BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN - EFEKTIVITAS VARIASI FORMULA JENIS KONSORSIUM BAKTERI DAN WAKTU INKUBASI TERHADAP DEGRADASI HERBISIDA PARAQUAT Repository - UNAIR REPOSITORY

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui formulasi terbaik dari bakteri

  pendegradasi paraguat pada tanah yang terpapar herbisida paraquat (gramoxone) dengan data hasil penelitian sebagai berikut:

  1. Tipe interaksi bakteri penyusun konsorsium.

  2. Waktu inkubasi berpengaruh terhadap % degradasi paraquat pada variasi waktu inkubasi.

  3. Formulasi bakteri berpengaruh terhadap % degradasi paraquat pada variasi formulas bakteri.

  4. Kombinasi waktu inkubasi dan formulasi bakteri berpengaruh terhadap % degradasi paraquat pada kombinasi waktu inkubasi dan formulasi bakteri.

  5. Kombinasi waktu inkubasi dan formulasi bakteri terbaik dalam mendegradasi paraquat.

  Uraian hasil penelitian secara lengkap adalah sebagai berikut:

4.1 Tipe Interaksi Bakteri Penyusun Konsorsium

  Hasil uji interaksi bakteri penyusun konsorsium menunjukkan bahwa adanya hubungan sinergis antar bakteri penyusun konsorsium dalam mendegradasi paraquat di tanah dan tidak ditemukan adanya hubungan antagonis, karena tidak terbentuknya zona halo. Formulasi yang menunjukkan h u b u n g a n s i n e r g i s diambil sebagai kandidat terpilih dalam mendegradasi paraquat. Berdasarkan hasil pengamatan di Laboratorium Mikrobiologi, Program Studi Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Airlangga ditemukan 3 bakteri penyusun konsorsium yaitu pq1, pq4 dan pq6. Tiga isolat bakteri pendegradasi paraquat

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  ditunjukkan pada Gambar 4.1 dan Gambar 4.2.

  

pq1 pq4 pq6

Gambar 4.1. Tiga isolat bakteri pendegradasi paraquat

  Ketiga isolat yang terdapat pada Gambar 4.1. di atas merupakan kandidat terpilih untuk dilakukan uji antagonis dan sinergis dalam formulasi bakteri pendegradai paraquat di tanah. Formulasi dari bakteri yang digunakan untuk mendegradasi paraquat dapat dilihat pada Gambar 4.2.

Gambar 4.2. Formulasi bakteri pendegradasi paraquat

  Berdasarkan Gambar 4.2. di atas, dapat dilihat hasil isolat sampel pq1, pq4 dan pq6 setelah dimurnikan dalam media NA miring maka ketiga isolat ini selanjutnya diformulasi untuk melihat apakah ketiga isolat ini sinergis atau antagonis, dalam uji formulasi ketiga bakteri ini tidak menunjukkan adanya hubungan antagonis, tetapi pq1 sinergis terhadap pq4 dan pq6, pq4 sinergis terhadap pq1 dan pq6, pq6 sinergis terhadap pq1 dan pq4, selanjutnya formulasi bakteri ini digunakan untuk mendegradasi paraquat di tanah.

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  Formulasi konsorsium bakteri pq1, pq4, dan pq6 memiliki karakteristik morfologi yang berbeda-beda saat direaksikan dengan pewarnaan Gram. Adapun karakteristik mikroskopik formulasi konsorsium bakteri pq1, pq4, dan pq6 setelah direaksikan dengan pewarnaan Gram ditunjukkan pada Tabel 4.1.

Tabel 4.1 Karakteristik Morfologi Koloni Bakteri dan Karakteristik Mikroskopis Sel Bakteri Pendegradasi Paraquat yang Direaksikan dengan Pewarnaan Gram, Diamati pada Pembesaran 1000x.

