulan
November

2004

sampai

April

2005

di

fenol dan CIAA dilakukan 2 kali. Sebanyak 2
kali volume etanol absolut ditambahkan pada

Laboratorium Biologi Molekuler, Pusat Studi

supernatan lalu dikocok

Ilmu Hayat (PSIH), IPB, Bogor.

terdapat endapan putih DNA. Campuran

perlahan hingga

disentrifuse pada 13.000 rpm selam 5 menit

BAHAN DAN METODE

dan etanol absolut diganti dengan alkohol
70%. Kemudian disentrifuse kembali pada
13.000 rpm selama 5 menit. Alkohol 70%

Bahan
Bahan yang digunakan adalah sampel
darah dan otot dari mencit rumah (M.m

dibuang dan endapan dikeringkan atau di
vacuum. 100 ì l buffer T ris

E DT A (TE)

castaneus) dari beberapa lokasi di Jakarta (10

ditambahkan ke dalam tabung kemudian

ekor), Bandung (11 ekor) dan Surabaya (9

disentrifuse pelan dan diinkubasi pada suhu

ekor) (lampiran 2). Total sampel 30 ekor.

37 C selama 15 menit lalu disimpan dalam

Metode

freezer.

o

Pengambilan sampel. Darah diambil dari

Uji kualitas DNA. DNA yang telah diisolasi

jantung menggunakan syringe yang telah

kemudian dielektroforesis menggunakan gel

berisi ethylene diamine tetra acetic acid

agarose 1.2 % dalam larutan 1xTBE (89 mM

(EDTA) 10% yang kemudian disimpan di suhu

Tris, 89 mM Asam Borat dan 2 mM EDTA, pH

rendah sebelum diisolasi. Sedangkan untuk

8,0) dalam piranti Submarine Electrophoresis

sampel dari otot menggunakan otot yang

(Hoefer).

berasal dari femur M.m castaneus yang sudah

bantuan s inar ultra violet (ë = 300 nm) setelah

dikuliti terlebih dahulu.

gel

Ekstraksi dan isolasi DNA. Ekstraksi
fenol adalah prosedur umum yang digunakan
untuk isolasi sampel DNA (Sambrook &

Pengamatan

diwarnai

dengan

dilakukan
ethidium

dengan
bromide

(0.5mg/ml).
Amplifikasi daerah D-loop. Sepasang
primer

digunakan

untuk

mengamplifikasi

Russel 2001). Sampel darah sebanyak 250-

sekuen D-loop dengan metode PCR. Primer

500 ì l dalam tabung eppendorf 1,5 ml

yang digunakan adalah CTD F 5’- TAA TAT

ditambah lysis buffer dengan volume yang

ACT GGT CTT GTA AAC C- 3’ dan CTD R 5’-

sama

dan

dikocok

sampai

homogen.

GGC TGG CAC GAG ATT TAC CAA CCC- 3’.
®

Disentrifuse selama 1 menit pada 6500 rpm.

PCR menggunakan mesin GeneAmp

PCR

E ndapan ditambah dengan 200 ì l rinse buffer

System 2400 (Perkin-Elmer). Kondisi PCR

11

o

pre-denaturasi

pada suhu 94 C selama 5

menit, kemudian dilanjutkan dengan siklus

unweighted

pair-group

method

using

arithmetic averages (UPGMA).

o

utama yaitu denaturasi pada suhu 94 C
o

selama 45 detik, annealing pada suhu 52 C

HASIL DAN PEMBAHASAN

o

selama 1 menit, elongasi pada suhu 72 C
selama 1 menit yang diulang sebanyak 35

Hasil

o

siklus dan post-elongasi pada suhu 72 C
selama 7 menit.

Amplifikasi daerah D-loop.
Penggandaan in vitro sekuen D-loop pada

Total campuran untuk tiap reaksi PCR

mitokondria M.m castaneus menggunakan

adalah 50 ì l dengan kompos is i sampel DNA 2

primer CTDF yang didesain terletak di tRNA

ì l (10-100 ng), 10X buffer PCR mix 5 ì l, 25

Threonin untuk forwardnya dan CTDR yang

mM MgCl2 3 ì l, 10 mM dNTP mix 1 ì l, 25 pM

terletak

primer CTDF dan primer CTDR masing-

menghasilkan produk sebesar 1384 pasang

mas ing 2 ì l , dan 5 unit / ì l Taq DNA

basa (pb) untuk semua sampel. Hal ini sesuai

polymerase 0.2 ì l (Promega) dan air steril

dengan hasil BLAST GeneBank Database

s ebanyakl 34.8 ì l.

(NCBI) M.m castaneus dengan nomor akses

Pemotongan dengan enzim restriksi.
Enzim

restriksi

yang

digunakan

di

AJ286323

12S

rRNA

(Lampiran

pada

3)

reversenya

dan

AY057792

dalam

(Lampiran 4) yang telah disisipkan sekuen gen

penelitian ini merupakan enzim pemotong 4

tRNA phenil alanin sebesar 68 pb (Lampiran

basa (four-cutter enzyme) yaitu

HaeIII (5’-

5). Oleh karena sekuen asli

tRNA phenil

GG*CC-3’), AluI (5’- AG*CT) dan RsaI (5’-

alanin dari M.m castaneus belum diketahui,

GT*AC-3’) (Promega). Pemotongan dilakukan

maka

sekuen

tRNA

phenil

alaninnya

dengan cara menambahkan 3.5 ì l air s teril, 1

diambilkan dari sekuen tRNA phenil alanin

ì l Buffer dan 0.5 ì l enzim ke dalam tabung

M.m

eppendorf 0.5 ml yang beris i 5 ì l produk PCR.

