Isolasi Dan Identifikasi Bakteri Endofit Tumbuhan Nyawai (Ficus Variegata Blume) Serta Analisis Senyawa Antibakteri.

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT
TUMBUHAN NYAWAI (Ficus variegata Blume) SERTA
ANALISIS SENYAWA ANTIBAKTERI

SHINTA LEONITA

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Identifikasi
Bakteri Endofit Tumbuhan Nyawai (Ficus variegata Blume) Serta Analisis
Senyawa Antibakteri adalah benar karya saya dengan arahan dari pembimbing
dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun.
Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun
tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan
dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut

Pertanian Bogor dan Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia
.

Bogor, Agustus 2015
Shinta Leonita
NRP G851130401

RINGKASAN
SHINTA LEONITA. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Endofit Tumbuhan Nyawai
(Ficus variegata Blume) Serta Analisis Senyawa Antibakteri. Dibimbing oleh
MARIA BINTANG dan FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Ficus variegata Blume merupakan tumbuhan obat yang mengandung
senyawa antibakteri. Bakteri endofit merupakan bakteri yang hidup bersimbiosis
dengan tanaman. Beberapa spesies bakteri endofit telah diteliti memiliki
kemampuan menghasilkan senyawa bioaktif, salah satunya antibakteri.
Tujuan penelitian ini adalah mengisolasi, menguji aktivitas antibakteri,
mengidentifikasi bakteri endofit dari tumbuhan nyawai, serta menganalisis
senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh isolat bakteri potensial menggunakan
GC-MS. Tahap awal pada penelitian ini yaitu isolasi bakteri endofit dari
tumbuhan nyawai. Isolat yang dihasilkan kemudian diuji aktivitas antibakterinya

terhadap Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, dan
Pseudomonas aeruginosa. Isolat yang mampu menghambat semua bakteri uji
dinamakan isolat potensial. Identifikasi dilakukan secara morfologi, biokimia, dan
molekuler berdasarkan sekuen 16S rRNA. Isolat potensial kemudian difermentasi
dalam media nutrient broth (NB) selama 48 jam. Supernatan hasil fermentasi
diekstraksi dengan etil asetat. Selanjutnya, analisis senyawa antibakteri yang
dihasilkan oleh bakteri endofit dilakukan dengan menggunakan GC-MS.
Sebanyak 29 isolat bakteri endofit diperoleh dari Ficus variegata Blume.
Berdasarkan uji aktivitas antibakteri, isolat bakteri endofit BH2 mampu
menghambat pertumbuhan semua bakteri uji. Hasil identifikasi morfologi dan
aktivitas biokimia menunjukkan bahwa bakteri isolat BH2 merupakan
Pseudomonas sp. Analisis sekuen 16S rRNA menggunakan BLAST menunjukkan
isolate BH2 memiliki presentase kemiripan dengan Pseudomonas aeruginosa
strain SV1 sebesar 99%. Hasil GC-MS menunjukkan bahwa senyawa aktif yang
diduga berperan sebagai antibakteri dari ekstrak etil asetat isolat BH2 diantaranya
asam nonanoat, dokosan, oktadekan, asam tetrakosanoat, asam heksadekanoat,
asam 9-oktadekanoat, asam 1,2-benzenedikarboksilat bis (2-etilheksil) ester,
tetradekan, eikosan, nonakosan, dan triakontan.
Kata kunci : Bakteri endofit, Ficus variegata Blume, Pseudomonas aeruginosa,
GC-MS, 16S rRNA

SUMMARY
SHINTA LEONITA. Isolation and Identification of Endophytic Bacteria from
Ficus variegata Blume and Analysis of Antibacterial Compounds. Supervised by
MARIA BINTANG dan FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Ficus variegata Blume known as medicinal plant which contains
antibacterial compounds. Endophytic bacteria are bacteria that live symbiotically
with plant. Some spesies of endophytic bacteria have the ability to produce
bioactive compound, one of them is antibacterial.
The objectives of this research are to isolate, test antibacterial activity,
identify endophytic bacteria from Ficus variegata Blume and analysis
antibacterial compounds from potential isolate using Gas Chromatography-Mass
Spectrometry (GC-MS). This research started with isolation of endophytic
bacteria from Ficus variegata Blume. The isolate were tested antibacterial activity
against Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, and
Pseudomonas aeruginosa. The isolate which able to inhibit the growth of all
against bacteria called potential isolate. Identification of potential isolate spesies
using morphological analysis, biochemical activity, and molecular analysis of 16S
rRNA. Potential isolate was fermented in nutrient broth (NB) for 48 hours. The
supernatant from fermentation was extracted with ethyl acetate. Analysis of

antibacterial compounds which produced by endophytic bacteria are using GCMS.
A total of 29 isolates of endophytic bacteria were obtained from Ficus
variegata Blume. Based on antibacterial activity test, endophytic bacteria isolate
BH2 from Ficus variegata Blume fruit had the ability to inhibit the growth of all
against bacteria. The result of the identification of morphology and biochemical
activity shows that bacteria isolate BH2 is Pseudomonas sp. Analysis of 16S
rRNA sequence using BLAST showed that BH2 isolate was related to
Pseudomonas aeruginosa strain SV1 with 99% identity. The result of GC-MC
analysis showed that active compound which estimated as antibacterial from ethyl
acetat extract of BH2 are : Nonanoic acid, Docosane, Octadecane, Tetracosanoic
acid, Hexadecanoic acid, 9-Octadecenoic acid, 1,2-Benzenedicarboxylic acid, bis
(2-ethyhexyl) ester, Tetradecane, Eicosane, Nonacosane, and Triacontane.
Keywords:

Endophytic bacteria, Ficus variegata
aeruginosa, GC-MS, 16S rRNA

Blume,

Pseudomonas

© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT
TUMBUHAN NYAWAI (Ficus variegata Blume) SERTA
ANALISIS SENYAWA ANTIBAKTERI

SHINTA LEONITA

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains

pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Dr. Mega Safithri, S.Si. M.Si.

PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat
dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul Isolasi
dan Identifikasi Bakteri Endofit Tumbuhan Nyawai (Ficus variegata Blume) Serta
Analisis Senyawa Antibakteri yang telah dilaksanakan sejak bulan September 2014
sampai Maret 2015 di Laboratorium Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan-IPB.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof Dr Drh Maria Bintang, MS dan
Prof Dr Drh Fachriyan Hasmi Pasaribu selaku pembimbing, Staf Laboratorium
Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan-IPB Bapak Agus Somantri, serta temanteman SPs Biokimia angkatan 2013 yang telah memberikan motivasi dalam
menyelesaikan karya ilmiah ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada

kedua orang tua, Teguh Purwo Wastianto, Idha Yunita Rizki, serta Nur Arifin atas
segala doa dan kasih sayangnya.
Penyusunan tesis ini tentunya tidak terlepas dari kekurangan. Oleh karena
itu, penulis mengharapkan adanya saran dan kritik yang bersifat membangun
untuk menyempurnakan penyusunan tesis ini. Semoga karya ilmiah ini dapat
memberikan informasi yang bermanfaat bagi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor, Agustus 2015
Shinta Leonita

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

vi

DAFTAR GAMBAR

vi

DAFTAR LAMPIRAN

vi

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian

1
1
3
3
3
3

2 METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Bahan

Alat
Prosedur Analisis Data

3
3
4
4
4

3 HASIL
Isolat Bakteri Endofit
Penapisan Aktivitas Antibakteri
Identifikasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Endofit Terpilih
Identifikasi Molekular 16S rRNA dan Pohon Filogenetik
Aktivitas Antibakteri Metabolit Isolat BH2
Identifikasi Senyawa dengan GC-MS

6
6
7

8
8
10
11

4 PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Endofit
Penapisan Aktivitas Antibakteri
Identifikasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Endofit Terpilih
Identifikasi Molekular 16S rRNA dan Pohon Filogenetik
Aktivitas Antibakteri Metabolit Isolat BH2
Identifikasi Senyawa dengan GC-MS

11
11
12
12
13
14
15

5 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran

16
16
17

DAFTAR PUSTAKA

17

LAMPIRAN

22

RIWAYAT HIDUP

33

vi

DAFTAR TABEL
1 Identifikasi morfologi sel dan biokimia
2 Perbandingan tingkat kemiripan sekuen isolat BH2 dengan beberapa
sekuen 16S rRNA pada data GenBank menggunakan program BLAST
3 Aktivitas antibakteri metabolit isolat BH2

8
9
10

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5

Tumbuhan nyawai
Presentase bakteri endofit yang diisolasi dari tumbuhan nyawai
Pembentukan zona hambat bakteri endofit
Pewarnaan Gram sel bakteri isolat BH2
Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari
isolat BH2
6 Zona hambat yang terbentuk pada pengujian ekstrak etil
asetat

2
7
7
8
10
11

DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7

Bagan Alir Penelitian
Determinasi tumbuhan nyawai
Data morfologi seluruh isolat bakteri endofit dari tumbuhan nyawai
Aktivitas antibakteri isolat bakteri endofit dari tumbuhan nyawai
Hasil sekuensing gen 16S rRNA bakteri endofit isolat BH2
Sekuen 16S rRNA isolat BH2 hasil pensejajaran
Hasil penelusuran homologi sekuen gen 16S rRNA dari bakteri endofit
isolat BH2 dengan sekuen pada Genbank
8 Kromatogram hasil identifikasi senyawa ekstrak etil asetat isolat BH2

23
24
23
26
27
29
30
32

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang memiliki biodiversitas tinggi dan
memiliki kawasan hutan hujan tropis yang luas. Berbagai penelitian telah
dilakukan untuk mengidentifikasi senyawa-senyawa bioaktif dari tumbuhan yang
dapat dijadikan sebagai bahan baku obat. Penggunaan tumbuhan sebagai sumber
obat meningkat seiring dengan meningkatnya resistensi bakteri penyebab infeksi
terhadap berbagai jenis obat. Saat ini, banyak dilakukan pencarian tumbuhan obat
yang belum teridentifikasi secara ilmiah di daerah pedalaman atau daerah hutan
(Rahmadani 2014).
Spesies tumbuhan hutan yang berpotensi sebagai tumbuhan obat tetapi
belum dimanfaatkan secara optimal, salah satu diantaranya adalah nyawai (Ficus
variegata Blume) (Gambar 1). Nama lain tumbuhan nyawai adalah kundang,
gondang (Jawa, Bali); kondang, (Sunda); ara, arah, aro, barai silai uding, haru
kucing (Sumatera); hara, lua, nyawi, nyawai (Kalimantan); aga, andharahi
montaha, bunta, rolli (Sulawesi); akau, andei yeva, gondal, sesem, kabato
(Maluku); ganalang, kanjilu (Sumba) (Sumarni et al. 2009). Tumbuhan nyawai
termasuk jenis pioner yang membutuhkan cahaya (intolerant) dan memiliki
pertumbuhan cepat (fast growing). Tumbuhan ini dapat mencapai 25 meter dan
mulai berbuah setelah umur 3 tahun. Buah tumbuh bergerombol pada batang atau
cabang. Buah muda berwarna hijau, kemudian menjadi kuning dan setelah matang
berwarna merah. Tipe buah termasuk buah periuk (Schiconium) dan berbentuk
bulat (Haryjanto & Prastyono 2014).
Nyawai (Ficus variegata Blume) merupakan salah satu tumbuhan tingkat
tinggi yang termasuk dalam genus Ficus. Tumbuhan genus Ficus merupakan
genus terbesar dalam keluarga Moraceae yang terdistibusi di daerah tropis dan
subtropis (Zheng et al. 2006). Penyebaran tumbuhan nyawai meliputi seluruh Asia
Tenggara, India, Jepang, Cina, Taiwan, Australia, Kepulauan Pasifik (Zhekun &
Gilbert 2003). Beberapa penelitian terbaru melaporkan tumbuhan genus Ficus
memiliki beberapa aktivitas. Akar nafas atau akar gantung Ficus bengalensis
memiliki aktivitas antipiretik (Hasti et al. 2011), Ficus religiosa berpotensi
sebagai antikanker (Gulecha & Sivakuma 2011), Ficus carica memiliki aktivitas
antimikroba (Jeong et al. 2009), Ficus racemosa memiliki aktivitas antioksidan
(Ravishankan et al. 2013) dan antibakteri (Shaikh et al. 2011). Beberapa genus
Ficus lainnya ada yang dijadikan obat secara langsung seperti Ficus quercifolia,
Ficus septica, dan Ficus variegata untuk mengobati penyakit bisul, borok, luka,
diare, eksim, dan penawar racun binatang berbisa (Aryani et al. 2009).
Nyawai merupakan salah satu jenis tumbuhan obat yang sejak lama
dimanfaatkan dalam pengobatan tradisional oleh masyarakat sekitar hutan. Getah
buah dan air rebusan buah nyawai digunakan dalam pengobatan tradisional
sebagai obat disentri (Dephut 2008). Buah nyawai telah dilaporkan memiliki efek
farmakologis diantaranya antikanker, antioksidan, dan antibakteri. Ekstrak buah
nyawai memiliki aktivitas antibakteri terhadap beberapa bakteri yang berperan
penting terhadap terjadinya penyakit pada masyarakat. Aktivitas tersebut
berkaitan dengan metabolit sekunder yang terkandung dalam buah nyawai yaitu

