TESIS UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER T47D SECARA IN VITRO
TESIS
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA
KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT
BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN
DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER T47D
SECARA IN VITRO
Oleh:
RATIH ANGGRAENI
NIM 127014005
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2014
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA
KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT
BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN
DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER T47D
SECARA IN VITRO
TESIS
Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh
gelar Magister Farmasi pada Fakultas Farmasi
Universitas Sumatera Utara
Oleh:
RATIH ANGGRAENI
NIM 127014005
PROGRAM STUDI MAGISTER FARMASI
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SUMATERA UTARA
MEDAN
2014
LEMBAR PENGESAHAN TESIS
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA
KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT BUAH
ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN DOKSORUBISIN
TERHADAP SEL KANKER T47D SECARA IN VITRO
Oleh:
RATIH ANGGRAENI
NIM 127014005
Medan, Oktober 2014 Menyetujui: Komisi Pembimbing, Komisi Penguji, Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt.
NIP 195311281983031002 NIP 195301011983031004 Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
NIP 195006071979031001 NIP 195103261978022001 Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt.
NIP 195311281983031002 Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.
NIP 195006071979031001 Mengetahui: Disahkan Oleh: Ketua Program Studi, Dekan, Prof. Dr. Karsono, Apt. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt.
NIP 195409091982011001 NIP 195311281983031002
PENGESAHAN TESIS
Nama Mahasiswa : Ratih Anggraeni Nomor Induk Mahasiswa : 127014005 Program Studi : Magister FarmasiJudul Tesis : Uji Aktivitas Antikanker Payudara Kombinasi
Ekstrak n-Heksana dan Etilasetat BuahAndaliman (Zanthoxylum acanthopodium DC.) dengan Doksorubisin terhadap Sel Kanker T47D secara In Vitro
Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Tim Penguji pada hari Selasa tanggal dua puluh satu bulan Oktober tahun dua ribu empat belas.
Mengesahkan: Tim Penguji Tesis Ketua Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt.
Anggota Tim Penguji Tesis : Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.
Prof. Dr. Urip Harahap, Apt. Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt.
SURAT PERNYATAAN
Saya yang bertanda tangan di bawah ini: Nama Mahasiswa : Ratih Anggraeni Nomor Induk Mahasiswa : 127014005 Program Studi : Magister Farmasi Judul Tesis : Uji Aktivitas Antikanker Payudara Kombinasi Ekstrak
n -Heksana dan Etilasetat Buah Andaliman
(Zanthoxylum acanthopodium DC.) dengan Doksorubisin terhadap Sel Kanker T47D secara In
Vitro
Dengan ini menyatakan bahwa tesis yang saya buat adalah hasil karya saya sendiri, bukan plagiat, dan apabila dikemudian hari diketahui tesis saya tersebut plagiat karena kesalahan saya sendiri, maka saya bersedia diberi sanksi apapun oleh Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi USU. Saya tidak akan menuntut pihak manapun atas perbuatan saya tersebut.
Demikianlah surat pernyataan ini saya perbuat dengan sebenarnya dalam keadaan sehat.
Medan, Oktober 2014 Yang membuat pernyataan, Ratih Anggraeni NIM 127014005
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur kehadirat Allah swt. yang telah memberikan nikmat dan karunia yang berlimpah sehingga penulis dapat menyelesaikan perkuliahan dan penelitian hingga tersusunnya tesis yang berjudul Uji Aktivitas Antikanker Payudara
Kombinasi Ekstrak n-Heksana dan Etilasetat Buah Andaliman (Zanthoxylum
acanthopodium DC.) dengan Doksorubisin terhadap Sel Kanker T47D secara In
Vitro . Tesis ini diajukan untuk melengkapi salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Farmasi di Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Pada kesempatan ini, dengan segala kerendahan hati penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Prof. Dr. dr. Syahril Pasaribu, DTMH&H., M.Sc., (CTM)., Sp.A(K)., selaku Rektor Universitas Sumatera Utara.
2. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
3. Prof. Dr. Karsono, Apt., selaku Ketua Program Studi Magister Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara.
4. Prof. Dr. Sumadio Hadisahputra, Apt., dan Prof. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt., selaku pembimbing yang telah membimbing dan memberikan petunjuk serta arahan selama penelitian hingga penulis dapat menyelesaikan tesis ini.
