PRINSIP REKAYASA GENETIKA PADA TANAMAN

PRI NSI P REKAYASA GENETI KA PADA
TANAMAN

Suharsono
- Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, I PB
- Departemen Biologi, I PB
E-mail: sony-sh@ipb.ac.id; sony@rcbio.org

Transformasi Tanaman dengan

Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens:
- gram negatif
- fitopatogen
- mentransformasi sel tanaman Æ tumor
Tumor:
transfer, integrasi dan
ekspresi gen yang terdapat
di T-DNA ke dalam genom
sel tanaman

Proses pembentukan tumor
Tanaman luka Æ acetosyringone,
hydroxyacetosyringone Æ induksi gen vir

Vir :
• 25 gen di dalam 7 operon
• di luar T-DNA
• fungsi: transfer & integrasi T-DNA di
genom tanaman

Plasmid Ti
T-DNA
1. iaaM ( tms1)
2. iaaH ( tms2)
3. tmr ( ipt )
4. gen-gen penyandi opine
• diekspresikan setelah
terintegrasi ke genom tanaman
• ditransfer dalam bentuk utas
tunggal linier, ujung 5’

membawa RB dan ujung 3’ LB
sekuen spesifik RB: 25 pb

Sintesis auxin dan sitokinine
iaaH (tms2)

trp 2-monooxygenase

i-3-a hydrolase

iaaM (tms1)

tmr (ipt)
isopentenyl diphosphate

isopentenyl transferase

isopentenyl adenosine monophosphate

Opine

• Sumber N dan C bagi A.

tumefaciens
• Beberapa jenis
• Tidak bermanfaat bagi
tanaman

Kendala pemanfaatan pTi alami
1. Sel tidak dapat diregenerasi
Æ gen fitohormon harus dibuang
2. Regenerasi sel terhambat karena N, dan C
digunakan untuk membentuk opine
Æ gen opine harus dibuang
3. Ukuran pTi terlalu besar
Æ segmen DNA yang tidak penting harus dibuang
4. Tidak dapat melakukan replikasi di E. coli
Æ Ori dari E. coli harus disisipkan ke pTi

Vektor derivatif dari pTi

Mengandung
1. gen penanda seleksi ( hpt , npt )
2. Ori di E. coli (kadang: + Ori di A. t )
3. RB dari T-DNA (sering: + LB)
4. Situs pengklonan (MCS)
Vektor ekspresi pTi
-tidak mempunyai vir
1. Vektor biner
2. vektor kointegrasi

Vektor ekspresi pTi
1. Vektor biner
• Ori E. coli, A.t
• Tidak ada vir
• A.t resipien:
-disarmed pTi: tidak ada T-DNA,
ada vir

2. Vektor kointegrasi
Rekombinasi vektor pengklonan +

disarmed pTi Æ vektor (vir, T-DNA)

Transfer gen dengan A. tumefaciens

Metode fisik untuk mentransfer gen ke tanaman

Tanaman yang telah ditransformasi secara genetik

Biolistik

• partikel diselimuti DNA+ CaCl, spermidine/ PEG
• efisiensi: DNA linier> sirkuler; besar< kecil (plasmid
besar Æ terfragmentasi Æ YAC)

Tanaman transgenik menggunakan biolistik

Biolistik dengan YAC

GOI = 150 kb (beberapa gen) dapat diintegrasikan
ke genom tanaman

GEN REPORTER
•
•
2
•
•

menyeleksi sel yang tertransformasi
kuantifikasi ekspresi gen
macam:
gen penanda seleksi dominan
gen yang produknya dapat dideteksi:
# β-D-glucuronidase:
* 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-glucuronide
acid Æ biru
* 4-methylumbelliferyl β-D-glucuronide Æ
fluorescent (fluorometer)
# GFP (green fluorescent protein): penanda in
vivo; sinar UV atau biru (tanpa substrat) Æ

fluorescent hijau (tanaman tipe liar Æ fluorescent
merah keunguan)

Gen reporter dan penanda seleksi di tanaman

Manipulasi ekspresi gen di tanaman
• Pilih Promoter
9Promoter 35S CaMV: konstitutif kuat, di seluruh
jaringan, sepanjang hidup
9Promoter SSU rubisco: aktif di daun (jaringan
fotosintetik)
9Pathogenesis-related promoter

Faktor penentu tingkat ekspresi lainnya
• enhancer: terletak di hulu promoter (1-ratusan bp)
• intron: stabilitas mRNA
• terminator

