Characterization and activity assay of Nitrous Oxide (N2O) reducing denitrifier isolated from rice soils

KARAKTERISASI DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI
DENITRIFIKASI PEREDUKSI DINITROGEN
OKSIDA (N2O) YANG DIISOLASI
DARI TANAH SAWAH

RATNA SETYANINGSIH

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

2

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN
SUMBER INFORMASI
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi Karakterisasi dan Uji
Aktivitas Bakteri Denitrifikasi Pereduksi Dinitrogen Oksida (N2O) yang Diisolasi
dari Tanah Sawah adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan
belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir disertasi.

Bogor, April 2011
Ratna Setyaningsih
NIM G361060041

3

ABSTRACT
RATNA SETYANINGSIH. Characterization and Activity Assay of Nitrous
Oxide (N2O) Reducing Denitrifier Isolated from Rice Soils. Under direction of
IMAN RUSMANA, PRIHASTO SETYANTO and ANTONIUS SUWANTO.
Nitrous oxide (N2O) is one of the main greenhouse gases and rice fields
are among major contributors of this ozone depleting agent. Soil denitrifiers
possessing high N2O reduction activity are important for controlling N2O
emission. Nitrous oxide reduction is the last step of denitrification process. The
aim of this study was to isolate denitrifying bacteria from rice soils possessing
high ability of N2O reduction and potential in reducing N2O emission.
Soil samples were collected from 6 locations of rice fields in Bogor (West

Java) and Tangerang (Banten), Indonesia. Bacteria were isolated through
enrichment culture supplemented with NO3-. Measurement of growth and N2O
reduction activity were conducted by growing bacterial isolates in medium with
N2O as a sole terminal electron acceptor. Physiological characterization and
identification were performed using API 20NE while molecular identification was
conducted based on 16S rRNA gene sequence. nosZ gene was analyzed by
cloning and sequencing. N2O emission activity was carried out using rice soil
slurry experiment.
It was found that 10 isolates of denitrifying bacteria could grow on N2O.
The bacterial growth indicated by optical density (OD) increased up to 0.12-0.47.
During 5 days incubation, isolate BL1, BL2 and BLN1 reduced N2O up to 4.09,
5.41 and 3.91 µmol mL-1 bacterial cultures respectively. BL1, BL2 and BLN1
grew well in medium supplemented with 900, 1380 and 1979 µM N2O but did not
grow well with 88 µM N2O in medium during 10 hours, this facts indicated that
the isolates consumed N2O during their growth. Maximum growth rate (µmax)
using N2O and Monod constant (Ks) of BL1, BL2 and BLN1 were 0.21 h-1 and
102.3 µM h-1, 0.23 h-1 and 213.3 µM h-1, 0.18 h-1 and 172.4 µM h-1 respectively.
N2O reduction rate of BL1, BL2 and BLN1 were 0.26, 0.28 and 0.43 µmol mL-1
h-1 respectively. N2O reduction proceeded along with growth. Based on the API
20NE assay, 3 isolates showed different physiological characteristics on

hydrolysis of esculine and P-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside and also for the
assimilation of potassium gluconate and trisodium citrate. From its physiological
characteristics, BLN1 was identified as Ochrobactrum anthropi with 99.9%
similarity, while BL1 and BL2 were not identified. Based on their 16S rRNA
sequence, BL1, BL2 and BLN1 were closely related to Ochrobactrum anthropi
ATCC 49188 with similarity of 99, 95 and 98% respectively. Analysis of nosZ
gene did not give the expected result. BLN1 isolate reduced the dissolved N2O
concentration in surface water from 32.12 to 12.94 nmol L-1 after 6 hours
supplementation of 0.6 mmol NO3-.
Keyword: denitrifier, N2O reduction, rice soil

4

RINGKASAN
RATNA SETYANINGSIH. Karakterisasi dan Uji Aktivitas Bakteri Denitrifikasi
Pereduksi Dinitrogen Oksida (N2O) yang Diisolasi dari Tanah Sawah. Di bawah
bimbingan IMAN RUSMANA, PRIHASTO SETYANTO dan ANTONIUS
SUWANTO.
Perubahan iklim yang disebabkan oleh gas-gas rumah kaca merupakan
masalah global yang penting selama beberapa dekade terakhir ini. Pengurangan

emisi gas-gas rumah kaca menjadi kajian pokok dalam banyak pertemuan tingkat
internasional yang berkaitan dengan perubahan iklim. Pengurangan emisi
dilakukan di berbagai sektor termasuk pertanian. Lahan pertanian termasuk sawah
merupakan salah satu sumber emisi gas-gas rumah kaca seperti metana (CH4) dan
dinitrogen oksida (N2O). Sebagai negara agraris dengan sebagian besar penduduk
mengkonsumsi beras sebagai bahan makanan pokok, masalah emisi gas-gas
rumah kaca dari lahan sawah di Indonesia menjadi penting terutama upaya
pencegahannya.
Gas dinitrogen oksida (N2O) merupakan salah satu gas rumah kaca yang
juga dapat menyebabkan kerusakan lapisan ozon di stratosfer. Gas ini memiliki
potensi pemanasan global 298 kali lebih besar dibandingkan dengan CO2. Masa
tinggal N2O di atmosfer selama 114 tahun, jauh lebih tinggi dari pada CH4 dengan
masa tinggal selama 12 tahun. Konsentrasi N2O di atmosfer meningkat dari 314
ppb pada tahun 1998 menjadi 319 ppb pada tahun 2005.
Lebih dari sepertiga emisi total N2O berasal dari aktivitas manusia
(antropogenik). Lahan pertanian termasuk sawah merupakan sumber N2O
antropogenik terbesar. Emisi N2O dari lahan pertanian sebesar 2.8 TgN per tahun
atau 15.82% dari total emisi N2O. Emisi N2O dari lahan pertanian meningkat
dengan adanya peningkatan penggunaan pupuk nitrogen, fiksasi gas dinitrogen
dari udara dan pengendapan senyawa-senyawa nitrogen.

Emisi N2O dari tanah berasal dari N2O yang diproduksi dalam tanah.
Produksi N2O dalam tanah terutama melalui dua proses mikrobiologis yaitu
denitrifikasi dan nitrifikasi. Beberapa faktor lingkungan seperti ketersediaan
oksigen (O2) dan N serta kandungan bahan organik dan air tanah mempengaruhi
produksi N2O yang berakibat berpengaruh pula terhadap emisi N2O. Selain faktor
lingkungan, komunitas mikroba dalam tanah mempengaruhi pula produksi dan
emisi N2O.
Komunitas bakteri merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap
tingkat emisi N2O dari suatu ekosistem. Oleh karena itu, salah satu usaha yang
dapat dilakukan untuk menurunkan emisi N2O adalah dengan memodifikasi
komposisi komunitas atau dominansi bakteri di lingkungan tersebut. Penambahan
isolat bakteri yang memiliki aktivitas mereduksi N2O tinggi diharapkan dapat
menurunkan tingkat emisi N2O.
Reduksi N2O merupakan tahap akhir proses denitrifikasi. Meskipun
demikian tidak semua bakteri denitrifikasi dapat mereduksi N2O dan tidak semua
bakteri pereduksi N2O dapat mereduksi N2O yang ada di luar selnya (eksogen).
Beberapa galur bakteri pereduksi N2O lebih efisien menggunakan N2O yang
dihasilkannya sendiri (endogen) untuk pertumbuhan dibandingkan dengan
menggunakan N2O eksogen. Ketahanan dan tingkat kemampuan bakteri

