BAB II TINJAUAN PUSTAKA - STUDI IN VITRO DAN IN SILICO CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D - repository perpustakaan

BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Kanker Payudara Kanker pada dasarnya merupakan sel dengan proliferasi yang tidak terkendali akibat kerusakan gen, utamanya pada regulator daur sel (Sherr, 2000). Daur sel suatu sel kanker pada dasarnya sama dengan sel normal. Dapat di lihat

  pada Gambar 1, yaitu terdapat tiga keadaan: sedang membelah (fase proliferatif), dalam keadaan istirahat (tidak membelah, Go), dan secara permanen tidak membelah. Sel tumor membelah melalui 4 fase, yaitu : fase G1, fase S (Sintesis DNA), fase G2 dan fase M (Foster et al., 2001).

  Gambar 1. Siklus sel (Sherr, 2000)

  Fase G0 (resting stage): Sel belum mulai membelah. Tergantung pada jenis sel, G0 dapat berlangsung dari beberapa jam sampai beberapa tahun. Ketika sel mendapat sinyal untuk mereproduksi, bergerak ke fase G1. Fase G1: Selama fase ini, sel mulai membuat lebih banyak protein dan bertambah besar, sehingga sel-sel baru akan menjadi ukuran normal. Fase ini berlangsung sekitar 18 sampai 30 jam. Fase S: Pada fase S, kromosom yang mengandung kode genetik (DNA) yang dapat disalin sehingga kedua sel-sel baru yang terbentuk akan memiliki untai DNA yang cocok. Fase S berlangsung sekitar 18 sampai 20 jam. Fase G2: Pada fase G2, sel mempersiapkan DNA untuk memulai membelah menjadi 2 sel. Fase ini berlangsung dari 2 sampai 10 jam. Fase M (mitosis): Pada fase ini, berlangsung hanya 30 sampai 60 menit, sel sebenarnya terbagi menjadi 2 sel-sel baru (American Cancer Society, 2013).

  Kasus penyakit kanker yang ditemukan di Provinsi Jawa Tengah pada tahun 2007 sebesar 22.167 kasus, terdiri dari kanker servik 7.715 kasus (34,61%), kanker payudara 11.310 kasus (51,04%), kanker hati 2.130 kasus (9,61%), dan kanker paru-paru 1.006 kasus (4,54%) (Anggorowati, 2013).

  Kanker payudara adalah tumor ganas yang berada di sel-sel payudara yang merupakan kumpulan dari sel-sel kanker yang dapat tumbuh dan menyerang ke dalam jaringan sekitarnya atau dapat menyebar ke dalam tubuh lainnya. Pada kebanyakan kanker payudara di mulai pada sel-sel yang melapisi lobulus, sementara sejumlah kecil lainnya di jaringan lain. Pertumbuhan sel kanker berbeda dari pertumbuhan sel normal. Sel-sel kanker terus tumbuh dan membentuk sel baru, yaitu sel-sel yang abnormal. Sel-sel kanker juga dapat menyerang jaringan lain, tumbuh di luar kendali, menyerang, kemudian merusak jaringan lain dan mulai membuat sel-sel kanker (American Cancer Society, 2013).

  Kejadian penyakit kanker payudara meningkat dengan bertambahnya umur. Ini juga menjadi salah satu faktor resiko pencetus kanker payudara. Selain itu faktor resiko lain dari penyakit kanker payudara antara lain: faktor endokrin, faktor genetika, faktor lingkungan dan pola hidup (Dipiro et al., 2008).