NC005089).

musculus

(GenBank

nomor

akses

Dengan demikian produk PCR

Tabung disentrifugasi lemah beberapa detik

tersebut terdiri dari sekuen tRNA

agar campuran merata. Kemudian diinkubasi

prolin, D-loop, tRNA phenil alanin dan 12S

o

threonin,

selama ± 16 jam pada suhu 37 C (Syafitri

rRNA. Besarnya sekuen utuh D-loop M.m

2005).

castaneus adalah sebesar 952 pb.

Analisis hasil PCR-RFLP. Fragmen DNA
hasil

PCR-RFLP

dapat

diamati

dengan

elektroforesis menggunakan agarose 1.2% (85
V/ 1-1.5 jam) dengan pewarnaan EtBr. Untuk

Keragaman

fragmen

D-loop

dengan

menggunakan Enzim Restriksi.
Untuk mengetahui keragaman produk PCR

mempertajam hasil digunakan PoliAcrylamide

tersebut

Gel Electrophoresis (PAGE) 5.5% (85 V/ 6

menggunakan tiga jenis enzim restriksi yaitu

jam)

HaeIII, AluI dan RsaI yang merupakan enzim

menggunakan

divisualisasikan

buffer

dengan

1X TBE
silver

dan

staining.

restriksi

maka

empat

Standar DNA yang digunakan adalah ladder

penggunaan

100 bp (Promega).

adalah

Analisis

keragaman.

dilakukan

basa.

enzim

dengan

Dasar

restriksi

harapan

dengan

pemilihan

empat

setiap

256

basa
pb

Rekonstruksi

ditemukan satu situs restriksi. Maka dalam

dendogram menggunakan program Molecular

1384 pb diharapkan terdapat lima situs

Evolutionary Genetic Analysis (MEGA) V.3.0

restriksi.

(Kumar

et

al.1993)

dengan

metode

12

Pemotongan dengan AluI.

Pemotongan dengan HaeIII.
HaeIII merupakan enzim restriksi yang

AluI merupakan enzim restriksi yang akan

yang akan memotong pada sekuen GG*CC.

memotong pada sekuen AG*CT. Sampel yang

Pada

dipotong dengan AluI menghasilkan tiga pola

ketigapuluh

sampel

yang

dipotong

dengan HaeIII menghasilkan tiga pola potong

yang berbeda yaitu D, E dan F. Pada pola D

A, B dan C.

Pola A menghasilkan empat

hasil pemotongan terdiri dari enam fragmen

fragmen (X1, X4, X5 dan X6). Pola B

(X1, X2, X3, X4, X5 dan X7). Pada pola E

menghasilkan empat fragmen (X1, X3, X5 dan

menghasilkan lima fragmen (X1, X3, X4, X6

X7). Sedangkan pola C hanya menghasilkan

dan

tiga fragmen (X2, X7 dan X8). Total ragam

menghasilkan empat fragmen ( X1, X2, X4

fragmen yang dihasilkan oleh HaeIII adalah

dan

sebanyak delapan fragmen (Tabel 1).

X7).
X8).

Sedangkan
Total

pada

ragam

pola

fragmen

F

yang

dihasilkan oleh AluI adalah sebanyak delapan
fragmen (Tabel 1).

Tabel 1 Pola pemotongan dengan enzim

RsaI merupakan enzim restriksi yang akan

restriksi.

Enzim
Restriksi

HaeIII
GG*CC

AluI
AG*CT

Pemotongan dengan RsaI.

Hasil pola
pemotongan
sampel
(pb)
A

B

C

X1
X4
X5
X6

X1
X3
X5
X7

X2
X7
X8

D

E

F

X1

X1

X1

X2
X3
X4
X5
X7

X3
X4
X6
X7

X2
X4
X8

Ragam
&
besar
fragmen
sampel
(pb)
X1 = 136
X2 = 264
X3 = 283
X4 = 290
X5 = 470
X6 = 488
X7 = 495
X8 = 625

memotong pada sekuen GT*AC. Sampel yang
dipotong dengan RsaI menghasilkan tiga pola
yang berbeda yaitu G, H dan I. Pada pola G
hasil pemotongan terdiri dari tiga fragmen (X1,
X7 dan X9). Pola H terdiri dari lima fragmen
(X1, X3, X4, X5 dan X8). Pola I terdiri dari tiga
fragmen (X2, X6 dan X9). Total ragam
fragmen yang dihasilkan oleh RsaI adalah
sebanyak sembilan fragmen (Tabel 1).
Analisis keragaman haplotipe
Semua

data

dianalisis

menggunakan

program MEGA untuk merekonstruksi pohon
filogenetik,

maka

didapatkan

sembilan

X1 = 96

haplotipe berdasarkan pemotongan dengan

X2 = 123
X3 = 140
X4 = 200
X5 = 277
X6 = 400
X7 = 548
X8 = 965

tiga enzim restriksi. Penentuan haplotipe
berdasarkan pada pola pemotongan tiap
enzim

restriksi,

sehingga

haplotipe

yang

dihasilkan merupakan gabungan tiga pola
potong masing-masing enzim (Tabel 2).
Haplotipe 1 dan 2 hanya ditemukan pada
sampel di wilayah Jakarta dan Bandung.

G

H

I

RsaI

X1

X1

X2

X1 = 140

Sedangkan haplotipe 4 dan 6 ditemukan pada

GT*AC

X7
X9

X3
X4

X6
X9

X2 = 155
X3 = 184

sampel di Bandung dan Surabaya. Haplotipe 5

X4 = 255
X5 = 320

Bandung, sedangkan haplotipe 8 dan 9 hanya

X5
X8

X6 = 445
X7 = 460
X8 = 485
X9 = 784

dan 7 hanya ditemukan pada sampel di
terdapat pada sampel di Surabaya. Haplotipe
3 ditemukan pada sampel yang berasal dari
ketiga kota tersebut (Tabel 2).