2

alkaloid dan saponin (Rijai 2013). Sedangkan pada daun nyawai telah diketahui
memiliki kandungan fenol yang tinggi (Lushaini et al. 2015).

Gambar 1 Tumbuhan nyawai (Rijai 2013; Lushaini et al. 2015)
Khasiat obat dari tumbuhan nyawai tidak terlepas dari kandungan senyawa
bioaktif yang dimilikinya. Senyawa bioaktif yang terkandung dalam tumbuhan
nyawai diduga erat kaitannya dengan keberadaan bakteri endofit dalam tumbuhan
tersebut. Beberapa studi ilmiah menunjukkan bahwa bakteri endofit mampu
menghasilkan senyawa bioaktif yang sama dengan tanaman inangnya (Radji
2005; Simarmata et al. 2007).
Pseudomonas, Bacillus dan Burkholderia adalah genus bakteri endofit
yang paling sering ditemui dan mampu menghasilkan senyawa bioaktif, salah
satunya berpotensi sebagai senyawa antimikroba (Ryan et al. 2007). Bacillus
subtilis yang diisolasi dari mulbery menunjukkan aktivitas antimikroba (QiongYing et al. 2012), Bacillus Pumilus dari cassava mampu menghasilkan
lipopeptida pumilacidin (Melo et al. 2009), Pseudomonas sp. yang diisolasi dari
umbi tanaman dahlia mampu memproduksi senyawa antibakteri yang mampu
menghambat bakteri patogen (Elita et al. 2013), serta Burkholderia cepacia
memiliki aktivitas antibakteri (Gohat et al. 2010). Jose & Christy (2013)
melaporkan bahwa Serratia, Bacillus, Pseudomonas, Micrococcus, dan
Enterobacter dari tanaman Rhizopora mucronata mampu menghasilkan senyawa
antimikroba yang aktif terhadap bakteri dan cendawan patogen. Beberapa hasil
penelitian senyawa antibakteri dari bahan alami terutama tumbuhan dan bakteri
endofit mampu memberikan hasil yang menjanjikan dalam pengembangan
senyawa-senyawa antibakteri baru.
Studi mengenai bakteri endofit dari tumbuhan nyawai diperlukan untuk
mengetahui potensi dari bakteri tersebut terutama untuk dikembangkan sebagai
alternatif senyawa obat antibakteri baru. Banyak penelitian yang telah dilaporkan
mengenai potensi bakteri endofit dalam menghasilkan senyawa bioaktif dari
berbagai tanaman obat. Selama ini belum pernah dilaporkan adanya bakteri
endofit dari tumbuhan nyawai. Oleh karena itu, perlu dilakukan penelitian
mencakup isolasi dan identifikasi bakteri endofit untuk menggali potensinya
dalam menghasilkan senyawa bioaktif berupa senyawa antibakteri.

3

Perumusan Masalah
Nyawai (Ficus variegata Blume) khususnya bagian buah telah dilaporkan
memiliki aktivitas antibakteri, sehingga berpotensi sebagai sumber obat
antibakteri baru. Kemungkinan besar senyawa antibakteri tersebut juga dihasilkan
oleh bakteri endofit yang hidup di dalam tumbuhan nyawai. Sampai saat ini,
belum dilaporkan mengenai isolasi dan identifikasi bakteri endofit tumbuhan
nyawai dalam menghasilkan senyawa antibakteri.

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi bakteri endofit
dari tumbuhan nyawai (Ficus variegata Blume) berdasarkan analisis morfologi,
biokimia, sekuen gen 16S rRNA, serta menganalisis senyawa antibakteri yang
dihasilkan oleh isolat bakteri endofit potensial menggunakan Gas
Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS).

Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai potensi
bakteri endofit dari tumbuhan nyawai (Ficus variegata Blume) sebagai penghasil
senyawa antibakteri yang akan memberikan konstribusi bagi pengembangan
penelitian dalam bidang kesehatan.

Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini mencakup isolasi bakteri endofit dari tumbuhan nyawai
(Ficus variegata Blume). Isolat-isolat tersebut diseleksi untuk menentukan isolat
yang memiliki aktivitas antibakteri melalui uji terhadap Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa. Isolat bakteri
endofit yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri uji diidentifikasi secara
morfologi, biokimia, molekuler dengan marka 16S rRNA, serta identifikasi
senyawa antibakteri yang dihasilkan dengan GC-MS.

2 METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian dilakukan pada September 2014 hingga Maret 2015 di
Laboratorium Bakteriologi Fakultas Kedokteran Hewan-IPB, Laboratorium
Biokimia FMIPA-IPB dan Laboratorium Pengujian Hasil Hutan P3KKPHH
Bogor.

4

Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tumbuhan nyawai
(Ficus variegata Blume) yang diperoleh dari daerah Gunung Sindur Bogor.
Tumbuhan nyawai ini telah diidentifikasi di Herbarium Bogoriense, Balitbang
Biologi-LIPI Bogor (Lampiran 2). Bahan lain yang digunakan yaitu Nutrient Agar
(Oxoid), Nutrient Broth (Difco), Na-hipoklorit 5,25%, nistatin, etanol 96%, kultur
bakteri uji (Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan
Pseudomonas aeruginosa), kristal violet, lugol, safranin, media untuk uji biokimia,
primer 27f (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’), 1492r (5’-GGTTACCTTGT
TACGAC TT-3’), 518F (5’-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3’) dan 800R (5’TACCAG GGTATCTAATCC-3’), InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA), Montage
PCR Clean up kit (Milipore), Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied
BioSystems, USA), n-heksana, etil asetat, kloroform, n-butanol dan kloramfenikol.

Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah pipet mikro, alat gelas,
vorteks, cawan Petri, inkubator, mikroskop, mesin sentrifugasi, corong pisah,
tabung eppendorf, mesin Polymerase Chain Reaction (PCR), Applied Biosystems
model 3730XL automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA)
dan Mesin GC-MS (Shimadzu Type GCMS-QP2010).

Prosedur Penelitian
Isolasi Bakteri Endofit (Kusumawati et al. 2014 modifikasi)
Sampel berupa beberapa bagian dari tumbuhan nyawai (Ficus variegata
Blume) seperti akar nafas (AR), batang (BT), daun (DN), dan buah (BH). Sampel
dicuci dengan air mengalir hingga bersih, kemudian dipotong masing-masing
sekitar 1-3 cm. Potongan sampel tersebut dilakukan sterilisasi permukaan secara
bertahap. Potongan sampel direndam etanol 96% selama 1 menit, dilanjutkan ke
dalam Na-hipoklorit 5.25% selama 5 menit, kemudian dibilas lagi ke dalam etanol
96% sebanyak tiga kali. Sampel yang telah disterilisasi lalu ditanam pada media
isolasi Nutrient Agar (NA) yang mengandung nistatin (0.01% b/v) kemudian
diinkubasi di ruang gelap pada suhu ruang dan diamati sampai adanya
pertumbuhan koloni. Pemurnian dilakukan dengan memindahkan 1 ose koloni
bakteri ke dalam media NA. Setelah diperoleh biakan murni, bakteri endofit
dipindahkan ke agar miring NA.
Penapisan Isolat Bakteri Endofit (Simarmata et al. 2007)
Peremajaan isolat bakteri endofit dan bakteri uji (Staphylococcus aureus,
Bacillus subtilis, Escherichia coli, dan Pseudomonas aeruginosa) dilakukan
dengan menginokulasi ke dalam media NA lalu diinkubasi pada suhu 28-300C
selama 24 jam. Koloni bakteri uji yang tumbuh dipindahkan ke dalam 5 ml media
Nutrien Broth (NB) kemudian diinkubasi pada suhu 28-300C selama 24 jam. Uji
aktivitas antibakteri dilakukan dengan menambahkan masing-masing 0,4 ml
kultur bakteri uji ke dalam 80 ml media NA cair yang besuhu ± 40 0C, kemudian

5

dituang ke dalam cawan Petri steril sebanyak ± 20 ml dan dibiarkan memadat.
Isolat bakteri endofit diinokulasikan ke dalam media yang telah mengandung
bakteri uji. Cawan tersebut diinkubasi selama 24-48 jam. Zona penghambat
diukur berdasarkan diameter zona bening yang terbentuk di sekitar isolat bakteri
endofit. Isolat bakteri endofit yang positif menunjukkan zona hambat terhadap
semua bakteri uji merupakan isolat potensial.
Identifikasi Morfologi dan Biokimia Isolat Bakteri Endofit Terpilih
Isolat bakteri endofit yang menghasilkan zona hambat terluas kemudian
diidentifikasi secara morfologi dan uji biokimia bakteri. Metode identifikasi
bakteri yang dilakukan secara konvensional tersebut meliputi : pewarnaan Gram,
uji katalase, uji oksidase, motilitas, pigmen, pertumbuhan, uji gula-gula, hidrolisis
gelatin, hidrolisis kasein, urea, sitrat, dan arginine. Hasil dari karakterisasi bakteri
tersebut kemudian dicocokan dengan Manual for the identification of Medical
Bacteria (Cowan 1974).
Identifikasi molekuler berdasarkan sekuen 16S rRNA
Isolasi DNA Bakteri Endofit Isolat BH2. Koloni isolat BH2
disuspensikan ke dalam 0,5 ml larutan garam steril pada tabung sentrifugasi 1,5
ml, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10000 rpm selama 10 menit. Pelet
lalu diresuspensi dengan penambahan 0,5 ml InstaGeneMatrix (Bio-Rad, USA).
Setelah itu, diinkubasi pada suhu 560C selama 30 menit, lalu dipanaskan 1000C
selama 10 menit. Setelah proses pemanasan, supernatant yang berisi DNA cetakan
siap untuk digunakan pada proses selanjutnya.
Amplifikasi Gen penyandi 16S rRNA. Amplifikasi DNA dilakukan
menggunakan mesin PCR. Primer yang digunakan pada penelitian ini adalah 27F
dan 1492R. Volume DNA cetakan yang ditambahkan adalah 1 µl dari 20 µl total
larutan reaksi. Amplifikasi yang dilakukan sebanyak 35 siklus, dengan kondisi
PCR sebagai berikut : denaturasi 940C selama 45 detik, annealing 550C selama 60
detik dan elongasi pada suhu 720C selama 60 detik. Selanjutnya dilakukan
purifikasi produk PCR menggunakan Montage PCR Clean up kit (Milipore).
Sekuensing Gen 16S rRNA, Analisis Bioinformatik dan Konstruksi
Pohon Filogenetik. Produk PCR kemudian disekuensing menggunakan dua
primer (518F dan 800R) dan Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied
BioSystems, USA) kemudian dianalisis menggunakan Applied Biosystems model
3730XL automated DNA sequencing system (Applied Biosystems, USA). Hasil
sekuensing berupa urutan DNA kemudian disejajarkan menggunakan program
BioEdit Sequence Aligment Editor versi 7.2.0 lalu dianalisis lebih lanjut
menggunakan program BLASTN (Kusumawati 2014). Analisis filogenetik
menggunakan program multiple aligment Clustal X2. Konstruksi jarak
kekerabatan genetik dengan metode Neighbor joining. Konstruksi jarak evolusi
dalam derajat kepercayaan menggunakan bootstrap value pada program NJ plot
(Singh et al. 2011).
Ekstraksi dan Pengujian Aktivitas Antibakteri Ekstrak Metabolit Sekunder
Isolat bakteri endofit isolat BH2 ditumbuhkan ke dalam 50 ml media NB
lalu diinkubasi pada suhu 28-300C dengan kecepatan 150 rpm selama 48 jam.
Hasil fermentasi disentrifugasi pada kecepatan 3600 rpm selama 10 menit untuk