  

Kode

Uraian No

  Isolat Gambar

  a. Karakteristik makroskopis bakteri

• Ukurannya Sedang

  Warnanya putih susu

• pq1
• 1 Bentunya bulat

  b. Karakteristik Mikroskopis bakteri

• Gram negatif

  2.95 µm

• Bentuk sel coccus berantai

  a. Karakteristik makroskopis bakteri

• Ukurannya Besar

  Warnanya krem

• pq4
• 2 Bentuknya Bulat

  b. Karakteristik Mikroskopis bakteri

• Gram negatif

  3,85 µm

• Bentuk sel Batang berantai

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  a. Karakteristik makroskopis bakteri

• Ukuran Sedang
• Warnanya putih susu
• Bentuknya Bulat
• Gram positif
• Bentuk sel coccus pq6

  b. Karakterisitik mikroskopis bakteri

  6 H2S - - -

  0,98 µm

  12 Urease + - -

  11 Indole - - -

  10 ONPG - + -

  9 Xylose - + -

  8 Mannitol - + -

  7 Glucose - + -

  5 Ornithine - + -

  Berdasarkan data pada Tabel 4.1 tentang karakteristik morfologi koloni bakteri dan karakteristik mikroskopis sel bakteri pendegradasi paraquat yang direaksikan dengan pewarnaan Gram, diamati pada pembesaran 1000x, ditemukan adanya perbedaan dan persaman antara tiap bakteri yang diuji.

  4 Lysine - - +

  3

  2 Motilitas + - -

  1 Oxidase + - +

Tabel 4.2. Hasil Pengamatan Karakteristik Fisiologis Isolat pq1, pq4, pq6 No. Karakteristik Hasil Pengamatan pq1 pq4 pq6

  GNB 12A dan 12B) dan Identifikasi bakteri menggunakan buku Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt, J.G. 1994, William & Wilkins Baltimore) dapat dilihat pada Tabel 4.2 dan Tabel 4.3

  

TM

  Hasil pengamatan karakteristik fisiologis isolat pq1, pq4, pq6 menggunakan Microbact Identification Kits (Microbact

  3 Nitrate + + +

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  13 VP

  14 Citrate

  15 TDA

  16 Gelatin

  17 Malonate

  18 Inositol

  19 Sorbitol - - -

  20 Rhamnose

  21 Sucrose

• 22 Lactose

  23 Arabinose

  24 Adonitol

  25 Raffinose - - -

  26 Salicin

  27 Arginine

• 28 Pewarnaan Gram

  29 Bentuk Batang Batang Bulat

Tabel 4.3. Hasil Pengamatan Identifikasi Isolat pq1, pq4, pq6 Nama Isolat Bakteri Klasifikasi pq1 pq4 pq6

  Filum Proteobacteria Proteobacteria Actinobacteria Kelas Gamma Proteobacteria Gamma Actinobacteria proteobacteria Ordo Pseudomonadales Pseudomonadales Actinomycetales Family Pseudomonadaceace Moraxellaceace Micrococcaceae Genus Pseudomonas Acinetobacter sp

  Micrococcus

  Spesies Pseudomonas stutzeri Acinetobacter sp Micrococcus sp Berdasarkan hasil pengamatan pada Tabel 4.2 dan Tabel 4.3 tentang hasil uji dengan menggunakan Kit dan identifikasi bakteri. Hasil identifikasi menunjukkan bahwa isolat pq1, bakteri teridentifikasi spesies Pseudomonas stutzeri dengan persen probability 99,42 %. pq4 teridentifikasi sebagai spesies Acinetobacter sp. dengan persen probability 82,76 %. pq6 teridentifikasi sebagai spesies Micrococcus sp. dengan persen probability 81,82 %.

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.2. Pengaruh Waktu Inkubasi terhadap Degradasi Paraquat.