5. Prof. Dr. Urip Harahap, Apt., dan Prof. Dr. Rosidah, M.Si., Apt., selaku penguji yang telah memberikan saran untuk menyempurnakan tesis ini.
6. Dra. Suwarti, M.Si., Apt., selaku Kepala Laboratorium Farmakognosi beserta staf.
7. Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., SU., Ph.D., SpParK., selaku Direktur Pusat Kedokteran Tropis Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada beserta staf.
Penulis juga mengucapkan terima kasih dan penghargaan yang setinggi- tingginya kepada Ayahanda (alm.) Suroso dan Ibunda Agusrina, serta kakak dan abang ipar, dan teristimewa kepada M. Taufik Alfyan yang tiada henti mendoakan dan memberikan semangat dan kasih sayang yang tak ternilai dengan apapun.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Cut Masyithah, Denny Satria, Fitri Yanti, Puji Lestari, Vonna Aulianshah, Mainal Furqan, dan semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah banyak membantu hingga selesainya tesis ini.
Semoga Allah swt. membalas dengan balasan yang berlipat ganda atas kebaikan dan bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari kesempurnaan. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun demi kesempurnaan tesis ini. Akhir kata penulis berharap semoga tesis ini dapat menjadi kontribusi yang bermanfaat bagi ilmu pengetahuan khususnya di bidang farmasi.
Medan, Oktober 2014 Penulis, Ratih Anggraeni NIM 127014005
UJI AKTIVITAS ANTIKANKER PAYUDARA
KOMBINASI EKSTRAK n-HEKSANA DAN ETILASETAT
BUAH ANDALIMAN (Zanthoxylum acanthopodium DC.) DENGAN
DOKSORUBISIN TERHADAP SEL KANKER T47D SECARA IN VITRO
Abstrak
Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang menjadi penyebab kematian terbesar di Indonesia pada wanita. Penggunaan agen kemoterapi doksorubisin merupakan salah satu pengobatan kanker payudara. Doksorubisin dapat menyebabkan resistensi sehingga potensi sitotoksik akan berkurang. Terapi kombinasi dengan obat herbal dapat meningkatkan sensitivitas sel kanker payudara dan meminimalkan efek samping doksorubisin. Penelitian sebelumnya telah melakukan uji tentang efek sitotoksik ekstrak etilasetat buah andaliman terhadap sel MCF-7. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antikanker yang dikandung ekstrak n-heksana (ENBA) dan ekstrak etilasetat (EEABA) buah andaliman serta kombinasi ENBA dan EEABA dengan doksorubisin terhadap sel T47D.
Buah andaliman yang digunakan diperoleh dari Kecamatan Onan Runggu, Kabupaten Samosir, Sumatera Utara. Lalu buah andaliman dibuat menjadi ekstrak melalui maserasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksana, etilasetat, dan etanol.
Pengujian sitotoksik ENBA dan EEABA secara in vitro (nilai IC
50 ) terhadap sel
T47D dan sel Vero menggunakan metode MTT yang kemudian dianalisis menggunakan SPSS 19 lalu dihitung indeks selektivitasnya. Selanjutnya ENBA dan EEABA dikombinasikan dengan doksorubisin. Kombinasi yang paling aktif dilanjutkan untuk uji penghambatan siklus sel dan apoptosis dengan metode flow
cytometry serta efek penekanan ekspresi protein Bcl-2 dan cox-2 dengan metode
imunositokimia terhadap sel T47D.Hasil penelitian menunjukkan bahwa nilai IC
50 ENBA dan EEABA sebesar
30,908 µg/mL dan 24,476 µg/mL. Pengujian dengan sel Vero menunjukkan ENBA dan EEABA selektif terhadap sel T47D. Kombinasi optimum ENBA-doksorubisin
1 50 /
- – dan EEABA-doksorubisin sebesar 20 µg/mL – 25 nM (½ IC
16 IC 50 ) dan 7,5
2
1
µg/mL – 25 nM ( – /
IC /
IC ). Kombinasi ENBA dan EEABA dengan
8
50
16
50
doksorubisin memiliki aktivitas antikanker terhadap sel T47D melalui penghambatan siklus sel pada fase G -G
1 , yaitu sebesar 84,37% dan 80,83% dan apoptosis pada
tahap apoptosis akhir dan nekrosis awal sebesar 69,51% dan 62,94% dikarenakan terjadi penghambatan ekspresi protein Bcl-2 dan cox-2. Kata kunci: kanker payudara, buah andaliman, doksorubisin, sel T47D, sitotoksik,
indeks kombinasi
ANTICANCER ACTIVITIES OF
n-HEXANE EXTRACT AND ETHYLACETATE EXTRACT OF
ANDALIMAN FRUIT (Zanthoxylum acanthopodium DC.)