6

memisahkan bagian pelet dan supernatan. Supernatan yang dihasilkan selanjutnya
diekstraksi dengan beberapa pelarut yaitu n-heksana, etil asetat, kloroform, nbutanol, dan etanol (1:1 v/v) menggunakan corong pisah. Ekstrak yang diperoleh
selanjutnya diuapkan pelarutnya. Ekstrak kering disimpan untuk analisis
selanjutnya (Garcia et al. 2012 modifikasi). Pengujian aktivitas antibakteri
dilakukan dengan menggunakan metode difusi sumur dengan mengukur diameter
penghambatan dari ekstrak tersebut (Garriga et al. 1993). Media NA yang
mengandung bakteri uji dituangkan ke dalam cawan Petri steril dan dibiarkan
memadat. Selanjutnya media tersebut dibuat lubang-lubang atau sumur dengan
diameter 6 mm. Ekstrak dari fraksi teraktif dimasukkan sebanyak 50 µl ke dalam
lubang tersebut dan diinkubasi dalam inkubator suhu 370C selama 24-48 jam.
Identifikasi Senyawa Antibakteri dengan GC-MS
Ekstrak dari fraksi teraktif selanjutnya dianalisis menggunakan mesin GCMS (Shimadzu tipe QP2010) untuk mengidentifikasi senyawa antibakteri dalam
ekstrak tersebut. Kolom yang digunakan adalah Capiler type Phase Rtx-5MS
dengan panjang 60 m dan diameter 0.25 mm. Kondisi alat meliputi : suhu kolom
50ºC, gas helium, SPL Temperature 280 ºC, MS Interface 280 ºC, pyrolisis
temperature 280 ºC, dan ion surface 200 ºC.

3 HASIL
Isolat Bakteri Endofit
Sebanyak 29 isolat bakteri endofit berhasil diisolasi dari beberapa bagian
tumbuhan nyawai yang berasal dari Kecamatan Gunung Sindur, Kabupaten
Bogor. Bagian daun (34%) memiliki jumlah isolat bakteri endofit terbanyak yaitu
sebanyak 10 isolat, kemudian diikuti akar nafas (28%) dan batang (28%) masingmasing sebanyak 8 isolat, dan terakhir adalah bagian buah (10%) sebanyak 3
isolat. Keragaman bakteri endofit dapat diketahui dengan melakukan karakterisasi
morfologi bakteri endofit yang telah diisolasi. Pengamatan morfologi yang
dilakukan meliputi warna, bentuk, elevasi, tepian, dan tekstur permukaan koloni
bakteri endofit. Hasil pengamatan morfologi koloni menunjukkan bahwa 29 isolat
bakteri endofit memiliki karakteristik yang berbeda (Lampiran 3). Berdasarkan
karakteristik morfologi sebagian besar isolat bakteri endofit bewarna putih tulang
(41%), bentuk tidak beraturan (62%), elevasi timbul (41%), tepian rata (48%),
serta tekstur permukaan halus (90%). Jumlah bakteri endofit yang berhasil
diisolasi dan hasil pengamatan morfologi bakteri tersebut dapat dilihat
berdasarkan presentase seperti pada Gambar 2.

7

Gambar 2 Presentase bakteri endofit yang diisolasi dari tumbuhan nyawai
Penapisan Aktivitas Antibakteri
Penapisan merupakan tahap seleksi dan penentuan bakteri endofit
tumbuhan nyawai yang memiliki aktivitas antibakteri. Hasil penapisan
menunjukkan dari 29 isolat bakteri endofit yang berhasil diisolasi ternyata hanya
7 isolat bakteri saja yang memiliki aktivitas antibakteri yaitu isolat DN11, DN12,
DN13, DN14, DN15, BT12, dan BH2. Sebanyak 6 isolat mampu menghambat
pertumbuhan Staphylococcus aureus, 5 isolat mampu menghambat Eschericia
coli, 4 isolat menghambat Bacillus subtilis, dan 4 isolat mampu menghambat
pertumbuhan Pseudomonas aeruginosa (Lampiran 4). Pemilihan isolat potensial
dilakukan dengan memilih isolat yang membentuk zona hambat paling besar dan
jernih pada semua bakteri uji. Isolat BH2 menunjukan aktivitas penghambatan
terhadap seluruh bakteri uji dan dipilih untuk tahap berikutnya (Gambar 3).

Gambar 3 Pembentukkan zona hambat bakteri endofit

8

Identifikasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Endofit Terpilih
Hasil pengamatan secara morfologi sel (Gambar 4), menunjukkan bahwa
isolat BH2 berbentuk batang dan termasuk bakteri Gram negatif. Berdasarkan
karakter morfologi dan biokimia yang diperoleh, isolat BH2 kemudian
dibandingkan dengan ciri-ciri bakteri yang diuraikan oleh Cowan (1974). Hasil
identifikasi isolat BH2 yaitu memiliki kemiripan dengan jenis Pseudomonas sp.
Hasil identifikasi isolat BH2 secara morfologi dan biokimia dapat dilihat pada
Tabel 1.

Gambar 4 Pewarnaan Gram sel bakteri endofit isolat BH2
Tabel 1 Identifikasi morfologi sel dan biokimia
Parameter uji
Morfologi sel
Katalase
Oksidase
Motilitas
Pigmen
Pertumbuhan
Uji gula-gula
Hidrolisis
Urease
Arginin

Hasil Reaksi
Gram
Negatif
+
+
+
+
420C
Glukosa
+
Gelatin
d
+

Bentuk
Batang

MacConkey
+
Laktosa
Kasein
-

Maltosa
d

Manitol
d

Salicin
-

Xylose
-

Keterangan : (+) = uji positif
(-) = uji negatif
(d) = uji dubius

Identifikasi Molekular 16S rRNA dan Pohon Filogenetik
Hasil sekuensing dari isolat BH2 diidentifikasi berdasarkan warna puncak
yang terbentuk pada kromatogram yang menggambarkan letak nukleotida yang
diamplifikasi secara hulu dan hilir (Lampiran 5). Berdasarkan alignment