5

mereduksi N2O juga berbeda-beda dan dipengaruhi oleh faktor lingkungan
terutama O2.
Meskipun penelitian tentang bakteri denitrifikasi yang memiliki
kemampuan mereduksi N2O telah banyak dilakukan, namun belum ada penelitian
yang mengarah kepada pemanfaatan bakteri denitrifikasi untuk menurunkan
produksi dan emisi N2O. Bakteri yang memiliki aktivitas tinggi mereduksi N2O
eksogen berpotensi untuk mengurangi N2O di lingkungan. Penelitian ini
dilakukan untuk pengembangan isolat bakteri denitrifikasi asal tanah sawah di
Indonesia yang memiliki aktivitas tinggi dalam mereduksi N2O untuk
menurunkan emisi N2O dari lahan sawah.
Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan isolat-isolat bakteri
denitrifikasi dari tanah sawah yang memiliki kemampuan tinggi mereduksi N2O
dan berpotensi menurunkan emisi N2O. Tujuan tersebut dicapai melalui beberapa
tahap kegiatan penelitian yaitu: 1) mengisolasi bakteri denitrifikasi dari tanah
sawah yang memiliki kemampuan mereduksi N2O 2) mengukur pertumbuhan dan
aktivitas reduksi N2O 3) mengidentifikasi isolat-isolat 4) menganalisis gen nosZ
penyandi enzim N2O reduktase dan 5) menguji kemampuan isolat terpilih dalam
menurunkan emisi N2O di tanah sawah.

Penelitian berlangsung mulai September 2007 sampai dengan Juli 2010.
Sampel tanah sawah diambil dari enam lokasi yang berada di Kabupaten Bogor,
Kota Bogor dan Kota Tangerang. Penelitian sebagian besar dilakukan di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor (IPB), Bogor. Sebagian penelitian
dilaksanakan di Microbial Ecology Laboratories, Department of Biological
Sciences, University of Essex, United Kingdom. Gas N2O diukur menggunakan
kromatografi gas di Laboratorium Bioteknologi Tanah Departemen Ilmu Tanah
dan Sumber Daya Lahan IPB dan Laboratorium Balai Penelitian Lingkungan
Pertanian, Jakenan, Pati. Sekuensing dilakukan di Research and Development
Center Biotechnology Department PT Charoen Pokphand Indonesia dan 1st BASE
Pte Ltd Singapura.
Sampel tanah sawah digunakan sebagai sumber isolat. Bakteri diisolasi
dari biakan pengkayaan mengandung NO3- selanjutnya dilakukan uji
oksidatif/fermentatif. Isolat yang bersifat oksidatif digunakan untuk penelitian
tahap selanjutnya yaitu uji reduksi NO3- dan akumulasi NO2- untuk memastikan
bahwa bakteri yang diisolasi adalah bakteri denitrifikasi. Selanjutnya bakteri
diseleksi berdasarkan pertumbuhan dan aktivitas reduksi N2O. Bakteri yang
memiliki aktivitas tinggi mereduksi N2O selanjutnya diukur kinetika
pertumbuhannya menggunakan N2O dan kecepatannya mereduksi N2O. Tahap

berikutnya adalah karakterisasi dan identifikasi bakteri secara morfologis,
fisiologis dan molekuler serta analisis molekuler gen nosZ penyandi enzim N2O
reduktase. Tahap terakhir adalah uji penurunan emisi N2O menggunakan tanah
sawah.
Sepuluh isolat bakteri denitrifikasi yang didapatkan dari enam lokasi
sawah mampu mereduksi NO3- berkisar 883.7-1164.5 µM dengan akumulasi NO2sebesar 3.2-11.7 µM jika ditumbuhkan selama 3 hari pada suhu ruang (28-30°C).
Sepuluh isolat tersebut semuanya dapat tumbuh dalam biakan dengan N2O
sebagai satu-satunya penerima elektron. Tiga isolat yang mereduksi N2O paling

6

banyak selama 5 hari adalah BL2, BL1 dan BLN1 yang masing-masing mereduksi
N2O sebesar 5.41, 4.09 dan 3.91 µmol mL-1 biakan.
Tiga isolat yang diuji lebih lanjut yaitu BL1, BL2 dan BLN1 tumbuh baik
dalam biakan dengan konsentrasi N2O terlarut dalam medium sebesar 900, 1380
dan 1979 µM tetapi tidak tumbuh baik dalam biakan dengan konsentrasi N2O 88
µM yang menunjukkan bahwa bakteri tumbuh menggunakan N2O. Kecepatan
pertumbuhan maksimum menggunakan N2O (µmax) dan konstanta Monod (Ks) dari
isolat BL1 sebesar 0.21 jam-1 dan 102.3 µM jam-1, BL2 0.23 jam-1 dan 213.3 µM
jam-1, BLN1 0.18 jam-1 dan 172.4 µM jam-1. Isolat BL1, BL2 dan BLN1 memiliki

kecepatan reduksi N2O masing-masing sebesar 0.26, 0.28 dan 0.43 µmol mL-1
jam-1. Reduksi N2O berlangsung seiring dengan pertumbuhan.
Isolat BL2 memiliki perbedaan bentuk koloni dengan BL1 dan BLN1.
Berdasarkan uji menggunakan API 20NE, di antara ketiga isolat terdapat
perbedaan sifat fisiologis dalam hal hidrolisis eskulin dan P-nitrofenil-β-Dgalaktopiranosida serta asimilasi potasium glukonat dan trisodium sitrat.
Identifikasi berdasarkan sifat-sifat fisiologis memberikan hasil bahwa isolat BLN1
memiliki kemiripan 99.9% dengan Ochrobactrum anthropi sedangkan isolat BL1
dan BL2 tidak teridentifikasi. Berdasarkan analisis 16S rRNA, isolat BL1, BL2
dan BLN1 masing-masing memiliki kemiripan sebesar 99, 95 dan 98% dengan
Ochrobactrum anthropi ATCC 49188. Dengan demikian tiga isolat yang
ditemukan dapat disebut sebagai bakteri O. anthropi BL1, Ochrobactrum sp. BL2
dan O. anthropi BLN1. Analisis terhadap gen nosZ belum memberikan hasil yang
diharapkan.
Penambahan isolat BLN1 dapat mengurangi konsentrasi N2O yang terlarut
dalam air permukaan dari 31.12 menjadi 12.94 nmol L-1 pada jam ke-6 setelah
penambahan 0.6 mmol NO3-. Emisi N2O ke udara tidak dipengaruhi penambahan
isolat BLN1.
Kata kunci: bakteri denitrifikasi, reduksi N2O, tanah sawah

7

© Hak Cipta milik IPB, tahun 2011
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
yang wajar IPB.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh Karya tulis
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB.