B. Sel T47D

  Sel T47D merupakan cell line yang pertama kali di isolasi dari wanita penderita kanker payudara dengan tumor duktal payudara. Sel ini sering di pakai dalam kanker in vitro oleh karena mudah penanganannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi, serta mudah diganti dengan stok beku jika terjadi kontaminasi (Burdall et al., 2003). Sel T47D memiliki morfologi seperti sel epitel. Sel ini di kulturkan dalam media DMEM + 10% FBS + 2 mM L-Glutamin, di inkubasi dalam CO inkubator 5% dan suhu

  2 37º Sel T47D memiliki karakteristik ER (Estrogen Reseptor)/PR (Progesteron Reseptor)-positif. Secara molekular, sel mengalami mutasi pada p53, sehingga sel kehilangan kontrol pada regulasi cell cyclenya (Nurani, 2012). Sel T47D merupakan sel yang sensitif terhadap doxorubicin (Zampieri et al., 2002). Morfologi sel kanker T47D dapat di lihat pada Gambar 2.

  Gambar 2. Morfologi Sel T47D yang diperoleh dari website ATCC (www.atcc.org) C. Kokemoterapi

  Pengobatan penyakit kanker payudara meliputi: operasi, kemoterapi, radioterapi, terapi hormonal, dan terapi target. Salah satu cara pengobatan kanker payudara yang masih menjadi pilihan utama adalah dengan agen kemoterapi. Kemoterapi merupakan pengobatan kanker dengan menggunakan bahan kimia yang mempunyai efek menghambat atau mematikan sel kanker. Namun karena biaya yang tinggi, hasil yang tidak memuaskan, dan multi drugs resistance maka penelitian baru tentang antikanker sangat diperlukan (Suyatno dan Pasaribu, 2010).

  Selain resistensi, masalah lain yang timbul pada kasus penggunaan obat kemoterapi adalah efek toksik pada sel normal, akibat penghambatan sel normal yang aktif membelah. Efek samping dari penggunaan agen kemoterapi ini yaitu dapat menyebabkan penurunan sel darah yang sering terjadi disertai sariawan, mencret-mencret, rambut rontok, mual dan muntah (American Cancer Society,

  2013). Hingga efek khusus seperti kardiotoksik juga dapat terjadi (Tjay dan Rahardja, 2010).

  Pengobatan dengan agen kemoterapi masih menjadi salah satu terapi untuk kanker, namun pasien akan mengalami efek samping obat, inilah yang masih menjadi permasalahan yang tak kunjung tuntas. Dengan melihat prevalensi kanker payudara di Indonesia yang cukup tinggi (Oemiati et al., 2011), menjadikan kanker payudara menjadi salah satu permasalahan kesehatan yang perlu diprioritaskan untuk ditangani.

  Pada pengobatan kanker sering digunakan beberapa obat. Kombinasi obat tersebut merupakan agen-agen yang memiliki efek sinergis melawan sel kanker namun dengan efek toksik seminimal mungkin sehingga secara klinik akan lebih efisien di dibandingkan dengan agen tunggal. Sampai saat ini belum ada terapi pengobatan untuk kanker payudara yang telah metastasis. Meskipun telah banyak agen sitotoksik yang digunakan dalam pengobatan penyakit ini, tetapi penggunaannya dibatasi oleh adanya efek samping sel kanker terhadap obat. Selain itu, agen kemoterapi sering menimbulkan toksisitas yang tinggi terhadap organ normal seperti efek yang ditimbulkan pada agen kemoterapi doxorubicin pada organ jantung. Oleh karenanya pengembangan cara pengobatan baru bagi kanker payudara sangat diperlukan dengan tujuan meningkatkan sensitivitas, menekan resistensi sel kanker dan mengurangi efek samping yang ditimbulkan oleh agen kemoterapi.

  Pada penelitian ini, dilakukan pengujian secara in vitro dengan metode

  

Combination Index (CI) yang merupakan salah satu model uji preklinik untuk

  mengetahui efek dari suatu kombinasi sebagai usaha pendekatan penerapan kombinasi yang bermanfaat secara klinik. Interaksi yang dihasilkan dari suatu kombinasi dapat berupa efek sinergis (efek kombinasi lebih besar daripada aktivitas aditif yang diperkirakan dari masing-masing agen tunggal), aditif, atau antagonis (kebalikan dari efek sinergis) (Reynolds dan Maurer, 2005).

