Kajian Pertumubuhan Akar Rambut Cinchona sp dari Inokulasi beberapa Galur Agrobacterium rhizogenes
KAJIAN PERTUMBITHAN AKAR RAMBUT
Cinchona sp D A N INOKULASI BEBERAPA
I
GALUR Agrobacterium rhizogenes
PROGRAM PASCASARlANA
INSTITUT PERTAMAN BOGOR
20Q2
Reflini. Study of haixy ruat growth of t'imhonu sp by inoculation af several
Agrobaeterium rhizogenes strains. Under the guidance of Dr. Hj, Anna Prkgani
Roswiem, klS and Dr. Nucita Toruan-Mathius, MS.APU.
Problem encountered in bcukation of Cinchona species by A, rhizogenes is
iow percentage of transformed root initiation and slow growth of hairy root. Strains
of A, rhizugenes and the growth medium has a sign&cant effect to the formation of
!miry roots. The aim of tkis research was to evaluate the potmtia1 of several
A. rhizogenes strains far initiation of hairy roots of C. mrccirubru d C. ledgeriano,
and to obtain the opthum composition of the medium for hairy roat culture of
Cinchona species. Axenic stem and leaf explants of six to eight-week-old from
C, succirubra and C. ledgeriunca
were inoculated with A. rhizogenes strains
15834, 8196, l2-20001, 07-20001, A4, R MAFFA, TTSm 509, TISTR 510 rtnd
LBA 9453. Inoculatd explants were cugured in solid MS medium. Subculture of the
havy root was performed by transfer of root pieces into fresh liquid basal medium
MS, B5, White and HeIler. Hairy roots from the best of b a d medium were
subcu1tured an the xime medium with addition of 50 mglf and 100 mg/I
L-Triptaphane; three (MSJV) and five (M55V) times concentratien of MS vitamins.
Thc integration of T-DNA in hairy roat was c o r n e d by using, spesific primer for
TL and TR-DNA of A. rhizogenes in Polymerase Chin Reaction (PCR) analysis. The
results showed that only A. rhizogeraes LBA 9457 were effective to the ~ e c t i o nof
explants from both Cinchona species. The h a q roots showed the fastest growth h
MS medium, while growth irz. others medium was poor. Hairy roots of C,ledgeriana
has vigor and growth better than hairy r m s of C. su~cl'rubra.MSJV is the best
medium for the improvement of hairy rout grawth and vigor. Transformed roots of
C. succi'rubra and C. ledgeriana uscd in this experiment were canfirmed t b t fialry
roots examined contained b t b TI, and TR-DNA region of Ri plasmid by PCR
amplificcttion d y s i s of DNA. The results obtained in this study indicate b t the
strains of A. ~hizogenes,plant. species, source of explant and mcdium composition
affcct the initiation and growth, development and vigor of hairy roots.
~~
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya m e n y a ~ a nbahwa tesis yanl; berjudul :
Kajian Pertumbuhan Akar Rambut Cinchofla sp dari Inokulasi
Beberapa Galur AgrolZacteriu r#iizogeptes
addah benw mmup&an hail kmya say8 sendiri dm Mum panah dipublikasikan,
Semua swber data dm informasi ymg digunakan telafi dinyatdapat. diperikszt kebenxannya.
NRP 49650
,,
secara jelas dm
KAJIIAN PERTUMBIJHAN AKAR RAMBUT
Cinchona sp DARI INOKULASI BEBERAPA
GALUR Agrobacterium rhizogenes
.
I-
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk rnemperoleh gelar
Magiszer Sains p d a
P r o p m Studi Bioteknologi
'
PROGRAM PASCASARJANA
INSTTTW PERTANTAN BOGOR
2002
Judul Tesis
rambut Cinchona sp dari inokulasi
beberapa g l u r Aphucteriunr rhizogenes
: Iieflini
:Kajian prkurnbuhan
Nama
MRP
Program Studi
: 99650
: Bioteknologi
Dr. Hj.Anna Priangani Roswiem, MS
Ketua
Tanggal Lufus : 3 8 Okt~ber2002
Penufis dilahirkan di Payakurnbuh pada tmgga! 1 Februari 1976 sebstgai an&
bungsu dari pasangan Yulizar (Alrn) dm Maridas. Penulis menyelesaikm Pendidikan
Dasar tahun 1988, Sekolah hnjutan Pertma tahun 1991 dm Sekolah Lanjutan Atas
tahun 1994. Pendidikm sarjana ditempuh di Jurusm Pendidikan Biologi, Fakultas
Pendidikan Maternatika dan Ilmu Pengetahan Alam IKIP Padmg, lulus pa& t d u n
1999. P d a tahun@
pmberi
cita rasa (flavoring#gent) kaxena rasanya pakit (Anderson et al. 1986).
kuinolin yang meningbt. Tetapi tmmm kina rnemerlukan w&tu paling sedikit
tujuh tahun untuk &pat dipmen d m produksi alkaloid tertinggi banr dapat dipperoleh
setelah t m m a n berumur 20 tahun. Kendala tersebut rnenyebabkm obat anti mdwia
sangat mahat dipasam, Untuk mengatttasi hd tersebut- tel&
merangsang
dikembangkmya obat anti malaria sintetik, Namun admya gejala resistensi terl-iaclap
obat anti malaria sintetik mengakibatkan kebutuhan alkaloid kuinulin kembali
mengalami peningkatan.