8

KARAKTERISASI DAN UJI AKTIVITAS BAKTERI
DENITRIFIKASI PEREDUKSI DINITROGEN
OKSIDA (N2O) YANG DIISOLASI
DARI TANAH SAWAH

RATNA SETYANINGSIH

Disertasi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Departemen Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2011

9

Judul Disertasi

Nama
NIM

: Karakterisasi dan Uji Aktivitas Bakteri Denitrifikasi
Pereduksi Dinitrogen Oksida (N2O) yang Diisolasi dari
Tanah Sawah
: Ratna Setyaningsih
: G361060041

Disetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
Ketua

Dr. Ir. Prihasto Setyanto, M.Sc.
Anggota

Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto M.Sc.
Anggota

Mengetahui
Ketua Program Studi Biologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dedy Duryadi Solihin, DEA

Dr. Ir. Dahrul Syah, M.Sc.Agr

Tanggal Ujian: 5 April 2011

Tanggal Lulus:

10

Penguji pada Ujian Tertutup : Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si
Dr. Rahayu Widyastuti, M.Sc

Penguji pada Ujian Terbuka : Dr. rer. nat. Sarjiya Antonius
Dr. Ibnul Qayim

11

PRAKATA
Puji Tuhan atas kasih dan pertolonganNya sehingga karya ilmiah ini dapat
diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan dari September 2007 sampai Juli 2010
ini berjudul Karakterisasi dan Uji Aktivitas Bakteri Denitrifikasi Pereduksi
Dinitrogen Oksida (N2O) yang Diisolasi dari Tanah Sawah.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si.,
Bapak Dr. Ir. Prihasto Setyanto, M.Sc dan Bapak Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto,
M.Sc. selaku pembimbing yang telah memberikan banyak bimbingan dan arahan.
Selain itu juga terima kasih kepada Dr. Nisa Rachmania Mubarik M.Si. dan Dr.
Rahayu Widyastuti M.Sc. sebagai penguji pada ujian tertutup serta Dr. rer. nat.
Sarjiya Antonius dan Dr. Ibnul Qayim sebagai penguji pada ujian terbuka.
Ungkapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada Rektor Universitas Sebelas
Maret Surakarta yang telah memberikan tugas belajar serta Institut Pertanian
Bogor (IPB) yang telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk menempuh
studi di Program Doktor Sekolah Pascasarjana. Juga ucapan terima kasih penulis
sampaikan kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Departemen Pendidikan
Nasional atas biaya pendidikan dan penelitian melalui Beasiswa Bantuan Program
Pascasarjana dan Program Sandwich. Selain itu penulis menyampaikan
penghargaan kepada Prof. David B. Nedwell yang telah memberikan bimbingan
dan ijin penelitian selama penulis melaksanakan penelitian yang merupakan
bagian dari disertasi melalui Program Sandwich di Microbial Ecology
Laboratories, Department of Biological Sciences, University of Essex, Colchester,
United Kingdom. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada orang
tua serta kakak-kakak dan adik yang telah memberikan dukungan doa, serta
teman-teman di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IPB atas kerjasamanya.

Bogor, April 2011
Ratna Setyaningsih

12

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Surakarta pada tanggal 14 Juli 1966 sebagai anak
ketiga dari empat bersaudara pasangan Bapak Sihiman dan Ibu Koesmarsini.
Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Biologi Lingkungan Fakultas Biologi
Universitas Gadjah Mada Yogyakarta, lulus tahun 1992. Selanjutnya dari
universitas yang sama penulis mendapatkan gelar Magister Sains Program Studi
Biologi pada tahun 2001. Penulis melanjutkan pendidikan Program Doktor di
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor sejak tahun 2006.
Penulis bekerja sebagai dosen di Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Sebelas Maret Surakarta sejak tahun 1999.
Penulis menekuni bidang Mikrobiologi dengan spesialisasi Mikrobiologi
Lingkungan. Selama mengikuti Program Doktor penulis telah menulis artikel pada
jurnal Microbiology Indonesia Volume 4 Nomor 2 dengan judul Physiologycal
Characterization and Molecular Identification of Denitrifying Bacteria Possesing
Nitrous Oxide High Reduction Activity Isolated from Rice Soils dan
menyampaikan makalah berjudul The Growth and Nitrous Oxide Reduction
Ability of Denitrifying Bacterium Isolated From Rice Field pada International
Seminar of Indonesian Society for Microbiology, 4-7 Oktober 2010 di Bogor dan
makalah berjudul Reduksi Dinitrogen Oksida (N2O) oleh Isolat-isolat Bakteri
Ochrobactrum yang Diisolasi dari Tanah Sawah pada Seminar Nasional Sains III,
13 November 2010 di Bogor.

13

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL.........................................................................................

15

DAFTAR GAMBAR.....................................................................................

16

DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................

17

PENDAHULUAN
Latar Belakang...................................................................................
Tujuan................................................................................................
Hipotesis............................................................................................
Manfaat Penelitian.............................................................................

18
20
21
21

TINJAUAN PUSTAKA
Gas Rumah Kaca................................................................................
N2O di Atmosfer................................................................................
Jalur-jalur Pembentukan N2O............................................................
Denitrifikasi pada Bakteri..................................................................
Enzim-enzim dan Gen-gen yang Berperan dalam Proses
Denitrifikasi.......................................................................................
Reduksi N2O......................................................................................
Keanekaragaman dan Penyebaran Bakteri Denitrifikasi...................
Faktor-faktor yang Mempengaruhi Emisi N2O dari Tanah...............
Emisi N2O di Sawah..........................................................................
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian............................................................
Bahan.................................................................................................
Isolasi Bakteri....................................................................................
Pembuatan Inokulum.........................................................................
Uji Oksidatif/Fermentatif...................................................................
Pengukuran Reduksi NO3-.................................................................
Pengukuran Akumulasi NO2-.............................................................
Seleksi Berdasarkan Pertumbuhan dan Kemampuan Mereduksi
N2O....................................................................................................
Pengukuran Kinetika Pertumbuhan Menggunakan N2O...................
Pengukuran Kecepatan Reduksi N2O dan Pertumbuhan...................
Karakterisasi dan Identifikasi Bakteri................................................
Analisis Molekuler Gen nosZ............................................................
Uji Penurunan Emisi N2O.................................................................

22
22
23
25
26
30
32
34
35

37
38
38
39
39
40
41
41
42
43
44
46
48

HASIL
Isolat-isolat yang Didapatkan............................................................
Kemampuan Bakteri Mereduksi NO3- dan Mengakumulasi NO2-....
Pertumbuhan Bakteri dan Kemampuan Mereduksi N2O...................

50
51
52

14

Kinetika Pertumbuhan Bakteri Menggunakan N2O..........................
Kecepatan Reduksi N2O dan Pertumbuhan.......................................
Karakter dan Identitas Bakteri...........................................................
Gen nosZ............................................................................................
N2O di Udara.....................................................................................
N2O di Air Permukaan.......................................................................

53
57
59
62
64
65

PEMBAHASAN............................................................................................

67

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan............................................................................................
Saran..................................................................................................