13

memiliki variasi yang relatif rendah maka

Tabel 2 Haplotipe dan penyebarannya

daerah
Total
Haplotipe

Penyebaran Haplotipe

D-loop

yang

kemungkinan keragaman dapat terdeteksi

Bandung

Surabaya

1. ADG

3

1

0

4

2. ADH

5

4

0

9

3. BEH

2

2

2

6

Tabel 3

4. AEG

0

1

1

2

dengan sekuens acuan

5. BDG

0

1

0

1

6. AEH

0

1

2

3

7. BDH

0

1

0

1

8. BEG

0

0

2

2

9. CFI

0

0

2

2

Total

10

11

9

30

Pembahasan
mitokondria

(mtDNA)

hewan

daerah tersebut.
Perbandingan hasil PCR-RFLP

Enzim
Restriksi

HaeIII
GG*CC

merupakan molekul sirkular yang berukuran
sekitar 16.000 pb dan diwariskan secara

Ragam
&
besar
fragmen
acuan
(pb) #

Ragam
&
besar
fragmen
sampel
(pb)

X1 = 62
X2 = 121
X3 = 229
X4 = 456
X5 = 516

X1 = 136
X2 = 264
X3 = 283
X4 = 290
X5 = 470
X6 = 488

maternal (Ryan et al. 2000). MtDNA berevolusi

X7 = 495
X8 = 625

jauh lebih cepat dibandingkan dengan laju
evolusi DNA inti. Tetapi karena pentingnya
fungsi mitokondria bagi kehidupan hewan,
maka ada faktor-faktor yang menghambat laju
evolusinya.

AluI
AG*CT

X1 = 91
X2 = 116
X3 = 188
X4 = 445
X5 = 544

X1 = 96
X2 = 123
X3 = 140
X4 = 200
X5 = 277
X6 = 400
X7 = 548
X8 = 965

RsaI
GT*AC

X1 = 8
X2 = 17

X1 = 140
X2 = 155

X3 = 17
X4 = 35

X3 = 184
X4 = 255

X5 = 121
X6 = 392

X5 = 320
X6 = 445

X7= 794

X7 = 460
X8 = 485
X9 = 784

Brown et al. 1979 mengatakan

bahwa semakin penting fungsi suatu gen atau
protein maka

laju evolusi gen atau protein

tersebut akan berjalan lebih lambat. Evolusi
molekular

didominasi oleh mutasi–mutasi

yang terakumulasi dengan laju yang stabil
pada garis keturunan yang masih bertahan
hidup (Vigilant et al. 1991).
MtDNA sebagian besar terdiri atas 90%
sekuen

yang

menyandikan,

sedangkan

sekuen D-loop merupakan sekuen yang tidak
menyandikan.
daerah

Daerah

non-coding

D-loop

utama

merupakan

pada

tumpuan

dengan mendesain primer yang terletak di

Jakarta

DNA

menjadi

mtDNA.

Sekuen D-loop memiliki peran dalam proses
replikasi utas berat ( Heavy strand) dan
transkripsi mtDNA (Clayton 1982).

D-loop

terletak di antara gen tRNA prolina dan tRNA
Phenil alanin (Anderson et al. 1982). Oleh
karena daerah tRNA threonin, prolin, phenil
alanin dan 12S rRNA relatif conserved dan

# Hasil BLAST AY057792 dan AJ286323 dengan
phenil alanin M.m castaneus no. akses NC005089

14

Dari hasil amplifikasi D-loop dengan

lamban. Sedangkan pada daerah tepinya

menggunakan sepasang primer CTDF dan

terjadi mutasi titik, indel, dan sejumlah

CTDR menghasilkan produk PCR yang

pengulangan tandem (Variable number of

seragam dan sesuai dengan besar sekuen

tandem repeats / VNTRs) yang

M.m castaneus acuan. Dapat disimpulkan

akumulasinya terjadi dengan cepat.

bahwa pada sekuen daerah target tidak
mengalami insersi atau

delesi panjang

sehingga produk PCR ketiga puluh sampel
berukuran sama, yaitu sebesar 1384 pb.
daerah

D-loop

memiliki

Adanya perbedaan pola pemotongan
pada

tiap-tiap

dijelaskan

enzim

dengan

restriksi

penambahan

dapat
atau

kehilangan salah satu atau beberapa situs

Douzery dan Randi 1997 menyebutkan
bahwa

laju

central

restriksi karena adanya substitusi basa.
Selain itu faktor lain yang menyebabkan

conserved region (CCR) yang diapit oleh

perbedaan pola potong karena adanya adisi

daerah tepi (peripheral) kiri dekat dengan

atau delesi

gen tRNA prolin dan daerah tepi kanan dekat

Perbedaan metilasi pada tiap individu dapat

satu atau beberapa basa .

dengan gen tRNA phenil alanin. Daerah

juga merupakan sumber terjadinya variasi

CCR mengalami mutasi titik, insersi dan

(Brown 1980).

delesi (indel) yang terakumulasi secara

B7
B8
B2

0.060

B1
J1 0
J9

0.060

H-2

J8
J6
J2

0.060

0.064

B9
S4

0.060

B 11

0.060

J4

0.060

0.166

H-6

S5

H-7

J5
B4
B 10

H-3

S3

0.080
0.040
0.080

0.064

S9
S2

B5
B3

0.060

0.060

H-8

S8

S1
J1

H-5
H-4

J3
J7

0.060
0.350

S6
S7

0.
05

Gambar 1 Dendogram dari 9 haplotipe

H-1

B6

H-9

15

Vigilant

et

1991

al.

menyatakan

perbedaan sekuen mtDNA pada daerah D-

berukuran

600

pb

didapatkan

dari

penjumlahan fragmen 140 pb dan 460 pb.

loop dapat pula disebabkan karena transisi

Sedangkan pada pola I fragmen 600 pb

dan transversi. Pada simpanse dan manusia

merupakan penjumlahan fragmen 155 pb

pemunculan

transversi

dan 445 pb. Pada pola H fragmen sebesar

transisi

dengan

memiliki perbandingan 15 : 1. Sehingga dari

759 pb merupakan penjumlahan fragmen

189 individu yang diamati ditemukan 135 tipe

184 pb, 255 pb dan 320 pb. Fragmen 759 pb

mtDNA (daerah D-loop).

