Kontruksi fusi transkripsi gen kitinase asal aeromonas caviae ws7b dan ekspresinya pada tanaman kentang kultivar desiree
KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE ASAL
Aeromonas caviae WS7b DAN EKSPRESINYA PADA
TANAMAN KENTANG KULTIVAR DESIREE
NI MADE ARMINI WIENDI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2005
Tulisan ini saya persembahkan untuk ayah dan ibu terkasih.
suami tercinta Alex Hartana, dan anak-anak tersayang
Andina Prameswari, Amanda Dwikarina, dan Abinata Triatama
SURAl PERNYAlAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul Konstruksi FuSi
Transkripsi Gen Kltinase Asal Aeromonas cav;ae WS7b dan Ekspresinya Pad ..
Tanaman Kentang Kultivar Desiree adalah karya saya sendiri dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber ir,formasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang telah diterbitkan maupun tidak diterbitkan dan
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Dattar Pustaka di
bagian akhir disertasi ini.
ABSTRAK
NI MADE ARMINI MEND!. Konstruksi Fusi TianskJipsi Gen Kitinase asal Aeromonas
caviae WS7b dan Ekspresinya Pada Tanaman Kentang Kultivar Desiree. Ditlimbing
oleh G. A. WATIIMENA, ANTONIUS SUWANTG, HA.iRIAL ASWIDINNOOR, MEITY
S. SINAGA, dan SUHARSONO.
Penyakit yC::19 disebabkan oleh cendawan maupun nematode- pada tanama"
kentang dapat menurunkan produksi aotara 30 -100%. Gen chi penyandi enzim
kitinase yang diisolasi dati bakteri Aeromonas cavise WS7b, merupakan balderi tanah
dan Pulau Bangka, Indonesia. Enzim kitinase adalah salah satu protein yang terlibat
dalam mekanisme pertahanan tanaman karena dapat mendegradasi kitin. Kitin adalah
komponen utama dan dinding hita cendawan patogenik dan sel nematoda. Taoaman
ttdak mengandung kitin pada selnya oleh karena itu terdapat peluang untuk
mengintroduksikan gen kitinase ke dalam genom tanama" untuk merakit tanaman
resisten cendawan patogen dan nematoda taopa mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangan tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi gep chi asal
bakteri Aeromonas caviae WS7b ke dalam vektor binary dan mempelajan ekspresinya
pada tanaman kentang kultivar Desiree dalam usaha merakit tanaman kentang yang
resiste" patogen cendawan maupun nematoda. Gen chi yang disubkloning ke dalam
plasmid binary besamya 2925 bp. Hasil analisis sekuen gen chi memiliki kandungan
G+C sebesar 63.74% dan A+T sebesar 36.26%, dengan jumlah asam amino 864 dan
perkiraan berat molekulnya 91.6 kDalton. Hasil analisis CLUSTAL W, pembandingan
sekuen dengan gen chi yang berasal dan tanaman kentang, gen ini memiliki sekuen
homology sekitar 23%, dan 98% dengan chiA dan A.caviae yang diisolasi di Israel.
Gen ini berhasil dikonstruksi pada plasmid binary dengan memfusikannya dibawah
kendali promotor 35SCaMV dan tenninator octopin. Gen chi yang dikonstruksi secara
fusi transknpsi ini ada yang searah dengan promotor (pada plasmid pARS51), dan ada
yang tidak searah dengan promotor (pada plasmid pARS52) yang selanjutnya akan
digunakan sebagai kontrol gen.
Modifikasi gen chi dilakukan pada daerah
RBS(Ribosome-Binding Sequence) dengan metode ｓｾｩｲ･｣ｴ､＠
mutagenesis
dengan PCR dan AATATGTT menjadi ACCATGGT. Hasil mutagenesis disubkloning
ke dalam plasmid rek.ombinan pCh1MOD631. Hasil konstruksi yaitu pARS51 dan
pARS52 ditransfonnasi ke dalam bakteri Agrobacterium tumefaciens LBA 4404
(pAL4404) dengan cara elektroporasi, selanjutnya bakten rekombinan ini digunakan
untuk merakit kentang transgenik dan kultivar Desiree. Marka seleksi yang digunakan
adalah nptll (gen resistensi terhadap kanamisin).
Kandidat transgenik yang
ditransformasi masing-masing dengan pARS51 dan pARS52 masing-masing sebanyak
25 individu dianalisis. Hasil hibndisasi Southern temyata membawa jumlah copy TDNA yang berbeda, mulai dan 1 sampai 5 kopi. Hasil amplifikasi PCR dengan primer
yang spesifik ARCHI1 (5'CCATGGTAAGTCCAAAACTTICCCTG) dan ARCHI2
(5'GTCCATCCGCCGACAGACGGCA) menunjukkan ada 2 individu yang tidak
membawa T-DNA dalam genomnya yaitu tanaman pembawa gen chi dari pARS52.
Analisis transkripsi dengan metode RT-PCR (Revetse Tmnscriptase-PCR) dilakukan
pada 7 individu yang positif membawa T-DNA dan pARS51 dan 4 individu yang
membawa T-ONA dan pARS52. Primer yang digunakan adalah ARCHI1, ARCHI2,
dan primer promotor 35SCaMV. Hasilnya menunjukkan gen chi yang ditransfonnasi
ke dalam genom tanaman dapat ditranskripsi menghasilkan mRNA. Analisis protein
kitinase dilakukan dengan mengevaluasi aktivitas antifungal dari enzim tersebut
terhadap pertumbuhan hifa cenclawan Fusarium oxysporum secara in vitro. Oiantara
10 galur yang membawa gen chi dari pARS51, 1 galur yang membawa gen chi dari
pARS52, 1 galur yang tidak membawa gen chi dan 1 kultivar nontransgenik, diisolasi
total proteinnya dan diper1akukan pada hita cendawan Fusarium oxysporum berumur 3
han pada beberapa tara! konsentrasi protein (10, 20, 30, 40, 50 1l9), ｡ｾ＠
dan BSA
sebagai kontrol. Pengamatan 14 han setelah inkubasi menunjukkan protein yang
berasa! dan individu yang membawa gen chi dan pARS51 mampu mengharnbat
perkembangan hifa cendawan Fusarium oxysporom dengan tingkat penghambatan
yang bervanasi, sementara yang membawa gen chi dari pARS52 kehilangan
kemampuan pe:1ghsmbat&nnya. Tanarnan yang tidak membawa gen chi, maupun dari
individu nontransgenik hanya mampu menghambat pertumbuhan cendawan hingga 7
hari setelah inkubasi. Dari hasil pengamatan mikroskopik terhadap hrfa cendawan
terlihat bahwa hifa cendawan yang terhambat pertumbuhannY3 mengalami degradasi
pada ujung dan septumnya sehingga terjadi kebocoran sel yang mengakibatkan
terjadi lis is. Hits-hits tersebut menjadi seperti tabung kosong karena isi sel nya keluar.
Pengujian terhadap kemampuan pembentukan umbi in vitro dan tanaman transgenik di
atas pada media padat- cair temyata tidak berbecla antara tanaman transgenik dan
yang nontransgenik. Kemampuan pembentukan umbi antar gatur transgenik
bervariasi, dan galur 511.8 yang membawa gen chi dan pARS51 memilki kemampuan
pembentukan umbi terbaik. Hasil evaluasi ga!!Jr transgenik di rumah ketat serangga
baik pada generasi To maupun Go memiliki keragaan fenotipe yang berbecla dengan
nontransgeniknya, begitu juga antar tanaman transgenik, namun warna, bentuk UnD,
dan bobot umbi pertanaman sarna. Dari hasil evaluasi keragaan fenotipe pada
generasi Go temyata galur 511.8, 511.9 dan 511.17 yang membawa gen chi dari
pARS51 memiliki patensi untuk dikembangkan menjadi kultivar baru karena memiliki
pertumbuhan vegetatit dan produksi yang lebih tinggi dibandingkan nontransgenik.