Pmspek pas& kina duniit pada kberapa eahun terakhir ini rnenunjukkm
kecendemgan y m g menggembir&m Permintam alkaloid kuinolin di psar d d a
diperkirdcan &an
tcrus meningkat karma pengguamyrt yang semakin meluas
di krbagai bidang industri m t m 1&n industri famzstsi, industri minuman, incfustri
kasrndik dm industri biapestisida. Setiap t&un terjadi peningkatan permin-
alkaloid kuinolin sebsar 20 persen. Pada tahun 2001 kebuhrhan alldoid kuinulin
rnencapai 175 ton &an diperkirakan pada tahm 2005 mendatang aim rneningkat
rnenjadi 275-300 ton dengm nilai sekitar US $9.9OQ.000(SIL 2000).
Usaha-rr~aha y m g telah dil&ukm untuk memproduksi dkdoid kuinoIin
antara lain dengan memarifaatkan teknik kdtw jaringan. Menmt Fowler (1983)
salah satu keuntungm teknik kultur jztringan dibmdingkm dengm cara kunvensiond
addah kernampurn dalam menghasilkan senyawa kirnia d a l m wak-.tu ymg relatif
singkat dm kemampuan untuk rnernproduksi senyawa yang sulrar diperoleh seem
alami.
Staba dm Ckung (198 1) telah herhasit memproduksi kuinolin pada kultur
daun C, ledgerima sebsar 0,45% dari bobot kcringnya. Sedangkan Mdder-Krieger
er al. (1982) juga berhasil mendapatkan kuinin sebesar 95 pg/g bobat kering dmi
kdus C. pubmeens. Kuinin dan tiinidin juga berfrztsil diperuleh d a i kdtur aka
C. ledgerianu sebesar 0,010 mglg bobut kering dm 0,001 mg/g bubot kering oleb
Anderson el ui. (1982). Scragg (1986) berhasil memprolch kuinidin sebessu 0,053%
dari kalus C, ledgeriaraa dengm penambahan 1 mg1 IAA dm 0,5 mg/l Zeatin.
Sedangkan Hay (1986) mendapatkan peningkatan lima kali lipat kuinin dm kuinidin
pada kultur akai C ledgerianu dengan pemberian 500 mgll prekmur L-triptofm.
Produksi alkaloid kin# melalui kulhxr jaringan m a i h menunjukkan p r o d h i
y m g rendah. Hal ini diduga karma pertumtruhm sel yang lambat dm d~prlukannya
sejumlah hamon pertumbuhm dengan kunsentrasi yang tepat. modes (1986)
menerangkan bahwa banyak persenyawam tidak ekonamis dipruduksi meidui kultur
suspensi dm tingkat heterugenitasnya jugst tinggi. Kultur cenderung tidak: stabil dari
masa ke masa, Adslnya kcndala-kendala ymg dihadapi tersebut telah rnembuka suatu
pengembangan tehi k baru mtuk menghasilkstn senyawa rnehbolit sekunder yang
lebih tinggi, yakni dengan memanfaatkm transfumasi Agrobacterium utuk:
merighasilkan &a rambut.
Agrobacteriokm merupakan bakteri tanah gram-negatif yang temasuk pada
kelompok Rhizobiaceae, mempunysti kernampurn untuk mentransfer sebagian bahan
genetiknya (DNA) pada sel tanaman melaiui gelukaan (Nilson dm Qlsson 1997).
DNA ymg ditransfex: disebut dengan T-DNA, yang rnerniliki gen-gen penyandi
enzirn untuk produksi opine (suatu kelompok konjugasi assun amino dm kabbidrat)
(Machstdo 1995). T-DNA rnenrpakan potongan beberapa rcttus kilo basa drtri plasmid
ymg dikenttl dengan Ri plasmid (root inducing plasmid') atau Ti plasmid (tumor
inducing plasmid), fii plasmid terdagat pada A, rhizogenes wdmgkan Ti plasmid
terdapat pada A. tumefascieras, T-DNA aka terintepsi pada kromosom tmamm dm
&an
mengekspksikan gen-gen untuk mensintesis senyawa win. Selain gea unt&
rnensintesis senyawa apin, T-DNA juga mengandung onkagen, yaitu gen-gen ymg
berperan untuk rnenyandi humon pertumbuhan auksin dan sitokinin. Bila ankogen
terekspresi maka akan terjadi pertwnbuhan cepat dari sel. Ekspresi onkogen pada
plasmid Ri rnencirikan pembentukan aka adventif secara besar-besaran pada
ternpat ymg diinfeksi dm dikenal dengan
'hairy root' (akw rambut)
(Nilson dm OTsson 1 997).