disetarakan dengan fragmen 784 pb pada

Transisi dan transversi tersebut dapat
menerangkan adanya perbedaan letak situs

pola G dan I (Lampiran 8).
Adanya

sembilan

haplotipe

yang

restriksi antara M.m castaneus acuan untuk

ditemukan di tiga populasi menunjukkan

masing-masing enzim dengan sampel yang

tingkat polimorfisme yang cukup tinggi pada

ada (Tabel 3). Substitusi basa yang terjadi

M.m castaneus (Gambar 1).

pada

2000 menyebutkan pada M.m domesticus di

mtDNA

dapat

menyebabkan

perbedaan letak situs restriksi

sehingga

Ryan et al.

Irlandia memiliki polimorfisme yang tinggi

besar dan jumlah fragmen yang dihasilkan

karena

dapat

beberapa haplotipe. Dibandingkan dengan

berbeda-beda.

Ohno

1997

dalam

satu

sarang

ditemukan

pada manusia laju

populasi di Jakarta dan Surabaya, populasi

substitusi basa di daerah D-loop sebesar 7 x

di kota Bandung memiliki lebih banyak

mengatakan bahwa
-8

haplotipe yaitu tujuh haplotipe (Tabel 2). Hal

10 / situs pertahun.
Hal

ini

dapat

dilihat

pada

hasil

pemotongan dengan ketiga enzim restriksi.

ini mungkin disebabkan adanya emigrasi dari
M.m

castaneus

dari

wilayah

lain

dan

Pada pola A dan B dengan pemotongan

beradaptasi dengan lingkungan sekitar. Kota

menggunakan enzim HaeIII dapat dilihat

Bandung juga memiliki kondisi cuaca yang

bahwa pembagian menjadi dua blok sebesar

cukup berbeda dibandingkan Kota Jakarta

606 pb dan 778 pb. Pada blok 606 pb

dan Surabaya yang memiliki kondisi cuaca

merupakan penjumlahan dari 136 pb dan

relatif sama. Haplotipe lokal 8 dan 9

470 pb (X1 + X5).

populasi Surabaya diperkirakan karena daya

Sedangkan pola C

pada

merupakan pengecualian yang merupakan

adaptasi yang tinggi terhadap lingkungan

kemungkinan

sekitar,

terjadinya

substitusi

basa

kemungkinan adanya genetic drift

dari wilayah lain ( pulau lain) yang terbawa

(Lampiran 6).
Pada pola E dari pemotongan enzim AluI

melalui alat transportasi (kapal laut / feri) dan

meghasilkan fragmen berukuran 400 pb

perbedaan jarak geografis yang cukup jauh

yang merupakan penjumlahan fragmen 123

dari dua populasi lainnya.

pb dan 277 pb pada pola D (penambahan

Ryan et al. 2000, menyebutkan bahwa

situs restriksi). Sedangkan pada pola F

distribusi

fragmen

disebabkan

sebesar

965

pb

merupakan

haplotipe

mtDNA

dapat

karena emigrasi dari suatu

penjumlahan fragmen 140 pb, 277 pb dan

kondisi padat yang menyebabkan suatu

548 pb pada pola D. Dengan demikian pola

individu harus meninggalkan populasinya.

F kehilangan dua situs restriksi (Lampiran 7).

Distribusi haplotipe dapat berubah seiring

RsaI

waktu dan ditemukannya korelasi antara

menghasilkan dua blok fragmen sebesar 784

keragaman sekuen dengan jarak geografis

pb dan 600 pb. Pada pola G fragmen

yang ada. Distribusi mtDNA haplotipe dapat

Pemotongan

dengan

enzim

16

dijelaskan dengan founder effect dan genetic

Boeadi A, Suyanto , S. Adi Soemanto. 1979.
Cara

drift.

sederhana

mengenal

tikus.

Prosiding lokakarya pengendalian hama

SIMPULAN DAN SARAN

tikus. Bogor : Direktorat Perlindungan
Penggandaan

fragmen

DNA

Tanaman.

menggunakan primer CTDF dan CTDR
menghasilkan produk sebesar 1384 pb. Dari

Brown WM, George M.JR., Wilson AC. 1979.

hasil pemotongan dengan masing-masing

Rapid evolution of animal mitochondrial

enzim restriksi empat basa HaeIII, AluI dan

DNA. Proc. Natl. Acad. Sci, USA. 76 (4)

RsaI (single digest) ditemukan sembilan

: 1967-1971.

haplotipe dari ketiga populasi. Populasi

Brown

WM.

1980.

Polymorphism

Jakarta memiliki tiga jenis haplotipe dan

mitochondrial

bukan

lokal.

revealed by restriction endonuclease

Sedangkan populasi Bandung memiliki tujuh

analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77

haplotipe.

(6) : 3605-3609.

merupakan
Dua

haplotipe

diantaranya

merupakan

DNA

of

in

human

as

haplotipe lokal, yaitu haplotipe 5 dan 7.
Populasi Surabaya memiliki lima haplotipe.
Haplotipe 8 dan 9 merupakan haplotipe

Clayton DA. 1982. Replication of animal
mitochondrial DNA. Cell 28: 693-705.

lokal. Haplotipe 3 merupakan haplotipe
umum karena ditemukan pada sampel yang

Douzery

E,

Randi

mitochondrial

berasal dari ketiga kota tersebut.

E.

control

1997.
region

The
of

perlu

Cervidae : Evolutionary Patterns and

dilakukan sequensing produk PCR agar data

Phylogenetic content. Mol. Biol. Evol.

yang dihasilkan lebih akurat. Selain itu untuk

14(11) : 1154-1166.