78
78

DAFTAR PUSTAKA....................................................................................

80

LAMPIRAN...................................................................................................

93

15

DAFTAR TABEL
Halaman
1 Jumlah isolat bakteri yang didapatkan dari tanah sawah di daerah
Bogor dan Tangerang .............................................................................
2 Kemampuan isolat-isolat bakteri mereduksi NO3- dan mengakumulasi
NO2 pada inkubasi selama 3 hari ............................................................
3 Pertumbuhan isolat-isolat bakteri dan reduksi N2O setelah diinkubasi
selama 5 hari............................................................................................
4 Kecepatan pertumbuhan maksimum (µmax) dan konstanta Monod (Ks)
isolat BL1, BL2 dan BLN1 ....................................................................
5 Kecepatan reduksi N2O (vred), kecepatan pertumbuhan spesifik (µ) dan
waktu generasi (g) isolat BL1, BL2 dan BLN1.......................................
6 Karakter fisiologis isolat BL1, BL2 dan BLN1 berdasarkan API 20NE.
7 Perbandingan hasil identifikasi menggunakan API 20NE dan sekuen
16S rRNA dari isolat BL1, BL2 dan BLN1 .............................................
8 Emisi N2O tanpa dan dengan penambahan isolat BLN1 setelah
penambahan 0.6 mmol NO3-....................................................................
9 Peningkatan konsentrasi N2O di air permukaan tanpa dan dengan
penambahan isolat BLN1 setelah penambahan 0.6 mmol NO3-..............

51
52
53
55
57
60
61
65
66

16

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

11

12
13
14

Transformasi N yang menghasilkan N2O yaitu jalur (1) denitrifikasi,
(2) reduksi NO3- disimilatif menjadi NH4+ (DNRA) dan (3) nitrifikasi.
Transformasi nitrogen oleh mikroba ......................................................
Organisasi dan tempat terjadinya rantai pemindahan elektron pada
P. stutzeri ................................................................................................
Bagan alir penelitian ...............................................................................
Uji penurunan emisi N2O menggunakan sedimen tanah sawah..............
Pola pertumbuhan isolat BL1, BL2 dan BLN1 dalam biakan dengan
konsentrasi N2O terlarut 88, 900, 1380 dan 1979 µM ...........................
Plot Hanes dari isolat BL1, BL2 dan BLN1 yang ditumbuhkan
menggunakan N2O ..................................................................................
Pertumbuhan dan aktivitas reduksi N2O isolat BL1, BL2 dan BLN1.....
Koloni isolat BL1, BL2 dan BLN1 yang ditumbuhkan di permukaan
medium denitrifikasi agar-agar ..............................................................
Gel agarosa yang menunjukkan pita potongan DNA dari gen penyandi
16S rRNA hasil amplifikasi PCR menggunakan primer 63F dan
1387R.......................................................................................................
Pohon filogenetik dari potongan gen penyandi 16S rRNA (700 basa)
isolat BL1, BL2 dan BLN1 serta beberapa bakteri anggota filum
Proteobacteria.........................................................................................
Gel agarosa yang menunjukkan pita potongan DNA hasil amplifikasi
PCR menggunakan primer nosZ661fF dan nosZ1773R.........................
Banyaknya N2O di udara tanpa dan dengan penambahan isolat BLN1
setelah penambahan 0.6 mmol NO3-........................................................
Konsentrasi N2O di air permukaan tanpa dan dengan penambahan
isolat BLN1 setelah penambahan 0.6 mmol NO3-...................................

25
26
27
37
49
54
56
58
59

61

62
63
65
66

17

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1

2
3
4
5
6
7
8

9
10
11
12

Sampel tanah, biakan pengkayaan, medium dan tabung untuk
seleksi pertumbuhan dan kemampuan mereduksi N2O, dan uji emisi
N2O menggunakan tanah sawah..............................................................
Bahan kimia untuk analisis, bufer dan medium ......................................
Kurva standar.. ........................................................................................
Jenis dan tekstur tanah sampel.................................................................
Uji API 20NE..........................................................................................
Hasil BLASTN sekuen 16S rRNA..........................................................
Urutan basa dari pita potongan DNA yang diduga sebagai gen nosZ.
Pita merupakan hasil PCR dengan suhu penempelan 56 °C....................
Hasil BLASTX urutan basa dari pita potongan DNA yang diduga
sebagai gen nosZ. Pita merupakan hasil PCR dengan suhu penempelan
56 °C........................................................................................................
Hasil kloning............................................................................................
Hasil BLASTX urutan basa dari pita potongan DNA yang diduga
sebagai gen nosZ. Pita merupakan hasil kloning.....................................
Analisis varian.........................................................................................
Penempelan primer..................................................................................

94
96
98
100
101
102
106

108
110
111
113
115

18

PENDAHULUAN

Latar Belakang
Perubahan iklim yang disebabkan oleh gas-gas rumah kaca merupakan
masalah global yang penting selama beberapa dekade terakhir ini. Pengurangan
emisi gas-gas rumah kaca menjadi kajian pokok dalam banyak pertemuan tingkat
internasional yang berkaitan dengan perubahan iklim. Pengurangan emisi
dilakukan di berbagai sektor termasuk pertanian. Lahan pertanian termasuk sawah
merupakan salah satu sumber emisi gas-gas rumah kaca seperti metana (CH4) dan
dinitrogen oksida (N2O). Sebagai negara agraris dengan sebagian besar penduduk
mengkonsumsi beras sebagai bahan makanan pokok, masalah emisi gas-gas
rumah kaca dari lahan sawah di Indonesia menjadi penting terutama upaya
pencegahannya.
Selain merupakan gas rumah kaca, N2O dapat merusak lapisan ozon di
stratosfer (Conrad 1996). Gas ini memiliki potensi pemanasan global 298 kali
lebih besar dibandingkan dengan CO2. Masa tinggal N2O di atmosfer selama 114
tahun, jauh lebih tinggi dari pada CH4 dengan masa tinggal selama 12 tahun.
Konsentrasi N2O di atmosfer meningkat dari 314 ppb pada tahun 1998 menjadi
319 ppb pada tahun 2005 (Forster dan Ramaswamy 2007).
Lebih dari sepertiga emisi total N2O berasal dari aktivitas manusia
(antropogenik) (IPCC 2007). Lahan pertanian merupakan sumber N2O
antropogenik terbesar. Emisi N2O dari lahan pertanian sebesar 2.8 TgN per tahun
atau 15.82 % dari total emisi N2O (Denman dan Brasseur 2007). Emisi N2O dari
lahan pertanian meningkat dengan adanya peningkatan penggunaan pupuk
nitrogen (N) (Freney 1997).
Emisi N2O dari tanah berasal dari N2O yang diproduksi dalam tanah.
Produksi N2O dalam tanah terutama melalui dua proses mikrobiologis yaitu
denitrifikasi dan nitrifikasi. Jika tanah dalam keadaan kering atau teraerasi, N2O
dihasilkan terutama melalui proses nitrifikasi. Sebaliknya jika tanah dalam kondisi
basah atau kurang aerasi, denitrifikasi merupakan proses utama yang
menghasilkan N2O (Davidson et al. 1986; Skiba et al. 1993). Denitrifikasi
berperan sebesar 85-90% mengemisikan N2O pada kondisi tanah jenuh oleh air

