Konstruksi Fusi Transkripsi Gen Kitinase dari Aeromonas caviae dan Ekspresinya pada Pseudomonas fluorescens

DISERTASI

KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DARI
Aeromonas caviae DAN EKSPRESINYA PADA
Pseudomonasfluoresceiti

Oleh
AMARLLA MALIK

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANTAN BOGOR
2000

DISERTASI

KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DARI
Aerornonas caviae DAN EKSPRESINYA PADA
Pseudomonas fluorescens
'

Oleh

AMARILA MALIK

PROGRAM PASCASAWANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2000

". . .plXzli meninggit&an orang yang
6eriman di antara &mu dan orang-oraw
yang di6eri $mu pengetahuan, 6e6erapa
derajat ... " @ l % ~ ~ ~ M d a h: l1iI )

To my parents.
To my beloved husband, Rusli, and our children. Rizka and Radhian

ABSTRACT

Chitinase gene (chi) fiom A e r o m o w m i a e WS%, which was cloned
previously in pUC19 based plasmid vector, has been sequenced. Its completed
nuceleotide sequence was determined. The structural gene consists of 2.937 bp with
an ORF encoding 865 amino acids. DNA sequence analysis indicated that the gene

was cloned without its indigenous promoter. Comparison to other chitinase genes in
database shows that the deduced amino acid sequence was nearly identical (97%) to
chiA from A. caviae isolated fiom Israel. In this study, chi was cloned either under a
strong constitutive promoter, i.e. P K ~ as
~ a, transcriptional fusion, or under an
inducible strong promoter, Pfac. To introduce the gene fision/s into Pseudomonas
fluorescemfPf),the constructs were cloned into broad host range plasmid vectors
such as pRK415, pBBRlMCS2, and pVSP61. Chitinolytic expression of ~ ~ m ~ - c h i
fUsion on chitin agar plate as clear zones could only be demonstrated in a
recombinant plasmid based on pBBRlMCS2 replicon, designated as pAM340.
pBBRlMCS2, which has higher copy number than the either pRK415 or pVSP61,
was used as a vector for the construction of Ptac-chi, which was designated as
fision
i
in a suicide vector, pWTmini-TnS SplSm, has been
pAM630. A P ~ r n ~ - c h
constructed as well, and was designated as pAM520. Construction of pAM520 was
performed to obtain the chi fision clone that integrated into Pf chromosome, and

that will be stably maintained as a single copy number. From the three

transcriptional fusion recombinants, only Escherichia wIi harboring pAM520
recombinant could not demonstrated chitinolytic activity. To mobilize the chi fusion
recombinant into PC gene tranfer was performed employing bacterial conjugation.
Based on the time of incubation required to display transparent zone on chitin agar
plate, the chi gene expression in Pf demonstrated much higher activity than when the
same construct was present in E. colz. Chitinase activities were determined
speckrophotometricaIly using colloidal chitin azure as a specific substrate.

The

results showed that the expression of chi fusion in E. w l i was significantly

influenced by plasmid w p y number as shown in E. coli (pWS506), which expressed
intracellular chitinase activity (4.17 U/mg protein) several folds higher than that of
medium copy plasmid in E. coZi (pAM630) (1.05 U/mg protein). Pf5 100 (pAM630)
overnight culture accumulated chitinase in the intracellular fraction which is three
folds higher (2.53 Ulmg protein) than the control strain. There was no significant
chitinase activity in the extracellular fraction of PfS100 (pAh.4630). From these
results, it could be concluded that the expression of chi was influenced by gene copy
number of constructed gene, as well as the nature of bacterial host used in this

study

AMi4RE.A h4AL.X. Konstmksi h s i translcripsi gen kitinase dari Aeromonas caviae
dan ekspresinya pada Psetcdomonas fIuorescens. Di bawah bimbingan ANTONIUS
SUWANTO sebagai ketua, dan berturut-tumt BUD1 TJAHJONO, MAGGY T.
SUHARTONO, INDRAWAT1 GANDJAR d m ED1 GUHARDJA sebagai anggota
komisi .

Penelitian tentang gen kitinase dan pemanfaatannya telah banyak dilakukan.
Gen kitinase berpotensi antara lain untuk mengkonstruksi agens biokontrol terhadap
~endawanpatogen tanaman, selain untuk dimanfaatkan ddam stud1 regulasi dan
ekspresi gen, serta proses degradasi kitin. Gen kitinase yang diisolasi dari
Aeromollas caviae rnasih belurn banyak dilaporkan jika dibandingkan dengan

laporan tentang gen kitinase dari Serratia marcescens. Studi tentang kloning gen
kitinase secara fisi transkripsi telah dilaporkan, namun sumber gen kitinase yang
digunakan adalah gen kitinase dari S. marcescens. Di dalam penelitian ini gen
kitinase (chi) dari A. cavzae isolat WS7b yang & i o n pada vektor berbasis pUC
(pWS506) oleh peneliti sebelumnya, telah disekuens, dan sekuens nukleotida yang
diperoleh diialisis dengan mernbandingkan dengan kitinase yang telah a& di

ahtabase.

Konstruksi fisi transkripsi gen chi di daIam penelitian ini menggunakan
vektor berspektmm inang has, yaitu pRK415, pBBRIMCS2, dm pVSP61. Ketiga
vektor mempunyai karakter berbeda, yaitu dari jumlah kopi, penanda antibiotik,
ulcuran plasmid, situs endonuklease restriksi,

dan kelompok inkompatibiiitas.

Promotor untuk ekspresi gen chi yang digunakan di dalam penelitian ini adatah
promotor gen resistensi Kanamisin, P K ~ yang
~ , bersifat konstitutic yang diisolasi
dari pUC4K, d m promotor hibrid trp-lac (Pfac) yang merupakan promotor kuat
bersifat terinduksi, namun dalam keadaan tidak terinduksi bersifat konstitutif
Konstruksi fbsi chi diintroduksi ke PseuCtOmo~sJluorescem (Pf) gatur dan isolat
biokontrol. Galur yang digunakan adalah B29, yaitu biokontrol balcteri patogen
penyebab pustul pada tanarnan kedelai, serta isolat Pf5024 dan Pf 5100, yaitu
biokontrol penghasil biosurfkktan yang diisolasi dari tanaman brokoli.

Penelitian ini bertujuan untuk : (i) karakterisasi DNA gen chi dengan

sekuensing, dan data sekuens yang diperoleh akan dibandingkan dengan kitikitinase yang sudah ada di &&base

unntuk mempelajari kekerabatannya; (ii)

mengkonstruksi gen chi sebagai fisi transkripsi di bawah prornotor ekspresi yang
konstitutie (iii) mengintroduksi k s i transkripsi chi ke P. fluorescens (Pf) isolatisolat biokontrol ; (iv) menganalisis ekspresi gen chi pada isolat-isolat P f secara esei
kualitatif dan esei kuantitatif.
Untuk mencapai tujuan tersebut telah dilalcukan serangkaian percobaan
sebagai berikut, yaitu (i) sekuensing DNA gen chi dengan stmtegi subkloning d m

primer waiking. Data sekuens yang diperoleh dianalisis dengan program BLAST dari
European Bioinformatics Institute, dan sekuens asam amino turunan diperoleh
dengan program Swiss-Prot. Pembandingan dengan kitinase-kitinase yang sudah ada
dilakukan rnenggunakan program CIustaI-W, ((ii) konstruksi fbsi transkripsi P K ~ ~ -