Untuk

penelitian

selanjutnya

mendapatkan data yang lebih variatif maka
perlu lebih banyak sampel dari berbagai

Duryadi D. 1994. Peran DNA mitokondria

tempat yang memiliki perbedaan cuaca dan

(mtDNA)

jarak

genetik dan biologi populasi pada

geografis

yang

cukup

signifikan.

dan

dengan

metode

studi

keragaman

hewan. Hayati 1 (1) : 1-4.

Penambahan jumlah enzim restriksi yang
digunakan

dalam

yang

berbeda seperti halnya double digest. Dapat

Gene

menghasilkan hasil yang lebih variatif lagi.

DAFTAR PUSTAKA

Gene

Bank
Database
.http
://
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer
.fcgi?ab=nucleotide&val=16555384
Bank

Database.

http

://

www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.
fcgi?ab=nucleotide&val=8919707
Anderson et al. 1982. Complete Sequence
of bovine mitochondrial DNA : conserved
features

of

the

mammalian

mitochondrial genome. J. Mol. Biol. 156 :
683-717.

Gene

Bank Database. http. :// www.
ebi.ac.uk/cgibin/abfetch?ab=embl&style=htm&id=A
B042432

17

Hartwell LH et al., 2000. Genetics from

Vigilant L, Stoneking M, Harpending H,

genes to genomes. New York : Mc

Hawkes K, Wilson AC. 1991. African
populations and the evolution of human

Grow Hill.

mitochondrial
Kumar S, Tamura K, Nei M. 1993. MEGA ;
Molecular evolutionary genetic analysis
version 1.01. USA: The Pennsylvania
State Univ.
Ohno S. 1997. The ancestor per generation
rule

and

three

other

rules

of

mitochondrial inheritance. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 94 : 8033-8035.
Ryan AW, Montgomery I, Duke EJ. 2000.
Short

communication

:

Microgeographic distribution of House
mouse,

Mus

domesticus

,

Mitochondrial DNA type on farmland in
North-East

Ireland.

Biology

and

environment : Proceeding of the royal
Irish Acad. 100B (3): 159-163.
Sambrook J, Russel DW. 2001. Molecular
cloning a Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory press.
Saiki

et

al.

1986.

Specific

enzymatic

amplification of DNA in vitro ; The
polymerase chain reaction. Cold spring
harbor

symposia

on

quantitative

biology.
Silver LM. 1995. Mouse genetics concepts
an applications. Oxford : Univ. Pr.
Syafitri S. 2005. Keragaman fragmen DNA
mitokondria daerah D-loop Rusa Timor
(Cervus

timorensis)

asal

Sulawesi

Tenggara. [skripsi]. Bogor : Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan
Alam, Institut Pertanian Bogor .

1503-1507.

DNA.

Science

253:

18

LAMPIRAN

19

Lampiran 1 Pola penyebaran Mus musculus di dunia (Silver 1995)

Penyebaran Mus musculus yang terbagi menjadi empat subspecies :
- Mus musculus musculus
- Mus musculus domesticus
- Mus musculus bactrianus
- Mus musculus castaneus

20

Lampiran 2 Daftar sampel
NO

NAMA

TEMPAT PENGAMBILAN

1

J1

Pasar Ampera,

2

J2

Rawamangun,

3

J3

Jakarta Timur

4

J4

Pasar Koja Baru,

5

J5

Jakarta Utara

6

J6

Pasar Cempaka Putih,

7

J7

Jakarta Pusat

8

J8

Pasar Tomang, Jakarta Barat

9

J9

Pasar Tebet,

10

J10

Jakarta Selatan

11

B1

Pasar Baru,

12

B2

Bandung Tengah

13

B3

Pasar Kosambi,

14

B4

Bandung Timur

15

B5

16

B6

Pasar Induk Caringin,

17

B7

Bandung Selatan

18

B8

19

B9

Pasar Suci, Bandung Utara

20

B10

Pasar Balubur,

21

B11

Bandung Utara

22

S1

Pasar Genteng, Surabaya Pusat

23

S2

24

S3

Pasar Turi,

25

S4

Surabaya Pusat

26

S5

27

S6

Pasar Rungkut,

28

S7

Surabaya Timur

29

S8

Pasar Genteng,

30

S9

Surabaya Pusat

ASAL SAMPEL

JAKARTA

BANDUNG

SURABAYA

21

Lampiran 3 Hasil BLAST primer forward pada Mus musculus castaneus
ORGANISM Mus musculus castaneus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Mus.
AUTHORS
Gunduz,I., Tez,C., Malikov,V., Vaziri,A., Polyakov,A.V. and
Searle,J.B.
TITLE
Mitochondrial DNA and chromosomal studies of wild mice (Mus)
from Turkey and Iran
JOURNAL
Heredity 84 (Pt 4), 458-467 (2000)
MEDLINE
20307679
PUBMED
10849070
AUTHORS
Gunduz,I.
TITLE
Direct Submission
FEATURES
source

gene
tRNA

gene
tRNA

D-loop
ORIGIN
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901
961
1021
1081

ngtcttgata
tcaagacatc
ttaaactact
acattaaact
acaacaacta
aatgttttaa
ctaaatacat
gtcataaact
atcctccgtg
aacttggggg
aaatgcgtta
tcagcccatg
ctttcatcaa
gtgaagaatc
acataaatgc
gcgccaaacc
atgtcctgat
ttttacaaaa
ttaacaa