  Doxorubicin merupakan salah satu agen kemoterapi yang masih banyak

  digunakan, tetapi terapi dengan obat ini dapat menimbulkan efek toksik pada sel normal. Seperti pada penelitian oleh Yeh et al pada tahun 2004, efek sampingnya yaitu kardiotoksik, yang dapat menyebabkan disfungsi jantung, kardiomiopati, dan akhirnya gagal jantung yang parah dan kematian. Citrulline berpotensi sebagai agen kemopreventif kanker. Dengan penambahan citrulline ini diharapkan dapat menekan efek samping dari doxorubicin karena citrulline dengan bantuan NO dapat memberikan efek rileksasi otot jantung.

  D.

   Doxorubicin Doxorubicin merupakan obat kemoterapi dari golongan antrasiklin yang diberikan pada berbagai jenis kanker, seperti kanker payudara dan leukemia.

  Doxorubicin merupakan salah satu agen kemoterapi yang banyak digunakan

  dalam terapi kanker. Struktur doxorubicin dapat di lihat pada Gambar 3. Hingga saat ini obat kemoterapi golongan doxorubicin masih merupakan obat pilihan untuk kasus keganasan kelenjar getah bening atau tumor lain. Pemakaian

  doxorubicin selalu meningkat setiap tahunnya, karena doxorubicin mampu (1)

  masuk kedalam DNA dan memperbaiki gangguan dari DNA topoisomerase-II yang dimediasi. (2) perusakan pada membran seluler, DNA dan protein sehingga dapat merusak sel-sel kanker (Gewirtz, 1999).

  

Gambar 3. Struktur doxorubicin (Kostrzewa-Nowak et al., 2005)

  Doxorubicin dapat menyebabkan terjadinya perubahan kardiovaskular

  yang disebabkan karena pembebasan radikal bebas pada waktu metabolisme (Bugger et al., 2010). Kardiotoksisitas doxorubicin berhubungan

  doxorubicin dengan proses oksidasi besi dan formasi radikal bebas (Shi et al., 2011).

  Terjadinya kardiomiopati pada pemakaian doxorubicin kemungkinan terjadi akibat peningkatan produksi oksidan di jantung. Mitokondria diperkirakan merupakan target utama kardiotoksisitas akibat doxorubicin, elektron tunggal ditransfer ke doxorubicin sehingga menyebabkan peningkatan pembentukan radikal oksigen melalui autooksidasi doxorubicin semiquinon. Hidrogen peroksida merupakan penyebab stres oksidatif dan bertanggungjawab pada induksi apoptosis oleh doxorubicin pada sel endotelial dan sel otot jantung. Mitokondria berperan dalam pengaturan apoptosis melalui pembebasan sitokrom c (Bruton et al., 2005).

  Sampai saat ini, belum ditemukan agen kombinasi yang efektif dengan efek toksik pada sel normal yang rendah. Agen kemoterapi tambahan yang diberikan justru menambah efek toksik pada sel normal seperti cardiotoxicity.

  Penggunan terapi doxorubicin dapat menimbulkan efek toksik pada sel normal sehingga tidak spesifik terhadap sel tubuh yang abnormal. Penggunaan agen doxorubicin dapat menyebabkan kardiotoksis (Chan et al., 1999).

  

Doxorubicin dapat menyebabkan kardiotoksisitas pada penggunaan jangka

panjang, hal itu menyebabkan penggunaannya secara klinis menjadi terbatas.

  Prevalensi gangguan fungsi diastolik pada penderita yang mendapat kemoterapi

  

doxorubicin sangat tinggi yaitu sebesar 86,8%, dimana gangguan tersebut

merupakan tanda awal dari gagal jantung kongestif (Martha dan Surianata, 2007).

  Efek samping lain dari doxorubicin adalah penekanan sumsum tulang, mual, muntah, rambut rontok, dan mukositis (Zhang, 2011). Efek samping pada pemakaian kronisnya bersifat ireversibel, termasuk terbentuknya cardiomyopathy dan congestive heart failure (Han et al., 2008). Peningkatan respon klinis dan pengurangan efek samping cenderung lebih baik pada penggunaan kombinasi dengan agen lain di bandingkan penggunaan doxorubicin tunggal (Bruton et al., 2005).