chi pa&

vektor-vektor plasmid berspektrum inang luas, analisis ekspresi kitinolitik

rekombinan-rekombinan di klon E. wi'i, dan intnwluksi rekombinan kitinolitik

(pAh.4340)ke isolat-isolat Pf; (iii) konstruksi fusi translcripsi pICmR-chi pada vektor
transposon mini, pUTmini-Tn5 Sp/Sm, menghasilkan pAMS20, analisis ekspresi
kitinolitik rekombinan di klon E. d i , dao introduksi pAM520 ke isolat-isotat
serta analisis keberadaan gen

transkripsi

Pfac-chi

pada

chi dengan metode amplifikasi; (iv) konstruksi fusi
vektor

berspektnun inang

luas

pBBRlMCS2,

menghasilkan pAM630, analisis ekspresi kitinolitik rekombinan di klon E colt, dan
introduksi pAM630 ke Pf5100; (v) esei aktivitas kitinase secara spektrofotometxi
rnenggunakan substrat spesifik Chitin Arure, serta mengukur konsentrasi protein
total dari finksi ekstraselular dan intraselular.

Dari hasil sekuensing diperoleh selcuens nukleotida gen chi sepanjang 2.937
pasang bssa yang m e n y a n d i i 865 asam amino lmumm yang menunjukkan
kemiripan sekuens DNA sangat tinggi (98%) dan kemiripan sekeuns asam amino

tunrnan 97% dengan chiA dari A. uzviue asal Israel. Fragmen DNA chi mengandung
satu kerangka baca terbuka yang mempunyai selaens mirip sekuens Shine-Dai'garno

AGGA terletak 9 nukleotida mendahului kodon inisiasi transkripsi ATG. Pada ujung
karboksil terdapat tiga buah sekuens ulangan terbalik yang potensial membentuk
struktur hairpin-loop sebagai terminasi transkripsi yang didahului oleh kodon
terminasi translasi TGA.

E. coli yang membawa konstruksi fisi transkripsi pECmR-chi di pRK415
(p-30)

dan pVSP61 (pAM430) tidak menunjukkan ekspresi kitinolitik medium

agar-agar kitin yang diamati sampai 7 hari inkubasi, sedangkan fisi di pBBRlMCS2
fpAM330 dan pAM340f dapat mendegradasi kitin, namun tidak sekuat di inang
asalnya. Dari faktor jumlah kopi gen, pBBRlMCS2 mempunyai jumlah kopi lebih
tinggi daripada pRK415 dan pVSP61. Introduksi pAM340 ke Pf B29 tidak berhasil
memperoleh ekskonjugan yang kitinolitik. Introduksi pAM340 ke Pf 5200 berhasil
memperoleh ekskonjugan yang menunjukkan ekspresi kitinolitik yang &p

lcuat

berupa wna bening setelah diinkubasi selama 9 hari. Hasil analisis ampiifikasi
menunjukkan Pf B29 tidak membawa gen chi, sedangkan Pf 5100 membawa gen
chi.

E. coli yang membawa h s i transkripsi ~ ~ m ~ - di
c h
pUTmini-TnS
i

Sp/Sm
(pAM520) tidak menunjukkan ekspresi kitinolitik sampai 10 hari inkubasi.
Introduksi pAM520 ke Pf B29, Pf 5024 dan Pf 5100 dianalisis dengan asnplifikasi

gen chi menunjukkan bahwa gen chi tidak ada di dalam Pf B29, namun terbukti ada
di dalam Pf 5024 dan 5100. Ekspresi gen chi di Pf 5024 dan 5100 tidak terlihat
sampai 10 hari inkubasi pa& medium agar-agar kitin.

E. coli yang membawa konstruksi fisi transhipsi Ptac-chi di pBBRlMCS2,
yaitu pAM630, menunjukkan ekspresi kitinolitiik setelah d i i b a s i selama 11 hari,

namun zona bening yang dihasilkan lemah. Introduksi pAM630 ke Pf 5100 berhasil
memperoleh ekskonjugan kitinolitik yang culcup kuat dari munadnya zona bening
setelah diinkubasi selama 7 hari.
Hasil esei aktivitas kitinase menunjukkan bahwa ekspresi fbsi chi di E c d i
dipengaruhi oleh jumlah kopi plasmid sebagaimana yang ditunjukkan oleh E. cdi
pembawa pWS506, yang merupakan plasmid bejumlah kopi tinggi, yang

mengekspresikan kitinase intraselular empat kali lipat lebih tinggi (4.17 U/mg
protein) dari E. wli pembawa pAM630 yang merupakan plasmid berjumlah kopi

medium (1.05 U/mg protein). Kitinase terakumulasi pada fiaksi intraselular dari

fkaksi

kuitur sernalarn Pf5100 (pAM630) yang menunjukkan aktivitas tiga kali lipat (2.53
U/mg protein) dari aktivitas pada

ekstraselular (0.93 Ulmg protein). Dari hasil

tersebut disimpulkan bahwa ekspresi gen chi dipenganthi oleh jumlah kopi gen serta
sifat balcteri inang atau isolat yang digunakan pada penelitian ini.

KONSTRUKSI FUSI TRANSKRIPSI GEN KITINASE DAM
Aeromonas caviae DAN EKSPRESINYA PADA
Pseudomonas fluorescens

Oleh

Disertasi
Sebagai saiah satu syarat untuk memperoleh gelar
DOKTOR
pada Program Studi Biologi Program Pascasarjana Institut Pertanian Bogor

PROGRAM PASCASARTANA
INSTITUT PERTANLAN BOGOR
2000

JUDUL DISERTASI

: KONSTRUKSI FUSI TRAlYSKRlPSI GEN KITINASE
DARI Aeromunm &c
DAN EBPRESINYA PADA
13eudomonmfZlcmescens

NAMA MAI-IASISWA : AlMARILA MALIK

NOMOR MAHASISWA: 95575
PROGRAM STUD1

: BIOLOGI

1. Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Antonius Suwanto M Sc.
Ketua

no

Prof. Dr.
-~nggota
2. Ketua Program Studi Biologi

A

Dr. Ir. Dedi Setiadi. MS
Tanggal Lulus : 19 Agustus 2000

Prof. Dr. Edi Guhardja
Anggota

ram Pas-

Saj a n a

Penulis adalah anak kedua dari empat bersaudara putra-putri dari ayah Amir
Malik dan ibu Martha Amir, dilahirkan di Jakarta pada tanggal 3 Oktober 1964. Telah
dikaruniai seorang putri Rizka h4aulida dan seorang putra Radhian Amandito dari suami
Rusli Yunus.
Penulis lulus pendidikan Sekolah Dasar (SD) di SD Adik Irma Suryani, Jakarta,
bulan Desember tahun 1976, Iulus pendidikan Sekolah Menengah tingkat Pertama
(SMP) di S M P Negeri I, Jakarta bulan Juni tahun 1980, dan lulus pendidikan Sekolah
Menengah tingkat Atas (SMA) di SMA Negeri 4, Jakarta bulan Juni tahun 1983. Pada
tahun yang sama melanjutkan pendidikan ke Jurusan Farmasi, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam (FhlIPA), Universitas Indonesia 0melalui Proyek Perintis I.
Lulus sarjana Farmasi pada bulan September tahun 1988, melanjutkan ke pendidikan
profesi Program Apoteker di Jurusan yang sama hingga iulus bulan Desember 1989.
Penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang S2 pada tahun akademik 1991/1992 hingga
lulus bulan Oktober tahun 1993 di Program Studi Farrnasi Pascasarjana fnstitut
Teknologi Bandung dengan sponsor dari Tim Manajemen Program Doktor (TMF'D),
Direktorat Pendidikan Tinggi (Dikti). Pada tahun akademik

1995/1996

penulis

melanjutkan p e n d i d i i ke jenjang 53 di Program Studi Biologi Prognun Pascasajana
Institut Pertanian Bogor dengan sponsor dari Beasiswa Unggulan (URGE) dari Bank

Dunia melalui Dikti. Sejak bulan Maret 1990 hingga sekarang menjadi s t a f pengajar di
Jurusan Farmasi FMfPA UI.