Pemmfagtan kultur aka rambut untuk merighasilkan senyawa mekbolit
sekundcr telah banyak dil&ukm, antara lain lobelin dmi Lobeliu injlanra L.
(Yonemitsu et QI. 199O), katarantin d m ajmalin dari Cutharc~nthusroseus (VazquezFlota ef 01. 18941, saponin dari Solmum aculeatr'ssurn (Ikenaga et al. 19951,
glukotropaeolin dari Tropaeolum majus (Wielmek dan Urbmek 19991, hiosimin d m
skapalamin dari Atropa beliardonna (Kmada et al, 1986 ; Aoki ee6 al, 1997) d m
Dutwra innoxia (Boitel-Conti et a!. 2000).
Kultur akar m b u t pada tanaman kina untuk mernproduksi kuinulin juga tel&
dilalrukan oieh Hamifi et al. (1 989) pada C. ledgerianu dengm A. rhizogenes gdur
LBA 9402 dm'R1000, dm Cieerling et al. (1999) pada C, oficinalis dengan galur
I,BA 9402. Narnun produksi kuinolinnya rnasih rendah dm diperoleh dalm periode
waktu lebih dari satu tahun, Hal ini discbabkan istju pcrturnbuhan akar rambut yang
ssuzgat lambat. Namun sistem produksi ini jauh lebih rnenguntmgkan dibandingkan
dengan vanamannya yang baru dapat dipmen setelah berumur lebih d a i 7 tahun.
Adanya kendda dalam kultur &ar rambut tanman kina disebabkan b l u m
ditemukan komposisi medium yank tepat untuk perturnbuh. akax rambut. Menurut
Gixi dm Naasy (2000) medium tumbuh mcmberikm pengaruh yang nyata terhadap
induksi akar rambut dan produksi rnetabolit sekunder. Untuk rnemperoleb
p e ~ u m b u h m akar rambut yang optimal, kondisi kultur haws diatw padst
tingkat optimum.
Bercfasarkan hasil yang telab dlperoleh d m dalm upaya rri~ndstpatkan
alkaloid kuinoin yang lebih tinggi dilakukw penelitian terhadap kemampuan
A. rhizogenes untuk mengirrfeksi dm rnenghasilkan respon pada tanaman kina,
Penelitian ini rnerupakan pahap awal dari serangkaian penelitian yang d:lrencim&an
untuk menghasilkan teknulogi kultur &ar rmbut C, succirubra dm C. ledgerianu
yang mernproduksi alkaloid kuinolin. T&;tpm
penelitian yang dildcuk-nuz
rnencangkup pengujian trmsformasi genetik behrapa galur A. rhizogenes terhadap
C succirubru dan C. ledgerima d m dilmjutkm dengm uji konfrrmasi T-DNA ymg
terintegrasi di "ddarn akar rambut C. succirubra dm C. Jedgeraiana dengan
rnenggunakan primer spesifik dari TL dm TR-DNA A. rhizogenes rnelalui tehik
Poly~ne~ase
C h i n Reaction (PCR).
1,2 Tujuan Penelitian
Penelitian ihi krtujuan untuk (1) menyeleksi beberapa galur A. rhizogenes yang
dapat menginokulasi C', succiru bra dm C. ledgerianu, (2) mendapatlcan medium
yang optimum untuk gertumbuhan &a rambut: C, succir:rubra dm C. ledgeriana,dan
(3) mendapatkan akar rambut tanaman kina y m g telah terintegrasi T-DNA.
1.3 Hipatesis
Hipatesis ymg digunalcm d d m penelitim ini addah :
I . A. rhizogenes &pat rnenginduksi pernbentukan akar rambut pada sel jaringan
tanaman kina C. succirubra dm C. ledge~.ia'araa.
2, Komposisi medium kuItur dqar rnempengaruhi pertumbuhan akar rambut
tanaman kin# C. succiuubra dm C. ledgeriana.