Namun galur-galur ini masih perlu dievaluasi resistensinya terhadap serangan patogen
yaitu cendawan dan nematoda.
ABSTRACT
NI MADE ARMINI WIENDI. Construction of Transcriptional Fustons of Chitinase Gene
from Aeromonas cav;ae WS7b and Their Expresskm in rotato cv Oeosiree. Advisors:
G. A. WATTIMENA, ANTONIUS SUWANTO, HAJRIAL ASWlDINNOOR, MEITY S.
SINAGA, and SUHARSONO
Fungal and nematode disease are a major limiting factor in potato production
areas, not only plants are kilted and reduced in the field, but also cause signifICant
production losses (30--100%). Chitin, a ｾＱＮＴＭｬｩｮｫ･､＠
polymer of N-aoetytglucosamine, is
a major structural component in the cell walls of nematode and most fungi except the
Oomycetes. Chitinase catatyse the hydrolysis of chitin. Due to the absence of chitin
in the plant cells it should be possible to engineer chitinase gene expression in these
cells without negative effects on plant growth and development. A 2925 bp bacterial
chitinase gene (chi) from soH borne bacteria Aeromonas caviae stnir1 WS7b codes for
chitinolitic protein of 864 amino acids. The 35SCaMV promoter was transcriptionally
fused into the 5' chi gene and the 3' end was fused to an octopin synthase
potyadenylation site to generate a binary plasmid designated as pARS51. A second
binary plasmid, pARS52, contains chi gene fused to 35SCaMV promoter in reversed
orientation relative to the 35SCaMV promotor orientation. Nucleotide modifICation for
over expresstion of chi gene was performed through oligonucleotide mutagenesis
around ATG of chi gene and fused to 35SCaMV promotor and ocs poIyadenyiation site
to generate a binary plasmid pChIM0D631. The nptll gene was used for a kanamycin
resistance selection for transformed plant cells. Each of the resulting constructions
were introduced into A. tumefaciens LB4404 and used to generate multiple
independent transgenic potato cv. Desiree. We analysed the expression of chi gene
from fifty independent plants which transformed with either pARS51 or pARS52. Forty
eight plants yietded PCR amplification with the expected size. Two transformants
which transformed with pARS52 have no expected band. Soothem hybridization
showed variability in T-DNA copy numbers from 1-5 copies. Transcription analysis of
chi gene
using RT-PCR with two spesific primers are (ARCHI1:
5'CCATGGTAAGTCCAAAACTTTCCCTG).
(ARCHI2:
5'GTCCATCCGCCGACA
GACGGCA), and promoter primer of 35SCaMV, annealed to the translational codon of
chi gene. Seven independent transgenic plants canying chi from pARS51 yielded
PCR amplifICation with the expected size with different intensity of DNA bands.
Crude protein isolated from transgenic and non transgenic plants was found inhibitory
to FusariUm oxysporum in in vitro assay. The effect of inhibition of crude protein vary
among transgenic lines. Phenotype evaluation of 11 transgenic lines carrying chi gene
from pARS51, 1 line from pARS52, 1 line without T-DNA, and nontransgenic plant,
were conducted for in vitro tuberizatton. Line 511.8 has the higest amount of mini
tuber. Phenotype of transgenic lines at To and Go showed vary among transgenic
lines compared to the nontransgenic line. Three transgenic potato 6nes carrying chi
gene from pARS51 (511.8, 511.9 and 511.t7) have the highest amount of tuber
production in the greenhouse test. Therefore, these transgenic potato lines could be
studied further for their resistance to fungal and nematode.
KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE ASAL
Aeromonas caviae WS7b DAN EKSPRESINYA PADA
TANAMAN KENTANG KULTIVAR ｄｅｓｉｒｾ＠
NI MADE ARMINI WIENDI
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogar
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2005
Judul Disertasi
Konstruksi Fusi Transkripsi Gen Kitinase Asal Aeromonas caviae
WS7b dan Ekspresinya Pada Tanaman Kantang Kultivar Desiree
Nama
Ni Made Armini Wiendi
NIM
: 95520
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. G.A. Wattimena. MSc.
Ketua
' ---,
t2
ｾＭ
Prof. Or. Ir. Antonius Suwanto. MSc.
Anggota
Or.lr.
atrial Aswidlnnoor. MSc.
Anggota
Dr. Ir Suharsono OEA
Dr. Ir. Meity . Sinaaa. MSc.
Anggota
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Agronomi
ｾ･ｫｯｬＢｨ＠
Pascasaljana
Or. Ir. Satrivas lIyas. MS.
Tanggal Lulu.:
Tanggal Ujian: 6 Junl 2005
VI
27 J\ll
2Ilfi
UCAPAN TERIMA KASIH
Konstruksl lusl transkripsi gen kltlnase asal Aen:mronas caviae WS7b dan
ekspreslnya
ｾ､｡＠
tanam;,n kentang kutth,a; Il9t;lree mal upakan judul disertasi
yang dibuat penulis sebsgai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pads
Program Sludi Agronomi, Sekotah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala
berkat dan karunia-NYA mulai dari awal kuliah sampai karya ilmiah ini berhasil
diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima' kasih yang tidak terhingga kepada 8apak Prof.
Dr. Ir. G.A. Wattimena, MSc; Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, MSc; Dr. Ir. Hajrial
Aswidinnoor, MSc; Or. Ir. Meity S. Sinaga, MSc; dan Dr. Suharsono, DEA, atas semus
bimbingan dan saran yang telah diberikan selama penyusunan proposal, penelman,
sampai dengan penulisan disertasi ini.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Surnamo, MSc; Dr. Sri
Hendrastuti Hidayat; dan Dr. Endang Nurhayati atas kesediaanllya menjadi penguji di
luar komisi, dan atas semua saran-saran.
Terima kasih penulis ucapkan kepada pengelola Program beasiswa TMPD dan
Program Sandwich, URGE, Direldorat Jendral Pendidikan Tinggi; dan Program Riset
Unggulan Terpadu IX, atas dukungan dana yang telah diberikan selama pendidikan
dan penelrtian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. G. A.
Wattimena. MSc yang teiah membantu dana penelrtian dari
Proyek Hibah Tim •
URGE. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr. Antonius Suwanto yang
telah memberikan ijin kepada penulis untuk mempeJajari ekspresi gen chi dari A.
caviae WS7b pada tanaman kentang. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
Dr. Richard Gardner dari Univ. of New Zealand yang telah memberikan plasmid
pART7 dan pART27 yang digunakan dalam penelrtian inL
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ketua Departemen Agronomi
dan Hortikultura, Oekan Fakultas Pertanian, dan Rektor InstiM Pertanian Bogor, yang
telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan program
Doktor.
Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Oekan Sekolah
ｐ｡ｳ｣ｾｮＬ＠
Institut Pertanian Bogor, atas segala bantuan yang diberikan selama pendidikan
benangsung.Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Direktur PP Bioteknoiogi,
Direktur PP IImu Hayat, IPB, yang telah memberikan kesempatan kepada penulis
untuk melaksanakan penelitian di Pusat penelnian tersebut.