UCAPAN TERIMA KASIH
Syukur AlhamduliUah penulis ucapkan atas segala rahmat dan hidayah dari
Allah SWT atas s e l d y a pelaksanaan penelitii dan penulisan d
semoga m

w

a e

i

i ini, dan

t bagi pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi,

khususnya di bidang Biologi.
Dalam mehksanakan penelitian dan penulisan disertasi penulis telah

mendapat bantuan dari berbagai pihak, baik bempa saran, kritik, dana, maupun
bantuan moril dan d o a Pada kesemptan ini perkenankan penulis mengucapkan
terima kasih yang tulus dan sebesar-besarnya kepada semua pihak yang telah
memberikan bantuan
Kepada Dr. Ir. Antonius Suwanto, M.Sc., sebagai ketua komisi pembimbing

yang telah ~nemberikanbiibimgan, saran dan arahan mulai dari pemilihan mata
ajaran, penyusunan usulan penelitian, pelaksanaan penelitian sampai penulisan
disertasi.

Penghargaan yang tinggi penulis haturkan atas dorongan beliau yang

kemampuan bersikap mandiri, tekun,

memotivasi penulis untuk rnenge-

dan percaya diri dalam meneliti. Tidak lupa rasa terima kasih p u g besar atas
kesempatan yang diperoleh

unNc

melakukan sebagian pekejaan penelitian ini di

Scottish Agricultural College, The University of Edinburgh, dari Higher Education

LINK Project, berjudd "Sustainable crop protection to improve food production:
tra~ "

'

g technology h m m

f

i to practice'' dari DFID, The British Council,

dimana beliau adalah salah seorang koordinator.

Kepada Dr. Ir. Budi Tjahjono, M-Agr., sebagai anggota komisi pembiiing

yang telah membmhn b i i h g a n dan saran, serta kesempatan bergabung dalarn
kelornpok peneliii H h h T
i
m (URGE) Project Grant 029/HTPP/WURGE/l996
"Construction of Biowntrol for B a c t d Disease in Plants: Genome Analysii
Pathogenesis, and Molecular Ecology of Xanthomonas campestris pv. gZycines",
sehingga mendapat bantuan dam yang b e r h g a untuk dapat mehksamkm dan

menyelesaikan pene-

ini Kepada Pro£ Dr. Ir. Maggy T. Suhartono, sebagai

anggota komisi pemb'img yang telah rnemberhn birnbingan dan saran, serta
kesempatan melakukan sebagii pekerjaan peffilitian di Laboratorium Mikrobiologi
dan Biokimia, Pusat Antar Universitas-Bioteknologi, IPB yang beliau kepalai.

Kepada Prof. Dr. Indrawati Gadjar, sebagai anggota kornisi p e m b i i b ' i atas
bib'mgan dan saran, serta dukungan m o d yang kuat sebagai intelektual dan Guru
3esar FMIPA, Universitas Indonesia, tempat penulis bekeja sebagai staf pengajar.
Kepada Prof. Dr. Edi Guhardja, sebagai anggota komisis pembimbing atas
bimbmgan dan saran, serta kearifan dalam memberikan pandangan dan masukan

yang berguna bagi kesempurnaan suaiu disertasi.
Kepada

Dr. Endang Purwantini, staf pengajar FMIPA Institut Teknologi

Bandung, dan Dr. Anja Meryandini, staf pengajar FMIPA Institut Pertanian Bogor,
sebagai penguji luar komisis, atas saran clan kritik yang menjadi masukan yang
IJ~rInanfaatagar disertasi ini menjadi kbih sempuma lagi
Kepada Direktur Program Pascasajana dan Ketua Program Studi Biologi,

Institut Pertanian Bogor. beserta staf yang telah memberikan kesempatan untuk
pendidikan S3 dengan Beasiswa Unggulan URGE (Universify Research for

Graduate Education) Batch III tahun 1996/1997. Kepada Rektor Universitas
Indonesia, Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas
Indonesia, dan Ketua Jurusan Farmasi FMIPA UI yang telah memberikan
kesempatan untuk pendidiken S3 di Institut Peaanian Bogor.

Kepada Direktur SEAMEO BIO'JXOP (South Easf Asia Regional Centrefor
Tropical Biology) Pro£ Dr. Sitanala Arsyad rcmg telah memberikan kesempatan clan

..

melakukan penelitii di Laboratorium Molecular Biology. Kepada para

peneliti dan -wan

S

M

O BIOTROP atas kesempatan mengguaakan

hilitas, terutama kepada Pro€ Dr- Irene M U m b o h sebagai kepala Divisi

Biofechnology and Tree Breeding (ETB), beserta stafdan telcnisi yang dengan penuh
kesabaran dan pengertian dalam suasana kekeluargaan dsn pmddxkm yang tulus

m e r n b e h d-an
&lupakan.

bagi kelancaran pekejaan penelitian hi tidak akan dapat

Kepada Dr. Rob Harling, koordinator Higher Education LINK Project
bejudul "Sustainable crop protection to improve f w d production: transferring
technology porn research to practice" dari DFID, The British Council, atas

b i i a n , saran, dan arahan yang &bedcan selama rnehkukan sebagii penelitian
ini di Scottish Agricultural College, Univemity of Edinburgh, Scotland, UK
Kepada rekan-rekan mahasiswa, para staf dan karyawan Pascasarjana IPB,
para teknisi PAU-Bioteknologi IPB dan Laboratorium Molecular Biology SEAMEO

BIOTROP, yang selama ini telah membantu dau bekejasama dengan baik.
Kepada yang tercinta keluarga pen&,

kakak, ad&-ad&,

ibu, ayah, suami, anak-anakku, nenek,

dan ibu mertua, yang selalu memberikan dukungan moril dan

kekuatan do'a, serta toleransi yang talc terhingga berupa rasa pengertian dan sangat
memaklurni sejak awd hingga selesainya pendidilcanS3 ini.