9

(pensejajaran) dengan sekuen 16S rRNA, diperoleh pasangan basa sepanjang
1463 bp (Lampiran 6).
Urutan basa yang diperoleh dari hasil sekuensing selanjutnya dianalisis
dengan program BLAST. Hasil analisis sekuen 16S rRNA menggunakan pogram
BLAST menunjukkan isolat BH2 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas
aeruginosa strain SV1 dengan nilai bit score yang tinggi dan E-value sebesar 0
dengan nilai identiknya 99% (Tabel 2). Hasil penelusuran homologi sekuen gen
16S rRNA dari bakteri endofit isolat BH2 dengan sekuen Pseudomonas
aeruginosa strain SV1 pada Genbank (Lampiran 7).
Tabel 2 Perbandingan tingkat kemiripan sekuen isolat BH2 dengan beberapa
sekuen 16S rRNA pada data GenBank menggunakan program BLAST
Description
Pseudomonas aeruginosa
strain SV1
Pseudomonas aeruginosa
strain AR01
Pseudomonas sp. BAB3048
Pseudomonas aeruginosa
strain SBTPa-092
Pseudomonas aeruginosa
strain VSS6
Pseudomonas aeruginosa
strain B 6863
Pseudomonas aeruginosa
PA96 genome
Pseudomonas aeruginosa
strain S20410
Pseudomonas aeruginosa
strain C1501
Pseudomonas aeruginosa
LESlike4

Max
Identi

Bit score

E-value
score

Accession

99%

2689

0

KF322024.1

99%

2687

0

KF929428.1

99%

2687

0

KF984403.1

99%

2686

0

KF574910.1

99%

2684

0

KJ528948.1

99%

2684

0

KF668476.1

99%

2684

0

CP007224.1

99%

2684

0

KF956583.1

99%

2684

0

KF9763394.1

99%

2684

0

CP006985.1

Hasil analisis pohon filogenetik jarak genetik (neighbor joining) dapat
dilihat pada Gambar 5. Angka yang terdapat disetiap cabang pohon
memperlihatkan nilai bootstrap. Berdasarkan pohon filogenetik yang
mengikutsertakan beberapa data sekuen GenBank sebagai pembanding
menunjukkan bahwa isolat BH2 berada dalam satu kelompok spesies
Pseudomonas. Isolat BH2 memiliki kemiripan terdekat dengan Pseudomonas
aeruginosa strain SV1. Bacillus subtilis strain MRRP129 merupakan bakteri
Gram positif yang dijadikan sebagai out of group sehingga memiliki cabang yang
berbeda.

10

Gambar 5 Pohon filogenetik berdasarkan sekuen gen 16S rRNA dari isolat BH2
Aktivitas Antibakteri Metabolit Isolat BH2
Hasil pengamatan terhadap aktivitas antibakteri ekstrak metabolit isolat
BH2 dari fraksi-fraksi pelarut disajikan pada Tabel 3. Fraksi etil asetat, kloroform,
dan n-butanol yang memiliki aktivitas antibakteri, sedangkan fraksi n-heksana dan
etanol tidak menunjukkan aktivitas antibakteri.
Tabel 3 Aktivitas antibakteri metabolit isolat BH2
Pelarut
n-heksana
Etil asetat
Kloroform
n-butanol
Etanol

Bacillus
subtillis
0
16.03
10.17
10.44
0

Zona hambat (mm)
Staphylococcus
Escherichia
aureus
coli
0
0
11.37
8.73
7.95
8.2
8.94
8.68
0
0

Pseudomonas
aeruginosa
0
8.5
3.47
5.83
0

Fraksi etil asetat menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi terhadap bakteri
uji dibandingkan fraksi kloroform dan n-butanol. Hasil uji aktivitas antibakteri
menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat metabolit bakteri endofit memiliki
spektrum luas karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan
Gram negatif. Berdasarkan hasil tersebut, menunjukkan diameter zona hambat
ekstrak etil asetat metabolit bakteri endofit paling besar yaitu terhadap Bacillus
subtillis yang dapat dilihat pada Gambar 6.

11

Gambar 6 Zona hambat yang terbentuk pada pengujian ekstrak etil asetat
metabolit isolat BH2 terhadap Bacillus subtillis
Identifikasi Senyawa dengan GC-MS
Hasil analisis GC-MS terhadap fraksi teraktif etil asetat metabolit isolat
BH2 teridentifikasi sebanyak 30 senyawa berdasarkan penelusuran database
nama-nama senyawa yang terdapat dalam perangkat computer GC-MS (Lampiran
8). Senyawa dengan konsentrasi tertinggi adalah asam nonanoat. Senyawa yang
sering muncul adalah dokosan dan oktadekan. Senyawa yang diduga berperan
sebagai antibakteri dengan konsentrasi yang lebih kecil yaitu asam tetrakosanoat,
asam heksadekanoat, asam 9-oktadekanoat, asam 1,2-benzenedikarboksilat bis (2etilheksil) ester, tetradekan, eikosan, nonakosan, triakontan.

4 PEMBAHASAN
Isolat Bakteri Endofit
Bakteri endofit dapat diisolasi dari jaringan tumbuhan bagian dalam.
Bakteri endofit diisolasi dari tumbuhan nyawai melalui sterilisasi permukaan.
Menurut Hallman et al. (1997) bakteri endofit adalah bakteri yang hidup dalam
jaringan tanaman yang dapat diisolasi melalui sterilisasi permukaan jaringan.
Jumlah bakteri endofit di dalam tanaman tidak dapat ditentukan secara pasti,
namun bakteri ini dapat dideteksi dengan mengisolasi pada media agar (Bacon &
Hinton 2006). Media isolasi yang digunakan adalah media NA karena media ini
lebih cocok untuk isolasi bakteri endofit (Sulistiyani 2014) dan ditambahkan
nistatin sebagai antifungi (Kumala & Siswanto 2007).
Jumlah bakteri endofit tumbuhan nyawai lebih banyak terdapat pada
bagian daun daripada batang ranting, akar nafas, dan buah (Gambar 2). Jumlah
bakteri endofit juga lebih banyak terdapat di daun daripada di batang ranting pada
tumbuhan jeruk (Lecava et al. 2004). Berbeda dengan Kusumawati (2014) yang
mendapatkan jumlah bakteri endofit paling banyak dari batang tanaman miana.
Zinniel et al. (2002) juga menyatakan biasanya populasi bakteri lebih banyak di
akar dan sedikit di daun dan batang ranting. Seo et al. (2010), Mano et al. (2007),
dan Helander et al. (2007) menyatakan bahwa adanya variasi jumlah bakteri
endofit tersebut tergantung dari jenis tanaman, struktur tanah, umur tanaman,
sebaran geografis dan waktu pengambilan sampel. Jalur masuk bakteri endofit

