KEAMANAN STEVIA HASIL BUDIDAYA B2P2TO2T DALAM ASPEK TERATOGENITAS

STEVIA SECURITY FROMCULTIVATION RESULTOF B2P2T02T

  K e y w o r d s : T e r a t o g e n i e , s t e v i a s w e e t o f

B 2 P 2 T 0 2 T T c u ltiv a tio n ,

S t e v i a r e b a u d i a n a B e r t o n i i

  FDA karena alasan keamanannya. Stevia dilaporkan menimbulkan efek karsinogenik dan mutagenik. Tetapi hal ini masih menjadi pertentangan mengingat ada beberapa hasil penelitian yang menyatakan stevia menunjukkan efek mutagenik, efek mutagenik lemah dan ada yang menyatakan tidak ada masalah dengan keamanannya. Efek mutagenik dan karsinogenik diduga disebabkan oleh adanya hasil metabolit stevisoida yang disebut steviol. Puluhan hasil penelitian mengenai keamanan steviosida dan steviol

  ( f o o d a d d i t i v e ) masih belum mendapat ijin dari

  buatan untuk penderita diabetes, juga diijinkan digunakan dalam makanan. Di Amerika, penggunaan stevia untuk zat tambahan makanan

  Bertoni M.) sangat potensial dikembangkan sebagai bahan baku gula (pemanis) alami, pendamping gula tebu dan pengganti gula sintetis. Daun stevia mengandung senyawa glikosida diterpen dengan tingkat kemanisan 200 D 300 kali gula tebu tetapi kalorinya sangat rendah, sehingga mempunyai keunggulan lain dapat digunakan oleh penderita diabetes maupun pada penderita kegemukan. Zat manis dalam stevia disebut stevisoida. Gula stevia telah dikomersilkan di Jepang, Korea, RRC, Amerika Selatan untuk bahan pemanis bagi penderita diabetes dan kegemukan. Di Jepang dan Brazilia, stevia selain digunakan sebagai pemanis

  ( S t e v i a r e b a u d i a n a

  anaman stevia

  P e n d a h u l u a n T

  m l / l 0 0 g b w p e r d a y d u r i n g o r g a n o g e n e s i s p e r i o d , o n t h e d a y o f p r e g n a n c y t o t h e

6 t h u n t i l 1 5 t h . D u r i n g t h e t e s t , t e s t a n i m a l s w e r e o b s e r v e d t w o t i m e s d a i l y w i t h t h e d i s t a n c e o f s i x h o u r s

a g a i n s t t h e t o x i c i t y s y m p t o m s s u c h a s c h a n g e s i n s k i n , h a i r , e y e s a n d m u c o u s m e m b r a n e s , b l e e d i n g .

A n i m a l s t h a t e x p e r i e n c e d a b o r t i o n , p r e m a t u r e b i r t h o r d e a t h d u r i n g t h e t r i a l p e r i o d w e r e s a c r i f i c e d a n d

o b s e r v e d i m m e d i a t e l y w i t h m i c r o s c o p i c t e c h n i c . A t 2 0 t h d a y o f p r e g n a n c y a l l o f t h e p r e g n a n t r a t

d i s s e c t e d , a n d p u t o u t t h e f e t u s e s f r o m t h e m o t h e r 's a n d o b s e r v a t e d t h e h e a l t h c o n d i t i o n s i n g e n e r a l a n d

t h e w h o l e o f m o t h e r s r e p r o d u c t i v e s y s t e m s o f f e t u s e s , t h e o u t e r f e t a l m a l f o r m a t i o n a n d s o f t t i s s u e s y s t e m

o f f e t a l . T h e c o n c l u s i o n w e r e s w e e t s t e v i a o f B 2 P 2 T 0 2 T n o w o r s e e f f e c t o n t h e m o t h e r r a t s , f e t a l b o d y w e i g h t a n d m o r p h o l o g y o f m o t h e r r a t s a n d t h e fetus, d o e s n o t a f f e c t t h e p r o c e s s o f d e v e l o p m e n t o f f e t a l

s o f t t i s s u e , a n d d o e s n o t a f f e c t t h e d e v e l o p m e n t o f f e t a l s k e l e t o n . G e n e r a l l y t h e B 2 P 2 T 0 2 T s t e v i a s w e e t

s u b s t a n c e s s a f e f o r u s e d , d o e s n o t c a u s e t e r a t o g e n i c e f f e c t s .