Location/Qualifiers
1..1087
/organism="Mus musculus castaneus"
/organelle="mitochondrion"
/mol_type="genomic DNA"
/strain="wild"
/sub_species="castaneus"
/db_xref="taxon:10091"
/haplotype="casIran.6"
/country="Iran:Kerman province"
/note="The sequence was obtained from 100% ethanol
preserved tail"
1..67
/gene="tRNA-Thr"
1..67
/gene="tRNA-Thr"
/product="tRNA-Thr"
/evidence=experimental
68..134
/gene="tRNA-Pro"
68..134
/gene="tRNA-Pro"
/product="tRNA-Pro"
/evidence=experimental
135..1087
/evidence=experimental
gtataaatat
aagaagaagg
tcttgagtac
attttcccca
tcaacataaa
agacatattt
caaattaatg
cttctcttcc
aaaccaacaa
tagctaaact
tcgcccatac
accaacataa
catagccgtc
attagtccgc
tactcaatac
ccaaaaacac
caattctagt
tcatgctccg

tactctggtc
aactactccc
ataaatttac
agcatataag
ctgatataca
gtgttatctg
ttttaaagac
atatgactat
cccgcccacc
gaaactttat
gttcccctta
ctgtggtgtc
aaggcatgag
aaaacccaat
tgaattttaa
taagaacttg
agttcccaaa
tgaaccaaaa

ttgtaaacct
caccaccagc
atagtacaat
caagtacatt
ccatgaatat
actaaactga
atatctgtgt
ccccttcccc
aatgcccctc
cagacatctg
aataagacat
atgcatttgg
aggacagcac
cacctaaggc
ctctccaaac
aaagacatat
atatgactca
ctctaatcac

gaaatgaaga
acccaaagct
agtacatcta
aaatcaatga
tatattaaat
tatacatcat
tatctgacat
atttggtcta
ttctcgctcc
gttcttactt
ctcgatggta
tattttttta
acagtctaga
taattattca
cccccaaccc
attattaact
tattttagta
actctattac

tcttctcttc
ggtattctaa
tgtatatcgt
tatcggtcat
acatcaaatt
gaatattata
acaccataca
ttaatctacc
gggcccatta
cagggccatc
tcgggtctaa
ttttggccta
cgcacctacg
tgcttgttag
cctcctctta
atcaaaccct
cttgtaaaaa
gcaataaaca

22

Lampiran 4 Hasil BLAST primer reverse pada Mus musculus castaneus
ORGANISM Mus musculus castaneus
Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
Mammalia; Eutheria; Rodentia; Sciurognathi; Muridae; Murinae; Mus.
REFERENCE 1 (bases 1 to 956)
AUTHORS Lundrigan,B.L., Jansa,S.A. and Tucker,P.K.
TITLE
Phylogenetic relationships in the genus mus, based on paternally,
maternally, and biparentally inherited characters
JOURNAL
Syst. Biol. 51 (3), 410-431 (2002)
MEDLINE
22075680
PUBMED
12079642
REFERENCE
2 (bases 1 to 956)
AUTHORS
Lundrigan,B.L., Jansa,S.A. and Tucker,P.K.
TITLE
Direct Submission
JOURNAL
Submitted (27-SEP-2001) Museum of Zoology and Department of
Biology, University of Michigan, Ann Arbor, MI 48109-1079, USA
FEATURES
Location/Qualifiers
source
1..956
/organism="Mus musculus castaneus"
/organelle="mitochondrion"
/mol_type="genomic DNA"
/sub_species="castaneus"
/db_xref="taxon:10091"
rRNA
1..956
/product="12S ribosomal RNA"

ORIGIN
1
61
121
181
241
301
361
421
481
541
601
661
721
781
841
901

caaaggtttg
tagaccggtg
attaaaatag
tattaagcaa
ccagccaccg
ctataaataa
taaactcaat
tgggattaga
atttgccaga
ccatctagag
aattcagcct
gaatcaaaca
cattttctta
tagtagtaaa
cccgtcaccc
tgagaggaga

gtcctggcct
taaaatccct
cttaagacac
taaacgaaag
cggtcatacg
ataaatagaa
aacgaaagta
taccccacta
gaactactag
gagcctgttc
atataccgcc
taaaaacgtt
taaaagaaca
ttaagaatag
tcctcaaatt
taagtcgtaa

tataattaat
taaacattta
cttgcctagc
tttgactaag
attaacccaa
ttaaaatcca
attctaatca
tgcttagcca
ccacagctta
tataatcgat
atcttcagca
aggtcaaggt
ttactatacc
agagcttaat
aaattaaact
caaggtaagc

tagaggtaaa
cttaaacttt
cacaccccca
ttatacctct
actaattatt
acttatatgt
tttataatac
taaacctaaa
aaactcaaag
aaaccccgct
aaccctaaaa
gtagccaatg
ctttatgaaa
tgaattgagc
taacataaat
atactggaaa

attacacatg
aaggagaggg
cgggactcag
tagggttggt
ttcggcgtaa
gaaaattcat
acgacagcta
taattaaatt
gacttggcgg
ctacctcacc
aggtattaaa
aaatgggaag
ctaaaggact
aatgaagtac
aatttctaga
gtgtgcttgg

caaacctcca
tatcaagcac
cagtgataaa
aaatttcgtg
aacgtgtcaa
tgttaggacc
agacccaaac
taacaaaact
tactttatat
atctcttgct
gtaagcaaaa
aaatgggcta
aaggaggatt
gcacacaccg
catccattta
aataat

23

Lampiran 5 Sekuens Mus musculus castaneus (hasil BLAST AY057792 dan
AJ286323) dengan gen phenil alanin Mus musculus ( no. akses NC005089)
Produk PCR sebesar 1384 pb.