3. T-DNA dari A, rhizugenes dapat te~integasipada &a rambut &~amankina
C succr'rubra dan C ledgerr'una,
l,4 Kegunaan PeneXitian
Penelitfan ini diharapkan dapat, menglxasilkan teknik trmsformasi pada
tanaman kina dengan rnenggunakan gdur A. rhizogenes yang
kumpatibel terhdap
genarn C. succr'rubru dan C. ledgerianu dan m e n d a p a t h medium terbaik ymg &pat
menghasilkm pertumbuhan akw rambut ymg optimal. Teknik ymg dihasilh
diharapkm dapat d i j a d i h sebagai d a m untuk: dapat mrneprduksi alkaloid kuinolin
2.1 Tinjauan Umum Tanaman Kina
Tanaman kina (Cinchona sp) menrpakan tanaman tropis yang b e r a d dari
benua Amerika Selatan d m termasuk suku Rubisceae (Croraquist 1981 ; Aerts el ai.
1991). Ada berbagai spesies tanaman kina, di mtaranya C, lanc$ulila,
C. triameI
C, cordifdid, C, succirubva, C, oflcinalis, C. micralathu, C. calopdera, C.josephiana
dan C, culisuya (Kerbosch 193 1). Di Indonesia, tanaman kina dibudidayakan
di drierah pegunungan pada ketinggian 800-1625 m di atas permukaan laut atau
kusmg dari 1950 rn di atas permukaan Iaut. Ada dua spesies kina y m g
dibudidaydcan, yaitu C. ledgeriana dm C. succkubra,
Pohor- C ledgeriano kurmg kuku!i~,tetapi pertumbuhamya ceprtt, mmpunyai
percabangan ymg banyak dm tidak beratwan. Dam C, ledgeriana tebal, berwarna
~ j a umuda, berbentuk jorong, Xmset, dengm alur ymg kecil pacia tulang-tulmg dam
& p e m h atas dam. Bunga kuning pucat, bakd bbu& berbentuk telur sku tomb&
dengm panjang 8 - 15 mm.Kulit teba1 dengan warna cukeXat (Astika 19751,
C, Szdccjrubra rnerniliki puhon ymg besar dm batang luws. Perhunbuhannya
cepat namun percabmgm sedikit, cabang-=bang muda berbulu. D a m y a besar,
tipis, benvma hijau muda, berbentuk jorong
&
-
(40 50) X (30
- 40)
ern dengan
lapisan bulu sepanjang tulmg daun pada permukaan bawah, Bmga b e w m a me&
muda dm perrnukaan atas rnahkota berwma putib. B&al buah rnemanjang
* 2 - 3 31x1.Kulit berwmna cakelat dengan sedikit bintltik-bintik yang keputih-putifran
(Astika 19751,
2.2 Alkaloid Tanaman Kina
Tanman kina telah lama dikenal sebagai penghasil metabulit sekunder, yrtitu
alkaloid kuinolin. Kuinolin banyak ditemukan di ddam kulie batang tanaman kina,
sedangkan pada bagian lain seperti kayu, buah dm daun hmya dikmukan d d m
kadar yang relatif sedikit (Musalam er al. 1980). Kurang lebih 35 macam alkaloid
kuinolin telah ditemukan pada tanaman kina, n m u n hmya terdapEtt empat macam
kuinolin u m a yaitu kuinin, kuinidin, sinkonin dm sinkunidin (Urdang 19451,
Kuinin dan kuinidin mempaksm turunan dari 6-metoksi-kuinolin, dm
mempunyai m u s empiris yang sama, yaitu C~~H24N202
dengan bemt rnolekul 232
(Verstridjen 1975). Keduanya menrpakan stereoisomer yang dibedakm d a m
karakteristik kikia dm fisikanya, sehingga mempunyai sifat yang berbeda. Perbedm
bentuk ruang kedua molekul ini berasal d x i orientasi yang berlainan dari
atom C pusat ymg tidak rnempwyai simefri dm dapat terikat ppada atom-af0In
dengan dua macam susunan, ywg satu merupakan baymgan cemin yang I&
(Verstrijden 19751,
Biasilltesis alkaloid kuinolin dapat dilihat pada gmbar 2.2. P=mbntukan
alkaloid kuinolin diawali dengan perubahan triptofan membentuk triptamin dengm
banturn enzim triptofan dekarbksilase. Selanjutnya terjadi kondensasi ezimatik dari
triptamin dm sekolagmin untuk membcntuk striktosidin, terw rnembenluk sejunlah
turunan dkdoid berikutnya termasuk alkaloid kuinolin (Aerts et al. 199 3).
Setiap jenis Cinchona mempunyai kandungm alkaloid kuinolin yang berbeda.