Perbandingan promoter 35S dengan promoter komposit

Promoter komposit: p35S+ 7 enhancer+ Ω TMV+ tnos
Gen reporter: β-glucuronase

Produksi protein di kloroplast/ mitokondria
Strategi:
• Gen penyandi fusi protein sasaran+ peptida signal Æ inti sel
• Gen penyandi protein sasaran Æ kloroplast/ mitokondria
Sel daun: 50-100 kloroplast @ 10-100 kopi DNA
¾insersi gen di kloroplast Æ produksi protein > insersi di
kromosom
¾Cara: GOI + marker diapit oleh sekuen DNA kloroplast Æ
microprojectile bombardment. Rekombinasi Æ GOI terintegrasi
ke genom kloroplat

Sekresi protein
Produksi protein di tanaman mahal
9untuk purifikasi (90% )
ÎTanaman sebagai bioreaktor Æ eksudasi protein
lewat (apoplast) akar

APLI KASI REKAYASA GENETI KA TANAMAN
Tujuan utama bioteknologi tanaman: merakit
kultivar baru

Perakitan tanaman resisten terhadap serangga
Strategi:
• insektisidal protoksin oleh Bacillus thuringiensis
• inhibitor α-amilase
• inhibitor protease
• lektin

Contoh sifat yang diperbaiki

Ulat menyerang tongkol jagung

Kapas biasa

Penggerek batang

Kapas-Bt

Non Bt

Kapas

Bt

Pepaya resisten Vs peka Ring Spot Virus

Meningkatkan ekspresi
• memotong gen (tersisa N-terminal yang
mengandung toksin)
• menggunakan promoter kuat
Perbandingan aa protoksin dari berbagai strain B.t:
ƒ 98% ujung N Æ terkonservasi; ujung C bervariasi
ƒ aktivitas: 646 aa pertama dari ujung N (protoxin:
1156 aa)
Æ Gen protoxin yang dipotong Æ tomat

Ekspresi toxin Bt

Manduca sexta
Heliothis zea
Keiferia lycopersicella

Usaha menaikkan ekspresi protoksin
1. Mutagenesis situs terarah: mengubah sekuen
yang menghambat transkripsi dan translasi Æ
95.6% smdg WT Æ 10 x produk WT
2. Modifikasi sekuen Æ sintesis secara kimia Æ
kodon yang biasa di tanaman Æ 78.9% smdg WT
Æ 100 x produk WT
3. Menggunakan promoter SSU rubisco + peptida
transit + sekuen termodifikasi Æ over produksi di
kloroplast Æ produk sangat tinggi (1% protein
daun)
4. I ntroduksi gen protoksin ke kloroplast Æ 2-3%
protein daun

Keuntungan ekspresi protoksin di kloroplast
1. Jumlah kloroplast tiap sel banyak Æ multi kopi
gen protoksin Æ produk tinggi
2. Tidak ada resiko penyebaran gen ke
lingkungannya melalui polen

Kerugian:
Serangga dapat menyerang akar, buah, bunga, batang yang
tidak mempunyai kloroplast

Ekspresi gen penyandi protoksin B.
thuringiensis di tanaman

Strategi lain mencegah serangan serangga
- Cowpea trypsin inhibitor
• menghambat H. virescens
- Potato proteinase inhibitor I I
• penggerek batang merah muda ( Sesamia inferens)
- I nhibitor α-amylase
• kumbang Callosobruchus maculatus, C. chinensis
-Cholesterol oxidase
• Anthonomus grandis grandis (coleoptera)
-Lektin
-Tryptophan decarboxylase
• kupu putih ( Bemisia tabaci)
-Avidin

Strategi lainnya untuk mencegah serangan serangga

Pencegahan resistensi serangga terhadap B.t
B.t. sebagai agen seleksi Æ serangga resisten
Cara pencegahan:
• Ekspresi protoksin Bt dibatasi pada waktu singkat
Æpromoter PR-1a Æ Bt diinduksi oleh pathogen atau
asam salisilat atau asam poliakrilat
• Fusi 2 gen toksin Æ protein toksin hibrid
• Kombinasi: Bt + insektisida lain (inhibitor α-amilase)
• Kombinasi: Bt + insektisida kimiawi dosis rendah
• Strategi pengungsian (refuge). 20% area non-Bt.
Serangga yang tahan di area Bt (80% ) jumlahnya
sedikit (99.9% mati) Æ kawin dengan serangga
sensitif di area 20% non-Bt Æ dilusi ketahanan

Tanaman resisten terhadap virus
Resistensi alami:
• mencegah transmisi virus
• mencegah terbentuknya virus
• mengatasi gejala virus

Proteksi dengan protein mantel virus

Ekspresi protein mantel

Tanaman transgenik:
• mengekspresikan protein mantel (RNA sense) Æ resisten
• dengan antisense Æ resisten pada dosis virus rendah