  

ARTIKEL

K E A M A N A N S T E V I A H A S I L B U D I D A Y A B

  1

  

T e r a t o g e n i c t e s t h a s b e e n p e r f o r m e d o n s w e e t s t e v i a a s p r o d u c t o f B 2 P 2 T 0 2 T c u l t i v a t i o n a t r a t s ( R a t t u s

n o v e r g i c u s ) p r e g n a n t f e m a l e W i s t a r . S t e v i a s w e e t w a s a d m i n i s t e r e d o r a l l y a t a d o s e o f 3 6 0 , 1 2 0 a n d 4 0

m g / k g b w , v o l u m e

  IN ASPECT OF T E R A T O G E N I T A S

Abstract

  

L u c i e W i d o w a t i , * A w a l P r i c h a t i n i K u s u m a d e w i , * * S r i M u r h a n d i n i * * *

  2 T

D A L A M A S P E K T E R A T O G E N I T A S

  2 T 0

  2 P

• Puslitbang Biomedis dan Farmasi,
• B2P2T02T,
• Badan POM
telah dilakukan. Hasil uji toksisitas akut (LD so) terhadap steviosida dan steviol terhadap 3 jenis hewan coba yaitu mencit, tikus dan hamster, menunjukkan bahwa steviosida sampai 15 g/kg bb tidak menyebabkan kematian pada ketiga jenis hewan. LD

  so

  n o v e r g i c u s ) ,

  Sebanyak 80 ekor tikus betina dan 50 ekor tikus jantan, dibagi menjadi 3 kelompok uji dan 1 kelompok kontrol masing-masing 20 ekor. Hewan diberi makan dan minum ad libitum. Sebelum pengujian dimulai, hewan diaklimatisasi dalam ruang percobaan selama tidak kurang dari

  Digunakan 4 kelompok dosis, jumlah hewan untuk setiap kelompok 10 ekor.

  C a r a k e r j a I . P e r s i a p a n h e w a n u j i

  terhadap perkembangan janin tikus putih

  UJI

  Melihat pengaruh pemberian bahan

  U j i T e r a t o g e n i t a s P r i n s i p k e r j a

  Rancangan Acak Lengkap, dengan cara pemilihan dan penarikan sampel sesuai dengan pedoman dari WHO.

  Percobaan'tr' Merupakan penelitian eksperimental laboratorium, percobaan dilakukan dengan

  2 bulan, bobot badan rata-rata 160-200 gram, berasal dari Puslitbang Biomedis dan Farmasi.

  ±

  galur Wistar, jenis kelamin jantan dan betina, umur

  Hewan coba Hewan coba tikus putih ( R a t t u s

  steviol pada hamster 5,2 dan 6,10 g/kg bb masing-masing untuk jenis kelamin jantan dan betina; sedangkan LD

  Balai Besar Penelitian Tanaman Obat dan Obat Tradisional (B ^{2 P 2 T0 2 T), Tawangmangu.}

  Bahan Zat manis dari S t e v i a r e b a u d i a n a yang diekstraksi dengan pelarut air," diperoleh dari

  B a h a n d a n C a r a K e r j a

  Manfaat penelitian adalah mendapatkan stevia galur B ^{2 P 2 T0 2 T sebagai pengganti pemanis} buatan yang aman.

  Tujuan khusus adalah adalah untuk mengetahui adanya efek toksik pada janin akibat pemberian bahan uji hewan bunting.