C. Eedgeriana diketahui memiliki kadar kuinin ymg tinggi (4
C. succirubru rnemiliki ktdar kuinin yang sangat rendah (0,8
-
-
13 %), sedmgkan
1,4
%I. Akm tetapi
kadar sinkanidin C, succirtib~.~
lebih tinggi yaitu 3,2 - 5,1 a/o dari pada C Itdgeriunn
R=l.l Sinkonidinon
l
Cinchona sp D A N INOKULASI BEBERAPA
I
GALUR Agrobacterium rhizogenes
PROGRAM PASCASARlANA
INSTITUT PERTAMAN BOGOR
20Q2
Reflini. Study of haixy ruat growth of t'imhonu sp by inoculation af several
Agrobaeterium rhizogenes strains. Under the guidance of Dr. Hj, Anna Prkgani
Roswiem, klS and Dr. Nucita Toruan-Mathius, MS.APU.
Problem encountered in bcukation of Cinchona species by A, rhizogenes is
iow percentage of transformed root initiation and slow growth of hairy root. Strains
of A, rhizugenes and the growth medium has a sign&cant effect to the formation of
!miry roots. The aim of tkis research was to evaluate the potmtia1 of several
A. rhizogenes strains far initiation of hairy roots of C. mrccirubru d C. ledgeriano,
and to obtain the opthum composition of the medium for hairy roat culture of
Cinchona species. Axenic stem and leaf explants of six to eight-week-old from
C, succirubra and C. ledgeriunca
were inoculated with A. rhizogenes strains
15834, 8196, l2-20001, 07-20001, A4, R MAFFA, TTSm 509, TISTR 510 rtnd
LBA 9453. Inoculatd explants were cugured in solid MS medium. Subculture of the
havy root was performed by transfer of root pieces into fresh liquid basal medium
MS, B5, White and HeIler. Hairy roots from the best of b a d medium were
subcu1tured an the xime medium with addition of 50 mglf and 100 mg/I
L-Triptaphane; three (MSJV) and five (M55V) times concentratien of MS vitamins.
Thc integration of T-DNA in hairy roat was c o r n e d by using, spesific primer for
TL and TR-DNA of A. rhizogenes in Polymerase Chin Reaction (PCR) analysis. The
results showed that only A. rhizogeraes LBA 9457 were effective to the ~ e c t i o nof
explants from both Cinchona species. The h a q roots showed the fastest growth h
MS medium, while growth irz. others medium was poor. Hairy roots of C,ledgeriana
has vigor and growth better than hairy r m s of C. su~cl'rubra.MSJV is the best
medium for the improvement of hairy rout grawth and vigor. Transformed roots of
C. succi'rubra and C. ledgeriana uscd in this experiment were canfirmed t b t fialry
roots examined contained b t b TI, and TR-DNA region of Ri plasmid by PCR
amplificcttion d y s i s of DNA. The results obtained in this study indicate b t the
strains of A. ~hizogenes,plant. species, source of explant and mcdium composition
affcct the initiation and growth, development and vigor of hairy roots.
~~
SURAT PERNYATAAN
Dengan ini saya m e n y a ~ a nbahwa tesis yanl; berjudul :
Kajian Pertumbuhan Akar Rambut Cinchofla sp dari Inokulasi
Beberapa Galur AgrolZacteriu r#iizogeptes
addah benw mmup&an hail kmya say8 sendiri dm Mum panah dipublikasikan,
Semua swber data dm informasi ymg digunakan telafi dinyatdapat. diperikszt kebenxannya.
NRP 49650
,,
secara jelas dm
KAJIIAN PERTUMBIJHAN AKAR RAMBUT
Cinchona sp DARI INOKULASI BEBERAPA
GALUR Agrobacterium rhizogenes
.
I-
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk rnemperoleh gelar
Magiszer Sains p d a
P r o p m Studi Bioteknologi
'
PROGRAM PASCASARJANA
INSTTTW PERTANTAN BOGOR
2002
Judul Tesis
rambut Cinchona sp dari inokulasi
beberapa g l u r Aphucteriunr rhizogenes
: Iieflini
:Kajian prkurnbuhan
Nama
MRP
Program Studi
: 99650
: Bioteknologi
Dr. Hj.Anna Priangani Roswiem, MS
Ketua
Tanggal Lufus : 3 8 Okt~ber2002
Penufis dilahirkan di Payakurnbuh pada tmgga! 1 Februari 1976 sebstgai an&
bungsu dari pasangan Yulizar (Alrn) dm Maridas. Penulis menyelesaikm Pendidikan
Dasar tahun 1988, Sekolah hnjutan Pertma tahun 1991 dm Sekolah Lanjutan Atas
tahun 1994. Pendidikm sarjana ditempuh di Jurusm Pendidikan Biologi, Fakultas
Pendidikan Maternatika dan Ilmu Pengetahan Alam IKIP Padmg, lulus pa& t d u n
1999. P d a tahun@
pmberi
cita rasa (flavoring#gent) kaxena rasanya pakit (Anderson et al. 1986).
kuinolin yang meningbt. Tetapi tmmm kina rnemerlukan w&tu paling sedikit
tujuh tahun untuk &pat dipmen d m produksi alkaloid tertinggi banr dapat dipperoleh
setelah t m m a n berumur 20 tahun. Kendala tersebut rnenyebabkm obat anti mdwia
sangat mahat dipasam, Untuk mengatttasi hd tersebut- tel&
merangsang
dikembangkmya obat anti malaria sintetik, Namun admya gejala resistensi terl-iaclap
obat anti malaria sintetik mengakibatkan kebutuhan alkaloid kuinulin kembali
mengalami peningkatan.