  49

  76.4

  20

  40

  60

  80 100

  3

  5

  7 % de g ra da si

  Waktu Inkubasi (hari) pq4pq6

  60.8

  31.3

  68.1

  20

  40

  60

  80 100

  3

  5

  7 % de g ra da si

  Waktu Inkubasi (hari) pq1pq4pq6

  68.5

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa waktu inkubasi berpengaruh terhadap degradasi paraquat di tanah, diantaranya waktu 7 hari pada formulasi bakteri pq1pq4 mampu mendegradasi paraquat sebesar 53,3%, pada waktu 7 hari pada formulasi bakteri pq1pq6 mampu mendegradasi sebesar 56,3%, pada waktu 7 harI formulasi bakteri pq4pq6 mampu mendegradasi sebesar 76,4%, sedangkan pada waktu 7 hari formulasi bakteri pq1pq4pq6 mampu mendegradasi sebesar 68,1%. Hal ini menunjukkan bahwa waktu inkubasi 7 hari berpengaruh terhadap degradasi paraquat.

Gambar 4.3. Persentase waktu inkubasi dalam mendegradasi paraquat di tanah dengan konsentrasi 40 ppm paraquat.

  5

  Uji statisitik selanjutnya dilakukan untuk mengetahui pengaruh waktu inkubasi terhadap degradasi paraquat dengan menggunakan uji Anova satu arah. Berdasarkan hasil uji Anova, nilai signifikansi yang didapat adalah 0,01 (<0,05) yang artinya H ditolak dengan nilai F (Anova) 8.924 . Hasil Uji Anova menunjukkan bahwa ada

  39.3

  42.6

  53.3

  20

  40

  60

  80 100

  3

  7 % de g ra da si

  7 % de g ra da si

  Waktu Inkubasi (hari) pq1pq4

  30

  55.3

  56.3

  20

  40

  60

  80 100

  3

  5

  Waktu Inkubasi (hari) pq1pq6

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  5

  20

  30

  40

  50

  60

  70

  80

  90 100

  5.4

  %degradasi TPC perlakuan TPC kontrol

  5.8

  6.2

  6.6

  7

  3

  5

  7 % d eg ra d as ai T

  P C ( C F U/m L ) pq1pq4

  %degradasi TPC perlakuan TPC kontrol

  10

  pengaruh waktu inkubasi terhadap degradasi paraquat. Uji lanjutan menggunakan uji

  

Duncan menunjukkan bahwa ada beda nyata antara waktu inkubasi terhadap degradasi

4.3 Pengaruh Formulasi Bakteri terhadap Degradasi Paraquat.

  60

  paraquat dimana waktu inkubasi hari ke-3 berbeda nyata dengan hari ke-5 dan hari ke-7 sedangkan hari ke-7 dan hari ke-5 tidak berbeda nyata. (lampiran 8.a)

  Hasil penelitian pengaruh formulasi bakteri terhadap degradasi paraquat di tanah, menunjukkan bahwa formulasi bakteri dari isolat pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6, dan pq1pq4pq6 mampu tumbuh baik dalam media kultur N-free tanpa paraquat (kontrol) dan yang mengandung 40 ppm paraquat dengan mengamati respon pertumbuhan. Pengamatan dilakukan mulai dari hari ke-0, 3, 5, dan 7. Respon pertumbuhan formulasi bakteri ditinjau berdasarkan perhitungan nilai Log Total

  Plate Count (TPC). Pertumbuhan formulasi bakteri (Log TPC CFU/mL) pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6, dan pq1pq4pq6 ditunjukkan pada Gambar 4.4.

  10

  20

  30

  40

  50

  70

  7 % d eg ra d as i T

  80

  90 100

  5

  5.4

  5.8

  6.2

  6.6

  7

  3

  5

  P C ( C F U/m L ) pq1pq6

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  pq1pq4pq6 pq4pq6

)

  7 100 )

  7 100

L

L

  6.6

  80

  6.6

80 U/m

  U/m i

F

F i as

  

C

C as d

  

(

( 6.2 60 d

  6.2

  60 ra C C ra

P

  P eg

T

eg

  T d

  5.8

  40

  5.8

  40 d % %

  5.4

  20

  5.4

  20

  5

  5

  3

  5

  7

  3

  5

  7 %degradasi TPC perlakuan TPC kontrol %degradasi TPC perlakuan TPC kontrol

Gambar 4.4 Pertumbuhan formulasi bakteri (Log TPC CFU/mL) dan persentase degradasi pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6, dan pq1pq4pq6 pada media kultur N-

  free dengan konsentrasi paraquat 40 ppm.