Kepada semua pihak yang belum disebutkan, penulis ucapkan banyak terima
kasih.
Atas segala bantuan clan amal ba&nya, penulis mendo'akan mudah-mudaban

Q

i h h l a n yaug setimpal oleh AUah SWT. Amiin

KATA PENGANTAR

Berkat rahmat Allah SWT, penelitian dan penulisan disertasi yang berjudul
"Konstruksi

fisi transkripsi gen kitinase dari Aeromonas caviae clan ekspresinya

pa& Pseuabmo~sfluorescen.3' dapat diselesaikan. Dalam penelitian ini ditalcukan
konstruksi penyisipan gen chi di bawah promotor konstitutif dan terinduksi , d m
diklon pada vektor berspekttum inang luas dan vektor transposon, sehingga ekspresi
gen chr akan dikendalikan secara konstitutif di inang Pseudomonas fluorescens
isolat-isolat biokontrol. Melalui penelitian dan penulisan ini penulis ingin
menyumbangkan informasi tentang karakteristik gen chi dari A. cuviae asal
Indonesia, serta kemungkinan pemanfkatannya sebagai sumber gen chi yang
berpotensi dalam mengkoastruksi biokontrol d w a a patogen tanaman.
Berdasarkan konstruksi fUsi transkripsi yang dihasilkan di dalam penelitian
ini maka ekspresi kitinase di biok-1

akan bersifat konstitutif tanpa induksi, yang

sangat sesuai untuk diimplikasikan sebagai biokontrol pencegah serangan ceadawan
patogen alternatif. Dengan demikian, penggunaan firagisida kimia yang selama ini
telah

terbukti

dapat

memberikaa

dam&

bumk

pada

liagkungan,

dan

membahayakan mahluk hidup serta m i k m o ~ s m enon target hinaya, dapat
dihindari.
Penulis mengharaplcaa adanya sumbang saran dan kritikan dari pembaca
sekalian untuk meajadikan hasil penelitian &sertasi

temtaag konstruksi &si

transkripsi gen chi di biokontrol P.fr~orescensini berpotensi untuk dikembangkan
dalam pencegahaa cendawan patogea altematifhagisida kimia.

Bogor, Agustus 2000
Penulis

DAFTAR IS1 ..................................................................................

xiv

DAFTAR GAMBAR ....................................................................... xvii
DAFTAR TABEL ..........................................................................
f.

xix

PENDAHULUAN ....................................................................

1

A . Latar Belakang .....................................................................

1

..

B . Tujuan Penelitran ...................................................................

6

C. Tahap Pengerjaan ..................................................................

6

D. Manfaat Penelitian .................................................................

7

I1. TINJAUAN PUSTAKA .............................................................

..

A. Enzim IOt~nase....................................................................

B. Gen Kitinase bakteri yang telah dilaporkan ..................................
C. Pseudornonc~sfluorescens........................................................
D . Teknologi DNA rekombinan ......................................................

E. Regulasi ekspresi gen dan fbsi transkripsi .....................................

F. Transfer gen pada Bakteri ..........................................................
G. Sekuensing DNA .................................................................

III. BAHAN DAN METODE ...........................................................
A. Tempat Penelitian .................................................................

B. Bahan ...............................................................................
C. Prosedur Umum dan Peralatan ...................................................
D . Metode ..............................................................................
E. Sekuensing DNA gen kitinase ..................................................
F. Konstruksi gen chi di bawah promotor gen

dan introduksi ke

P.ji'uorescens ......................................................................
xiv

8
8

11

F.1. Penyisipan gen penanda resistensi antibiotik ............................

59

F.2. Penyisipan gen KmRpada plasmid vektor berspektrum inang luas ...

59

F.3. Pembuatan fragmen gen chi bemjung tumpul dengan teknikfiCI-in ...

61

F.4. Penyisipan -men

tumpul gen chi pa& vektor perantara .............. 6 2

F.5.Penyisipan gen chi di bawah PKmR .........................................

62

F.6. Penyisipan gen penyandi CimRsebagai penanda seleksi ................. 63
F.7. Introduksi konstruksi fusi transkripsi ~ ~ r n ~ -pada
c h ivektor

berspektrum inang luas ke Pf ...............................................

63

G. Rekonstruksi fusi transkripsi pKmR-chimenggunakan vektor
integrasi dan introduksi ke P.fIuorescens .......................................

64

G.1. Konstruksi sisipan fragmen gen chi dengan penanda C+mR............... 64

G.2. Penyisipan fkagmen chi-GmR di bawah PKmR pada pUC4K ........

66

G.3. Penyisipan m e n fhsi PKmR-chi-GmR pada vektor perantara
pUC 18NotI ....................................................................

66

G.4 Konstruksi h i PKrnR-chi-GmR pada vektor integrasi pUTmini .....

67

G.5. Introduksi konstnrksi fusi pI€mR-chipada pUTmini ke Pf ............

67

H. Konstruksi Fusi Transkripsi gen chi di bawah Ptac dan introduksi ke Pf

..

67

H.1. Pengambilan Ptac dari pKK223-3 dm penyisipan pada vektor plasmid 68
H.2. Fusi transkripsi m e n gen chi-GmR di bawah kontrol Ptac ..........

68

.................................

69

H.3. Introduksi konstruksi fusi Pfac-chi ke Pf

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................
A. Sekuens DNA gen kitinase ........................................................
B . Konstruksi gen chi di bawah pKrnRdan introduksi ke ~f ...................

71
71
80

C . Rekonstruski fisi tramkripsi pKrnR-chi menggunakan velctor transposon
dan inhoduksi ke Pf ................................................................

D . Konstruksi fusi transkripsi gen chi di b a w d Ptac dan introduksi ke Pf

....

92
97

E. Esei enzimatik kitinase dengan substrat spesifik ...... .................. ... 104
V.KESIMPZJLAN DAN SARAN ................................................ . .... 1 1 7
DAFTAR PUSTAKA .,. ...... . .. ..... .... ........... ........ ... .. .. ....... ..... . ... .....

120

DAFTAR GAMBAR

Halaman

..

2.1 Struktur htln ............................................................................

9

2.2 Lintasan degradasi kitin ..............................................................

10

2.3 Alur informasi dan fakto-faktor regulasi ekspresi gen .............................

26

2.4 Fusi gen terhadap suatu gen penyandi ............................................... 28
3.1 Strategi sekuensing gen chi dengan subkloning danprimer walking ...........

55

3.2 Skerna konstruksi fisi transkripsi ~ ~ m ~ -pada
c h vektor
i
berspektrum

inang luas ................................................................................
3.3 Plasmid p34S-Grn .....................................................................

60

63

pada vektor integrasi
3.4 Skema konstruksi k s i transkripsi pICmR-chi-~mR
PUT mini-Tn5 Sp/Sm ................................................................. 65
3.5

Skema konstruksi h s i transkripsi ~fac-chiGrnR
pada vektor berspektrum
inang luas ............................................................................... 70

4.1 Sekuens nukleotida fragmen 2.9 kb gen chi beserta sekuens asam amino
4.2 Pembandingan sekuens asam amino turunan dari kitinasekitinase yang

berkerabat dekat .......................................................................
4.3 Analisa perbandingan ujung karboksil gen chi WS7b ...........................

77

80

p ~ ~ 5 ......................
0 6

81

4.5 Vektor-vektor berspektmm inang luas yang digunakan ..........................

83

4.4 ~ e n y i s i ~ gen
a n T~~ di bagian hilir gen chi

chi-^^^

plasmid p ~ ~ 3 8............................
5

84

4.7 Verifikas'l orientasi pAM201 dengan enzim restriksi pada gel agaros ........

86

4.6 ~ e n y i s i ~&agmen
an
4.8 Fragmen

chi-^^^ disisipkan di vektor-vektor pembawa gen ICmR..............

87

4.9 Verifikasi orientasi rekombinan fbsi transkripsi pAM330 .......................

88

4.10 Peta restriksi plasmid pAM330 .....................................................

89

4.1 1 Ekspresi kitinolitik gen chi pada klon E. coli dan P.fluorescem 5 100

pembawa pAM340 ...................................................................