Kepada Head of
Department of Genomtca, PRI, The Nethenands, Prof. Dr. W. J. Stiekema, penulis
mengucapkan terima kasih atas kesempatan yang diberikan untuk melaksanakan
penelitian sehingga sebagian dari penelitian untuk program Doktor dapat diselesaikan
dengan baik, serta bimbingan dan saran yang diberikan selama penulis menjalani
program Sandwich.
Kepada Dr Andy Pereira, Dept. Of Genomica, PRI, The
Netherlads, penulis mengucapkan lerima kasih atas sagala bimbingan dan saransaran di bidang bioloQi molekular selama penulis melaksanakan penelitian. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Or Oyah Manuhara yang telah banyak membantu
dalam melakukan percobaan analisis antifungal.
Kepada teman-teman Or. Ella Matzkwitch; Dr. Raffaella Grico; Nayelly
Martinez, MSc; Gert van Anckel; Dr Dion Florae; dan Dr. Edwin, penulis ucapkan
terima kasih atas segala bantuannya telah mengajarkan tehnik-tehnik molekular dan
juga literatur yang sangat membantu penyelesaian karya ilmiah ini.
Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Ir. Pribowo Dwi Saputro, Ir. Abraham Karuniawan
dan Ir Rosyida Aif'Yanti yang telah banyak membantu penetitian evaluasi tanaman
transgenik baik secara In vitro maupun in vNo.
kasih kepada BapakJlbu
Penults juga mengucapkan terima
stat pengajar di Oepartemen Agronomi dan Hortikultura,
Fakultas Pertanian, IPS, atas semangat dan dorongan yang diberikan.
Secara khusus penulis menyampaikan penghargaan dan terima kasih yang
,
tidak terhingga kepada suami dan anak-anakku: Alex Hartana, Andina Prameswari,
Amanda Dwikarina, dan Abinata Triatama atas segala pengorbanan, pengertian,
dorongan dan doa yang tiada henti sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan.
Juga kepada Ayahnda almarhum, lbunda, dan kakak serta adik yang telah
memberikan perhatian, dorongan dan semangat, penulis ucapkan terima kasih.
Penulis berharap semoga karya ilmiah ini bennanfaat dan dapat memberikan
sumbangan pemikiran dibidang ilmu pengetahuan terutama dalam perakitan tanaman
transgenik resisten penyakit.
Bogor, Juni 2005
Penulis
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirtan di Oenpasar- Bali pada tangpal 12 Apri! 1961 sebag3i anak
ketujull ciari sepuluh bersaudara dari pasangan I Nycman Windi (A1marhum) dan Ni
Nyoman Rodja.
Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Agronomi, Fakultas
Pertanian, Institut Pertanian Bogar dan lulus tahu" 1985.
pendidikan Magister tii Program Sludi Agronomi,
Penulis metanjutkan
Program Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogar dan lulus pada tahun 1992. Pada tahu" 1995 penulis diterima pada
program studi yang sarna untuk menempuh program Doktor.
diperoleh dari TMPD.
Beasiswa pendidikan
Penelitian program Doktor sebagian dikerjakan di Department
of Genomica, Plant Research International, Wageningen, The Netherlands, dengan
beasiswa Sandwich Program, URGE, Oirektorat Jendral Perguruan Tinggi dari bulan
Oktober 1999 sampai dengan Agustus 2000.
Penulis menjadi
stat
pengajar di Departemen Agronomi dan Hotikultura,
Fakultas Pertanian, InstiM Pertanian Bogor, sejak tahun 1987 sampai dengan
sekarang. Pada tanggal 3 Juni 1989 penulis menikah dengan Alex Hartana, dan telah
dikaruniai dua orang putri dan seorang putra yaitu Andina Prameswari, Amanda
Dwikarina, dan Abinata Triatama.
DAFTAR
151
Haiamar.
DAFTAR TABEL....................................................................................................
XV
DAFTAR GAMBAR................................................................................................
XVI
DAFTAR LAMPI RAN .............................................................................................
XX
I PENDAHULUAN.c............................................ .................................................
1
1.1 Latar Belakang.......................................... ..................................................
1.2 Tujuan Penelitian ...........................................................................................
1.3 Hipotesis ...... _....................................................................................
1
6
7
II TINJAUAN PUSTAKA .............................. ....................... ..... .....................
8
2.1 Tanaman Kentang ........................................................................................
2.2 Mekanisrne Pertahanan Tanaman Terhadap Cendawan Patogen .................
2.3 Patogenesis Cendawan Patogen ... _.........................................................
8
11
17
2.3.1 Mekanisme Inleksi oleh Patogen...............................................
2.3.2 Interaksi Gen Antara Inang dan Palogen ..........................................
17
18
Enzim Kitinase...... .... ........ ............. ........ .............. ........ ..... ....... .......... ..........
19
2.4.1 Pengelompokan Enzim Kitinase.........................................................
2.4.2 Gen Penyandi Enzim Kitinase............................................................
2.4.3 Mekanisme Hidrolisis Kitin oleh Enzim Kitinase .................................
21
22
23
2.5 Rekayasa Genetika Tanaman Resisten Cendawan Patogen .........................
2.6 Ekspresi Gen pada Tanaman Transgenik......................................................
28
34
2.4
2.6.1
2.6.2
2.6.3
2.6.4
2.6.5
2.6.6
2.6.7
Metode Transformasi Gen Spesifik.....................................................
Target Integrasi Gen Spesifik pada Genom Tanaman.........................
Jumlah Copy Gen Spesifik pada Genom Tanaman.............................
Posisi Integrasi Gen Spesifik pada Genom Tanaman .........................
Promotor Gen Spesifik........................................................................
Sekuen DNA Dan Gen Spesifik...........................................................
Metilasi DNA Gen Spesifik pada Tanaman .........................................
34
38
40
44
45
50
56
III BAHAN DAN METODE .................... ...... ............. .... ....... ..... ..... ............ .........
62
3.1. Tempal dan Waktu PenelHian ........................................................................
3.2. Bahan-bahan Penelitian.................................................................................
62
64
3.2.1 Bahan Tanaman .................................................................................
3.2.2 Bahan Bakteri, Plasmid, dan Fragmen DNA ......................................
64
65
3.2.3 Bahan lsolat Cendawan .....................................................................
67
3. 3. Isolasi dan Verifikasi DNA.............................................................................
68
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.3.6
Isolasi DNA Plasmid Sa!deri.............................................. ... .........
Verifikasi DNA Plasmid ..................................... ................................
Purifikasi Fragmen ｄｴｾ＠
dari Gel Agarose. .......................................
Reaksi Fill-in Pada Fragmen DNA................................................
Transformasi dan Seleksi Plasmid Rekombinan pada 8akteri............
Isolasi dan Verifikasi DNA Genom Total Tanaman Kentang...............
6e
70
70
71
72
73
3.4 Amplifikasi DNA Secara In Vitro dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
75
3.4.1 Sekuensing DNA dengan peR .........................................................
3.4.2 Modifikasi Basa Nukleotida DNA dengan PCR...............................
3.4.3 Analisis T-DNA pada Genom Tanaman Transgenik dengal"! PCR.....
75
76
77
3.5 Isolasi RNA Total Tanaman Transgenik.........................................................
78
3.6 Isolasi Protein Kasar (crude protein) Tanaman Kentang Transgenik..............
79
3.7 Metode Penelitian ..........................................................................................
80
Percobaan I
Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA Geo chi Asal Balderi
Aeromonas cav;ae strain WS7b .... .............................. ...................