121

TRNA-Thr
CTD F
ngtcttgata gtataaatat tactctggtc ttgtaaacct gaaatgaaga tcttctcttc
tRNA-Pro
tcaagacatc aagaagaagg aactactccc caccaccagc acccaaagct ggtattctaa
D-loop
ttaaactact tcttgagtac ataaatttac atagtacaat agtacatcta tgtatatcgt

181

acattaaact attttcccca agcatataag caagtacatt aaatcaatga tatcggtcat

241

acaacaacta tcaacataaa ctgatataca ccatgaatat tatattaaat acatcaaatt

301

aatgttttaa agacatattt gtgttatctg actaaactga tatacatcat gaatattata

361

ctaaatacat caaattaatg ttttaaagac atatctgtgt tatctgacat acaccataca

421

gtcataaact cttctcttcc atatgactat ccccttcccc atttggtcta ttaatctacc

481

atcctccgtg aaaccaacaa cccgcccacc aatgcccctc ttctcgctcc gggcccatta

541

aacttggggg tagctaaact gaaactttat cagacatctg gttcttactt cagggccatc

601

aaatgcgtta tcgcccatac gttcccctta aataagacat ctcgatggta tcgggtataa

661

tcagcccatg accaacataa ctgtggtgtc atgcatttgg tattttttta ttttggccta

721

ctttcatcaa catagccgtc aaggcatgag aggacagcac acagtctaga cgcacctacg

781

gtgaacaatc attagtccgc aaaacccaat cacctaaggc taattattca tgcttgttag

841

acataaatgc tactcaatac tgaattttaa ctctccaaac cccccaaccc cctcctctta

901

gcgccaaacc ccaaaaacac taagaacttg aaagacatat attattaact atcaaaccct

961

atgtcctgat caattctagt agttcccaaa atatgactca tattttagta cttgtaaaaa

1021

1141

ttttacaaaa tcatgctccg tgaaccaaaa ctctaatcac actctattac gcaataaaca
tRNA-Phe
ttaacaagtt aatgtagctt aataacaaag caaagcactg aaaatgctta gatggataat
12S rRNA
tgtatcccat aaacacaaag gtttggtcct ggccttataa ttaattagag gtaaaattac

1201

acatgcaaac ctccatagac cggtgtaaaa tcccttaaac atttacttaa actttaagga

1261

gagggtatca agcacattaa aatagcttaa gacaccttgc ctagccacac ccccacggga

1321

ctcagcagtg ataaatatta agcaataaac gaaagtttga ctaagttata cctcttaggg

1381

ttggtaaatt tcgtgccagc caccg

1
61

1081

HaeIII
AluI
RsaI

= 5’-gg*cc-3’
= 5’-ag*ct-3’
= 5’-gt*ac-3’

24

Lampiran 6 Hasil dan pola pemotongan dengan HaeIII

A
136 pb

290 pb

470 pb

488 pb

136 pb

283 pb

470 pb

495 pb

B

C
264 pb

A

475 pb

606 pb (136 pb + 470 pb)

625 pb

778 pb (290 pb + 488 pb)

B
606 pb (136 pb + 470 pb)

778 pb (283 pb + 495 pb)

C
475 pb

889 pb (264 + 625 pb)

25

Lampiran 7 Hasil dan pola pemotongan dengan AluI

D
96 pb 123 pb 140 pb 200 pb

277 pb

548 pb

E
96 pb 140 pb

200 pb

96 pb 123 pb
pb

200 pb

400 pb

548 pb

F

D 96 pb 123 pb 140 pb
E

96 pbpb 140 pb

F 96 pb
pb

123 pb

965 pb

200 pb

277 pb

400 pb
200 pb (123 pb + 277pb)

200 pb

548 pb

548 pb

965 pb (140 pb + 277 pb + 548 pb)

26

Lampiran 8 Hasil dan pola pemotongan dengan RsaI

G

140 pb

460 pb

784 pb

H
140 pb 184 pb

255 pb

320 pb

485 pb

I
155 pb

G

445 pb

600 pb ( 140 pb + 460 pb )

H
625 pb (140 pb + 485 pb )

784 pb

784 pb

759 pb
( 184 pb + 255 pb + 320 pb )

I
600 pb (155 pb + 445 pb )

784 pb

27

Lampiran 9 Hasil PAGE 5.5% dengan silver staining

Pemotongan dengan HaeIII

Pemotongan dengan AluI

Pemotongan dengan RsaI

ANALISIS KERAGAMAN D-LOOP DNA MITOKONDRIA
MENCIT RUMAH (Mus musculus castaneus)
DI DAERAH JAKARTA, BANDUNG DAN SURABAYA
DENGAN PCR-RFLP

Oleh :
Diana Yulianti
G04499071

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2005

3

ABSTRAK

DIANA YULIANTI. Analisis Keragaman D-loop DNA Mitokondria Mencit Rumah (Mus musculus
castaneus) di Daerah Jakarta, Bandung dan Surabaya dengan PCR-RFLP. Dibimbing oleh DEDY
DURYADI SOLIHIN dan RONNY RACHMAN NOOR.
Mencit rumah (Mus musculus) termasuk dalam kelas Mamalia, infrakelas Eutheria, ordo
Rodentia, subordo Myomorpha dan famili Muridae. Spesies tersebut dalam perkembangannya
terbagi menjadi subspesies Mus musculus domesticus, Mus musculus musculus, Mus musculus
castaneus dan Mus musculus bactrianus (Silver 1995). Subspesies yang tersebar di Indonesia
adalah Mus musculus castaneus (Boeadi et al.1982).
DNA mitokondria (mtDNA) sering digunakan sebagai penanda molekular sebagai salah satu
cara untuk mengetahui keragaman genetik. Keragaman genetik mtDNA dapat diketahui dengan
menggunakan metode PCR-RFLP (Polymerase Chain Reaction - Restriction Fragment Lenght
Polymorphism). Sepasang primer yang digunakan adalah CTDF dan CTDR. Sedangkan enzim
restriksi yang digunakan adalah HaeIII, AluI dan RsaI. Sampel yang digunakan berasal dari Jakarta
(10 ekor), Bandung (11 ekor) dan Surabaya (9 ekor) sehingga total sampel menjadi 30 ekor.
Dengan menggunakan metode PCR-RFLP ditemukan sembilan haplotipe pada ketiga puluh
sampel mencit rumah. Pada populasi Jakarta ditemukan tiga haplotipe, Bandung tujuh haplotipe
dan Surabaya lima haplotipe. Haplotipe lokal ditemukan di populasi Bandung (H-5 dan H-7) dan
Surabaya (H-8 dan H-9). H-3 merupakan haplotipe umum yang terdapat di semua populasi.