Gambar 4.4 menunjukkan bahwa formulasi bakteri dapat menggunakan paraquat sebagai substrat pertumbuhannya. Respon pertumbuhan formulasi bakteri pq1pq4 yaitu

  ditandai dengan pertambahan jumlah sel bakteri melalui perhitungan Total Plate Count (TPC) dari hari ke-0 sampai hari ke-3 menunjukkan fase eksponensial dan mengalami fase stasioner di hari ke-5 dan menurun di hari ke-7 dan mendegradasi paraquat sebesar 53.3%. Pada hari ke-7 mengalami penurunan karena beberapa bakteri mengalami fase kematian karena kurangnya nutrisi, ketersediaan oksigen dan pH. Formulasi bakteri pq1pq6 dari hari ke-0 sampai hari ke-5 menunjukkan fase eksponensial, dan di hari ke-7 mengalami penurunan dan mendegradasi paraquat sebesar 56,3%. Formulasi bakteri pq4pq6 dari hari ke-0 sampai hari ke-3 menunjukkan fase eksponensial, hari ke 5 mengalami peningkatan dan menurun di hari ke-7 dan mendegradasi paraquat sebesar 76,4%. Formulasi bakteri pq1pq4pq6 dari hari ke-0 sampai hari ke-5 menunjukkan fase eksponensial dan mengalami penurunan di hari ke-7 dan mendegradasi paraquat sebesar 68,1%. Analisis statistik uji homogenitas menunjukkan bahwa kelompok data homogen dengan signifikansi 0,081 (>0,05) sehingga dapat dilanjutkan ke uji anova. Hasil uji anova menunjukkan bahwa jenis isolat tidak berpengaruh signifikan terhadap degradasi

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  paraquat (sig. 0.156), sehingga tidak dapat dilanjutkan ke uji Duncan untuk mengetahui beda nyata antar kelompok jenis isolat (lampiran 8.b).

  Formulasi bakteri pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6 dan pq1pq4pq6 pada hari ke-7 menunjukkan penurunan jumlah formulasi bakteri. Hal ini disebabkan karena pada waktu inkubasi 7 hari bakteri mengalami fase kematian karena berkurangnya nutrisi. Formulasi bakteri pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6, dan pq1pq4pq6 menggunakan paraquat sebagai sumber nutrisi dalam proses pertumbuhan karena jumlah sel bakteri lebih besar dibandingkan dengan kontrol tanpa penambahan paraquat. Kecepatan pembelahan sel dan waktu generasi formulasi bakteri pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6, dan pq1pq4pq6 ditunjukkan pada Tabel 4.4.

Tabel 4.4 Kecepatan pembelahan sel dan waktu generasi formulasi bakteri pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6, dan pq1pq4pq6 pada media kultur N-free

  dengan konsentrasi paraquat 40 ppm Kecepatan pembelahan (jumlah Waktu generasi Isolat bakteri pembelahan sel/jam) (jam)

  pq1pq4

  0.02

  50 pq1pq6 0.01 100 pq4pq6

  4.2

  0.23 pq1pq4pq6

  0.02

  50 Berdasarkan respon pertumbuhan dan waktu generasi dapat diketahui bahwa formulasi bakteri menunjukkan kemampuan dalam mengurai struktur paraquat dan menggunakan paraquat sebagai satu-satunya sumber nitrogen untuk pertumbuhan bakteri. Kecepatan pembelahan sel dari fomulasi pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6, dan pq1pq4pq6 (Tabel 4.4) dalam kultur media N-free yang mengandung 40 ppm paraquat. Pada umumnya pertumbuhan mikroba melalui empat fase secara berurutan yaitu fase lag, fase log, fase stasioner dan fase kematian, pada penelitian ini formulasi bakteri mengalami penurunan di hari ke-7. Menurut Madigan et al, (2012) waktu generasi dari setiap bakteri berbeda-beda, karena kemampuan dalam memanfaatkan sumber nutrisi