19

(Mathieu et al. 2006). Jika pori tanah 35-60% terisi air, emisi N2O terutama
dihasilkan melalui proses nitrifikasi. Emisi N2O melalui proses nitrifikasi dapat
mencapai 81% pada tanah dengan 60% pori terisi air (Bateman dan Baggs 2005).
Di sawah, kondisi tergenang dan kering secara bergantian memacu terbentuknya
N2O melalui denitrifikasi (Garcia dan Tiedje 1981) maupun nitrifikasi (Byrnes et
al. 1993).
Beberapa faktor lingkungan seperti ketersediaan oksigen (O2), nitrogen,
bahan organik dan kandungan air tanah mempengaruhi produksi N2O yang
berakibat berpengaruh pula terhadap emisi N2O (Dobbie dan Smith 2001;
Włodarczyk et al. 2004; Zhao et al. 2009). Selain faktor lingkungan, komunitas
mikroba dalam tanah mempengaruhi pula produksi dan emisi N2O (Chèneby
1998; Holtan-Hartwig et al. 2000)
Holtan-Hartwig et al. (2000) membandingkan emisi N2O dari tiga tempat
yang ada di Jerman, Swedia dan Finlandia. Secara in situ, emisi N2O dari lahan di
Swedia lebih rendah (4.0 kg N2O-N ha-1 th-1) dibandingkan dengan Jerman (14.6
kg N2O-N ha-1 th-1) dan Finlandia (8.3 kg N2O-N ha-1 th-1). Hasil pengukuran
terhadap tanah dari tiga tempat tersebut yang telah diseragamkan kondisinya di
laboratorium menunjukkan bahwa tanah yang berasal dari Swedia memiliki rasio
Vmax reduksi NO3- : Vmax reduksi N2O lebih rendah (0.3) dibandingkan sampel
tanah dari Jerman (2.0) dan Finlandia (1.0). Tanah yang lebih sedikit
mengemisikan N2O memiliki rasio Vmax reduksi NO3- : Vmax reduksi N2O lebih
kecil. Rasio Vmax reduksi NO3- : Vmax reduksi N2O di tanah ditentukan oleh
komposisi komunitas mikroba terutama bakteri dalam tanah tersebut.
Komunitas bakteri merupakan salah satu faktor yang berpengaruh terhadap
besarnya emisi N2O dari suatu ekosistem. Dengan demikian, memodifikasi
komposisi komunitas bakteri merupakan salah satu usaha yang diharapkan dapat
menurunkan emisi N2O. Penambahan isolat bakteri yang memiliki aktivitas
mereduksi N2O tinggi diharapkan dapat menekan produksi N2O sehingga
menurunkan tingkat emisinya.
Reduksi N2O merupakan tahap terakhir proses denitrifikasi. Meskipun
demikian tidak semua bakteri denitrifikasi dapat mereduksi N2O. Bakteri
denitrifikasi yang telah diketahui dapat mereduksi N2O menjadi N2 di antaranya

20

adalah Pseudomonas stutzeri (Carlson dan Ingraham 1983), Azospirillum
brasilense (Tibelius dan Knowles 1984), Paracoccus denitrificans (Snyder et al.
1987), P. aeruginosa (Snyder et al. 1987), Rhodobacter sphaeroides (Itoh et al.
1989) serta Bradyrhizobium japonicum (Sameshima-Saito et al. 2006). Di antara
bakteri yang memiliki kemampuan mereduksi N2O, tidak semuanya dapat
mereduksi N2O yang ada di luar selnya (eksogen) (Zumft 1997). Beberapa galur
pereduksi N2O lebih efisien menggunakan N2O yang dihasilkannya sendiri
(endogen)

untuk

pertumbuhan

(Bazylinski

et

al.

1986)

dibandingkan

menggunakan N2O eksogen. Ketahanan dan tingkat kemampuan bakteri
mereduksi N2O juga berbeda di antara galur yang berbeda (Snyder et al. 1987)
dan dipengaruhi oleh faktor lingkungan terutama O2 (Watahiki et al. 1983).
Meskipun penelitian tentang bakteri

denitrifikasi

yang memiliki

kemampuan mereduksi N2O telah banyak dilakukan, namun masih belum ada
penelitian yang mengarah kepada pengembangan potensi dan pemanfaatan isolat
bakteri denitrifikasi untuk menurunkan emisi N2O. Bakteri yang memiliki
aktivitas tinggi mereduksi N2O eksogen berpotensi untuk mengurangi N2O di
lingkungan. Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan isolat bakteri
denitrifikasi asal tanah sawah yang memiliki aktivitas tinggi dalam mereduksi
N2O sehingga akan dapat dimanfaatkan sebagai inokulum untuk menurunkan
emisi N2O dari lahan sawah.

Tujuan
Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan isolat-isolat bakteri
denitrifikasi dari tanah sawah yang memiliki kemampuan tinggi mereduksi N2O
dan berpotensi menurunkan emisi N2O. Tujuan tersebut dicapai melalui beberapa
tahap kegiatan penelitian yaitu: 1) mengisolasi bakteri denitrifikasi dari tanah
sawah yang memiliki kemampuan mereduksi N2O 2) mengukur pertumbuhan dan
aktivitas reduksi N2O 3) mengidentifikasi isolat–isolat 4) menganalisis gen nosZ
penyandi enzim N2O reduktase dan 5) menguji kemampuan isolat terpilih dalam
menurunkan emisi N2O di tanah sawah.

21

Hipotesis
Di antara bakteri-bakteri yang hidup di sawah terdapat bakteri denitrifikasi
yang memiliki kemampuan tinggi mereduksi N2O. Bakteri-bakteri tersebut dapat
diisolasi dan diidentifikasi serta dapat digunakan sebagai inokulum untuk
menurunkan emisi N2O dari tanah sawah.

Manfaat Penelitian
Penelitian ini memberikan informasi awal tentang isolat-isolat bakteri
denitrifikasi asal sawah yang memiliki kemampuan mereduksi N2O, karakter dan
identitasnya. Isolat-isolat bakteri ini, melalui studi lebih lanjut dapat dimanfaatkan
untuk mengurangi emisi N2O dari sawah.