ABSTRACT

DIANA YULIANTI. Genetic Diversity Analysis of D-loop Mitochondrial DNA of House Mice (Mus
musculus castaneus) in Jakarta, Bandung and Surabaya. Supervisors : DEDY DURYADI SOLIHIN
and RONNY RACHMAN NOOR.
House mice ( Mus musculus) belongs to class Mammal, infraclass Eutheria, Order Rodentia,
suborder Myomorpha and family Muridae. This spesies divided into subspesies subspesies Mus
musculus domesticus, Mus musculus musculus, Mus musculus castaneus and Mus musculus
bactrianus (Silver 1995). Subspesies which spread all over Indonesia is Mus musculus castaneus.
Mitochondrial DNA (mtDNA) is often used as genetic marker to study genetic diversity. Genetic
diversity of mtDNA can be obtained using PCR-RFLP. The Primers used for analysis were CTDF
and CTDR. The restriction enzyme used were HaeIII, AluI and RsaI. The samples were from
Jakarta (10 mice), Bandung (11 mice) and Surabaya (9 mice) so the total amount of samples were
30 mice.
We generated pcr product 1384 bp in length using PCR-RFLP. Nine haplotype were found. In
Jakarta population there were three haplotype, Bandung seven haplotype and Surabaya five
haplotype. Local haplotypes were found in Bandung (H-5 and H-7) and Surabaya (H-8 and H-9).
The H-3 was common haplotype that were found in all population.

Mencit dapat digunakan sebagai hewan

PENDAHULUAN

model dalam penelitian bidang kedokteran dan
Mencit rumah (Mus musculus) termasuk
dalam kelas Mamalia, infrakelas Eutheria,
ordo Rodentia, subordo Myomorpha dan famili
Muridae. Famili Muridae awalnya diperkirakan
berasal dari daerah India dan Asia Tenggara.
Berdasarkan data paleontologi dan filogeni
diperkirakan bahwa tikus berasal dari nenek
moyang yang hidup 10-15 juta tahun SM.
Sekitar enam juta tahun SM genus Mus
ditemukan, kemudian berkembang menjadi
beberapa spesies yang tersebar di sekitar
India dan ke benua lain (Silver 1995).
Pada 10.000 tahun lalu, Mus musculus
telah mengalami pembagian menjadi empat
populasi yang terpisah dan tidak mengalami
tumpang tindih area di India dan benua lain.
Spesies tersebut dalam perkembangannya
terbagi menjadi subspesies Mus musculus
domesticus, Mus musculus musculus, Mus
musculus

castaneus

dan

Mus

musculus

bactrianus (Silver 1995).
Diperkirakan penyebaran M.m domesticus
terfokus di pinggir wilayah Pakistan dan di
India bagian barat. Sedangkan M.m musculus
berada di utara india . M.m castaneus berada
di daerah Bangladesh dan M.m bactrianus
tetap berada di India (Silver 1995)(Lampiran
1). Subspesies yang tersebar di Indonesia
adalah Mus musculus castaneus (Boeadi et
al.1979).
M.m castaneus berukuran kecil dan lincah.
Hampir seluruh tubuhnya ditumbuhi oleh
rambut bertekstur lembut dengan warna pada
bagian dada tidak putih dan punggungnya
coklat kelabu. Mencit ini memiliki ekor lebih
panjang

dari

panjang

badannya

dengan

bentuk yang meruncing. Ekornya memiliki
anulasi yang cukup jelas dan ditumbuhi oleh
sedikit rambut. Formula puting susu yang
dimiliki adalah tiga pasang di dada dan dua
pasang di perut (Boeadi et al. 1979).

genetika karena memiliki banyak kelebihan
antara lain waktu generasi
kemampuan

adaptasi

yang

kemampuan

ratusan

gen

yang cepat,
tinggi

dan

tunggalnya

bermutasi (Hartwell et al. 2000).
Penggunaan

penanda

molekular

merupakan salah satu cara untuk mengetahui
keragaman

genetik.

DNA

mitokondria

(mtDNA) sering digunakan sebagai penanda
molekular karena memiliki banyak kelebihan
antara lain jumlah kopi yang tinggi, ukuran
yang relatif kecil (14-39 kb) dan pada bagian
tertentu dari genom mitokondria berevolusi
dengan kecepatan yang berbeda (Duryadi
1994).
Mitokondria DNA terdiri dari 13 gen
penyandi polipeptida, 22 gen tRNA dan 2 gen
rRNA.

Urutan gen-gen mitokondria pada

umumnya

relatif

conserved

pada

semua

vertebrata (Brown 1980). Gen-gen tersebut
tersusun dalam 2 utas yaitu utas Heavy (H)
dan utas Light (L). Selain daerah penyandi,
mtDNA juga memiliki daerah noncoding yang
disebut D-loop.
Brown 1980 mengatakan bahwa daerah
D-loop bersifat hipervariabel, karena memiliki
laju evolusi tertinggi. Dapat mencapai 5-10 kali
lebih cepat dibandingkan dengan DNA inti.
Keragaman

genetik

mtDNA

dapat

diketahui dengan reaksi perbanyakan DNA
secara in vitro

pada sekuen target dengan

memanfaatkan cara replikasi DNA dengan
bantuan

enzim

DNA

polimerase

dan

perubahan sifat fisik DNA terhadap suhu.
Metode ini dikenal sebagai Polymerase Chain
Reaction (PCR) (Saiki et al.1986).
Produk
menggunakan

PCR
enzim

kemudian

dipotong

restriksi

(restriction

endonuclease). Sebuah enzim restriksi akan
memotong DNA secara spesifik, terbatas