  E.

   Citrulline Citrulline adalah asam amino non esensial dan antioksidan yang pertama

  kali di identifikasi dari jus semangka. Ada tiga bentuk NOS yaitu: neuronal NOS (nNOS) dan endotel NOS (eNOS) adalah enzim yang ada di lokasi subsel yang berbeda dalam kardiomiosit, sedangkan inducible NOS (iNOS) tidak ada di jantung yang sehat tetapi ekspresinya diinduksi oleh mediator pro-inflammatory (Visser et al., 2010).

  Arginin merupakan substrat NOS yang dapat menghasilkan NO (Lameu et

  

al., 2012). eNOS yang berada dalam endotel pembuluh jantung secara alamiah

  memproduksi NO dalam jumlah yang rendah, sehingga apabila eNOS tidak dihambat maka tidak menyebabkan vasokontriksi. Struktur citrulline dapat di lihat pada Gambar 4.

  Gambar 4. Struktur citrulline 2005) Nitrit Oxide (NO) dihasilkan dari L-arginine/L-citrulline melalui sintesis

  enzim nitric oxide synthase (eNOS) yang memainkan peran penting dalam produksi NO dan fungsi paru-paru. NO adalah senyawa yang penting bagi jantung dan pembuluh darah, yang menyebabkan vasodilatasi dan relaksasi otot polos pada organ tubuh lain (Sopi et al., 2012). Pada kardiomiosit, aksi dari NO lebih kompleks karena dapat menginduksi aktivasi dari guanylate cyclase dan memiliki efek berlawanan pada fungsi jantung seperti memicu terjadinya apoptosis dan meningkatkan fungsi dari ventrikel kiri ( Umar dan Arnoud, 2010).

  Suplementasi oral citrulline secara signifikan dapat meningkatkan kadar plasma arginin, yang diindikasikan dapat meningkatkan produksi NO (Orozzo et

  al ., 2010). Citrulline tidak toksik sehingga aman digunakan dalam berbagai pengobatan.

  Dalam berbagai penelitian ditemukan bahwa citrulline dapat digunakan untuk menurunkan toksisitas arginase pada manusia dengan suplemen citrulline pada tikus (Mauldin et al., 2012). Citrulline juga dapat menyembuhkan atherosclerosis pada kelinci (Hayashi et al., 2005).

  Gambar 5. Usulan mekanisme peran siklus L-citrulline/L-arginine dalam regulasi fungsi saluran pernafasan (Sopi et al., 2012).

  Gambar diatas menggabungkan fungsi fisiologi, biokimia, dan mekanisme molekular dimana pada kondisi hyperoxia dapat mengganggu NO-sinyal cGMP dan relaksasi otot polos. NO secara eksogen sering digunakan untuk mencegah efek buruk dari hyperoxia. L-arginine merupakan substrat untuk NOS (Nitric

  Oxide Synthase ) dan arginase. Peningkatan hyperoxia pada jantung akan

  mengaktifkan arginase yang akan mengurangi bioavaibilitas dari L-arginine ke NOS. Terjadi perubahan daur ulang dari L-arginine menjadi L-citrulline dengan melalui enzim Argininosuccinate Synthase (ASL) dan Argininosuccinate Lyase (AAS). Perubahan citrulline dengan pemblokkan NOS (L-NAME) meningkatkan aktivitas arginase pada kondisi hyperoxia dan meningkatkan bioavaibilitas dari L-

  arginine . Garis merah diatas mengindikasikan penghambatan. NO adalah hasil

  dari L-arginine melalui sintesis NOS. Bioavaibilitas dari L-arginine memainkan peran penting dalam produksi NO dan fungsi paru-paru (Sopi et al., 2012).