22

TINJAUAN PUSTAKA
Gas Rumah Kaca
Energi radiasi matahari dipancarkan ke bumi terutama dalam bentuk
radiasi dengan panjang gelombang pendek misalnya ultraviolet. Kurang lebih
sepertiga energi dipantulkan oleh bagian atas atmosfer sedangkan sekitar dua
pertiganya diserap permukaan bumi. Bumi memantulkan energi radiasi yang
diterimanya sebagian besar dalam bentuk radiasi infra merah. Radiasi termal yang
dipancarkan oleh bumi diserap oleh atmosfer dan dipancarkan kembali ke bumi,
sehingga menimbulkan efek rumah kaca. Secara alami tanpa efek rumah kaca
suhu bumi akan berada di bawah 0 °C (Le Treut dan Somerville 2007).
Aktivitas manusia menghasilkan emisi empat macam gas-gas rumah kaca
utama yaitu CO2, CH4, N2O dan halokarbon yang mengandung fluorin, klorin dan
bromin. Gas-gas tersebut terakumulasi di atmosfer sehingga konsentrasinya
meningkat sejalan dengan waktu. Peningkatan konsentrasi CO2 disebabkan oleh
penggunaan bahan bakar fosil, alat pengatur suhu ruang dan penebangan hutan.
Peningkatan CH4 antara lain sebagai hasil kegiatan pertanian dan penimbunan
bahan organik, sedangkan emisi N2O meningkat oleh penggunaan pupuk N dan
pembakaran bahan bakar fosil. Halokarbon misalnya klorofluorokarbon
(chlorofluorocarbon=CFC) yang digunakan sebagai bahan pendingin selain
merupakan gas rumah kaca juga dapat merusak ozon (Forster dan Ramaswamy
2007).
Gas-gas rumah kaca memiliki kekuatan radiatif (radiative forcing=RF).
Kekuatan radiatif bernilai positif menyebabkan pemanasan bumi (Forster dan
Ramaswamy 2007). Peningkatan kekuatan radiatif atmosfer bumi menyebabkan
perubahan iklim secara cepat sehingga dapat mengganggu aktivitas manusia dan
ekosistem alami (Schlesinger 2003).

N2O di Atmosfer
Pada satu abad terakhir ini, aktivitas manusia secara dramatis
meningkatkan emisi dan pelepasan N reaktif ke atmosfer bumi, yaitu sebanyak
tiga sampai lima kali. Gangguan terhadap siklus N mempengaruhi sistem iklim di

23

atmosfer oleh adanya tiga gas N utama yaitu N2O, amonia (NH3) dan NOx (nitrik
oksida (NO) + nitrogen dioksida (NO2)). Aktivitas manusia meningkatkan
pasokan N ke pantai dan laut lepas, menurunkan ketersedian O2 dan emisi N2O.
Meskipun demikian pertanian merupakan sumber N2O antropogenik terbesar
(Denman dan Brasseur 2007).
Dinitrogen oksida memiliki nilai RF positif di urutan keempat terbesar di
antara gas-gas rumah kaca yang memiliki masa tinggal lama (longlife greenhouse
gases=LLGHGs) setelah CO2, CH4 dan CFC-12. Nilai RF N2O sebesar +0,16
Watt m-2 sedangkan nilai total RF dari LLGHGs sebesar +2,63 Watt m-2 (Forster
dan Ramaswamy 2007). Selain merupakan gas rumah kaca, N2O memiliki efek
merusak lapisan ozon (O3) di stratosfer. Sebagian besar (90%) O3 berada di
stratosfer (ketinggian 10-50 km) sedangkan sisanya (10%) di troposfer (0-10 km).
O3 menyerap kuat radiasi ultraviolet terutama pada panjang gelombang antara
200-290 nm. Panas yang diserap oleh O3 menyebabkan suhu maksimum di
ketinggian 50 km (Fraser 1997). Kerusakan O3 di stratosfer disebabkan oleh emisi
uap air dan N oksida dari pesawat jet supersonik, reaksi-reaksi kimia yang terjadi
di stratosfer, difusi klorofluorometan yang digunakan untuk alat pendingin dan
difusi N2O dari troposfer (Knowles 1982).

Jalur-jalur Pembentukan N2O
Lebih kurang sebesar 90% gas N2O secara global dihasilkan dari proses
biotik (Paul dan Clark 1996). Mikroba terutama bakteri berperan penting dalam
menghasilkan N2O, salah satunya melalui proses denitrifikasi. Menurut Zumft
(1997) transformasi N lengkap pada jalur denitrifikasi adalah NO3- → NO2- →
NO → N2O → N2. Denitrifikasi tidak lengkap merupakan proses reduksi NO3yang berakhir pada N2O. Pada umumnya hal tersebut terjadi jika tidak ada enzim
N2O reduktase. Snyder et al. (1987) melaporkan bahwa bakteri yang kehilangan
aktivitas enzim N2O reduktase tidak dapat mereduksi N2O sehingga N2O
merupakan hasil akhir denitrifikasi.
Gas N2O juga dihasilkan sebagai hasil antara proses nitrifikasi. Nitrifikasi
terdiri dari dua tahap proses yang melibatkan dua kelompok mikroba. Kelompok
pertama mengoksidasi NH4+ menjadi NO2- sedangkan kelompok kedua

24

mengoksidasi NO2- menjadi NO3- (Paul dan Clark 1996). Penelitian terhadap
bakteri nitrifikasi Nitrosomonas sp. memberikan hasil bahwa jika nitrifikasi
terjadi pada konsentrasi O2 lebih rendah dari yang dibutuhkan, produksi NO2sedikit dan akan banyak dihasilkan N2O. Gejala yang sama ditunjukkan oleh
bakteri Nitrosolobus, Nitrospira dan Nitrosococcus. Dalam proses oksidasi NH4+
menjadi

NO2-,

hidroksilamin

(NH2OH)

merupakan

hasil

antara.

Pada

Nitrosomonas, radikal nitroksil (HNO) dihasilkan sebagai hasil antara oksidasi
NH2OH menjadi NO2-. Diduga, HNO akan terdekomposisi secara spontan
menjadi N2O (Goreau et al. 1980; Roswall 1981).
Jalur lain yang dapat menghasilkan N2O adalah reduksi NO3- disimilatif
menghasilkan NH4+ (dissimilatory

nitrate reduction to ammonium=DNRA).

Dalam proses DNRA, NO3- direduksi menjadi NO2- dan selanjutnya NO2direduksi menjadi NH4+ dengan N2O sebagai hasil samping (Kelso 1997)
(Gambar 1). Terdapat dua jalur DNRA. Jalur pertama adalah reduksi NO3disimilatif yang berpasangan dengan aliran elektron dari bahan organik untuk
mereduksi NO3- melalui reaksi fermentasi dan proses ini pada umumnya terjadi di
lingkungan dengan NO3- terbatas dan kaya akan C labil (karbon yang bersifat
mudah dirombak). Jalur DNRA yang kedua adalah khemolitoautotrofik, reduksi
NO3- berpasangan dengan oksidasi sulfur (S) dalam bentuk tereduksi (Stark dan
Richards 2008). Proses DNRA dapat menjadi sumber emisi N2O di lingkungan
yang berada dalam keadaan tergenang pada waktu yang lama (Włodarczyk et al.
2004). Childs et al. (2002) menyatakan, bakteri DNRA dapat bersaing dengan
bakteri denitrifikasi di lingkungan dengan NO3- terbatas karena bakteri DNRA
memindahkan elektron lebih banyak ke NO3- yaitu sebanyak delapan elektron per
mol NO3-, dibandingkan bakteri denitrifikasi yang memindahkan lima elektron per
mol NO3-.

25

NO31

NO2

2
-

NO
3

1

N2O

3

2

NH2OH
2

1

3

N2

NH4+

Gambar 1 Transformasi N yang menghasilkan N2O yaitu jalur (1) denitrifikasi,
(2) reduksi NO3- disimilatif menghasilkan NH4+ (DNRA) dan
(3) nitrifikasi (dimodifikasi dari Kelso 1997).