Resistensi terhadap banyak virus
Protein mantel CuMV, Zucchini yellow mosaic virus,
WMV2 Æ Cucurbita pepo resisten terhadap ketiga
virus

Tanaman resisten terhadap herbisida
Tanaman resisten herbisida:
1. Menghambat penyerapan herbisida
2. Produksi protein sasaran herbisida secara
berlebihan Æ protein aktif masih ada
3. Mengurangi kemampuan protein sasaran
mengikat herbisida
4. Menginaktivasi herbisida melalui metabolisme
2-4: melalui perakitan tanaman transgenik
EPSPS (5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate
synthase) Æ aa aromatik; sasaran glyphosate
EPSPS mutan E. coli Æ tanaman Æ tanaman
resisten terhadap glyphosate

Perakitan tanaman resisten terhadap herbisida

Resisten herbisida bromoxynil
• Nitrilase (dari Klebsiella ozaenae) menginaktivasi
herbisida bromoxynile Æ tanaman resisten
• Herbisida bromoxynil (3,5-dibromo-4hydroxybenzonitrile) Æ menghambat fotosintesis

Tanaman resisten terhadap fungi dan bakteri

Æ ekspresi pathogenesis-related (PR) protein:
β-1,3-glukanase, chitinase, thaumatin-like protein,
protease inhibitor, asam salisilat

• chitinase menghidrolisis β-1,4 dari chitin Nacetyl-D-glucosamine (dinding sel fungi)

Ekspresi asam salisilat di tanaman
• Resisten terhadap fungi dan bakteri
• Cara: Ekspresi gen penyandi enzim isochorismate
synthase dan isochorismate lyase

Tanaman toleran terhadap cekaman dan
senesen
Ekspresi SOD:
• tahan panas, herbisida methyl viologen
(paraquat), layu (bunga potong)
Ekspresi glutation peroksidase (-s-transferase):
• tahan garam, beku

Toleran terhadap cekaman garam/ kering
• perlu osmoprotectant:
¾gula, alkohol, prolin, trehalose, D-ononitol,
mannitol, sorbitol, glisin betain, 3methylsulfoniopropionate
• ekspresi choline dehydrogenase ( betA) Æ betain

Penundaan buah masak dan bunga layu
Buah masak:
• ekspresi polygalacturonase dan cellulase
• diinduksi
Æ dihambat: masak buah tertunda (layu bunga,
gugur daun tertunda)
Bagaimana menghambat ekspresi?
• RNA antisense thd gen penyandi
• mengalihkan jalur sintesis

Mengalihkan jalur sintesis etilen
ƒuntuk menghambat sintesis etilen

Degradasi ACCÆ sintesis etilen dihambat

Manipulasi genetik pigmentasi bunga
Antosianin (flavonoid) Æ pigmen bunga
Chrysanthemum + cDNA CHS sense/ antisense Î
bunga putih
Astaxanthin:
• pink (salmon, udang)
• dari bakteri & mikroalga
• mencegah telur rusak karena UV
• meningkatkan daya hidup & laju tumbuh Æ
antioksidan
Produksi astaxanthin:
-ekspresi cDNA β-caroten ketolase ( β-C-4
oxygenase) alga hijau ( Haematococcus pluvialis)

Modifikasi kandungan nutrisi tanaman
memperbaiki:
-kualitas nutrisi: jagung, kacang polong
(kandungan aa di biji)
-komposisi asam lemak dari tanaman penghasil
minyak
-rasa buah dan sayuran

Meningkatkan kandungan lisin
Over produksi lisin:
menghentikan feedback
inhibition oleh aspartokinase &
dihydrodipicolinic acid synthase
Æekspresi gen DHDPS lysinfeedback-insensitive dari
Corynebacterium & AK lysinfeedback-insensitive dari E. coli
dikendalikan promoter biji Æ biji
mengandung 2-5 x lisin

Kandungan lipid
Kanola transgenik: antisense gen stearate
desaturase dari Brasicca Æ akumulasi asam stearat
(tidak menjadi asam oleat)

Mengganggu RNA tanaman
Modifikasi fenotipe: downregulation dari ekspresi gen Æ
menghambat mRNA
Cara:
• ekspresi kopi tambahan ( cosuppression )
• ekspresi antisens
• ribozim Æ molekul kecil RNA Æ endoribonuklease spesifik
stearoyl-ACP U9 desaturase: asam stearat Æ asam oleat;
stearat meningkat Æ margarin dan minyak goreng