91

4.12 Peta restriksi plasmid pernbawa sisipan fragmen chi-GnR, pAM202 .........

93

4.13 Peta restriksi pAMSOO (A) ..........................................................

94

4.14 Verifikasi rekombinan pAMSOO. p a 5 0 3 dan pAh4520 .....................

95

4.15 Esei aktivitas kitinolitik E. coZi (pAM500) .......................................

96

4.16 Anaiisis keberadaan gen chi dengan teknik amplifikasi .......................

97

4.17 Konstruksi Ptac pada pBBRlMCS2 dalam dua orientasi ........................ 99
4.18 Hasil elektroforesis pengambilan h g m e n Pfac dari pKK223-3 dan verifikasi
pAM601 clan pAM630 ..............................................................

101

4.19 Peta plasmid rekombinan pAM630 ...............................................

102

4.20 Esei aktivitas kitinolitik bakteri pembawa fUsi transkripsi Ptac-chi ..........

103

4.21 Kurva pengukuran waktu inkubasi optimum dan lcurva standar ...............

106

4.22 Aktivitas kitinase A . cavim WS7b pada dua suhu inkubasi ....................

107

4.23 Esei kuantitatif aktivitas kitinase gen chi di E. colz dan P.fluorescens
terhadap substrat Chitin Azure .....................................................

xviii

109

DAFTAR TABEL
Halaman
3.1 Galur bakteri yang digunakan .................................................
3.2 Plasmid yang digunakan .......................................................

4.1 Ukuran £'ragmen DNA hasit verifikasi pAh4201 ..........................
4 . 2 Ukuran fragmen DNA hasil verifikasi pAM330 ..........................
4.3 Ukuran ftagmen DNA hasil verifikasi pAMSOO, pAMS03 dan pAM520
4.4 Ukuran fragmen DNA hasil verifikasi pAM601 dan pAM630 ........
4.5 Ekspresi kitinolitik gen chi pada reombinan plasmid ...................

4.6 Aktivitas kitinase hasil ekspresi gen chi di E. coli dan P.fluorescem...

A. Latar Bdakang

Kitinase

(EC3.2.1.14

=

poly-PZ.4-(Zacetami&2-Cieoxy)-D-gZucosi&

g & m hydrolase) adalah enzim yang mempunyai kemampuan menghidrolisis kitin.

Senyawa kitin adalab polimer N-asetilglukosamin dengan ikatan P(14) yang banyak
terdapat di alam sebagai komponen utama kerangka luar arhopoda, mohska,
dinding sel cendawan dan askarida, serta dinding sel streptomises (Smucker & Kim,
1991).

Aeromonas caviae WS7b, yaitu suatu isolat bakteri tanah asal Pulau Bangka.
Propinsi Sumatera Selatan, yang diisolasi dari areal pertanian mengandung relatif
sedikit populasi nematoda patogen tumbuhan, menunjukkan aktivitas kitinolitik
yang h a t pada medium agar kitin. Gen kitinase dari galur ini telah diklon oleh

Wenuganen (1997) pada vektor plasmid turunan pUC19 dinamai pWS506. Gen
kitinase tersebut dapat diekspresikan dengan baik pada Ekckriichia coli DHSa di
b a w d promotor gen penyandi enzim P-gdaktosidase ( C u d ) .
Wenuganen (1997) menunjukkan bahwa gen kitinase-tersebut

Hasii penelitian

diduga terklon tanpa

promotor aslinya.
Penelitian-penelitian pemanfaatan gen kitinase telah dilakukan baik dengan
mengkonstrue~galur bakteri biokontrol maupun mengkonstruksi tanaman yang
membawa gen kitinase terhadap cendawan patogen (Boller et al., 1983; Hedrick ei
al., 1988; Oppenheim & Chef

1992). Selain untuk tujuan proteksi

terhadap

2

cendawan patogen, penelitian-penelitian tentang gen kitinase banyak dilakukan
untuk tujuan rnempelajari regulasi tahap degradasi dan pemanfiistan kitin,
rnengkadkerisasi gen-gen kitinase dan produk-produknya, serta model untuk
mempelajari regulasi ekspresi dan sekresi protein Wobbins et al., 1992; Fujii 62
Miyashita, 1993; Miyashita & Fujii, 1993; Brurberg et al., 1995, Watanabe et al.,
1997)
Gen kitinase berpotensi untuk dimanfaatkan dalam mengkonstruksi galurgdur biokontrol potensial yang dapat mencegah timbulnya penyakit tumbuhan yang
disebabkan oleh cendawan. Biokontrol, berasal dari kata bioIogicaI controt,menjadi
komponen yang sangat penting &lam pertanian. Pestisida kimia telah menjadi suatu
substansi yang mencemaskan beberapa tahun terakhir hi,karena efek samping yang
dapat diiimbulkannya terhadap linglcungan yang

rnembahayakan baik bagi

kesehatan manusia, maupun organisme nontarget lainnya, termasuk musuh alami

yang sebenarnya menguntungkan. Oleh karena itu dipandang penting untuk
mengembangkan pengendali alternatif yang arnan dan layak lingkungan, terutama
dengan rnenggunakan organisme yang sudah ada di dalam suatu habitat alamiya.
Organisme-organisme ini mampu bertindak melindungi tanaman terhadap berbagai
macam cendawan patogen tanamaq tanpa m e n i m b u l b efek perusalcan terhadap

sistem ekologis. Namun, sebelum biokontrol ini menjadi suatu komponen dalam
penanganan penyakit tumbuhan, haruslah efektif, mampu bertahan, konsisten, dan
ekonomis. Untuk memenuhi kriteria tersebut antara lain dapat ditalcukan manipulasi

genetik untuk menarnbah ketangguhan atau memperluas spektrum aktivitas bioIogis
(Chet et al,, 1993).

Untuk rnemanipulasi dan mengintroduksi gen kitinase ke berbagai bakteri
selain E. coli dan kerabatnya, gen ini hams dikonstruksi pada plasmid vektor
berspektrum inang luas dan di bawah promotor yang sesuai agar dapat terekspresi,
sebagaimana yang dilalcukan dalam penelitian ini. Vektor plasmid yang berspektrum
inang luas yang sudah banyak digunakan anatara lain adalah pRK415, (JCeen et al.
1988). Selaim mengkonstruksi suatu gen di plasmid vektor berspektrum inang luas,

sebagian peneliti rnengkonstruksi gen yang diminati di dalam suatu transposon.
Beberapa penelitian m e r n b u k t i bahwa konstruksi suatu gen di dahm transposon,
yang kemudian akan terintegrasi ke dalarn kromosom inang yang dituju sebagai
resipien, akan Iebih s a i l dibandingkan d

m konstruksi pada vektor plasmid

yang dapat hilang karena adaptasi dan seieksi di alam (Koby et al, 1994;

de

Lorenu, et d.,1990; Herrero ef al., 1990). Selain i t y lokasi penyisipan elemen
sisipan beserta gen yang dirninati di kromosom juga menjadi masalah yang harus

d

i apakah penyisipan
~
tersebut
~
akan mempengamhi kernampuan sel inang

dalam proses pertumbuhaq dan kernampuan m e u g k o l o n i s ~serta kadcter-kamkkr
penting tainnya. Berdasarkan ha1 tersebut ~~i

plasmid r e k o m b ' i fUsi

transkripsi pada penelitian ini diIakdcan pada beberapa vektor bexspektrum inang
luas dan juga transposon Tn5 dengan menambahkan gen penanda antibiotik yang

sesuai untuk introduksi m e n fbsi transkripsi ke galur-gdur
Pseudomomsfluorescens