80
1.1 Sekuensing DNA dari Gen chi.............................................................
1.2 Analisis Sekuen DNA dari Gen chi .....................................................
80
81
Percobaan II Konstruksi Fusi Transkripsi Gen chi Asal Bakteri
Aeromonas caviae strain WS7b ke dalam Vektor Binary ................
81
11.1 Konstruksi Fusi Transkripsi Gen chi ................................................
11.2 Modifikasi Basa Nukleotida Gen chi ...................................................
81
88
Percobaan III Transformasi Gen chi ke dalam Tanaman Kentang Kultivar
Desiree dan Analisis Tanaman Transgenik ..................................
91
111.1 Transtonnasi Gen chi ke dal?lm Sel Kentang................................
111.2 Analisis T-ONA Tanaman Kandidat Tanaman Transgenik............
111.3 Analisis mRNA pada Individu Tanaman Transgenik ......................
91
93
95
Evaluasi Aktivitas Antifungal Enzim Kitinase Dari
Tanaman Transgenik Terhadap Pertumbuhan Hifa
Cendawan Fusarium oxysporum ............................................. .
97
Evaluasi Keragaan Fenotipe Tanaman Kentang Transgenik
Pembawa Gen chi Secara In Vitro dan In Vivo Pada
Generasi To dan Go ..................................................................
98
Percobaan IV
PercobaanV
V.1. Tahap I Evaluasi Daya Pengumbian Tanaman Transgenik Kentang
Secara In Vitro........ ................... ........................................
V.2. Tahap II Evaluasi Keragaan Fenotipe Tanaman Kentang Transgenik
Generasi To... .
V.3. Tahap III Evaluasi ker3gaan Fef'lotipe Tanaman ｋ･ｮｾ｡Ｙ＠
Transgenik Generasi Umbi Go .......................... ................
101
IV HASIL DAN PEMBAHASAN. .... ......... ........................................................
103
4.1
4.2
4.3
103
107
Sekuen Gen chi Asal Aeromonas caviae WS7b............................................
Konstruksi Fusi Transkripsi dan Modifikasi Gen chi ......................................
Transformasi Gen chi Kedalam Sel Kentang dan Analisis Molekular
Tanaman Transgenik ..................................................................................
4.4 Analisis T-ONA pada Kandidat Tanaman Transgenik Kentang .....................
4.5 Analisis Transkripsi Gen chi pada Tanaman Transgenik Kentang.................
4.6 Pengujian Aktivitas Antifungal dan Protein Total Tanaman Transgenik
Kentang .................................................. .....................................................
4.7 Evaluasi Daya Pengumbian Tanaman Trallsgeni Kentang Secara In Vitro...
4.8 Evaluasi Keragaan Fenotipe Tanaman Kentang Transgenik Generasi
Umbi To
4.9 Evaluasi Keragaan Fenotipe Tanaman Kentang Transgenik Generasi
Umbi Go
Pembahasan Umum .............................................................................................
98
99
113
116
122
124
128
132
142
152
KESIMPULAN ......................................................................... ...................
157
SARAN. ..................................................................................................................
158
DAFTAR PUSTAKA....................................................................................
159
LAMPIRAN ........... ........ ........................... ............ .......... ............. .................
178
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Gatur bakteri. cendawan, darl p!asmid yang digunakan dalam
penelitian ini.............................................. ...........................................
66
Jumtah eksplan kentang Desiree membentuk kalus dan eksplan
terkontaminasi ." .................... ", ......... '" .......... _,., ............................ '........
114
Kecepatan dan keserempakan pembentukan umbi dari galur-galur
kentang transgenik dan nontransgenik secara in vitro.... ...... ' ..... ,' ........... "....
129
Rata-rata jumlah umbi per botol dan bobot basah umbi per umbi pada sistem
MPC dan Mec dan tanaman kentang transgenik dan nontransgenik ...........
130
Rekapitulasi hasit uji F peubah kUantitatif pada gatur transgenik dan
non transgenik.............................................................................................
134
Pengamatan tinggi tanaman, jumlah buku, jumlah cabang dan diameter
batang utama pada 8 MST ................................... '".....................................
136
Rata-rata jumlah bunga, jumlah bunga jadi buah, waktu berbunga, panjang
tangkai dan putik bunga, diameter korola ................................................. '"
138
Pengamatan jumlah umbi, babot umbi, diameter umbi, dan jumlah mata umbi
dan tanaman TO ......... " .............................. ". ... .......... ............... ....................
140
Rekapitulasi Uji F terhadap beberapa peubah pada percobaan evaluasi
keragaan fenotipe galur kentang transgenik pembawa gen kitinase G o.... ___
144
Nilai rata-rata tinggi tanaman, jumlah buku, dan jumlah batang pada umur
8 MST..........................................................................................................
145
Rata-rata jumlah bUnga tiap tanaman, waktu berbunga, panjang tangkai
bunga , diameter korola, dan panjang tangkai tandan.. ........... .....................
146
Rata-rala jumlah bunga jadi buah, jumlah buah tiap tanaman, bobot tiap
buah, dan diameter buah ...........................................................................
147
Nilai rata-rata jumlah umbi tiap tanaman, bobot tiap umbi, bobot umbi
tiap tanaman, diameter umbi, dan berat kering umbi....................................
149
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
Diagram homologi yang dapat menginduksi gene silencing dan transgen
pada tanaman (Matzke et al. 1994)..............................................................
41
StruktUf gen tanaman dan mekanisme ekspresir:ya membentuk mRNA
(Robinson et al. 1993)....................................................................................
46
Proses pasca transkripsi pacta gen-gen dari tanaman sebelum
ditranspor ke sitoplasma (Robinson at al.1993) ......... ,...................................
53
Skema alur percobaan dalam penelitian konstruksi tusi transkripsi gen
kitinase asal bakteri A. caviae strain WS7b dan ekspresinya pada
tanaman kentang kultivar Desiree .... .. ", ............................................ '............
64
5
Peta plasmid pAS385 yang digunakan dalam penelitian ini ...........................
82
6
Peta plasmid pART7 (a) dan pART27(b) yang digunakan dalam penelitian ini
83
7
Skema pemotongan pAS385 dengan enzim EcoRV dan isolasi fragmen
gen chi dari pWS506 .....................................................................................
84
Skema subkloning gan chi ke dalam pAS385 setelah melalui reaksi fill-in
sehingga menghasilkan plasmid rekombinan pAR51 dan pAR52 ..................
85
3
4
8
9
Subkloning gan chi searah promotor 35SCaMV ke dalam plasmid dan
dilanjutkan ke plasmid pART27 untuk menghasilkan ptasmid
rekombinan pARS51......................................................................................
10
11
12
Skema subkloning gen chi yang tidak searah dengan promotor 35SCaMV
ke dalam plasmid pART? dan dilanjutkan ke pART27 untuk menghasilkan
plasmid rekombinan pARS52........................ .................................................
87
Subkloning gen chi (0.9 kb dan ujung 5') ke dalam plasmid
Bluescript pSK· untuk menghasilkan plasmid rekombinan pChiO.9kb ............
89
Mutasi site-directed mutagenesis gell chi (0.9 kb) dengan PCR dan
subkloning ke dalam plasmid Bluescript pSt
Aeromonas caviae WS7b DAN EKSPRESINYA PADA
TANAMAN KENTANG KULTIVAR DESIREE
NI MADE ARMINI WIENDI
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2005
Tulisan ini saya persembahkan untuk ayah dan ibu terkasih.
suami tercinta Alex Hartana, dan anak-anak tersayang
Andina Prameswari, Amanda Dwikarina, dan Abinata Triatama
SURAl PERNYAlAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa disertasi yang berjudul Konstruksi FuSi
Transkripsi Gen Kltinase Asal Aeromonas cav;ae WS7b dan Ekspresinya Pad ..