Denitrifikasi pada Bakteri
Nitrogen merupakan salah satu unsur utama penyusun sel. Di alam, N
berada dalam bentuk-bentuk yang memiliki bilangan oksidasi berbeda.
Denitrifikasi merupakan bagian dari siklus transformasi N di alam (Gambar 2).
Nitrogen masuk ke lingkungan kehidupan (biosfer) melalui fiksasi N2 dan keluar
dari biosfer melalui proses denitrifikasi (Zumft 1997).
Pada proses denitrifikasi, bakteri menggunakan N oksida sebagai penerima
elektron terakhir untuk bioenergetik seluler dalam keadaan anaerob, mikroaerofil
atau bahkan dalam kondisi aerob. Denitrifikasi merupakan proses transformasi
secara disimilatif, berhubungan dengan konservasi energi. Pemindahan elektron
secara enzimatik berpasangan dengan sintesis adenosine triphosphate (ATP)
melalui translokasi proton dan pembentukan potensial membran. Terjadinya
denitrifikasi dalam sel dipicu oleh kondisi lingkungan dengan tekanan O2 rendah
dan tersedianya N oksida (Zumft 1997).
Meskipun denitrifikasi pada umumnya berlangsung dalam kondisi anaerob
dan aktivitas enzim-enzim denitrifikasi dihambat oleh O2, beberapa bakteri dapat
melakukan proses denitrifikasi dalam kondisi aerob. Pseudomonas stutzeri SU2

26

mereduksi NO3- menghasilkan N2 tanpa akumulasi NO2- selama 92 jam pada
kondisi konsentrasi O2 di lingkungan 92% dan NO3- yang tereduksi sebanyak
99.24% (Su et al. 2001a). Pada kondisi yang sama Pseudomonas stutzeri NS-2
dan Pseudomonas stutzeri SM-3 mereduksi NO3- menghasilkan N2 hampir tanpa
akumulasi NO2- selama 20 jam (Su et al. 2001b). Thiosphaera pantotropha LMD
82.5 dapat melakukan seluruh proses denitrifikasi dalam kondisi aerob (Van Niel
1992). Pada Thauera mechernichensis DSM12266 reduksi NO3- terjadi dalam
keadaan aerob tetapi N2O terbentuk dalam kondisi anaerob (Scholten et al. 1999).

N2

N2
Nitrifikasi

Fiksasi N2
N organik

Oksidasi amonium

Oksidasi nitrit

NH4+

NO2-

NH2OH

NO3-

OKSIK
NO2-

SUBOKSIK

NO3NO2Denitrifikasi

Remineralisasi

NO
N2O

NH4+

N2

D
e
n
i
t
r
i
f
i
k
a
s
i

Gambar 2 Transformasi nitrogen oleh mikroba (Francis et al. 2007). DNRA:
dissimilatory nitrate reduction to ammonium (reduksi NO3- disimilatif
menghasilkan NH4+), Annamox: anaerobic ammonium oxidation
(oksidasi amonium anaerob).
Enzim-enzim dan Gen-gen yang Berperan dalam Proses Denitrifikasi
Selama proses denitrifikasi yang melibatkan empat tahap reduksi secara
berurutan, beberapa metaloenzim mengkatalisis reduksi NO3- berturut-turut
menjadi NO2-, NO, N2O dan N2. Metaloenzim tersebut adalah NO3- reduktase
(Nar dan Nap), NO2- reduktase (Nir), NO reduktase (Nor) dan N2O reduktase

27

(Nos) (Lalucat et al. 2006). Enzim-enzim tersebut terdapat di membran sitoplasma
atau periplasma (Gambar 3).
Denitrifikasi diawali oleh proses reduksi NO3-. Ada dua tipe enzim yang
mengkatalisis proses ini, yaitu NO3- reduktase respiratif terikat membran (Nar)
dan NO3- reduktase periplasmik (Nap). Nar terekspresi hanya pada kondisi
pertumbuhan anaerob dan dapat mereduksi klorat. Sedangkan Nap disintesis dan
aktif dalam kondisi ada oksigen dan tidak dapat mereduksi klorat (Zumft 1997).

NO2-

NO3-

Periplasma
NO2-

N2O

N2

Nap

CuZ

CuZ

MGD

Nos CuA
CuNos
A

c

Sitc

H+

d1

H+

b
FeS

QH2

QH2
DH

Q

Q

NO2-

NO3

FeS
Sit
bc1

c

NO

N 2O

Sitc
Sit
cb

c

b

Nor

MGD
NADH+H+

-

d1

H+
Sitc

Nar

NO

Nir
C551

Sitc

NO3-

NO2-

NO2-

NAD+

Sitoplasma

Gambar 3 Organisasi dan tempat terjadinya rantai pemindahan elektron pada
P. stutzeri. Komponen rantai respirasi aerob konstitutif terdiri dari
NADH dehidrogenase (DH), siklus quinon (Q, QH2), kompleks
sitokrom bc1 (sit bc1), dan kompleks oksidase terakhir sitokrom cb
(sit cb). Sistem denitrifikasi terdiri dari NO3- reduktase (Nap dan Nar),
NO2- reduktase (Nir), NO reduktase (Nor) dan N2O reduktase
(Nos). Singkatan: FeS, pusat besi-belerang; b, heme b; c, heme c;
d, heme d; sit c, sitokrom tipe c menerima elektron dari kompleks
bc1; sit551, sitokrom c551 (Zumft 1997).

Nar menghasilkan kekuatan mendorong proton (proton motif force=PMF)
yang memungkinkan terjadinya sintesis ATP (Moreno-Vivián 1999). Enzim ini
pada Pseudomonas stutzeri terdiri dari tiga subunit yaitu α, β dan γ. Subunit α
(NarG) merupakan pusat katalitik, terdiri dari molibdenum dan dua kofaktor
pterin (molybdopterin guanine dinucleotide=MGD). Kompleks besi belerang