(Po.

biokontrol

Ekspresi yang diharapkan dari suatu agens biokontrol antara lain adalah
ekspresi tanpa induksi,

yaitu menghasilkan produk gen secara konstitutif dalam

tingkat konsentmsi tertentu, sehingga dapat berfimgsi sebagai pencegah serangan
patogen. Untuk tujuan tersebut dalam penelitian ini gen kitinase difusikan di bawah
promotor gen yang M i f a t konstitutif, yaitu promotor gen resistensi antibiotik

Kanamisin (PICmR)clan promotor hibrid trp dan lac, Ptac. Promotor pICmR diambil
dari kaset gen resistensi Kanarnisin dari plasmid pUC4K yang berasal dari
transposon Tn903 (Oka et a1..1981). Promotor fac yang diambil dari plasmid
pKK223-3 (Pharmacia) adalah suatu promotor kuat dalam kondisi konstitutif
maupun terinduksi (Glick & Pastern&

1994). Koby et d (1994) dan Downing &

Thomson (2000), telah berhasil mengklon gen kitinase asal Sema
&ekspresikan di bawah promotor tat di dalam

murcecens dan

baik yang terkonstruksi di dalam

vektor plasmid maupun pada tmnsposon.

Galur biokontrol yang tengah d i m b a n g k a n terhadap patogen tanaman
kedelai Xbnakmtmm c a m p e m pathovarg2ycines adalah Psemhnonarfluorescem

B29 @ b a r h i ,

1995; Suwanto et al, 1996, Manuella et al., 1997). Galur Pf B29

diisolasi dari daun tanaman kedelai yang terserang bakteri patogen tersebut. Penelitipenetiti terdahulu membulctikan bahwa @ur

Pf B29 mampu m e n g e n d a t i bakteri

penyebab pushd pada kedelai seuua kompetitif (Nawangsih, 1997; Khaeruni, 1998).

Galur Pf B29 akan dikembangkan kemampuannya sebagai biokontrol terhadap

cendawan dengan mengkonstruksi galur B29 yang kitinolitik

Dari studi

pendahuluan diketahui bahwa Pf B29 rnampu hidup pada media yang dibubuhi

antibiotik Tetrasiklin (10

pg/ml),

Kanamisin (25 pdrnl),

Streptomisin dan

Spektinomisin (masing-masing 50 dd).Untuk keperluan pemeliharaan dan
seleksi, h4ariani (1995), telah melakukan mutasi spontan pada Pf B29 sehingga
menjadi resisten terhadap antibiotik Rifampisin (100 pg/ml).

Gatur Pf lainnya yang juga sedang dikembangkan sebagai agens biokontrol
adalah isolat Pf5024 dan isolat PfS100, yang termasuk Pf kelompok Vb berdasarkan
pengelompolcan secara taksonomi yang diuraikan oleh Leltiott el a!. (1966). Isolatisolat tersebut merupakan galur-galur nonpatogen yang diisohsi dari pucuk brokoli
(Brassica oleracea var italics), dan telah dimanfaatkan sebagai biokontrol pada
pertanaman brokoli karena kemampuannya menghasilkan biosurfaktan (Campbell et

at., 1995). Isolat-isolat Pf tipe liar tersebut telah diiutasikan secara spontan
sehingga menjadi resisten terhadap antibiotik Rifampisin di dalam penelitian in<

untuk membantu proses seleksi balik (carnter-seZection) pada teknik introduksi gen
kitinase secara konjugasi bakterial.

Di d a b penelitian inii juga dilakukan sekuensing m e n DNA gen
penyandi kitinase (ch2 urrtuk memastikan struldur daerah promotor, selain
memperoleh infonnasi-informasi lain seperti hubungan karakternya dengan data
sekuens DNA yang sudah ada di database, sekuens asam-amino gen kitinase
dugaan, dan informasi tentang protein kitinase, berdasarkan data sekuens DNA yang
diperoleh Gen penyandi kitinase dari isolat bakteri tanah berasal dari Israel,
Aeromonas caviae, telah diisolasi dan disekuens sepanjang 2.710 basa nukleotida
tanpa daerah promotor yang lengkap (Sitrit et al., 1995). tnformasi ini dapat menjadi

data pembanding bagi gen kitinase isolat asal Indonesa berdasarkan data sekuens
DNA yang diperoleh, dan akan merupakan suatu hat yang rnenarik, karena kedua
bakteri ini berasa1 dari daerah yang seuurr geografrs sangat berjauhan.
B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan organisme
rekombinan, dalam ha1 ini P.fluorescens, yang memproduksi kitinase ekstraselular.
Berdasarkan ha1 tersebut, maka penelitian ini dilakukan dengan suatu strategi yang
meliputi beberapa tahapan, yaitu

(i) mengkarakterisasi DNA gen kitinase (chi)

dengan sekuensing. Data sekuens DNA gen chi yang diperoleh dimanfaatkan dalarn
mempelajari d m meneliti kekerabatan gen chi ini dengan gen-gen kitinase lain yang
telah ada dengan m e m b a n d i a n n y a dengan data sekuens DNA di dblzbase. dan
membandingkan sekuens asarn amino turunannya; (ii) melakukan fusi gen chi di
bawah promotor konstitutif yang sesuai untuk ekspresi gen kitinase di inang selain

E.coli, sehingga produk kitinase &pat

diekspresikan secara konstitutif; (ii)

mengintroduksi fbsi transkripsi gen chi ke galur-galur biokontrol P. jluorescew, dan
(iv) menganalisis ekspresi gen chi pa&

galur-galur bakteri biokontrol dengan esei

halitatif dan semikuantitatif aktivitas enzim kitinase.

C.Tahap Pengerjaan
Di &lam

disertasi ini pekerjaan penelitian dibagi sebagai berikut, (i)

sekuensing m e n DNA gen chi, (ii) konstnrksi gen chi difhsikan di bawah
promotor konstitutic promotor gen resisten Kanamisin, d m promotor Icrc, yang

7

bersifrtt terhduks'i dan konstitutic pada vektor-vektor plasmid yang berspektrum
inang luas, d m pada vektor transposon, (iii) introduksi gen chi ke galur-galur bakteri
biokontrol P s e d m o n a s jluorescens, beserta esei ekspresinya pada media agar kitin

dan esei kuantitatif.
D. Manfaal:peneiitian

Di dalam rnengkonshuksi agens biokontrol, diharapkan suatu gen potensial
yang diklon dapat diekspresikan secara konstitutif. Dengan demikian produk gen
yang dihasilkan tidak b e r l e b i i sehingga tidak menyebabkan toks'i d m inang klon

gen tersebut, dalam ha1 ini agens biokontml. dapat mengadaptasi kondisi baru ini
dengan baik, tanpa tejadi mutasi untuk mengatrtsi efek produk gen tersebut.
Ekspresi fusi transkripsi gen chi pada galur-galur biokontrol Pf akan sangat
berguna sebagai anticenciawan altematif pengganti penggunaan fungisida kimia yang

sudah terbukti memberikan darnpak negatif bagi lingkungan dan mabiuk hidup lain

A.Enzim kitinase

Kitinase adalah enzim yang mempunyai kemampuan mendegradasi kitin,
yaitu polisakarida yang &bangun oleh satuan N-asetilglukosamin dengan ikatan P(14). Kitin (Garnbar 2.1) merupakan biopolimer yang paling metimpah di alam karena

merupakan komponen struktural dinding sel cendawan kecuali oomycetes, kerangka
luar artropod, kerangka luar molusca, cangkang luar cmstaceae dm nematod
(Adonreal 8t Reese, 1969; Cabib, 1987). Produk kitinase umum diproduksi di

berbagai organisme. Beberapa bakteri memproduksi kitinase untuk autilisis,
morfogenetis, maupun nutrisi yaitu memadaatkrtn kitin sebagai sumber karbon
(Gooday, 1990; Monreal 62 Reese, 1969; Roberts & Cabib, 1992; Watanabe et al.,
1990). Prokariot yang banyak ditaporkan r n e m p r o d a i kit'mase adalah bakteri

luncur, Pseudomonad, Vibrio, Photobacterium, Enterobacteriaceae, Actinomycetes,
Bacillus dan Clostridium (Gooday, 1979; Jones et al., 1986, Watanabe et al., 1990;