Pmspek pas& kina duniit pada kberapa eahun terakhir ini rnenunjukkm
kecendemgan y m g menggembir&m Permintam alkaloid kuinolin di psar d d a
diperkirdcan &an
tcrus meningkat karma pengguamyrt yang semakin meluas
di krbagai bidang industri m t m 1&n industri famzstsi, industri minuman, incfustri
kasrndik dm industri biapestisida. Setiap t&un terjadi peningkatan permin-
alkaloid kuinolin sebsar 20 persen. Pada tahun 2001 kebuhrhan alldoid kuinulin
rnencapai 175 ton &an diperkirakan pada tahm 2005 mendatang aim rneningkat
rnenjadi 275-300 ton dengm nilai sekitar US $9.9OQ.000(SIL 2000).
Usaha-rr~aha y m g telah dil&ukm untuk memproduksi dkdoid kuinoIin
antara lain dengan memarifaatkan teknik kdtw jaringan. Menmt Fowler (1983)
salah satu keuntungm teknik kultur jztringan dibmdingkm dengm cara kunvensiond
addah kernampurn dalam menghasilkan senyawa kirnia d a l m wak-.tu ymg relatif
singkat dm kemampuan untuk rnernproduksi senyawa yang sulrar diperoleh seem
alami.
Staba dm Ckung (198 1) telah herhasit memproduksi kuinolin pada kultur
daun C, ledgerima sebsar 0,45% dari bobot kcringnya. Sedangkan Mdder-Krieger
er al. (1982) juga berhasil mendapatkan kuinin sebesar 95 pg/g bobat kering dmi
kdus C. pubmeens. Kuinin dan tiinidin juga berfrztsil diperuleh d a i kdtur aka
C. ledgerianu sebesar 0,010 mglg bobut kering dm 0,001 mg/g bubot kering oleb
Anderson el ui. (1982). Scragg (1986) berhasil memprolch kuinidin sebessu 0,053%
dari kalus C, ledgeriaraa dengm penambahan 1 mg1 IAA dm 0,5 mg/l Zeatin.
Sedangkan Hay (1986) mendapatkan peningkatan lima kali lipat kuinin dm kuinidin
pada kultur akai C ledgerianu dengan pemberian 500 mgll prekmur L-triptofm.
Produksi alkaloid kin# melalui kulhxr jaringan m a i h menunjukkan p r o d h i
y m g rendah. Hal ini diduga karma pertumtruhm sel yang lambat dm d~prlukannya
sejumlah hamon pertumbuhm dengan kunsentrasi yang tepat. modes (1986)
menerangkan bahwa banyak persenyawam tidak ekonamis dipruduksi meidui kultur
suspensi dm tingkat heterugenitasnya jugst tinggi. Kultur cenderung tidak: stabil dari
masa ke masa, Adslnya kcndala-kendala ymg dihadapi tersebut telah rnembuka suatu
pengembangan tehi k baru mtuk menghasilkstn senyawa rnehbolit sekunder yang
lebih tinggi, yakni dengan memanfaatkm transfumasi Agrobacterium utuk:
merighasilkan &a rambut.
Agrobacteriokm merupakan bakteri tanah gram-negatif yang temasuk pada
kelompok Rhizobiaceae, mempunysti kernampurn untuk mentransfer sebagian bahan
genetiknya (DNA) pada sel tanaman melaiui gelukaan (Nilson dm Qlsson 1997).
DNA ymg ditransfex: disebut dengan T-DNA, yang rnerniliki gen-gen penyandi
enzirn untuk produksi opine (suatu kelompok konjugasi assun amino dm kabbidrat)
(Machstdo 1995). T-DNA rnenrpakan potongan beberapa rcttus kilo basa drtri plasmid
ymg dikenttl dengan Ri plasmid (root inducing plasmid') atau Ti plasmid (tumor
inducing plasmid), fii plasmid terdagat pada A, rhizogenes wdmgkan Ti plasmid
terdapat pada A. tumefascieras, T-DNA aka terintepsi pada kromosom tmamm dm
&an
mengekspksikan gen-gen untuk mensintesis senyawa win. Selain gea unt&
rnensintesis senyawa apin, T-DNA juga mengandung onkagen, yaitu gen-gen ymg
berperan untuk rnenyandi humon pertumbuhan auksin dan sitokinin. Bila ankogen
terekspresi maka akan terjadi pertwnbuhan cepat dari sel. Ekspresi onkogen pada
plasmid Ri rnencirikan pembentukan aka adventif secara besar-besaran pada
ternpat ymg diinfeksi dm dikenal dengan
'hairy root' (akw rambut)
(Nilson dm OTsson 1 997).