Tanaman Kentang Kultivar Desiree adalah karya saya sendiri dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun.
Sumber ir,formasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang telah diterbitkan maupun tidak diterbitkan dan
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Dattar Pustaka di
bagian akhir disertasi ini.
ABSTRAK
NI MADE ARMINI MEND!. Konstruksi Fusi TianskJipsi Gen Kitinase asal Aeromonas
caviae WS7b dan Ekspresinya Pada Tanaman Kentang Kultivar Desiree. Ditlimbing
oleh G. A. WATIIMENA, ANTONIUS SUWANTG, HA.iRIAL ASWIDINNOOR, MEITY
S. SINAGA, dan SUHARSONO.
Penyakit yC::19 disebabkan oleh cendawan maupun nematode- pada tanama"
kentang dapat menurunkan produksi aotara 30 -100%. Gen chi penyandi enzim
kitinase yang diisolasi dati bakteri Aeromonas cavise WS7b, merupakan balderi tanah
dan Pulau Bangka, Indonesia. Enzim kitinase adalah salah satu protein yang terlibat
dalam mekanisme pertahanan tanaman karena dapat mendegradasi kitin. Kitin adalah
komponen utama dan dinding hita cendawan patogenik dan sel nematoda. Taoaman
ttdak mengandung kitin pada selnya oleh karena itu terdapat peluang untuk
mengintroduksikan gen kitinase ke dalam genom tanama" untuk merakit tanaman
resisten cendawan patogen dan nematoda taopa mempengaruhi pertumbuhan dan
perkembangan tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk mengkonstruksi gep chi asal
bakteri Aeromonas caviae WS7b ke dalam vektor binary dan mempelajan ekspresinya
pada tanaman kentang kultivar Desiree dalam usaha merakit tanaman kentang yang
resiste" patogen cendawan maupun nematoda. Gen chi yang disubkloning ke dalam
plasmid binary besamya 2925 bp. Hasil analisis sekuen gen chi memiliki kandungan
G+C sebesar 63.74% dan A+T sebesar 36.26%, dengan jumlah asam amino 864 dan
perkiraan berat molekulnya 91.6 kDalton. Hasil analisis CLUSTAL W, pembandingan
sekuen dengan gen chi yang berasal dan tanaman kentang, gen ini memiliki sekuen
homology sekitar 23%, dan 98% dengan chiA dan A.caviae yang diisolasi di Israel.
Gen ini berhasil dikonstruksi pada plasmid binary dengan memfusikannya dibawah
kendali promotor 35SCaMV dan tenninator octopin. Gen chi yang dikonstruksi secara
fusi transknpsi ini ada yang searah dengan promotor (pada plasmid pARS51), dan ada
yang tidak searah dengan promotor (pada plasmid pARS52) yang selanjutnya akan
digunakan sebagai kontrol gen.
Modifikasi gen chi dilakukan pada daerah
RBS(Ribosome-Binding Sequence) dengan metode ｓｾｩｲ･｣ｴ､＠
mutagenesis
dengan PCR dan AATATGTT menjadi ACCATGGT. Hasil mutagenesis disubkloning
ke dalam plasmid rek.ombinan pCh1MOD631. Hasil konstruksi yaitu pARS51 dan
pARS52 ditransfonnasi ke dalam bakteri Agrobacterium tumefaciens LBA 4404
(pAL4404) dengan cara elektroporasi, selanjutnya bakten rekombinan ini digunakan
untuk merakit kentang transgenik dan kultivar Desiree. Marka seleksi yang digunakan
adalah nptll (gen resistensi terhadap kanamisin).
Kandidat transgenik yang
ditransformasi masing-masing dengan pARS51 dan pARS52 masing-masing sebanyak
25 individu dianalisis. Hasil hibndisasi Southern temyata membawa jumlah copy TDNA yang berbeda, mulai dan 1 sampai 5 kopi. Hasil amplifikasi PCR dengan primer
yang spesifik ARCHI1 (5'CCATGGTAAGTCCAAAACTTICCCTG) dan ARCHI2
(5'GTCCATCCGCCGACAGACGGCA) menunjukkan ada 2 individu yang tidak
membawa T-DNA dalam genomnya yaitu tanaman pembawa gen chi dari pARS52.
Analisis transkripsi dengan metode RT-PCR (Revetse Tmnscriptase-PCR) dilakukan
pada 7 individu yang positif membawa T-DNA dan pARS51 dan 4 individu yang
membawa T-ONA dan pARS52. Primer yang digunakan adalah ARCHI1, ARCHI2,
dan primer promotor 35SCaMV. Hasilnya menunjukkan gen chi yang ditransfonnasi
ke dalam genom tanaman dapat ditranskripsi menghasilkan mRNA. Analisis protein
kitinase dilakukan dengan mengevaluasi aktivitas antifungal dari enzim tersebut
terhadap pertumbuhan hifa cenclawan Fusarium oxysporum secara in vitro. Oiantara
10 galur yang membawa gen chi dari pARS51, 1 galur yang membawa gen chi dari
pARS52, 1 galur yang tidak membawa gen chi dan 1 kultivar nontransgenik, diisolasi
total proteinnya dan diper1akukan pada hita cendawan Fusarium oxysporum berumur 3
han pada beberapa tara! konsentrasi protein (10, 20, 30, 40, 50 1l9), ｡ｾ＠
dan BSA
sebagai kontrol. Pengamatan 14 han setelah inkubasi menunjukkan protein yang
berasa! dan individu yang membawa gen chi dan pARS51 mampu mengharnbat
perkembangan hifa cendawan Fusarium oxysporom dengan tingkat penghambatan
yang bervanasi, sementara yang membawa gen chi dari pARS52 kehilangan
kemampuan pe:1ghsmbat&nnya. Tanarnan yang tidak membawa gen chi, maupun dari
individu nontransgenik hanya mampu menghambat pertumbuhan cendawan hingga 7
hari setelah inkubasi. Dari hasil pengamatan mikroskopik terhadap hrfa cendawan
terlihat bahwa hifa cendawan yang terhambat pertumbuhannY3 mengalami degradasi
pada ujung dan septumnya sehingga terjadi kebocoran sel yang mengakibatkan
terjadi lis is. Hits-hits tersebut menjadi seperti tabung kosong karena isi sel nya keluar.
Pengujian terhadap kemampuan pembentukan umbi in vitro dan tanaman transgenik di
atas pada media padat- cair temyata tidak berbecla antara tanaman transgenik dan
yang nontransgenik. Kemampuan pembentukan umbi antar gatur transgenik
bervariasi, dan galur 511.8 yang membawa gen chi dan pARS51 memilki kemampuan
pembentukan umbi terbaik. Hasil evaluasi ga!!Jr transgenik di rumah ketat serangga
baik pada generasi To maupun Go memiliki keragaan fenotipe yang berbecla dengan
nontransgeniknya, begitu juga antar tanaman transgenik, namun warna, bentuk UnD,
dan bobot umbi pertanaman sarna. Dari hasil evaluasi keragaan fenotipe pada
generasi Go temyata galur 511.8, 511.9 dan 511.17 yang membawa gen chi dari
pARS51 memiliki patensi untuk dikembangkan menjadi kultivar baru karena memiliki
pertumbuhan vegetatit dan produksi yang lebih tinggi dibandingkan nontransgenik.