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

4.4 Kombinasi waktu inkubasi dan formulasi bakteri berpengaruh terhadap degradasi paraquat.

  6

  20

  7

  6.5

  6

  5.5

  80 100

  % de g ra da si waktu inkubasi (hari) pq4pq6

  dalam kultur pertumbuhan tidak sama, dalam kondisi medium kaya nutrisi, minimal yang dimiliki oleh kebanyakan bakteri sekitar 0.5-6 jam untuk pembelahan sel.

  5.5

  7

  6.5

  60

  20

  40

  60

  80 100

  3

  5

  7 T P C (CF U/m L )

  % de g ra da si waktu inkubasi (hari) pq1pq4pq6

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi waktu inkubasi dan formulasi bakteri berpengaruh terhadap degradasi paraquat di tanah, diantaranya formulasi bakteri pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6 dan pq1pq4pq6 mampu mendegradasi paraquat dalam media kultur N-free. Kemampuan biodegradasi dari konsorsium ini, diketahui melalui analisis dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 300 nm dengan waktu pengamatan mulai dari hari ke 0, 3, 5, dan hari ke 7 yang disajikan pada Gambar 4.5

  40

• 20

  5

  60

  5.5

  6

  6.5

  7

  20

  40

  80 100

  % degradasi konsorsium bakteri

  3

  5

  7 T P C (CF U/m L )

  % de g ra da si waktu inkubasi (hari) pq1pq6

  % degradasi konsorsium bakteri

Gambar 4.5. Persentase biodegradasi oleh formulasi bakteri pq1pq4, pq1pq6, pq4pq6 dan pq1pq4pq6 pada konsentrasi 40 ppm paraquat dan lama waktu inkubasi.

  5

  5

  3

  5

  5

  7 T P C (CF U/m L )

  % degradasi konsorsium bakteri

  % de g ra da si waktu inkubasi (hari) pq1pq4

  5

  7 T P C (CF U/m L )

  3

  5.5

  80 100

  60

  40

  20

  7

  6.5

  6

  % degradasi konsorsium bakteri

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa formulasi bakteri, kombinasi waktu inkubasi berpengaruh terhadap degradasi paraquat di tanah yang ditunjukkan oleh formulasi bakteri pq4pq6 sebesar 76.4% dengan waktu inkubasi 7 hari, diikuti pq1pq4pq6 sebesar 68.1% dengan waktu inkubasi 7 hari, pq1pq6 56.3% dengan waktu inkubasi 7 hari, pq1pq4 53.3% dengan waktu inkubasi 7 hari. Persentasi degradasi tertinggi ditunjukkan oleh pq4pq6 sebesar 76.4% Menurut Jadhav et al.,(2008), konsorsium merupakan campuran populasi mikroba dalam bentuk komunitas yang mempunyai hubungan kooperatif, komensal,dan mutualistik. Sistem pengolahan yang menggunakan campuran kultur mikroba akan memberikan hasil yang lebih efektif dibandingkan kultur murni karena adanya aktivitas katabolic kultur bakteri yang saling melengkapi satu sama lain dan produk dekomposisi yang dihasilkan dari suatu kultur dapat digunakan oleh kultur lain untuk proses dekomposisi selanjutnya sehingga dapat membantu peningkatan oksidasi bahan organik limbah cair.