  Dalam semangka terkandung kalium, magnesium, natrium, zink dan mangan (Janick dan Robert, 2006). Buah semangka mengandung pigmen karotenoid jenis flavonoid yang memberikan warna daging buah merah atau kuning (Prajnanta, 2003). Dalam kulit buah semangka juga terkandung citrulline yang merupakan asam amino non esensial (Lameu et al., 2012). Kandungan

  

citrulline pada kulit buah semangka diketahui dapat meningkatkan sensitivitas

insulin pada pasien diabetes mellitus tipe 2 (Piatti et al., 2012).

  F. soluble Guanylyl Cyclase (sGC) Guanylyl cyclase (GC) adalah enzim yang mengkatalisis pembentukan

guanosine monophosphate (cGMP) dari guanosine triphosphate (GTP). Soluble

  

Guanylyl Cyclase merupakan reseptor dari NO dalam pembuluh darah jantung.

  NO dapat mengaktivasi soluble Guanylate Cyclase (sGC), yaitu suatu reseptor untuk NO di otot polos pembuluh jantung yang dapat menyebabkan vasodilatasi (Arnold et al., 1997: Namara et al., 1980). NO memainkan peran penting dalam regulasi tonus vaskular dan tekanan darah. Ketika dilepaskan dari endotelium (dapat di lihat pada Gambar 6) dalam menanggapi rangsangan fisiologis, NO mengikat bagian heme dari sGC dan meningkatkan pembentukan cGMP dari GTP sehingga terjadi penurunan kalsium intra seluler dan vasodilatasi (Bobby et al., 2012), seperti yang terlihat pada Gambar 7.

  Beberapa asam amino dimediasi oleh aktifitas biologis dengan mengikat reseptor GC dengan cGMP. Asam amino ini melibatkan fungsi dari NO dalam pengendalian fungsi kardiovaskular tetapi dengan mengaktivasi sGC. L-arginine mengalami perubahan daur ulang menjadi L-citrulline. Perubahan dari arginin menjadi citrulline ini mengakibatkan terjadinya vasodilatasi sehingga toksisitas jantung menurun. Ketika NO diproduksi, akan mengaktifkan sGC menjadi cGMP yang menghasilkan efek rileksasi otot jantung.

  Gambar 6. Jalur NO (nitric oxide) dalam menstimulasi guanylyl cyclase yang

dapat menyebabkan relaksasi otot polos jantung. (Bobby et al.,

2012).

  Gambar 7. Mekanisme NO (nitric oxide), dan stimulator sGC (soluble guanylyl cyclase) dalam menstimulasi reduksi heme pada stimulasi cGMP pada penghambatan vasodilatasi dari agregasi dan efek inflamasi pada pembuluh jantung (Bobby et al., 2012)

G. Metode Docking

  Docking adalah salah satu cakupan dari bioinformatika yang digunakan

  terutama untuk tujuan penemuan obat dan memprediksikan apakah suatu molekul dapat berikatan dengan reseptor. Protein dan ligan dirancang secara modelling dan dicari interaksi ikatan sehingga perilaku ligan sebagai inhibitor ataupun agonis dapat diketahui.

  Pengukuran afinitas berdasarkan pada stabilitas energi sistem dan interaksi yang paling stabil memiliki energi bebas yang rendah atau negative. Kompleks protein-ligan alami diperoleh dari Protein Data Bank (PDB) dan proses docking menggunakan perangkat lunak PLANTS. Format PDB merupakan format yang dapat dimengerti baik oleh komputer maupun manusia. Dimana di dalam format ini ditampilkan informasi tentang sumber, sekuens, struktur sekunder, dan juga koordinat tiga dimensi protein. PLANTS adalah program aplikasi molecular

  

docking gratis yang diketahui memiliki kualitas seperti GOLD yang banyak

  digunakan di Eropa dan Amerika. Software ini sederhana dan mudah di aplikasikan. Interaksi antara sebagian besar ligan dengan binding sitenya dapat dijelaskan melalui afinitas ikatan. Semakin tinggi afinitas, maka akan menghasilkan energi ikatan antar molekul yang tinggi (Purnomo, 2011).