IN COMBINATION WITH DOXORUBICIN
ON T47D CANCER CELLS IN VITRO
Abstract
Breast cancer is one of cancer variety of the Indonesia's leading cause of death in women. The use of chemotherapeutic agent doxorubicin is one of the breast cancer treatment. Doxorubicin can cause resistance so that the cytotoxic potency will be reduced. Combination therapy with herbal medicines can increase the sensitivity of breast cancer cells and minimize the side effects of doxorubicin. Previous research has tested ethylacetate extract of andaliman fruit’s cytotoxic effect on MCF-7 cells. The purpose of this study to was to determine the anticancer activity of n-hexane extract (ENBA) and ethylacetate extract (EEABA) of andaliman fruit and their combination with doxorubicin on T47D cells.
This study used andaliman fruit from Kecamatan Onan Runggu, Kabupaten Samosir, Sumatera Utara. Extract was made by multilevel maceration with n-hexane, ethylacetate, and ethanol. Cytotoxic effect of EEABA and ENBA was tested in vitro (IC
50 values) on the T47D cells and Vero cells used MTT using SPSS 19 and
calculated selectivity index. Then ENBA and EEABA were combined with doxorubicin. The most active combination was eventually tested on the inhibition of cell cycle and apoptosis by flowcytometry method and suppressive effects of Bcl-2 and cox-2 protein expression by immunocytochemistry method on T47D cells.
The result of this study showed that IC
50 values ENBA and EEABA at 30.908
µg/mL and 24.476 µg/mL. Selectivity test on Vero cells showed that ENBA and EEABA were selective to ward T47D cells. Optimal combination of ENBA-
1 50 /
- – doxorubicin was 20 µg/mL - 25 nM (½ IC
16 IC 50 ) and combination of EEABA-
2
1
- – doxorubicin was 7.5 µg/mL - 25 nM ( /
8 IC 50 /
16 IC 50 ). Combination of ENBA and
EEABA with doxorubicin had anticancer activity to ward T47D cells due to inhibition of cell cycle at G -G phase, amounting to 84.37% and 80.83% and
1
apoptosis in the late stage of apoptosis and early necrosis of 69.51% and 62.94% caused by inhibition of Bcl-2 and cox-2 protein expression. Key words: breast cancer, andaliman fruits, doxorubicin, T47D cells, cytotoxic,
combination index
DAFTAR ISI
Halaman JUDUL ................................................................................................... i LEMBAR PENGESAHAN TESIS ........................................................ iii PENGESAHAN TESIS .......................................................................... iv SURAT PERNYATAAN ....................................................................... v KATA PENGANTAR ............................................................................ vi ABSTRAK ............................................................................................. viii ABSTRACT ........................................................................................... ix DAFTAR ISI .......................................................................................... x DAFTAR TABEL .................................................................................. xv DAFTAR GAMBAR ............................................................................. xvi DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................... xviii BAB I PENDAHULUAN .............................................................. ......
1 1.1 Latar Belakang .........................................................................
1 1.2 Perumusan Masalah .................................................................
5 1.3 Hipotesis ...................................................................................
5 1.4 Tujuan Penelitian .....................................................................
6 1.5 Manfaat Penelitian ..................................................................
6 1.6 Kerangka Pikir Penelitian ........................................................
7 BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................
8 2.1 Siklus Sel ..................................................................................
8 2.1.1 Apoptosis dan proliferasi ..............................................
10
2.2 Kanker ......................................................................................
12 2.2.1 Karsinogenesis ..............................................................
15 2.2.2 Kanker payudara ...........................................................
17 2.2.2.1 Sel T47D ........................................................