  Penggunaan konsorsium mikroba cenderung memberikan hasil yang lebih baik dibandingkan penggunaan isolat tunggal, kerja enzim dari tiap jenis mikroba dapat saling melengkapi untuk dapat bertahan hidup menggunakan sumber nutrient yang tersedia. Di alam terdapat banyak mikroba indigenous dengan kekhasan metabolisme dan kometabolisme yang dapat dimanfaatkan untuk mendegradasi suatu materi terutama senyawa organik. Suatu senyawa dengan susunan yang kompleks dan heterogen menyebabkan suatu spesies tunggal mikroba tidak dapat mendegradasi keseluruhan komponen penyusunnya sehingga diperlukan suatu interaksi yang saling menguntungkan dalam bentuk konsorsium (Nugroho, 2007)

  Uji statistik menggunakan Two-Way Analysis of Varians (ANOVA) menunjukkan bahwa ada pengaruh kombinasi waktu inkubasi dan formulasi bakteri berpengaruh terhadap degradasi paraquat di tanah, dengan nilai signifikansi yang

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  didapat adalah 0,009 (<0,05) yang artinya H ditolak dengan nilai F (Anova) 3.183 (lampiran 8.c)

4.5 Kombinasi waktu inkubasi dan formulasi bakteri yang terbaik dalam mendegradasi paraquat.

  Hasil penelitian menunjukkan bahwa kombinasi waktu inkubasi dan formulasi bakteri yang terbaik dalam mendegradasi paraquat ditunjukkan pada Gambar 4.6.

  

pq4pq6

100

  6

  90

  5

  80 i

  70 76.4 as

  4

  60

  68.5 ad

  50

  3 H p egr

  40 d

  2

  30 %

  31.3

  20

  1

  10

  3

  5

  7 waktu inkubasi (hari)

  %degradasi pH

Gambar 4.6. Persentase waktu inkubasi dan formulasi bakteri pq4pq6 dalam mendegradasi paraquat dengan konsentrasi 40 ppm paraquatGambar 4.6 menunjukkan bahwa peningkatan degradasi paraquat diiringi oleh pertumbuhan formulasi bakteri yaitu pq4pq6 yang mampu mendegradasi paraquat di

  tanah sebesar 76.4 % dengan waktu inkubasi selama 7 hari. Hal ini terjadi karena formulasi bakteri ini memanfaatkan paraquat sebagai sumber nutrisinya dengan bertambahnya jumlah sel bakteri dan bertambahnya waktu inkubasi. Menurut Maier et

  

al. (2000) dan Prescott et al (2003) aktivitas seluler suatu bakteri senantiasa

  dipengaruhi oleh ketersediaan nutrisi pada medium tumbuh serta lama waktu inkubasi. Jika nutrisi pada medium tersedia dalam jumlah yang besar maka aktivitas pertumbuhan sel akan berlangsung dalam jumlah yang banyak, namun ketika nutrisi

ADLN_PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

  tersedia dalam jumlah sedikit maka aktivitas pertumbuhan sel akan sedikit walaupun waktu inkubasi masih tersedia. hasil uji anova dua arah dari interaksi jenis isolat dan waktu inkubasi menunjukkan bahwa tidak ada pengaruh yang signifikan antara keduanya terhadap degradasi paraquat. Hal ini ditunjukkan dengan signifikansi interakasi kedua kelompok tersebut yang bernilai 0,496 (>0,05). Hasil yang signifikan hanya ditunjukkan oleh pengaruh waktu inkubasi terhadap degradasi paraquat, dengan nilai signifikansi 0,01 (<0,05), sementara nilai signifikansi sebesar 0,055 didapatkan dari uji pengaruh jenis isolat terhadap degradasi paraquat yang berarti tidak signifikan.

  Selama proses biodegradasi pH berperan penting, pada formulasi pq4pq6 menunjukkan nilai pH 4 dengan waktu inkubasi 7 dan 3 hari seperti nilai pH awal sedangkan pada waktu inkubasi 5 hari menunjukkan pH 5. Penelitian yang dilakukan oleh Anderson dan Elizabeth (1971) menunjukkan bahwa pH optimum degradasi paraquat dalam media kultul N-free antara 4,2-5,4 oleh Lipomyces starkeyi. Menurut Singh (2014) ada beberapa faktor yang mempengaruhi efektivitas degradasi mikroba terhadap herbisida yaitu ukuran inokulum, jumlah penambahan co-substrat karbon dan nitrogen, bahan organik dan pH.