Pemmfagtan kultur aka rambut untuk merighasilkan senyawa mekbolit
sekundcr telah banyak dil&ukm, antara lain lobelin dmi Lobeliu injlanra L.
(Yonemitsu et QI. 199O), katarantin d m ajmalin dari Cutharc~nthusroseus (VazquezFlota ef 01. 18941, saponin dari Solmum aculeatr'ssurn (Ikenaga et al. 19951,
glukotropaeolin dari Tropaeolum majus (Wielmek dan Urbmek 19991, hiosimin d m
skapalamin dari Atropa beliardonna (Kmada et al, 1986 ; Aoki ee6 al, 1997) d m
Dutwra innoxia (Boitel-Conti et a!. 2000).
Kultur akar m b u t pada tanaman kina untuk mernproduksi kuinulin juga tel&
dilalrukan oieh Hamifi et al. (1 989) pada C. ledgerianu dengm A. rhizogenes gdur
LBA 9402 dm'R1000, dm Cieerling et al. (1999) pada C, oficinalis dengan galur
I,BA 9402. Narnun produksi kuinolinnya rnasih rendah dm diperoleh dalm periode
waktu lebih dari satu tahun, Hal ini discbabkan istju pcrturnbuhan akar rambut yang
ssuzgat lambat. Namun sistem produksi ini jauh lebih rnenguntmgkan dibandingkan
dengan vanamannya yang baru dapat dipmen setelah berumur lebih d a i 7 tahun.
Adanya kendda dalam kultur &ar rambut tanman kina disebabkan b l u m
ditemukan komposisi medium yank tepat untuk perturnbuh. akax rambut. Menurut
Gixi dm Naasy (2000) medium tumbuh mcmberikm pengaruh yang nyata terhadap
induksi akar rambut dan produksi rnetabolit sekunder. Untuk rnemperoleb
p e ~ u m b u h m akar rambut yang optimal, kondisi kultur haws diatw padst
tingkat optimum.
Bercfasarkan hasil yang telab dlperoleh d m dalm upaya rri~ndstpatkan
alkaloid kuinoin yang lebih tinggi dilakukw penelitian terhadap kemampuan
A. rhizogenes untuk mengirrfeksi dm rnenghasilkan respon pada tanaman kina,
Penelitian ini rnerupakan pahap awal dari serangkaian penelitian yang d:lrencim&an
untuk menghasilkan teknulogi kultur &ar rmbut C, succirubra dm C. ledgerianu
yang mernproduksi alkaloid kuinolin. T&;tpm
penelitian yang dildcuk-nuz
rnencangkup pengujian trmsformasi genetik behrapa galur A. rhizogenes terhadap
C succirubru dan C. ledgerima d m dilmjutkm dengm uji konfrrmasi T-DNA ymg
terintegrasi di "ddarn akar rambut C. succirubra dm C. Jedgeraiana dengan
rnenggunakan primer spesifik dari TL dm TR-DNA A. rhizogenes rnelalui tehik
Poly~ne~ase
C h i n Reaction (PCR).
1,2 Tujuan Penelitian
Penelitian ihi krtujuan untuk (1) menyeleksi beberapa galur A. rhizogenes yang
dapat menginokulasi C', succiru bra dm C. ledgerianu, (2) mendapatlcan medium
yang optimum untuk gertumbuhan &a rambut: C, succir:rubra dm C. ledgeriana,dan
(3) mendapatkan akar rambut tanaman kina y m g telah terintegrasi T-DNA.
1.3 Hipatesis
Hipatesis ymg digunalcm d d m penelitim ini addah :
I . A. rhizogenes &pat rnenginduksi pernbentukan akar rambut pada sel jaringan
tanaman kina C. succirubra dm C. ledge~.ia'araa.
2, Komposisi medium kuItur dqar rnempengaruhi pertumbuhan akar rambut
tanaman kin# C. succiuubra dm C. ledgeriana.