28

dalam subunit β (NarH) berperan dalam pemindahan elektron dari kelompokan
quinol di membran sel. Subunit γ (NarI) terletak di membran dan merupakan
protein sitokrom b yang mengandung dua gugus heme tipe b (Lalucat et al. 2006).
Pada Pseudomonas aeruginosa narG, narH dan narI merupakan bagian dari
operon narK1K2GHJI (Schreiber et al. 2007). Pada Pseudomonas stutzeri terdapat
tambahan gen narC yang bersama-sama dengan narK menyandi protein yang
diduga merupakan pembawa (Lalucat et al. 2006). Selain itu terdapat gen-gen
pengendali untuk Nar yaitu anr, dnr dan narXL (Härtig et al. 1999; Schreiber et
al. 2007). Aktivitas Nar dihambat oleh azida, klorat, sianida dan tiosianat
(Moreno-Vivián 1999).
Nap hanya dimiliki oleh bakteri Gram negatif (Philippot 2005). Peran
fisiologis Nap adalah membuang kekuatan pereduksi yang berlebihan dan
menghasilkan NO2- untuk denitrifikasi aerob (Zumft 1997). Nap tersusun dari
subunit katalitik NapA yang mengandung kofaktor molibdopterin dan [4Fe-4S]
serta subunit NapB yang mengandung dua heme tipe c. Kompleks NapAB terletak
di periplasmik, menerima elektron dari NapC yang terikat membran. NapC
mengandung empat heme tipe c dan diduga berperan dalam pemindahan elektron
antara quinol dan Nap (Bedmar et al. 2005; Philippot 2005; Lalucat et al. 2006).
Gen-gen penyandi Nap pada beberapa bakteri tergabung dalam operon
napEDABC. Produk napD adalah protein yang dapat larut dan diasumsikan
berperan dalam pematangan NapB. Sedangkan napE menyandi protein
transmembran yang belum diketahui fungsinya (Bedmar et al. 2004). Aktivitas
Nar maupun Nap dikendalikan oleh NO3- melalui protein sensor narX dan narQ
(Stewart 2003).
Reduksi NO2- menjadi NO merupakan tahap yang menentukan untuk
terjadinya jalur denitrifikasi. NO yang dihasilkan dapat digunakan sebagai
substrat hanya oleh NO reduktase dan harus segera dikeluarkan dari sel karena
NO bersifat toksik bahkan pada konsentrasi yang sangat rendah (Baker et al.
1998). Enzim NO2- reduktase (Nir) terletak di periplasma. Aktivitas reduksi NO2pada bakteri denitrifikasi terjadi oleh dua metaloenzim. Kedua enzim tersebut
berbeda dalam hal struktur dan senyawa-senyawa logam prostetik yang
dimilikinya. Enzim-enzim tersebut yang pertama adalah sitokrom cd1 yang

29

mengandung heme c dan d1 sebagai kofaktor esensial, disandi oleh nirS. Yang
kedua merupakan NO2- reduktase yang mengandung tembaga (Cu) pada sisi
aktifnya, disandi oleh nirK. Dua jenis enzim tersebut tidak pernah ditemukan
dalam sel yang sama (Lalucat et al. 2006). nirS merupakan bagian dari kelompok
gen-gen (operon) nirSTBMCFDLGH penyandi NO2- oksida reduktase sedangkan
nirK merupakan gen tunggal (Bedmar et al. 2005). nirT menyandi sitokrom
tetraheme, nirB menyandi sitokrom diheme dan nirM menyandi pemberi elektron
(sitokrom c551) untuk nirS. Sedangkan nirMCFDLGH merupakan motif yang
dikenali untuk regulator FNR di daerah promotor (Lalucat et al. 2006).
Reduksi NO menjadi N2O dikatalisis oleh dua tipe NO reduktase (Nor),
enzim yang terikat ke membran sitoplasma. Tipe pertama memiliki rantai lebih
pendek, menerima elektron dari sitokrom c, disebut cNor. Sedangkan tipe kedua
yang memiliki rantai lebih panjang menerima elektron dari quinol, disebut qNor
(Bedmar et al. 2005; Lalucat et al. 2006). Gen-gen norC dan norB masing-masing
menyandi subunit II yang mengandung sitokrom c dan subunit I yang
mengandung sitokrom b dari cNor. Bradyrhizobium japonicum memiliki gen-gen
penyandi Nor yang tergabung dalam norCBQDE. norQ menyandi protein
pengikat ATP atau guanosine triphosphate (GTP) sedangkan produk norD belum
diketahui fungsinya. norE menghasilkan protein yang memiliki kemiripan 60%
dengan sitokrom c oksidase tipe aa3 (Bedmar et al. 2005). Gen-gen norCB dari
Paracoccus dilengkapi oleh norQDEF untuk pematangan NO reduktase (Baker et
al. 1998). Pada denitrifikasi yang bersifat aerob atau mikroaerofil, ekspresi Nor
dihambat konsentrasi oksigen tinggi (Zumft 1997).
Enzim yang berperan pada tahap terakhir denitrifikasi adalah N2O
reduktase (Nos). Nos dari P. stutzeri lebih intensif dipelajari dari pada Nos
bakteri lain. Enzim ini merupakan enzim dimer yang terletak di periplasma dan
ada dalam beberapa bentuk. Bentuk I dapat diisolasi dalam keadaan anaerob,
berwarna ungu. Bentuk II berwarna merah muda, didapatkan jika Nos diisolasi
dalam kondisi aerob. Bentuk II memiliki aktivitas rendah, juga kandungan Cu
rendah, diduga karena oksigen mempengaruhi pusat katalitik. Bentuk I berubah
menjadi bentuk III yang berwarna biru jika ditionit ditambahkan. Bentuk IV dapat
dibuat dari apoenzim dengan inkubasi menggunakan Cu(II). Bentuk ini tidak aktif

30

secara katalitik. Bentuk V didapatkan dari Pseudomonas stutzeri mutan MK402
yang tidak dapat membentuk pusat katalitik. Setiap subunit enzim, yang disandi
oleh nosZ, mengandung dua pusat Cu. Ion logam yang terkandung paling sedikit
enam ion Cu setiap subunit. Kedua pusat tersebut adalah CuA yang merupakan sisi
masuknya elektron, dan CuZ yaitu sisi untuk mengikat substrat (Lalucat et al.
2006). Demaneche et al. (2009) menemukan ada dua tipe kelompok gen-gen
penyandi N2O reduktase yaitu nosRZDFYLX dan nosRZDFYL. nosZ merupakan
gen struktural untuk enzim N2O reduktase yang mengandung Cu. nosR menyandi
komponen regulator yang penting untuk transkripsi nosZ. nosDFY merupakan gen
untuk pematangan, produknya antara lain terlibat dalam perolehan dan proses
penggabungan Cu membentuk N2O reduktase yang aktif secara katalitik. Selain
itu terdapat nosL penyandi NosL yang merupakan kaperon Cu (Lalucat et al.
2006). Sedangkan nosX menyandi komponen periplasmik (Demaneche et al.
2009). Aktivitas N2O reduktase dihambat oleh asetilen, karbon monoksida (CO),
azida dan sianida (Kristjansson dan Hollocher 1980).
Beberapa faktor dapat mempengaruhi ekspresi gen-gen denitrifikasi.
Ekspresi gen-gen penyandi NO3- reduktase, NO2- reduktase (sitokrom cd1) dan
N2O reduktase dipengaruhi oleh perbedaan tingkat O2 dan ketersediaan N oksida
(Körner dan Zumft 1989). Ekspresi gen-gen norB dan nirS dari Pseudomonas
mandelii tidak sensitif terhadap perubahan pH pada kisaran 6-8 tetapi menurun
pada pH 5. Gen-gen tersebut tertunda induksi dan ekspresi maksimumnya pada
suhu di bawah 30 °C (Saleh-Lakha 2009). Aktivitas enzim-enzim denitrifikasi di
tanah kering menurun sekitar 16-29% setelah 7 hari inkubasi. Aktivitas enzimenzim akan kembali ke kondisi semula jika tanah dilembabkan kembali (Smith
dan Parsons 1985).

Reduksi N2O
Konversi N2O m