12

umumnya melalui akar, namun demikian, bagian tanaman yang terpapar udara
langsung seperti daun (melalui stomata), bunga, batang ranting, dan kotiledon
dapat juga sebagai jalur masuk bakteri endofit. Bakteri endofit juga bisa
memasuki tanaman pada saat tanaman mengalami luka yang disebabkan oleh
faktor biotik dan faktor abiotik (Siddiqui & Shaukat 2003). Penelitian ini juga
diperoleh bakteri endofit pada akar nafas dan buah. Hal ini membuktikan bahwa
bakteri endofit dapat diisolasi dari berbagai jaringan tanaman serperti akar, daun,
batang, dan buah (Hallmann et al. 1997; Simarmata et al. 2007; Bacon & Hinton
2006).
Penapisan Aktivitas Antibakteri
Penapisan merupakan tahap seleksi dan penentuan bakteri endofit
tumbuhan nyawai yang memiliki aktivitas antibakteri. Isolat bakteri endofit yang
mempunyai aktivitas antibakteri dapat dilihat dari zona hambat yang terbentuk
pada cawan Petri. Zona hambat yang terbentuk disebabkan bahwa bakteri endofit
tersebut memiliki kemampuan untuk memproduksi senyawa ekstraseluler yang
bersifat antibakteri (Kusumawati 2014). Pembentukkan zona hambat juga
dipengaruhi oleh jenis bakteri uji. Menurut Tortora et al. (2007) dan Pandey et al.
(2011) menjelaskan bahwa adanya perbedaan antara dinding sel bakteri Gram
positif dan Gram negatif. Perbedaan ini yang menyebabkan bakteri Gram positif
lebih rentan karena pada bagian luar hanya memiliki lapisan peptidoglikan yang
tidak efektif sebagai penghalang, sedangkan bakteri Gram negatif memiliki
membran luar polisakarida yang menyebabkan dinding sel tidak dapat ditembus
oleh antibiotik, pewarna, dan deterjen.
Senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri memiliki sifat selektif
dalam menghambat pertumbuhan bakteri lain. Senyawa antibakteri kisaran luas
adalah senyawa antibakteri yang mampu membunuh berbagai jenis
mikroorganisme, sedangkan antibakteri kisaraan sempit ialah senyawa antibakteri
yang mampu mematikan hanya beberapa jenis mikroorganisme (Levinson 2004).
Pemilihan isolat potensial dilakukan dengan memilih isolat yang membentuk zona
hambat paling besar dan jernih pada semua bakteri uji. Berdasarkan hasil tersebut
maka isolat BH2 yang menunjukan aktivitas penghambatan terhadap seluruh
bakteri uji dan dipilih untuk tahap berikutnya (Gambar 3).
Identifikasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Endofit Terpilih
Pengamatan berdasarkan bentuk morfologi bakteri tidak cukup untuk
melakukan identifikasi bakteri. Ciri lainnya seperti sifat pewarnaan dan sifat
metabolisme bakteri berdasarkan serangkaian uji biokimia sangat membantu
dalam identifikasi bakteri. Wilson (2014) menyatakan bahwa uji biokimia
merupakan hal penting dalam identifikasi bakteri karena setiap isolat bakteri
memiliki ciri fisiologis yang spesifik untuk setiap uji. Hasil pengamatan
morfologi sel dan uji biokimia dapat dilihat pada Tabel 1.
Berdasarkan hasil pewarnaan Gram pada Gambar 4, menunjukkan bahwa
isolat BH2 termasuk bakteri Gram negatif. Bakteri Gram negatif masuk ke dalam
phylum Proteobacteria yang merupakan kelompok bakteri yang sering ditemukan
dan mendominasi sebagai bakteria endofit yang diisolasi dari berbagai tanaman
(Mano et al. 2007; Seo et al. 2010; Pereira et al. 2011). Berdasarkan pengamatan
bentuk sel isolat BH2 yang diisolasi dari buah nyawai berbentuk batang. Sinha et