  ( f o o d a d d i t i v e ) .

  4 galur harapan stevia. Mengingat banyaknya terjadi kontroversi dalam keamanan terhadap beberapa produk pemanis buatan yang sudah digunakan, maka untuk mendukung data keamanannya diperlukan pengujian (toksistas kronis, uji mutagenik, uji karsinogenik maupun teratogenik) pada Stevia induk B2P2T02T. Penelitian ini belum pernah dilakukan, mengingat bahwa budidaya Stevia di Indonesia belum banyak dilakukan. Pada penelitian awal akan dilakukan uji toksisitas akut dan teratogenik pada hewan tikus. Penelitian bertujuan untuk men- dapatkan data keamanan zat manis stevia budidaya B ² P ² T0 ² T sebagai bahan tambahan makanan

  Stevia sudah mulai ditanam massal di berbagai perkebunan di Indonesia, dan dibudidayakan di Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Tanaman obat Obat tradisional (B ^{2 P 2 T0 2 T). Saat ini B 2 P 2 T0 2 T sedang berusaha} menurunkan satu galur Stevia varietas unggul dari

  menunjukkan bahwa ekstrak stevia sangat aman. Pemberian 20 gram ekstrak stevia atau sebanding dengan 3 liter pada manusia, tidak menunjukkan kelainan setelah 7 hari. Steviosida pada dosis sampai 2,5 g/kg tidak menimbulkan bahaya pada hewan coba, tidak mempengaruhi perkembangan pertumbuhan hamster.' Data LD so daun Stevia dari B2P2T02T Tawangmangu, menunjukkan nilai 79,81 mg/l0 g (=8,0 g/kg ) bb mencit, dengan pemberian intra peritoneal. ³ Stevia merupakan tanaman semak semusim dengan tinggi antara 30-90 cm, dapat tumbuh pada 10-1300 dpl. Stevia ditanam dengan populasi 60.000-125.000 tanaman/ha, usia produktif 2-3 tahun, masa panen 6-7 kali/tahun. Didataran rendah stevia cepat berbunga dan mudah mati apabila sering dipanen. Stevia yang ditanam di Indonesia berasal dari Jepang, Korea dan China. Bahan tanaman tersebut berasal dari biji sehingga pertumbuhan tanaman stevia di lapangan sangat beragam."

  J a p a n F o o d S a n i t a t i o n C o r p o r a t i o n tahun 1991,

  steviol pada mencit dan tikus lebih besar dari 15 g/kg bb. Hal ini menunjukkan bahwa steviosida maupun steviol sangat aman. ¹ Penelitian lain mengenai toksisitas akut terhadap mencit yang dilakukan oleh

  so

  1 minggu sehingga hewan dapat beradaptasi dengan lingkungan yang baru.

  P e n e n t u a n t a h a p s i k l u s p r o e s t r u s p a d a t i k u s b e t i n a

  a. F etus hidup

  1 mm dengan mengutamakan hidung, mata dan ventrikel lateral, sayatan-sayatan diletakkan dalam plat tetes berisi air hingga terendam. Selanjutnya kulit di sekitar perut ditoreh menggunakan pisau, bagian depan dipotong dan dibuang, organ dalam rongga perut dikeluarkan, keadaan ureter, kelenjar kelamin dan kandung kemih diperiksa, dilihat penyimpangan dari kondisi normal.

  Bouin selama 1-2 minggu disayat dengan pola tertentu. Kepala bagian atas di antara kedua rahang dan di sebelah bawah telinga dipotong menggunakan pisau mikrotomlsilet, dan permukaan langit-langit diperiksa lalu diletakkan di sebelah bawah dan sayatan melintang kepala dibuat dari hidung berurutan ke arah belakang dengan jarak maksimum

  lunak" F etus yang telah difiksasi dengan larutan

  6 . F i k s a s i f e t u s d a n p e n i l a i a n j a r i n g a n

  Sepertiga dari jumlah fetus dimasukkan ke dalam etanol 90% untuk pemeriksaan kerangka dan dua per tiga dari jumlah fetus diikat satu persatu secara berurutan dan diberi nomor induk, dimasukkan ke dalam larutan Bouin sekurang- kurangnya 10-14 hari untuk pemeriksaan jaringan lunak.