Bmrberg et al., 1995; Sitrit et al., 1995; Svitil el al., 1997). 1Mikroba-rnikroba
eukariot yang memiliki kemampuan m e n u d a d c m kitin sebagai sumber karbon dan
energi adatah Myxomycetes, Chytri4 Zygomycetes, Deutemmycetes, Ascomycetes
dan Basidiomycetes, dengan memodifikasi konstituen struldur kitin (Ohtakara,
1961). Salah satu cendawan air tawar yang mempunyai kemampuan t d u t addah

Kmlingia asteraysfa yang bersifat kitofil obligat. Ditemukan pula arnuba tanah

yang memiIiki kemampuan mendegradasi kitin (Gooday. 1990). Pada tumbuhan

tinggi juga dilaporkan produe1 enzim pengbidrolisis kitin tersebut (Powning &
Irzykiewcz, 1965; Abeles et al., 1970; Pegg & Vassey, 1973; Boller eta/-,1983).

Di alam terdapat beberapa bentuk kitin, yang tenrtama ditemukan adalah
bentuk a-kitin, berupa rantai yang terancang sebagai antiparalel, misalnya pada
kaliks hydrozoa, kulit telur nematoda, dm raduhe moluska. Bentuk kitin yang lain
adalah 0-kitin, terancang sebagai rantai yang paralel, umumnya terdapat pada
caugkang moluska. dan y-kitin yang me~pakat'bjenis kitin yang t e d i dari

campran antara kedua jenis kitin ( a clan P)yang disebut di atas (Svitil

el d., 1997;

Gooday, 1990).

A0
\

CHI

Proses degradasi kitin dapat melalui dua lintasan (Gambar 2.2). Lintasan
pertama adalah hidrolisis ikatan P(1-4) yang disebut proses kitinolitik. Enzim yang
berperan dalarn proses tersebut adalah enzim kitinme. Proses kitinolitik melibatkan
dua jenis enzim kitinase, yaitu eksokitinase dan endoki*.

Eksokitinase

memotong unit diasetilkitobiosa nonreduksi pada ujung rantai polimer, sedangkan
endokitinase memotong ikatan gliosida rantai kitin secara acak menghasilkan

diasetilkitobiosa sebagai hasii utama dan triasetiikitotriosa, yang lambat laun a

h

didegradasi menjadi disakarida dan monosakarida. Bentuk di- dan mono- akan
diangkut ke dalam sel mikroorganisme dan b e d b g s i sebagai sumber karbon dan
nitrogen. Di dalam sel, metabolisme N-asetilglukosamin dapat melalui fosforilasi N-

asetilglukosamin-6-fosfat, ataupun melalui deasetilasi menjdi glukosamin, melalui
deaminasi, dan selanjutnya meialui hidrolisis menjadi glukosa oleh glukosaminidase
(Gooday, 1990).
Lintasan alternatif degradasi kitin adalah lintasan yang melibatkan deasetilasi
kitin menjadi kitosan. Proses ini penting untuk lingkungan yang memiliki
kandungan kitosan pada sedimen perairan. Enzim kitosanase dapat menghidrolisis
ikatan glikosida P(1-4) pada kitosan menghasilkan kitobiosa, kemudian kitobiosa
dihidrolisis oleh eN-asetilglukosaminidase menjadi N-asetilglukosamin (Gooday,
1990).

KAsetIl
glukosarninidase

1

1

Kitosanase

Kitobima
(Glukosaminil glukosaminida)

N-asetilglukosamin
GIkNAs
D

d

I

A

dkJIln!dase

Glukoasamin
(GlW

Gambar 2.2 Lintasan degradasi kitin

B. Gen kitinase bakteri yang telah dilaporkan
Kitinase baEderi, yaitu kitinase yang dihasilkan oleh bakteri, mempunyai
mekanisme aktivitas antikngi yang berbeda dari kitinase tanaman. Kitinase bakteri
berperanan penting dalam menjaga keseimbangan ekologis dengan mendegradasi
dan mengubah kitin menjadi bentuk biologis yang bermanfaat, disamping
memanfaatkan kitin sebagai sumber nutrisi (Roberts & Selitrennikoe 1988).
Berdasarkan sekuens DNA, Ohno ef al. (1996) menyebutkan bahwa gen-gen kitinase

dapat dikelompokkan menjadi dua firmili yaitu M l i 18 dan 19. Kitinase bakteri
sesungguhnya berada dalam satu kelompok famili 18 bersama kitinase dari
cendawan, virus, hewan dan kelas III dan V kitinase tumbuhan. Kitinase yang
termasuk famili 19 adalah k e h I, II clan IV kitinase tumbuhan. Namun, Saito et d
(1999) melaporkan kini telah ada kitinase bakteri yang dapat dikelompokkan ke

&lam Eamili 19.
Berbagai gen kitinase bakteri telah dikion dan dikarakterisasi bersarna
dengan produk transLas'mya dari bakteri aerob mauputt anaerob. W i e dari

Serratia rnarcescens telah banyak diteliii serta gen-gen kitinasenya telah & i o n
dan disekuens.
Gen yang menyandikan kitinase utarna dari Serratia marcescecens, yaitu chitinase A

(chL4) telah diklon oleh Downing & Thomson (2000) di bawah kendali promotor
tac, baik disisipkan di suatu plasmid berspektrum inang luas, maupun di w
tu vektor

integrasi, dan diintroduksi ke P. frtlorescem. Galw Pfyang membawa tac-chiA baik
di plasmid maupun terintegrasi di dalam kromosom merupakan age-

biokontrol

yang efektif terhadap cendawan patogen tanaman Rhizoctonia soIani. Struldur tiga
dimensi enzim

kitinase chiA

dari

S. marcescens galur

QMB1466

telah

dikarakterisasi dan dilaporkan oleh Srurberg et al. (1996), serta pembandingan
sekuens-sekuens chitinuse A d m B telah dilakukan beserta lokalisasi seluIarnya di
klon E. coli. Suatu sistem transposon Tn7 yang membawa gen chiA telah
dikonstruksi oleh Koby et al. (1994) dalam bentuk &si operon di bawah promotor
hc.

K o n s t ~ uini
~ telah diintroduksi ke dalam Pseudomona~ji'uorescens dan

terintegrasi dengan stabil, serta mengekspresikan enzirn kitinase yang aktiE Galur
biokontrol tersebut telah diuji pula kernampuan melindungi kecambah biji kapas
terhadap Rhizoctonza s o h i .

