Kemampuan rhizobakteri memproduksi IAA dapat dimanfaatkan untuk peningkatan dan perbaikan pertumbuhan tanaman melalui teknologi rekayasa genetika.

SEMINAR HASIL DOSEN MUDA

PENDAHULUAN
• Kira-kira 25% dari luas daratan

Indonesia mrpk ultisol
• Permasalahan tanah ultisol
hara
makro rendah, hara mikro tinggi
meracuni tanaman
menghambat
pertumbuhan akar
• Mikroorganisme di dalam tanah dapat
memacu pertumbuhan tanaman
menghasilkan auksin, giberelin, etilen,
dll

 Auksin sangat berperan dalam

pertumbuhan dan perkembangan
tanaman terutama dalam

perbesaran dan pembelahan sel,
mempengaruhi permeabilitas
membran sel, peningkatan respirasi
pada jaringan tanaman, memacu
sintesis mRNA serta protein enzim
berupa protein struktural, inisiasi
pembentukan akar, dll

 Biosintesis auksin tidak hanya pada

tanaman tingkat tinggi tetapi juga
pada mikroorganisme seperti fungi,
bakteri, actinomycetes dan alga.
 Kemampuan rhizobakteri

memproduksi IAA dapat
dimanfaatkan untuk peningkatan dan
perbaikan pertumbuhan tanaman
melalui teknologi rekayasa genetika

 Gen yang diperoleh dari pustaka

genom dapat digunakan untuk
memproduksi IAA dalam jumlah
besar
 Pustaka DNA mrpk sekumpulan

sekuens DNA dari suatu organisme
yang masing-masing telah diklon ke
dalam vektor tertentu untuk
memudahkan pemurnian ,
penyimpanan, dan menganalisisnya.

TUJUAN PENELITIAN
 Memperoleh isolat rhizobakteri yang

mampu menghasilkan IAA
 Menyusun pustaka DNA genomik
rhizobakteri penghasil IAA tertinggi

BAHAN DAN METODE
 Penelitian ini dilakukan mulai bulan April

2009 – Januari 2010, di laboratorium
Bioteknologi dan Pemuliaan Tanaman Lt
II Jur BDP Faperta Unand
 Penelitian ini terdiri dari 2 tahap :
1. Identifikasi rhizobakteri penghasil IAA
2. Penyusunan pustaka DNA rhizobakteri
penghasil IAA

I. Identifikasi
rhizobakteri

 A. Secara fisiologis
 1. Pengambilan sampel tanah
 2. Isolasi rhizobakteri
 3. Uji gram
 4. Uji pigmen fluorescen
 5. Uji kemampuan rhizobakteri dalam

memproduksi IAA

HASIL DAN PEMBAHASAN
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15

16
17
18
19
20
21
22
23
24
25

Kode
Isolat

Asal
Tanaman

Uji
Gram

Al 1
Al 2
Al 3
Al 4
Al 5
Al 6
Al 7
Al 8
Al 9
Al 10
Al 11
SK 1
SK 2
SK 3
SK 4
SK 5
SK 6
SK 7
SK 8
PR 1

PR 2
PR 3
PR 4
PR 5
PR 6

Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Alang-alang
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk

Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Sikaduduk
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam

Negatif
Negatif
Positif
Positif
Positif
Negatif
Negatif
Negatif

Positif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Negatif
Positif
Positif
Negatif

Uji
Fluorescen

Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak

Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak

ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada

OD

IAA

0.113
0.101
0.096
0.276
0.071
0.071
0.132
0.117
0.061
0.336
0.289
0.092
0.303
0.09
0.062
0.065
0.221
0.102
0.079
0.096
0.094
0.156
0.109
0.162
0.123

10.53
9.41
8.94
25.71
6.61
6.61
12.3
10.9
5.68
31.3
26.92
8.57
28.22
8.38
5.78
6.05
20.59
9.5
7.36
8.94
8.76
14.53
10.15
15.09
11.46

26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50

PR 7
PR 8
PR 9
PR 10
PR 11
PR 12
PR13
PR 14
PR 15
PR 16
PR 17
PM 1
PM 2
PM 3
PM 4
PM 5
PM 6
PM 7
PM 8
KM 1
KM 2
KM 3
KM 4
PT 1
PT 2

Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Paku resam
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Pimping
Karamunting
Karamunting
Karamunting
Karamunting
Polysticum sp
Polysticum sp

Positif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Positif
Negatif
Negatif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Positif
Positif
Positif
Negatif
Negatif
Positif
Positif
Positif

Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak
Tidak

ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada
ada

0.142
0.067
0.15
0.057
0.047
0.107
0.099
0.101
0.093
0.099
0.234
0.109
0.135
0.052
0.155
0.1
0.077
0.172
0.108
0.078
0.095
0.13
0.094
0.068
0.082

13.23
6.24
13.97
5.31
4.38
9.97
9.22
9.41
8.66
9.22
21.8
10.15
12.58
4.84
14.44
9.32
7.17
16.02
10.06
7.27
8.85
12.11
8.76
6.33
7.64

• Dari 50 isolat dipilih 6 isolat yang menghasilkan

IAA tertinggi untuk selanjutnya dilakukan uji
pertumbuhan bakteri sekaligus uji kemampuan
rhizobakteri menghasilkan IAA setiap 4 jam
A
B
S
O
R
B
A
N
WAKTU PENGAMATAN (JAM)

• Grafik 1. Laju pertumbuhan dan kemampuan isolat

menghasilkan IAA,

•

ket : a = isolat Al 10 , b = isolat Al 4, c = isolat
PR 17,
d =isolat SK 6, e = isolat SK 2, f = isolat Al 11

 B. Secara molekuler
 Isolat yang menghasilkan IAA tertinggi

(Isolat Al 11) diidentifikasi secara
molekuler
 1. Isolasi DNA
 Menggunakan metode Leah, White, Rhoad

& Leung (1994)
M
1

M = λ DNA 50,

1 = DNA isolat Al 11

 2. Amplifikasi gen 16S rRNA
 DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan

menggunakan kombinasi primer yang didesain
dari sekuen gen 16S rRNA. Kombinasi primer
yang digunakan adalah 27F (5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’) dan 1525R (5’AAGGAGGTGWTCCARCC-3’).
 Reaksi PCR dilakukan pada total volume 25 µl

yang terdiri dari 2 µl DNA templet, 2 µl kombinasi
masing-masing primer 27Fdan 1525R (5
pmol/µl), 21 µl ddH2O PCR dalam RTG-PCR Bead.
Amplifikasi dilakukan sebanyak 30 siklus pada
mesin PCR (Biometra-Jerman).

M

1

1500 bp

M = 1 Kb,

1 = produk PCR

Hasil elektroforesis dari fragmen produk PCR dengan
ukuran sekitar 1500 bp, yang merupakan ukuran yang
diharapkan bila menggunakan kombinasi primer 27F
dan 1525R dari sekuens gen 16S rRNA

• 2. Analisis sekuens gen 16S rRNA
– Sekuensing dilakukan di PT CPI (Chaeron

Phokphand Ind) di Jakarta. Sekuensing
dilakukan satu arah (one read direction)
menggunakan primer 1525R, kemudian
diedit menggunakan bantuan paket
software DNASTAR (Madison Wisconsin-USA)
dan dikontrol secara manual.

 C. Analisis BLAST sekuen DNA
 Analisis BLAST dilakukan untuk

•.

membandingkan data sekuens yang
dimiliki dengan sekuens-sekuens DNA
dari berbagai penjuru dunia dan
tanaman yang didepositkan pada
database (gen bank) sekuens publik.
Analisis BLAST dilakukan secara online
pada website NCBI (National Centre of
Biotechnology Information)
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.