  Fetus-fetus dipindahkan secara berurutan mulai dari pangkal uterus sampai ovarium, dan dilakukan: penghitungan jumlah fetus; pengamatan morfologi mulai dari kepala sampai ekor; penentuan jenis kelamin (jantan/betina); penimbangan bobot tubuh; penentuan jumlah fetus mati dan hidup; penghitungan jumlah korp ora lutea; penghitungan jumlah implant.

  saja mati, bentuknya lengkap tapi warnanya lebih pucat dari normal c. Kematian lambat ( l a t e d e a t h , LD), organogenesis telah terjadi sehingga embrio sudah tampak tetapi perkembangannya tidak sampai ke tingkat fetus (resorpsi embrionik) d. Kematian awal ( e a r l y d e a t h , ED), kematian terjadi sesaat setelah implantasi sehingga belum terbentuk embrio, implant berupa jaringan timbul dari plasenta yang berdegenerasi (titik implantasi).

  ( f o e t a l d e a t h ,

  Pada hari ke-20 kehamilan semua induk dibedah untuk diambil fetusnya. Sebelumnya hewan dikeluarkan kemudian fetus dan implant diangkat dengan hati-hati dan diklasifikasikan sebagai berikut:

  Tahap siklus proestrus betina dewasa dapat ditentukan dari perbandingan komposisi sel epitel berinti, sel epitel bertanduk dan leukosit dalam apusan vagmanya.

  5 . P e m b e d a h a n d a n p e n g a m a t a n t e r a t o l o g i u m u m

  Volume pemberian 1 mi per 100 g bb per hari. Selama pemberian zat manis stevia, hewan uji diamati 2 x sehari dengan jarak 6 jam terhadap gejala toksik seperti perubahan kulit, bulu, mata dan lapisan mukosa, perdarahan. Hewan yang mengalami aborsi, lahir prematur atau mati selama masa percobaan segera dikorbankan dan diamati secara mikroskopis.

  Bahan uji diberikan secara oral setiap hari pada tikus hamil selama masa organogenesis (hari ke 6 sampai 15), dalam 3 kelompok perlakuan: Kelompok I, diberi zat manis stevia 360 mg/kg bb Kelompok II, diberi zat manis stevia 120 mg/kg bb Kelompok III, diberi zat manis stevia 40 mg/kg bb Kelompok IV, diberi akuades 2 cc/200g bb.

  Hewan betina yang terbukti kawin dipelihara dalam kandang individual dan dikelompokan secara acak dengan cara penomoran agar tikus yang digunakan dapat mewakili populasi keseluruhan.

  h a m i l

  4. P e m b e r i a n z a t u j i s e c a r a o r a l p a d a t i k u s

  Tiga ekor tikus betina virgin yang dalam masa proestrus disatukan dengan dua ekor tikus jantan pada sore hari. Tikus dinyatakan kawin apabila ditemukan sperma dalam apusan vaginanya pada keesokan harinya. Tikus yang terbukti kawin dinyatakan sebagai hari ke 0 dari kehamilan.

  p e m b u k t i a n p e r k a w i n a n

  3. M e n g a w i n k a n t i k u s y a n g p r o e s t r u s d a n

  Penilaian dilakukan dengan membanding- kan fetus perlakuan terhadap fetus kontrol di bawah mikroskop stereo dengan pembesaran 4-10 X terhadap jumlah, bentuk, ukuran dan posisi organ. ¹⁰ Organ yang dinilai pada pengamatan