Namun galur-galur ini masih perlu dievaluasi resistensinya terhadap serangan patogen
yaitu cendawan dan nematoda.
ABSTRACT
NI MADE ARMINI WIENDI. Construction of Transcriptional Fustons of Chitinase Gene
from Aeromonas cav;ae WS7b and Their Expresskm in rotato cv Oeosiree. Advisors:
G. A. WATTIMENA, ANTONIUS SUWANTO, HAJRIAL ASWlDINNOOR, MEITY S.
SINAGA, and SUHARSONO
Fungal and nematode disease are a major limiting factor in potato production
areas, not only plants are kilted and reduced in the field, but also cause signifICant
production losses (30--100%). Chitin, a ｾＱＮＴＭｬｩｮｫ･､＠
polymer of N-aoetytglucosamine, is
a major structural component in the cell walls of nematode and most fungi except the
Oomycetes. Chitinase catatyse the hydrolysis of chitin. Due to the absence of chitin
in the plant cells it should be possible to engineer chitinase gene expression in these
cells without negative effects on plant growth and development. A 2925 bp bacterial
chitinase gene (chi) from soH borne bacteria Aeromonas caviae stnir1 WS7b codes for
chitinolitic protein of 864 amino acids. The 35SCaMV promoter was transcriptionally
fused into the 5' chi gene and the 3' end was fused to an octopin synthase
potyadenylation site to generate a binary plasmid designated as pARS51. A second
binary plasmid, pARS52, contains chi gene fused to 35SCaMV promoter in reversed
orientation relative to the 35SCaMV promotor orientation. Nucleotide modifICation for
over expresstion of chi gene was performed through oligonucleotide mutagenesis
around ATG of chi gene and fused to 35SCaMV promotor and ocs poIyadenyiation site
to generate a binary plasmid pChIM0D631. The nptll gene was used for a kanamycin
resistance selection for transformed plant cells. Each of the resulting constructions
were introduced into A. tumefaciens LB4404 and used to generate multiple
independent transgenic potato cv. Desiree. We analysed the expression of chi gene
from fifty independent plants which transformed with either pARS51 or pARS52. Forty
eight plants yietded PCR amplification with the expected size. Two transformants
which transformed with pARS52 have no expected band. Soothem hybridization
showed variability in T-DNA copy numbers from 1-5 copies. Transcription analysis of
chi gene
using RT-PCR with two spesific primers are (ARCHI1:
5'CCATGGTAAGTCCAAAACTTTCCCTG).
(ARCHI2:
5'GTCCATCCGCCGACA
GACGGCA), and promoter primer of 35SCaMV, annealed to the translational codon of
chi gene. Seven independent transgenic plants canying chi from pARS51 yielded
PCR amplifICation with the expected size with different intensity of DNA bands.
Crude protein isolated from transgenic and non transgenic plants was found inhibitory
to FusariUm oxysporum in in vitro assay. The effect of inhibition of crude protein vary
among transgenic lines. Phenotype evaluation of 11 transgenic lines carrying chi gene
from pARS51, 1 line from pARS52, 1 line without T-DNA, and nontransgenic plant,
were conducted for in vitro tuberizatton. Line 511.8 has the higest amount of mini
tuber. Phenotype of transgenic lines at To and Go showed vary among transgenic
lines compared to the nontransgenic line. Three transgenic potato 6nes carrying chi
gene from pARS51 (511.8, 511.9 and 511.t7) have the highest amount of tuber
production in the greenhouse test. Therefore, these transgenic potato lines could be
studied further for their resistance to fungal and nematode.
KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE ASAL
Aeromonas caviae WS7b DAN EKSPRESINYA PADA
TANAMAN KENTANG KULTIVAR ｄｅｓｉｒｾ＠
NI MADE ARMINI WIENDI
Disertasi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Doktor pada
Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogar
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2005
Judul Disertasi
Konstruksi Fusi Transkripsi Gen Kitinase Asal Aeromonas caviae
WS7b dan Ekspresinya Pada Tanaman Kantang Kultivar Desiree
Nama
Ni Made Armini Wiendi
NIM
: 95520
Disetujui
Komisi Pembimbing
Prof. Dr. Ir. G.A. Wattimena. MSc.
Ketua
' ---,
t2
ｾＭ
Prof. Or. Ir. Antonius Suwanto. MSc.
Anggota
Or.lr.
atrial Aswidlnnoor. MSc.
Anggota
Dr. Ir Suharsono OEA
Dr. Ir. Meity . Sinaaa. MSc.
Anggota
Anggota
Diketahui
Ketua Program Studi Agronomi
ｾ･ｫｯｬＢｨ＠
Pascasaljana
Or. Ir. Satrivas lIyas. MS.
Tanggal Lulu.:
Tanggal Ujian: 6 Junl 2005
VI
27 J\ll
2Ilfi
UCAPAN TERIMA KASIH
Konstruksl lusl transkripsi gen kltlnase asal Aen:mronas caviae WS7b dan
ekspreslnya
ｾ､｡＠
tanam;,n kentang kutth,a; Il9t;lree mal upakan judul disertasi
yang dibuat penulis sebsgai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pads
Program Sludi Agronomi, Sekotah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala
berkat dan karunia-NYA mulai dari awal kuliah sampai karya ilmiah ini berhasil
diselesaikan.
Penulis mengucapkan terima' kasih yang tidak terhingga kepada 8apak Prof.
Dr. Ir. G.A. Wattimena, MSc; Prof. Dr. Ir. Antonius Suwanto, MSc; Dr. Ir. Hajrial
Aswidinnoor, MSc; Or. Ir. Meity S. Sinaga, MSc; dan Dr. Suharsono, DEA, atas semus
bimbingan dan saran yang telah diberikan selama penyusunan proposal, penelman,
sampai dengan penulisan disertasi ini.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Surnamo, MSc; Dr. Sri
Hendrastuti Hidayat; dan Dr. Endang Nurhayati atas kesediaanllya menjadi penguji di
luar komisi, dan atas semua saran-saran.
Terima kasih penulis ucapkan kepada pengelola Program beasiswa TMPD dan
Program Sandwich, URGE, Direldorat Jendral Pendidikan Tinggi; dan Program Riset
Unggulan Terpadu IX, atas dukungan dana yang telah diberikan selama pendidikan
dan penelrtian ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Ir. G. A.
Wattimena. MSc yang teiah membantu dana penelrtian dari
Proyek Hibah Tim •
URGE. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof Dr. Antonius Suwanto yang
telah memberikan ijin kepada penulis untuk mempeJajari ekspresi gen chi dari A.
caviae WS7b pada tanaman kentang. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
Dr. Richard Gardner dari Univ. of New Zealand yang telah memberikan plasmid
pART7 dan pART27 yang digunakan dalam penelrtian inL
Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Ketua Departemen Agronomi
dan Hortikultura, Oekan Fakultas Pertanian, dan Rektor InstiM Pertanian Bogor, yang
telah memberikan kesempatan kepada penulis untuk mengikuti pendidikan program
Doktor.
Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Oekan Sekolah
ｐ｡ｳ｣ｾｮＬ＠
Institut Pertanian Bogor, atas segala bantuan yang diberikan selama pendidikan
benangsung.Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Direktur PP Bioteknoiogi,
Direktur PP IImu Hayat, IPB, yang telah memberikan kesempatan kepada penulis
untuk melaksanakan penelitian di Pusat penelnian tersebut.