Kode
akses
FN563421.1
FN563419.1
GQ487956.1
AY346313.2
EU116047.1

Deskripsi

Max.
Identifikas
i

Acinetobacter genomosp.3 partial 16S rRNA gene, 
strain bpoe1350
Acinetobacter genomosp.3 partial 16S rRNA gene, 
strain bpoe1348
Uncultured bacterium clone G1041 16S rRNA 
gene, partial sequence
Acinetobacter calcoaceticus strain HPC253 16S 
rRNA gene, partial sequence
Acinetobacter calcoaceticus strain D9 16S rRNA 
gene, partial sequence

93%
93%
93%
93%
93%

 Bakteri Acinetobacter calcoaceticus

merupakan bakteri gram negatif,
mampu menghasilkan IAA,
siderophor, pelarut phospat
(Prashantt, Makarand, Bhushan,
Sudhir, 2008)

 8 strain Acinetobacter yang di

isolasi dari rhizosfir tanaman
gandum mampu menghasilkan IAA

(Huddedar1, Shete,  Tilekar, Gore,
Dhavale, Chopade, 2002)

II. Penyusunan Pustaka
DNA
 1. Isolasi DNA genomik rhizobakteri
 2. Pemotongan parsial DNA






rhizobakteri
3. Preparasi DNA plasmid
4. Ligasi fragmen ke dalam vektor
5. Transformasi vektor ke dalam sel
inang
6. Seleksi koleksi rekombinan
7. Analisis ukuran insert

2.Penyusunan Pustaka DNA
• 1. Isolasi DNA rhizobakteri

konsentrasi DNA cukup tinggi kira-kira 600
ng1000 ng.
•
M
1
2
3
4

• Gambar 1. Hasil elektroforesis isolasi DNA rhizobakteri

‘G’,
•

M = λ DNA 50, 1-4 = DNA rhizobakteri
‘G’

 2. Pemotongan parsial DNA

rhizobakteri
 Penggunaan enzim EcoRI karena kompatibel

dengan plasmid PUC18.
 Menghasilkan pita smear antara 4-10 kb.
M



4.5 u

5u

5.5 u

6u

6.5 u

10000 bp

4000 bp

 Gambar 2. Hasil elektroforesis restriksi

menggunakan

enzim EcoRI, M = 1 kb,

7u

• 3. Isolasi dan pemotongan DNA plasmid

PUC 18
• Vektor yang digunakan untuk penyusunan pustaka DNA

ini adalah PUC18 yang berukuran 2686 bp.
• PUC18 ini sebelum dipergunakan perlu diperbanyak
terlebih dahulu di dalam E.coli, setelah itu baru DNA
plasmid diisolasi.

•

M

1

Gambar 3. Hasil elektroforesis isolasi DNA PUC18,
M = 1 kb, 1 = DNA PUC18

 4. Ligasi dan transformasi
 Ligasi antara fragmen DNA ‘G’ dengan

plasmid PUC18 dilakukan dengan enzim T4
DNA ligase, yang kemudian langsung
ditransformasi menggunakan metode heat
shock, hasil transformasi ini ditumbuhkan
pada media LB padat yang mengandung
ampicilin, X-gal dan IPTG.

Gambar 4. Hasil transformasi klon rekombinan ke
dalam E.coli DH5α

Koloni putih = koloni rekombinan = 176 koloni
Koloni biru = non rekombinan = 6 koloni

• 6. Analisis ukuran insert
– Koloni putih yang dihasilkan kemudian

diamplifikasi menggunakan primer M13RF,
dengan kondisi PCR predenaturasi 940C selama 2
menit, denaturasi 940C selama 1 menit, anneling
550C selama 1 menit, extensi 720C selama 1
menit, final extensi 720C selama 7 menit.
– Amplifikasi ini bertujuan untuk mengetahui
berapa fragmen DNA yang telah terinsert
M

2

1000 bp

•

•

1

Gambar 5. Hasil elektroforesis amplifikasi koloni
rekombinan, M = 1 kb, 1-2 = DNA ‘G’

•  

 Dari gambar diatas dapat dilihat

bahwa setelah diamplifikasi ternyata
fragmen DNA yang terinsert ke
dalam vektor adalah sebesar lebih
kurang 1000 bp – 103 bp (panjang
primer M13) = 897 bp

KESIMPULAN
 1. Dari 50 isolat yang diisolasi dari

rhizosfir tanaman ultisol mampu
menghasilkan IAA, Isolat Al 11
merupakan penghasil IAA tertinggi
dari rhizosfir tanaman alang-alang
sebanyak 26,92 ppm
 2. Penyusunan pustaka DNA telah
berhasil dilakukan dengan
terinsertnya fragmen sekitar 897 bp

TERIMA KASIH