  Bouin adalah langit-langit/rongga mulut, rongga Pada uji teratogenitas, dipilih hewan uji hidung, mata, otak, trakea, esopagus, tikus, tikus mengingat tikus adalah hewan yang jantung/pembuluh darag, paru-paru, diagpragma, berkembang biak dengan cepat (mulai umur

  8 hati, lambung, limpa, usus, adreanal, ginjal, ₁₀ minggu), dengan masa hamil yang singkat (21 ureter, kelamin dan ekor. _{10 (6 sampai 15 ekor). Tikus mempunyai rata-rata} hari), mempunyai jumlah anak yang relatif banyak

  ti

  7. Pembuatan preparat kerangka etus ₁₂ cacat atau malformasi spontan sebesar 1%. Pada Tahap pekerjaan meliputi: pembuangan uji ini, dosis maksimum yang dipersyaratkan pada kulit dan organ bagian dalam; penjernihan tikus maksimal adalah 600 mg/kg bobot jaringan; pemutihan; pewarnaan kerangka; badan/hari)." Pada penelitian ini, uji teratogenitas pembersihan akhir. menggunakan dosis zat manis stevia B ^{2 P 2 T0 2 T}

  Fetus yang sudah berwarna merah ungu sebesar 360 mg/kg bb per hari (dosis terbesar) dan dibilas dengan air beberapa kali kemudian menurun pada dosis 120 dan 40 mg/kg bb per direndam secara bertahap dalam larutan gliserol hari. 5, 20, 40 dan 80% masing-masing selama

  1 Zat manis Stevia diberikan pada masa mmggu. organogenesis, periode ini merupakan periode perkembangan yang labil, sehingga sangat peka

  8. Penilaian kerangka akan pengaruh senyawa dari luar. Pada periode ini Pengamatan dilakukan setelah preparat akan mulai terbentuk lapisan germinal yang akan direndam dalam larutan gliserol 80% paling ₁₂ berdeferiensiasi menjadi organ. Selama pemberi- sedikit seminggu. Kerangka terlihat berwarna an zat manis stevia hari ke ke-6 sampai ke-IS, merah diantara jaringan yang jernih. Analisis induk hamil tidak menunjukkan gejala-gejala berupa pengukuran relatif dan absolut tulang, toksik seperti perubahan pada kulit, bulu, mata distribusi warna, struktur, morfologi, jumlah, dan lapisan mukosa. Juga tidak terjadi ukuran dan posisi tulang, dibandingkan dengan pendarahan, aborsi ataupun cacat prematur.

  II

  kelompok control. Pengamatan dilakukan di Pemeriksaan bobot badan induk hamil bawah mikroskop stereo dengan pembesaran 4-10

  (Gambar 1) tidak menunjukkan perbedaan yang kali. bermakna pada ratio bobot badan secara statistik dengan uji Student T pada p<0,05 antara

  Hasil dan Pembahasan kelompok kontrol dan ketiga kelompok perlakuan.

  1. Zat manis stevia _{2 2 2} Selama pemberian zat manis stevia pada Hasil budidaya stevia B P T0 T menghasil- masa kehamilan hari ke-6 sampai ke-IS, induk kan zat manis stevia sebesar 6,5%, berupa kristal hamil tidak memperlihatkan gejala-gejala toksik putih kering, rasa sangat manis. seperti perubahan pada kulit, bulu, mata dan lapisan mukosa. Juga tidak terjadi kematian, _{2 00 -,----------------} pendarahan, aborsi ataupun lahir prematur. 160 _{12 140 18 5~~~ ~ 40 m g 1 00} - ------------- + _{~ 12 0m g 8} ------------- - + ₆₀ ------------- - + _{~ 360 m g 40 2 ------------- -} - ------------- + ₊ ^{~ a kuad es} _{h ari} ------------- - + _{3 h ar i 6 h a ri 9 h a ri 12 h ar i 1 5} Gambar

  1. Kenaikan bobot badan

  Kesuburan induk tikus kelompok I sampai sayatan otak , terjadi pada kelompok dosis kecil