Sebelumnya Sundheim et al. (1988) telah behasil

mengklon dua macam kitinase dari Serratia mmcescens, kemudian mengintmduksi

salah satu gen kitinase tersebut ke Pseuabmonm fluorescens. M ~ v i t a skitinase
dapat terekspresi di P. Ji'uorescens,

dan galur tersebut dapat menghambat

pertumbuhan tabung kecambah dari F d u m o ~ ~ c u fsp.
r n re&Zens,

seserta

menurunkan smmga~~
penyakit pada lobak yang dibabkan oleh cendawan tersebut.
EnteroZMcler aggiorneram juga merupakan bakteri sumber gen kitinase
bakteri yang betpotexmi. Chernin et al. (1997) telah mengklon dan mengkadcterisasi
sekuens gen penyandi endokitinase chiA dari E agglomerans. Selruens lengkap gen
chi4 telah dilaporkan, dan dari sekuens asam amino turunsnnya diperoleh i n f o m i
d a n y a suatu kerangka baca terbuka (open reading frame

=

ORF) yang

menyandikan 562 asam amino dari suatu protein prekuisor dengan berat molekd 61

kDa dengan suatu perkiraan kpernimpin (leader pepti&)

pada ujung

13

karboksil. Chernin et al. (1995) telah berhasil mendeteksi empat macam enzim
kitinase, yaitu dua macarn N-asetil-j3-D-glukosaminidasedengan berat molekul 89
kDa dan 67 ma,satu endokitinase dengan berat molekul 59 kDa, serta suaiu
kitobiosidase dengan berat molekul

50 kDa. Kuantifikasi enzim-enzirn kitinase

tersebut dilakukan menggunakan substrat kromogenik analog p-nitrofenil disakarida,
trisakarida dan tetrasakarida turunan N-asetifglukosarnin
Isolat kitinolitik dari Aerornonas m l a e yang diisolasi dari akar tanaman
buncis yang sehat yang tumbuh di tanah yang mengandung Sclerotium rolfsii
dilaporkan bahwa secara artifisid dapat mengendalikan Rhizoctonia s o h i dan
F w i w n oxyqmrwn fsp. vainfeeturn d
i kapas dan S. rolfsii di buncis di dalam

kondisi rumah kaca. Inbar & Chet (1991) telah mengkadcterisasi produk kitinase
yang dihasilkan. Ekspresi gen k i t i i s e dari A. d u e di Ecoli telah dianalisis oleh
Sitrit et al(1995) dan menunjukkan produk kitinase yang aktif. Selruens nukleotida
gen tersebut telah dikar%kterisasi,

dan dilaporkiui mempunyai kerninpan ti@

dengan gen chi4 dari S. marcescens. Produk kitinase dari suatu isolat Aeromonas sp
telah dikarakterisasi oleh Ueda et al. (1992) dan Utda et al.(1998), dan dilaporkan

ada delapan macam kitinase. Salah satu gen kitinase tersebut telah diklon dan di
karakterisasi &ens

nukleotidanya

BacilZus sp adalah kelompok bakteri yang termasuk berpotensi memproduksi

kitinase. Dari suatu isolat BueiZZm cirmIans telah berhasil diidentifkkasi clan
dikarakterisasi produk kitinase dan sekuens nukleotida sembitan macam kitinase

14

(Watanabe ei al., 1990; Watanabe et a/., 1992; Watanabe et al., 1994; Alam et al.,
1995; Alam et al., 1996)
Suatu penelitian enzim kitinase bakteri pada Vibrio harveyz (Svitil et al.,
1997) menunjukkan bahwa keragaman jenis enzim kitinolitik yang dihasilkan oleh
setiap rnikroorganisme disebabkan perbedaan jenis substrat kitin yang didegradasi,

dan jenis turunan kitin. Enzim-enzim kitinase yang dihasilkan menunjukkan
perbedaan berdasarkan pola restriksi DNA data imunologi, dan aktivitas enzim

Streptomyces adalah bakteri tanah bersifat saprofit yang merupakan salah
satu penghasii kitinase utama di dalam lingkungan tanah. Telah banyak gen-gen
kitinase yang diklon dari kelompok ini, yang sumbernya berasal dari S. plicatus
(Robbins et al., 1992), S. Iiviabw (Fujii & Miyashita, 1992; Miyashita & Fujii,
1992), S. gri~ars (Ohno et al., 1996), d m S. coelicolor (Saito el al., 1999).
Enzim kitinase yang terdapat pada tumbuhan tidak

menunjukkan homologi dengan

enzim kitinase

yang

satupun yang

dihasilkan

mikroba,

sebagaimana diutarakan oleh Oppenheim 62 Chet (1992). Roberts & Selitrennikoff
(1988) membandingkan aktivitas anti-

terhadap kitinase bakteri

kitinase tumbuhan dari biji gandum

dari Serratia m~llcescens,Stmptornyces

Pseudomoms stutzeri. Uji dil-

dan

berdasarkan penghambatan pemanjaagan hifa

cendawan uji Trichoderma reesei d m Phyumycxs bIakzsleearzus. Disebutkan
bahwa perbedaan aktivitas antifungi kedua jenis kitinase berkaitan dengan perbedaan
mekanisme dari dua kelas enzim kitinase. Kitinase tumbuhan merupakan
endokitinase, sedangkan kitinase bakteri adalah eksokitinase.

Pseudomoms fluorescens tennasuk

datam genus Pseudornonas pada

kelompok Pseudomonad. Kelompok ini merupakan kelompok kemoorganotrofik
aerob yang tidak menunjukkan metabolisme fermentatit respirasi bersifat obligat,
mempunyai kemarnpuan denitrifikasi, berupa Gram negatic

bersel tunggal,

berbentuk batang lurus atau bengkok, berukuran 0.5 - 1.0 pn x 1.5 - 4.0 pm,
dengan flagella polar, tunggal afaupun majemuk. Bakteri-bakteri Pseudomonad
hanya membutuhkan nutrien yang sederhana untuk pertumbuhannya, serta hidup

pada kicisaran pH netral dan suhu mesofilik (Madigan e f al., 1997). Namun, beberapa
bakteri kelompok ini dapat pula dijumpai bertahan hidup pada kondisi suhu, pH, dan
faktor-faktoc fisik dan kimia yang ekstrim (Lindow. 1992). Secara filogenetis
anggota kelompok ini tersebar di dalam kelornpok bakteri ungu di dalam kingdom

Balderi. Spesies-spesies genus P&monas

dapat dibedakan berdasarkrrn berbagai

karakter fisiologis dan genetiknya. Berdasarkan analisis 16s r R N q P. fluorescens
dikelornpokkan ke dalam bakteri ungu hlompok gamma, bersama P. a e ~ ~ m sP.
a.

putiab, dan P. syrhgue yang disebut subkelompok Fluoresens. Persen (%) mol GC
DNA bakteri subkelompok ini berkisar antara 58 sampai 67 %, dimana P.

fluorescens mempunyai % mol GC 59-61. Berdasarkm fisiologinya, P. fluorescens
dibedakan berdasarkan adanya flagella polar yang majemuk,
ketidak mampuanannya m e n g h a s i b -in,

dan berdasarkan

serta ketidak mampuannya

tumbuh sampai suhu 4 3 ' ~sebagaimanaP. ueruginos (Madigan et al., 1997).

Spesies-spesies Pseudomonas yang bet