Kepada Head of
Department of Genomtca, PRI, The Nethenands, Prof. Dr. W. J. Stiekema, penulis
mengucapkan terima kasih atas kesempatan yang diberikan untuk melaksanakan
penelitian sehingga sebagian dari penelitian untuk program Doktor dapat diselesaikan
dengan baik, serta bimbingan dan saran yang diberikan selama penulis menjalani
program Sandwich.
Kepada Dr Andy Pereira, Dept. Of Genomica, PRI, The
Netherlads, penulis mengucapkan lerima kasih atas sagala bimbingan dan saransaran di bidang bioloQi molekular selama penulis melaksanakan penelitian. Terima
kasih juga penulis ucapkan kepada Or Oyah Manuhara yang telah banyak membantu
dalam melakukan percobaan analisis antifungal.
Kepada teman-teman Or. Ella Matzkwitch; Dr. Raffaella Grico; Nayelly
Martinez, MSc; Gert van Anckel; Dr Dion Florae; dan Dr. Edwin, penulis ucapkan
terima kasih atas segala bantuannya telah mengajarkan tehnik-tehnik molekular dan
juga literatur yang sangat membantu penyelesaian karya ilmiah ini.
Penulis juga
mengucapkan terima kasih kepada Ir. Pribowo Dwi Saputro, Ir. Abraham Karuniawan
dan Ir Rosyida Aif'Yanti yang telah banyak membantu penetitian evaluasi tanaman
transgenik baik secara In vitro maupun in vNo.
kasih kepada BapakJlbu
Penults juga mengucapkan terima
stat pengajar di Oepartemen Agronomi dan Hortikultura,
Fakultas Pertanian, IPS, atas semangat dan dorongan yang diberikan.
Secara khusus penulis menyampaikan penghargaan dan terima kasih yang
,
tidak terhingga kepada suami dan anak-anakku: Alex Hartana, Andina Prameswari,
Amanda Dwikarina, dan Abinata Triatama atas segala pengorbanan, pengertian,
dorongan dan doa yang tiada henti sehingga penulis dapat menyelesaikan pendidikan.
Juga kepada Ayahnda almarhum, lbunda, dan kakak serta adik yang telah
memberikan perhatian, dorongan dan semangat, penulis ucapkan terima kasih.
Penulis berharap semoga karya ilmiah ini bennanfaat dan dapat memberikan
sumbangan pemikiran dibidang ilmu pengetahuan terutama dalam perakitan tanaman
transgenik resisten penyakit.
Bogor, Juni 2005
Penulis
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirtan di Oenpasar- Bali pada tangpal 12 Apri! 1961 sebag3i anak
ketujull ciari sepuluh bersaudara dari pasangan I Nycman Windi (A1marhum) dan Ni
Nyoman Rodja.
Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Agronomi, Fakultas
Pertanian, Institut Pertanian Bogar dan lulus tahu" 1985.
pendidikan Magister tii Program Sludi Agronomi,
Penulis metanjutkan
Program Pascasarjana, Institut
Pertanian Bogar dan lulus pada tahun 1992. Pada tahu" 1995 penulis diterima pada
program studi yang sarna untuk menempuh program Doktor.
diperoleh dari TMPD.
Beasiswa pendidikan
Penelitian program Doktor sebagian dikerjakan di Department
of Genomica, Plant Research International, Wageningen, The Netherlands, dengan
beasiswa Sandwich Program, URGE, Oirektorat Jendral Perguruan Tinggi dari bulan
Oktober 1999 sampai dengan Agustus 2000.
Penulis menjadi
stat
pengajar di Departemen Agronomi dan Hotikultura,
Fakultas Pertanian, InstiM Pertanian Bogor, sejak tahun 1987 sampai dengan
sekarang. Pada tanggal 3 Juni 1989 penulis menikah dengan Alex Hartana, dan telah
dikaruniai dua orang putri dan seorang putra yaitu Andina Prameswari, Amanda
Dwikarina, dan Abinata Triatama.
DAFTAR
151
Haiamar.
DAFTAR TABEL....................................................................................................
XV
DAFTAR GAMBAR................................................................................................
XVI
DAFTAR LAMPI RAN .............................................................................................
XX
I PENDAHULUAN.c............................................ .................................................
1
1.1 Latar Belakang.......................................... ..................................................
1.2 Tujuan Penelitian ...........................................................................................
1.3 Hipotesis ...... _....................................................................................
1
6
7
II TINJAUAN PUSTAKA .............................. ....................... ..... .....................
8
2.1 Tanaman Kentang ........................................................................................
2.2 Mekanisrne Pertahanan Tanaman Terhadap Cendawan Patogen .................
2.3 Patogenesis Cendawan Patogen ... _.........................................................
8
11
17
2.3.1 Mekanisme Inleksi oleh Patogen...............................................
2.3.2 Interaksi Gen Antara Inang dan Palogen ..........................................
17
18
Enzim Kitinase...... .... ........ ............. ........ .............. ........ ..... ....... .......... ..........
19
2.4.1 Pengelompokan Enzim Kitinase.........................................................
2.4.2 Gen Penyandi Enzim Kitinase............................................................
2.4.3 Mekanisme Hidrolisis Kitin oleh Enzim Kitinase .................................
21
22
23
2.5 Rekayasa Genetika Tanaman Resisten Cendawan Patogen .........................
2.6 Ekspresi Gen pada Tanaman Transgenik......................................................
28
34
2.4
2.6.1
2.6.2
2.6.3
2.6.4
2.6.5
2.6.6
2.6.7
Metode Transformasi Gen Spesifik.....................................................
Target Integrasi Gen Spesifik pada Genom Tanaman.........................
Jumlah Copy Gen Spesifik pada Genom Tanaman.............................
Posisi Integrasi Gen Spesifik pada Genom Tanaman .........................
Promotor Gen Spesifik........................................................................
Sekuen DNA Dan Gen Spesifik...........................................................
Metilasi DNA Gen Spesifik pada Tanaman .........................................
34
38
40
44
45
50
56
III BAHAN DAN METODE .................... ...... ............. .... ....... ..... ..... ............ .........
62
3.1. Tempal dan Waktu PenelHian ........................................................................
3.2. Bahan-bahan Penelitian.................................................................................
62
64
3.2.1 Bahan Tanaman .................................................................................
3.2.2 Bahan Bakteri, Plasmid, dan Fragmen DNA ......................................
64
65
3.2.3 Bahan lsolat Cendawan .....................................................................
67
3. 3. Isolasi dan Verifikasi DNA.............................................................................
68
3.3.1
3.3.2
3.3.3
3.3.4
3.3.5
3.3.6
Isolasi DNA Plasmid Sa!deri.............................................. ... .........
Verifikasi DNA Plasmid ..................................... ................................
Purifikasi Fragmen ｄｴｾ＠
dari Gel Agarose. .......................................
Reaksi Fill-in Pada Fragmen DNA................................................
Transformasi dan Seleksi Plasmid Rekombinan pada 8akteri............
Isolasi dan Verifikasi DNA Genom Total Tanaman Kentang...............
6e
70
70
71
72
73
3.4 Amplifikasi DNA Secara In Vitro dengan Polymerase Chain Reaction (PCR)
75
3.4.1 Sekuensing DNA dengan peR .........................................................
3.4.2 Modifikasi Basa Nukleotida DNA dengan PCR...............................
3.4.3 Analisis T-DNA pada Genom Tanaman Transgenik dengal"! PCR.....
75
76
77
3.5 Isolasi RNA Total Tanaman Transgenik.........................................................
78
3.6 Isolasi Protein Kasar (crude protein) Tanaman Kentang Transgenik..............
79
3.7 Metode Penelitian ..........................................................................................
80
Percobaan I
Sekuensing dan Analisis Sekuen DNA Geo chi Asal Balderi
Aeromonas cav;ae strain WS7b .... .............................. ...................