  IV berturut-turut nilainya adalah 75%, 78,92%, dan kelompok akuades, berupa pembesaran 71,43% dan 81,82%. Efek terhadap reproduksi ventrikel. Tidak terdapat kelainan pada dosis induk seperti jumlah implant dan ratio implantasi sedang dan dosis besar. Hal ini menunjukkan tidak berbeda nyata antara kelompok perlakuan bahwa kelainan tidak disebabkan oleh bahan uji. dan kelompok akuades. Demikian pula dengan

  Kelainan lain adalah pada sayatan pada peritoneal rata-rata jumlah korpus luteum tidak ginjal berupa perbedaan posisi uretra, terjadi pada menunjukkan perbedaan yang signifikan dengan semua perlakuan dosis dan akuades dengan ratio kelompok kontrol, nilainya berturut turut 8,2; 7,7; kelainan berturut-turut 90,0,2%; 91,89%; 93,0%

  8,28 pada kelompok dosis perlakuan dan 8,14 dan 92,5% pada kelompok akuades. Secara umum untuk kelompok akuades. (tabel 1) tidak terdapat kelainan yang spesifik pada sayatan organ lain. (Tabel 3)

  Tabel 1. Efek Pemberian Zat Manis Stevia Secara Oral Terhadap Induk Hamil

  Kelompok Perlakuan Parameter

  I II 111

  IV Jumlah induk kawin

  12

  13

  14

  11 Jumlah induk hamil

  9

  10

  10

  9 Jumlah induk tidak hamil

  3

  3

  4

  2 Jumlah induk hamil mati o o o

  Jumlah induk hamil hidup

  9

  10

  10

  9 Jumlah induk dengan seluruh

  9

  10

  10

  9 fetus hidup Jumlah korpora luteum

  82 77 116

  57 (rata-rata± SD) 8,2 ± 0,124 7,7 ± 0,823 8,28 ± 0,611 8,14 ± 0,690 Jumlah implant

  71 69 109

  50 (rata-rata± SD) 7,1 ± 1,197 6,9 ± 1,370 7,78 ± 0,975 7,142 ± 1,773 Ratio implantasi (%) 86,5 89,6 93,9 87,7

  Rasio implantasi adalah rata-rata kejadian pada tiap induk.

  Tabel2. Efek Pemberian Zat Manis Stevia Terhadap Perkembangan Fetus

  Parameter Kelompok Perlakuan

  I II 111

  IV Jumlah fetus yang diperiksa 63 60 196

  40 (rata-rata ± SD) Jumlah fetus dengan anomali ekstemal Rasio Jems kelamin 31/32 30/38 45/64 20/21 (jantan/betina) Bobot badan (g) Jantan (rata-rata ± SD) 3,38 ± 0,760 3,78 ± 0,559 3,26 ± 0,704 2,60 ± 0,941 Betina (rata-rata ± SD) 3,44 ± 0,443 3,23 ± 0,490 2,84 ± 0,786 2,65 ± 0,758 Mortalitas (%)

  Mortalitas merupakan rata-rata kejadian pada tiap induk

  Tabel

  3. Efek Pemberian Zat Manis Stevia terhadap Jaringan Lunak Fetus Kelompok perlakuan Jaringan lunak/Organ

  I II 111

  IV

  a. Sayatan pertama pada kepala langit-langit + (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27)

• (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27) saluran hidung
• mata + (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27)
• otak + (41/41) +(37/37)
• (70/72) + (26/27)
• (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27) timus
• b. Sayatan pada toraks jantung + (41/41) +(37/37) + (72/72)
• (27/27)
• paru + (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27)

  c. Sayatan untuk pengamat- + (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27) an diagfragma

d. Sayatan pada peritoneal

• (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27) Hati
• Lambung + (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27)

  ginjal + (37/41) + (34/37) + (67/72) + (25/27)

  e. Sayatan pada organ reproduksi kelamin + (41/41) +(37/37) + (72/72) + (27/27)