+ ribozim: asam oleat dihambat Æ akumulasi asam stearat

Vitamin A
Mamalia: β-carotene (provitamin A) Æ vitamin A
β-carotene: pigmen karotenoid pada membran tanaman
fotosintetik
Ekspresi β-carotene di beras via A. t:
ƒ 1: Phytoene synthase (psy)
(pglutellin) & phytoene desaturase
(crt) (p35S) tanpa smg + peptida
transit plastid
ƒ 2: Lycopene b-cyclase (lcy)
(pglutellin) + peptida transit plastid
ƒ 1+ 2 Æ padi Æ beras mengandung βcarotene shg berwarna kuning/ emas
Æ golden rice

Modifikasi rasa dan tampilan tanaman
Mencegah perubahan warna
Polifenol oksidase: oksidasi monofenol/ o-difenol Æ o-quinon
Æ perubahan warna buah/ sayuran
Perubahan warna dihambat dengan menghambat sintesis
polifenol oksidase

(Granule-bound starch synthase)

Kentang:
Æ antisense polifenol oksidase + p35S/ pGBSSÆ
resisten thd black spot
Æ Sense polifenol oksidase Æ tidak tahan

Pemanis
Monellin:
-Dioscoreophyllum cumminsii
-3000 x lebih manis darpd sukrosa
-Dimer: rantai A 45 aa, B 50 aa dengan
ikatan lemah nonkovalen
-Rusak oleh: panas, asam

Pemanis rendah kalori

Kandungan pati
Kentang: 20-30 amilosa (rantai lurus); 70-80% amilopektin
(rantai bercabang) Æ rasio keduanya: perubahan sifat fisik &
kimia pati

Amilosa: ikatan α-1,4

Amilopektin: ikatan α-1,4
dan α-1,6

Biosintesis pati

Glukan+ glukan Æ α-1,6 Æ amilopektin

p35S + antisense startch branching enzyme Æ amilosa naik:
28% Æ 60-80%

Tanaman sebagai bioreaktor

Produksi agen terapetik di tanaman transgenik (skala lab)

Antibodi
Keunggulan tanaman drpd bakteri: integrasi DNA di genom tanaman lebih
stabil, protein mengalami pemrosesan spt di sel hewan, lebih murah
(produksi antobodi per gram di sel hibridoma: $ 5000, bakteri: $ 1000,
tanaman: $ 10-100), dapat disimpan di biji shg tahan lama pada suhu ruang

Produksi biopolimer
Biosintesis poly (3-hydroxybutyric acid) dari acetyl-CoA

Alcaligenes eutrophus
Acetyl Co-A
3-ketothiolase

Acetoacetyl Co-A

D-3-Hydroxybutyryl co-A

Acetoacetyl Co-A reductase

PHA

Poly(3-hydroxybutyric acid) synthase

PHA: bioplastik, di A. eutrophus Æ 1 operon Æ tidak dikenal
tanaman Æ ekspresi 3 gen terpisah: A. thaliana Æ target ke
kloroplast
@ gen + peptida transit di kloroplast ssu rubisco + p35S Æ
pTi biner
1 x 2 Æ tanaman (1+ 2) Æ x 3 Æ tanaman (1+ 2+ 3) Æ 1 mg
/ g daun segar PHA

Mengubah kandungan lignin
Lignin:
tinggi Æ mutu pulp dan hijauan pakan rendah
rendah: antisense 4-Coumarate:coenzyme A ligase

PERKEMBANGAN REKAYASA GENETI KA
TANAMAN
• Adopsi tanaman transgenik pesat
– 1996: 2.8 jt ha (AS, Kanada, Argentina,
Brasil, Afsel, China) Æ 2003: 67.7 jt ha (18
negara)
– 4 komoditas penting: kedelai, jagung, kapas,
kanola
– 2 sifat: resisten herbisida, resisten hama
(penggerek)
• 2006: + negara, + komoditas (pepaya, padi,
alfalfa, labu), + sifat (toleran virus

Jumlah negara dan luas tanaman transgenik

( James 1996-2006)
Tahun

Jumlah negara

Luas (juta ha)

1996

6

1.7

1997

8

11.0

1998

8

27.8

1999

14

39.9

2000

13

44.2

2001

13

52.6

2002

16

58.7

2003

18

67.7

2004

20

81.0

2005

21

90.0

2006

22

102.0

Melibatkan > 10 jt petani (90% petani kecil)

Luas tanaman transgenik di dunia,
berdasarkan jenis tanaman
No

Crop

2002
(% )

2005
(million ha)

%

2006
(million ha)

%

1

Soybean

62

54.4

50

58.6

57

2

Maize

21

21.2

24

25.2

25

3

Cotton

12

9.8

11

13.4

13

4

Canola

5

4.6

5

4.8

5

5

Alfalfa

-

-

-

< 0.1