20 2.2.3 Sel Vero .........................................................................
21 2.2.4 P-glycoprotein ...............................................................
21 2.3 Penanganan Kanker ..................................................................
24 2.3.1 Penanganan kanker payudara ........................................
25 2.3.1.1 Doksorubisin ...................................................
26 2.3.1.2 Terapi kombinasi ............................................
28 2.4 Tanaman yang Bersifat Antikanker .........................................
29 2.4.1 Andaliman .....................................................................
29
2.4.2 Pengujian sifat antikanker dari berbagai tanaman obat ...............................................................................
32 2.4.2.1 Metode pemisahan ekstraksi ...........................
33 2.4.2.2 Metode pengujian aktivitas antikanker ...........
34 BAB III METODE PENELITIAN .........................................................
40 3.1 Alat ..........................................................................................
40 3.2 Bahan .......................................................................................
41 3.3 Penyiapan Bahan Uji ...............................................................
42 3.4 Pembuatan Pereaksi ................................................................
43 3.5 Pemeriksaan Karateristik Simplisia dan Ekstrak ....................
44 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik dan mikroskopik ..............
44 3.5.2 Penetapan kadar air .....................................................
44 3.5.3 Penetapan kadar sari yang larut dalam air ...................
45
3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol .............
3.8.1 Pembuatan media Roswell Park Memorial Institute (RPMI) .......................................................................
54 3.9.6 Panen sel Vero ............................................................
53 3.9.5 Subkultur sel Vero ......................................................
53 3.9.4 Penumbuhan sel Vero .................................................
52 3.9.3 Panen sel kanker payudara (T47D) .............................
52 3.9.2 Subkultur sel kanker payudara (T47D) .......................
52 3.9.1 Penumbuhan sel kanker payudara (T47D) .................
52 3.9 Penumbuhan Sel .....................................................................
51 3.8.4 Pembuatan media MK-M199 .....................................
50 3.8.3 Pembuatan media M199 .............................................
50 3.8.2 Pembuatan media kultur lengkap (MK-RPMI) ..........
50
46 3.5.5 Penetapan kadar abu total ...........................................
50 3.8 Pembuatan Media ....................................................................
49 3.7 Sterilisasi Alat dan Bahan .......................................................
49 3.6.7 Pemeriksaan antrakuinon ............................................
49 3.6.6 Pemeriksaan steroid/triterpenoid ................................
49 3.6.5 Pemeriksaan tanin .......................................................
48 3.6.4 Pemeriksaan saponin ..................................................
48 3.6.3 Pemeriksaan glikosida ................................................
47 3.6.2 Pemeriksaan flavonoid ................................................
47 3.6.1 Pemeriksaan alkaloid ..................................................
47 3.6 Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak .............................
46 3.5.6 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam .....
54
3.9.7 Penghitungan sel T47D dan sel Vero .........................
54 3.10 Pembuatan Larutan Uji .........................................................
55 3.11 Pengujian Sitotoksik ..............................................................
56 3.11.1 Pengujian sitotoksik terhadap sel Vero .......................
56 3.11.2 Pengujian sitotoksik terhadap sel T47D .....................
57 3.11.3 Analisis Hasil ..............................................................
57 3.11.4 Indeks Selektivitas ......................................................
58
3.12 Uji Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin terhadap Sel T47D ..........................................
58
3.13 Pengujian Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin terhadap Apoptosis dan Siklus Sel Sel T47D ...................................... ........................................
60
3.14 Pengujian Kombinasi Ekstrak Buah Andaliman dengan Doksorubisin dalam Penghambatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Cox-2 terhadap Sel T47D ....................................
61 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...............................................
63 4.1 Identifikasi Tumbuhan ..........................................................
63 4.2 Karakteristik Simplisia dan Ekstrak ......................................
63 4.3 Hasil Skrining Fitokimia Simplisia dan Ekstrak ...................
67
4.4 Efek Sitotoksik ENBA dan EEABA terhadap Sel Vero dan Sel T47D ................................................................................
69 4.4.1 Efek sitotoksik terhadap sel Vero ...............................
69 4.4.2 Efek sitotoksik terhadap sel T47D ..............................
69
4.4.3 Pengaruh Selektivitas ENBA dan EEABA terhadap Sel Vero dan Sel T47D ................................................