• Tabel

  4. Efek Pemberian Zat Manis Stevia Terhadap Multi Anomali Kerangka Fetus Parameter Jumlah Kelompok perlakuan normal

  I II 111

  IV Jumlah fetus yang

  23

  

19

  25

  21 diperiksa Jumlah fetus dengan anomali

  7

  

4

  7

  10 Skull (tengkorak)

  5

  

2

  5

  8 Vertical vertebrae

  7

  7

  

7

  7

  7 Deformitas Thoracis vertebrae

  13

  13

  

13

  13

  13 Hipoplasia Deformitas Lumbar vertebrae

  6

  6

  

6

  6

  6 Aplasia Ribs (rusuk)

  13

  13

  

13

  13

  13

• + + + + +

  Bergelombang

• + + + + Pendek +

  Stemebrae (dada)

  6 5,67 5,77 5,37 5,6

  Absen Aplasia

  

2

  2 Deformitas

  2

  2 Terbelah Keadaan penulangan Sacro caudal Metacarpus (tangan)

  4 3,67 3,35 3.71 3,68 Metatartus (kaki)

4 4,00 3,95 3,60 3,75

kejadiannya sama dengan kelompok akuades.

  Terjadi beberapa kelainan malformasi pada Bahkan pada kelompok akuades kelainan pada keadaan penulangan dan tengkorak, namun perlakuan.

  Stevia, Bahan Pembuatan Pemanis Alami, Penerbit Kanisius, 2003. 5. ------, Parameter Standar Umum Ekstrak

  K e s i m p u l a n

  Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan, Zat manis stevia B ^{2 P 2 T0 2 T tidak} 2000. memberikan efek buruk pada induk tikus, bobot

  6. Hayes AW., Princip les and methods of badan induk dan fetus serta morfologi fetus; tidak Toxicology, Raven Press, Book Ltd. New mempengaruhi proses perkembangan jaringan York, 1984. lunak fetus dan tidak mempengaruhi perkembangan kerangka fetus.

  7. Pusat Pemeriksaan Obat dan Makanan, Prosedur Operasional Baku Toksisitas,

  Secara umum zat manis stevia B ^{2 P 2 T0 2 T} 1991. aman digunakan, tidak menimbulkan efek teratogenik dalam mendukung upaya budidaya

  8. OECD, The OECD Principles of Good stevia untuk mendapatkan stevia varietas unggul Laboratory Practice, Organizarion For B ^{2 P 2 T0 2 T.}

  Economic Cooperation and Development, Paris, 1992.

  9. Georg J Krinke, T i s s u e f i x a x i o n on T h e

  D a f t a r P u s t a k a h a n d b o o k o f e x p e r i m e n t a l a n i m a l r a t s ,

  The 1. cute toxicity of stevioside, a natural

  Laboratory Rat, Academic Press, London, sweetener, and its metabolite, steviol, in 2000. several anirnal species, Toskulkao,

  C:

  10. Manson JM., Principles and methods of Chaturat, L : Temcharoen, P : Glinsukon, T. toxicology, edited by Wallace Hayes,

  Drug Chemical Toxicology; 1997 Feb- Raven Press, New York, ,1982, p 141-184. May; 20(1-2):31-44.

  11. Taylor P. and AG. Sandaz, Practical 2. Stevia Safety Studies, teratology, Academic Press, London, 1986,

  Selected examples from the hundreds of p 1-108 studiesattesting to the safety of stevia leaf and its extracts. Diakses

  10 Mei 2008, pk.

  12. Arlene M.Wallace and Janet L. Engstro,

  22.00 The effects of aerobic exercise on the pregnant woman, fetus, and pregnancy

  3. Wahjoedi B. Data toksisitas akut tanaman outcome, Journal of Nurse_Midwifery, obat Indonesia, Medika No. 10 , tahun 13, Copyright © 2011 Elsevier B.V.

  1987: 1005-1007.