80
1.1 Sekuensing DNA dari Gen chi.............................................................
1.2 Analisis Sekuen DNA dari Gen chi .....................................................
80
81
Percobaan II Konstruksi Fusi Transkripsi Gen chi Asal Bakteri
Aeromonas caviae strain WS7b ke dalam Vektor Binary ................
81
11.1 Konstruksi Fusi Transkripsi Gen chi ................................................
11.2 Modifikasi Basa Nukleotida Gen chi ...................................................
81
88
Percobaan III Transformasi Gen chi ke dalam Tanaman Kentang Kultivar
Desiree dan Analisis Tanaman Transgenik ..................................
91
111.1 Transtonnasi Gen chi ke dal?lm Sel Kentang................................
111.2 Analisis T-ONA Tanaman Kandidat Tanaman Transgenik............
111.3 Analisis mRNA pada Individu Tanaman Transgenik ......................
91
93
95
Evaluasi Aktivitas Antifungal Enzim Kitinase Dari
Tanaman Transgenik Terhadap Pertumbuhan Hifa
Cendawan Fusarium oxysporum ............................................. .
97
Evaluasi Keragaan Fenotipe Tanaman Kentang Transgenik
Pembawa Gen chi Secara In Vitro dan In Vivo Pada
Generasi To dan Go ..................................................................
98
Percobaan IV
PercobaanV
V.1. Tahap I Evaluasi Daya Pengumbian Tanaman Transgenik Kentang
Secara In Vitro........ ................... ........................................
V.2. Tahap II Evaluasi Keragaan Fenotipe Tanaman Kentang Transgenik
Generasi To... .
V.3. Tahap III Evaluasi ker3gaan Fef'lotipe Tanaman ｋ･ｮｾ｡Ｙ＠
Transgenik Generasi Umbi Go .......................... ................
101
IV HASIL DAN PEMBAHASAN. .... ......... ........................................................
103
4.1
4.2
4.3
103
107
Sekuen Gen chi Asal Aeromonas caviae WS7b............................................
Konstruksi Fusi Transkripsi dan Modifikasi Gen chi ......................................
Transformasi Gen chi Kedalam Sel Kentang dan Analisis Molekular
Tanaman Transgenik ..................................................................................
4.4 Analisis T-ONA pada Kandidat Tanaman Transgenik Kentang .....................
4.5 Analisis Transkripsi Gen chi pada Tanaman Transgenik Kentang.................
4.6 Pengujian Aktivitas Antifungal dan Protein Total Tanaman Transgenik
Kentang .................................................. .....................................................
4.7 Evaluasi Daya Pengumbian Tanaman Trallsgeni Kentang Secara In Vitro...
4.8 Evaluasi Keragaan Fenotipe Tanaman Kentang Transgenik Generasi
Umbi To
4.9 Evaluasi Keragaan Fenotipe Tanaman Kentang Transgenik Generasi
Umbi Go
Pembahasan Umum .............................................................................................
98
99
113
116
122
124
128
132
142
152
KESIMPULAN ......................................................................... ...................
157
SARAN. ..................................................................................................................
158
DAFTAR PUSTAKA....................................................................................
159
LAMPIRAN ........... ........ ........................... ............ .......... ............. .................
178
DAFTAR TABEL
Halaman
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Gatur bakteri. cendawan, darl p!asmid yang digunakan dalam
penelitian ini.............................................. ...........................................
66
Jumtah eksplan kentang Desiree membentuk kalus dan eksplan
terkontaminasi ." .................... ", ......... '" .......... _,., ............................ '........
114
Kecepatan dan keserempakan pembentukan umbi dari galur-galur
kentang transgenik dan nontransgenik secara in vitro.... ...... ' ..... ,' ........... "....
129
Rata-rata jumlah umbi per botol dan bobot basah umbi per umbi pada sistem
MPC dan Mec dan tanaman kentang transgenik dan nontransgenik ...........
130
Rekapitulasi hasit uji F peubah kUantitatif pada gatur transgenik dan
non transgenik.............................................................................................
134
Pengamatan tinggi tanaman, jumlah buku, jumlah cabang dan diameter
batang utama pada 8 MST ................................... '".....................................
136
Rata-rata jumlah bunga, jumlah bunga jadi buah, waktu berbunga, panjang
tangkai dan putik bunga, diameter korola ................................................. '"
138
Pengamatan jumlah umbi, babot umbi, diameter umbi, dan jumlah mata umbi
dan tanaman TO ......... " .............................. ". ... .......... ............... ....................
140
Rekapitulasi Uji F terhadap beberapa peubah pada percobaan evaluasi
keragaan fenotipe galur kentang transgenik pembawa gen kitinase G o.... ___
144
Nilai rata-rata tinggi tanaman, jumlah buku, dan jumlah batang pada umur
8 MST..........................................................................................................
145
Rata-rata jumlah bUnga tiap tanaman, waktu berbunga, panjang tangkai
bunga , diameter korola, dan panjang tangkai tandan.. ........... .....................
146
Rata-rala jumlah bunga jadi buah, jumlah buah tiap tanaman, bobot tiap
buah, dan diameter buah ...........................................................................
147
Nilai rata-rata jumlah umbi tiap tanaman, bobot tiap umbi, bobot umbi
tiap tanaman, diameter umbi, dan berat kering umbi....................................
149
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1
2
Diagram homologi yang dapat menginduksi gene silencing dan transgen
pada tanaman (Matzke et al. 1994)..............................................................
41
StruktUf gen tanaman dan mekanisme ekspresir:ya membentuk mRNA
(Robinson et al. 1993)....................................................................................
46
Proses pasca transkripsi pacta gen-gen dari tanaman sebelum
ditranspor ke sitoplasma (Robinson at al.1993) ......... ,...................................
53
Skema alur percobaan dalam penelitian konstruksi tusi transkripsi gen
kitinase asal bakteri A. caviae strain WS7b dan ekspresinya pada
tanaman kentang kultivar Desiree .... .. ", ............................................ '............
64
5
Peta plasmid pAS385 yang digunakan dalam penelitian ini ...........................
82
6
Peta plasmid pART7 (a) dan pART27(b) yang digunakan dalam penelitian ini
83
7
Skema pemotongan pAS385 dengan enzim EcoRV dan isolasi fragmen
gen chi dari pWS506 .....................................................................................
84
Skema subkloning gan chi ke dalam pAS385 setelah melalui reaksi fill-in
sehingga menghasilkan plasmid rekombinan pAR51 dan pAR52 ..................
85
3
4
8
9
Subkloning gan chi searah promotor 35SCaMV ke dalam plasmid dan
dilanjutkan ke plasmid pART27 untuk menghasilkan ptasmid
rekombinan pARS51......................................................................................
10
11
12
Skema subkloning gen chi yang tidak searah dengan promotor 35SCaMV
ke dalam plasmid pART? dan dilanjutkan ke pART27 untuk menghasilkan
plasmid rekombinan pARS52........................ .................................................
87
Subkloning gen chi (0.9 kb dan ujung 5') ke dalam plasmid
Bluescript pSK· untuk menghasilkan plasmid rekombinan pChiO.9kb ............
89
Mutasi site-directed mutagenesis gell chi (0.9 kb) dengan PCR dan
subkloning ke dalam plasmid Bluescript pSt