3. T-DNA dari A, rhizugenes dapat te~integasipada &a rambut &~amankina
C succr'rubra dan C ledgerr'una,
l,4 Kegunaan PeneXitian
Penelitfan ini diharapkan dapat, menglxasilkan teknik trmsformasi pada
tanaman kina dengan rnenggunakan gdur A. rhizogenes yang
kumpatibel terhdap
genarn C. succr'rubru dan C. ledgerianu dan m e n d a p a t h medium terbaik ymg &pat
menghasilkm pertumbuhan akw rambut ymg optimal. Teknik ymg dihasilh
diharapkm dapat d i j a d i h sebagai d a m untuk: dapat mrneprduksi alkaloid kuinolin
2.1 Tinjauan Umum Tanaman Kina
Tanaman kina (Cinchona sp) menrpakan tanaman tropis yang b e r a d dari
benua Amerika Selatan d m termasuk suku Rubisceae (Croraquist 1981 ; Aerts el ai.
1991). Ada berbagai spesies tanaman kina, di mtaranya C, lanc$ulila,
C. triameI
C, cordifdid, C, succirubva, C, oflcinalis, C. micralathu, C. calopdera, C.josephiana
dan C, culisuya (Kerbosch 193 1). Di Indonesia, tanaman kina dibudidayakan
di drierah pegunungan pada ketinggian 800-1625 m di atas permukaan laut atau
kusmg dari 1950 rn di atas permukaan Iaut. Ada dua spesies kina y m g
dibudidaydcan, yaitu C. ledgeriana dm C. succkubra,
Pohor- C ledgeriano kurmg kuku!i~,tetapi pertumbuhamya ceprtt, mmpunyai
percabangan ymg banyak dm tidak beratwan. Dam C, ledgeriana tebal, berwarna
~ j a umuda, berbentuk jorong, Xmset, dengm alur ymg kecil pacia tulang-tulmg dam
& p e m h atas dam. Bunga kuning pucat, bakd bbu& berbentuk telur sku tomb&
dengm panjang 8 - 15 mm.Kulit teba1 dengan warna cukeXat (Astika 19751,
C, Szdccjrubra rnerniliki puhon ymg besar dm batang luws. Perhunbuhannya
cepat namun percabmgm sedikit, cabang-=bang muda berbulu. D a m y a besar,
tipis, benvma hijau muda, berbentuk jorong
&
-
(40 50) X (30
- 40)
ern dengan
lapisan bulu sepanjang tulmg daun pada permukaan bawah, Bmga b e w m a me&
muda dm perrnukaan atas rnahkota berwma putib. B&al buah rnemanjang
* 2 - 3 31x1.Kulit berwmna cakelat dengan sedikit bintltik-bintik yang keputih-putifran
(Astika 19751,
2.2 Alkaloid Tanaman Kina
Tanman kina telah lama dikenal sebagai penghasil metabulit sekunder, yrtitu
alkaloid kuinolin. Kuinolin banyak ditemukan di ddam kulie batang tanaman kina,
sedangkan pada bagian lain seperti kayu, buah dm daun hmya dikmukan d d m
kadar yang relatif sedikit (Musalam er al. 1980). Kurang lebih 35 macam alkaloid
kuinolin telah ditemukan pada tanaman kina, n m u n hmya terdapEtt empat macam
kuinolin u m a yaitu kuinin, kuinidin, sinkonin dm sinkunidin (Urdang 19451,
Kuinin dan kuinidin mempaksm turunan dari 6-metoksi-kuinolin, dm
mempunyai m u s empiris yang sama, yaitu C~~H24N202
dengan bemt rnolekul 232
(Verstridjen 1975). Keduanya menrpakan stereoisomer yang dibedakm d a m
karakteristik kikia dm fisikanya, sehingga mempunyai sifat yang berbeda. Perbedm
bentuk ruang kedua molekul ini berasal d x i orientasi yang berlainan dari
atom C pusat ymg tidak rnempwyai simefri dm dapat terikat ppada atom-af0In
dengan dua macam susunan, ywg satu merupakan baymgan cemin yang I&
(Verstrijden 19751,
Biasilltesis alkaloid kuinolin dapat dilihat pada gmbar 2.2. P=mbntukan
alkaloid kuinolin diawali dengan perubahan triptofan membentuk triptamin dengm
banturn enzim triptofan dekarbksilase. Selanjutnya terjadi kondensasi ezimatik dari
triptamin dm sekolagmin untuk membcntuk striktosidin, terw rnembenluk sejunlah
turunan dkdoid berikutnya termasuk alkaloid kuinolin (Aerts et al. 199 3).
Setiap jenis Cinchona mempunyai kandungm alkaloid kuinolin yang berbeda.
C. Eedgeriana diketahui memiliki kadar kuinin ymg tinggi (4
C. succirubru rnemiliki ktdar kuinin yang sangat rendah (0,8
-
-
13 %), sedmgkan
1,4
%I. Akm tetapi
kadar sinkanidin C, succirtib~.~
lebih tinggi yaitu 3,2 - 5,1 a/o dari pada C Itdgeriunn
R=l.l Sinkonidinon
l