70
4.5 Hasil Pengujian Kombinasi ENBA dan EEABA dengan Doksorubisin terhadap Sel T47D ...........................................
71
4.6 Pengaruh Kombinasi ENBA dan EEABA dengan Doksorubisin terhadap Apoptosis Sel T47D .........................
73
4.7 Pengaruh Kombinasi ENBA dan EEABA dengan Doksorubisin terhadap Siklus Sel T47D ................................
78
4.8 Pengaruh Kombinasi ENBA dan EEABA dengan Doksorubisin dalam Penghambatan Ekspresi Protein Bcl-2 dan Cox-2 terhadap Sel T47D ...............................................
81 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................
87 5.1 Kesimpulan ............................................................................
87 5.2 Saran .......................................................................................
88 DAFTAR PUSTAKA ............................................................................
89 LAMPIRAN ........................................................................................... 101
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1 Beberapa tumbuhan yang berpotensi sebagai antikanker .....
30 Tabel 2.2 Interpretasi nilai CI (Combination Index) .............................
36 Tabel 4.1 Hasil karakteristik simplisia dan ekstrak buah andaliman ....
66 Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia simplisia dan ekstrak buah andaliman ..............................................................................
68 Tabel 4.3 Nilai indeks selektivitas (IS) ENBA dan EEABA ................
71 Tabel 4.4 Nilai indeks kombinasi ENBA-doksorubisin dan EEABA-doksorubisin ...........................................................
72 Tabel 4.5 Pengaruh tunggal ENBA, tunggal EEABA, tunggal doksorubisin, kombinasi ENBA-doksorubisin dan EEABA-doksorubisin terhadap apoptosis sel T47D .............
76 Tabel 4.6 Pengaruh kombinasi ENBA-doksorubisin dan EEABA-doksorubisin terhadap siklus sel T47D ...................
79 Tabel 4.7 Hasil pengujian penghambatan ekspresi protein Bcl-2 ..........
81 Tabel 4.8 Hasil pengujian penghambatan ekspresi protein cox-2 ..........
84
DAFTAR GAMBAR
69 Gambar 4.5 Apoptosis sel T47D kontrol ............................................
78 Gambar 4.13 Siklus sel T47D kombinasi ENBA-doksorubisin ............
76 Gambar 4.12 Siklus sel T47D kontrol ...................................................
75 Gambar 4.11 Persentase jumlah sel yang diberi perlakuan tunggal ENBA, tunggal EEABA, tunggal doksorubisin, kombinasi ENBA-doksorubisin dan EEABA-doksorubisin terhadap apoptosis sel T47D ...........................................
75 Gambar 4.10 Apoptosis sel T47D kombinasi EEABA-doksorubisin ...
75 Gambar 4.9 Apoptosis sel T47D kombinasi ENBA-doksorubisin .....
74 Gambar 4.8 Apoptosis sel T47D tunggal doksorubisin ......................
74 Gambar 4.7 Apoptosis sel T47D tunggal EEABA ..............................
74 Gambar 4.6 Apoptosis sel T47D tunggal ENBA ................................
65 Gambar 4.4 Korelasi antara konsentrasi larutan uji dengan efek toksik yang ditimbulkan terhadap sel T47D ...................
Halaman Gambar 1.1 Diagram kerangka pikir penelitian ..................................
64 Gambar 4.3 Gambar mikroskopik simplisia buah andaliman .............
63 Gambar 4.2 Simplisia buah andaliman ...............................................
55 Gambar 4.1 Buah andaliman segar .....................................................
37 Gambar 3.1 Hemositometer ................................................................
35 Gambar 2.4 Skema alat flow cytometer ...............................................
27 Gambar 2.3 Reduksi MTT menjadi formazan ....................................
23 Gambar 2.2 Struktur kimia doksorubisin ............................................
7 Gambar 2.1 Mekanisme pemompaan oleh Pgp ...................................
79
Gambar 4.14 Siklus sel T47D kombinasi EEABA-doksorubisin .........79 Gambar 4.15 Ekspresi protein Bcl-2 dengan berbagai perlakuan .........
82 Gambar 4.16 Ekspresi protein cox-2 dengan berbagai perlakuan .........
85