13

al. (2012) menyatakan bahwa bakteri yang umum terdapat pada permukaan buah
meliputi bakteri Gram positif dan Gram negatif dengan struktur morfologi yang
bervariasi seperti batang, bacillary rods, dan bulat.
Beberapa uji biokimia yang penting dalam identifikasi isolat bakteri antara
lain katalase, oksidase, motilitas, pigmen, pertumbuhan, penggunaan karbohidrat,
hidrolisis gelatin dan kasein, urease, serta arginin. Hasil uji katalase isolat BH2
menunjukkan hasil positif. Aktivitas enzim katalase yang dimiliki oleh isolat
bakteri endofit dan biasanya terdapat pada sel-sel bakteri dengan metabolisme
aerobik (Wilson 2014). Hal ini menunjukkan bahwa isolat BH2 juga dapat
dikatakan bakteri aerob karena mampu menghasilkan enzim katalase yang
merupakan enzim yang penting bagi sel bakteri.
Tahapan uji biokimia ini sangat mempengaruhi dalam menentukan genus
dan spesies dari bakteri. Menurut Cowan (1974) identifikasi bakteri dengan teknik
konvensional adalah membandingkan bakteri yang sedang diidentifikasi dengan
bakteri yang telah teridentifikasi sebelumnya dan tidak dapat menemukan spesies
baru. Berdasarkan karakter morfologi dan biokimia yang diperoleh, isolat BH2
kemudian dibandingkan dengan ciri-ciri bakteri yang diuraikan oleh Cowan
(1974). Hasil identifikasi isolat BH2 yaitu memiliki kemiripan dengan jenis
Pseudomonas sp. Genus Pseudomonas merupakan bakteri endofit yang banyak
ditemukan hampir pada semua sampel tanaman. Hal ini dikarenakan bakteri ini
mudah ditumbuhkan dan berpotensi sebagai agen biokontrol (Miller et al. 2012).
Pseudomonas dikenal sebagai bakteri antagonis karena menghasilkan metabolit
sekunder berupa antibiotik terhadap bakteri patogen tumbuhan. Bakteri endofit
Pseudomonas yang berhasil diisolasi dari tanaman mangrove memiliki aktivitas
antibakteri dan antifungi (Jose & Christy 2013). Selain itu, Elita et al. (2013)
melaporkan bakteri endofit genus Pseudomonas sp. dari tanaman dahlia (Dahlia
variabillis) mengandung metabolit sekunder golongan saponin yang berpotensi
sebagai antibakteri karena dapat menghambat pertumbuhan Eschericia coli dan
Staphylococcus aureus.
Identifikasi Molekular 16S rRNA dan Pohon Filogenetik
Keanekaragaman bakteri endofit dapat dipelajari melalui karakterisasi
morfologis dan biokimia. Proses karakterisasi ini memiliki kelemahan karena
hanya melihat karakter fenotipnya saja. Seiiring dengan kemajuan ilmu biologi
molekular, teknik identifikasi berdasarkan molekuler saat ini lebih banyak
digunakan sebagai metode tambahan ataupun sebagai pengganti metode biokimia.
Keanekaragaman bakteri dapat dipelajari dengan mengamati profil 16S rRNA.
Profil 16S rRNA ini sangat spesifik untuk setiap bakteri sehingga dapat
membantu untuk identifikasi bakteri dari lingkungan. 16S rRNA adalah subunit
kecil penyusun ribosom pada semua organisme prokariot, sehingga dapat
digunakan untuk mengidentifikasi bakteri (Madigan et al 2009). Analisis gen
penyandi 16S rRNA dapat digunakan sebagai salah satu cara untuk
mendefinisikan spesies karena molekul ini bersifat ubikuitus, sehingga dapat
dirancang suatu primer universal untuk seluruh kelompok. Apabila sekuens basa
gen penyandi 16S rRNA memiliki nilai tingkat identitas maksimum lebih dari
97% maka dapat dikatakan memiliki kemiripan dengan sekuens homologinya
(Stakebrandt & Goebel 1994).

14

Amplifikasi sekuen 16S rRNA pada penelitian ini menggunakan primer
universal, yaitu primer forward dan reverse (27F dan 1492R). Daerah gen pada
primer tersebut banyak digunakan dalam filogenetika, klasifikasi, dan identifikasi
untuk bakteri karena sifat keberadaannya yang ubikuitas dengan fungsi yang
identik pada semua bakteri. Produk DNA hasil amplifikasi kemudian digunakan
untuk sekuensing.
Urutan basa yang diperoleh dari hasil sekuensing (Lampiran 6) selanjutnya
dianalisis dengan program BLAST. Program bioinformatika BLAST
menggunakan analisis statistik untuk menghasilkan bit score dan E-value.
Homologi yang tinggi ditunjukkan dengan bit score yang semakin besar.
Sedangkan nilai E-value yang semakin kecil menunjukkan tingkat homologi
kedua sekuens semakin tinggi. Hasil analisis sekuen 16S rRNA menggunakan
pogram BLAST menunjukkan isolat BH2 memiliki kemiripan dengan
Pseudomonas aeruginosa strain SV1 dengan nilai bit score yang tinggi dan Evalue sebesar 0 dengan nilai identiknya 99% (Tabel 2). Hal ini menunjukkan
bahwa tingkat homologi sekuen sampel sangat tinggi. Nilai E-value bernilai 0
menunjukkan bahwa kedua sekuen tersebut identik (Claverie & Notredame 2003).
Berdasarkan pohon filogenetik yang mengikutsertakan beberapa data
sekuen GenBank sebagai pembanding menunjukkan bahwa isolat BH2 berada
dalam satu kelompok spesies Pseudomonas (Gambar 5). Isolat BH2 memiliki
kemiripan terdekat dengan Pseudomonas aeruginosa strain SV1. Bakteri
Pseudomonas aeruginosa dapat memberikan keuntungan pada tumbuhan
inangnya. Berdasarkan hasil penelitian Hidayati (2014) membuktikan bahwa
bakteri endofit pseudomonas aeruginosa yang diisolasi dari tanaman karet mampu
menghasilkan hormon Indole Acetic Acid (IAA), Gliberelin dan Sitokinin. Selain
itu, Charyulu et al. (2012) menunjukkan bahwa estrak metabolit sekunder
Pseudomonas aeruginosa MTCC 5210 yang diisolasi dari sendimen laut mampu
menghasilkan senyawa antibakteri yang mampu penghambat pertumbuhan
mikroba resisten terhadap antibiotik seperti Methicillin Resisten Staphylococcus
aureus (MRSA).
Aktivitas Antibakteri Metabolit Isolat BH2
Isolasi senyawa aktif yang memiliki aktivitas antibakteri dilakukan dengan
menumbuhkan isolat bakteri potensial BH2 ke dalam media NB selama 48 jam
kemudian disentrifugasi untuk memisahkan sel bakteri dengan supernatan yang
mengandung senyawa ekstraseluler bersifat antibakteri (Kusumawati 2014).
Supernatan dari kultur bakteri endofit BH2 diekstrak menggunakan berbagai
pelarut n-heksana, etil asetat, kloroform, n-butanol, dan etanol. Fraksi-fraksi
pelarut tersebut selanjutnya dilakukan uji aktivitas antibakteri. Pengujian ini
dilakukkan untuk mengetahui potensi antibakteri dari ekstrak metabolit isolat
bakteri endofit tersebut dalam menghambat pertumbuhan bakteri uji. Zona hambat
yang terbentuk disebabkan adanya senyawa metabolit isolat BH2 yang memiliki
aktivitas antibakteri.
Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi etil asetat
merupakan fraksi teraktif karena menghasilkan aktivitas antibakteri lebih tinggi
dibandingkan dengan fraksi pelarut lainnya. Hasil penelitian juga menunjukkan
bahwa fraksi etil asetat tergolong sebagai antibakteri yang memiliki aktivitas kuat
karena mampu menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus subtillis dan

15

Staphylococcus aureus dengan rata-rata diameter zona hambat diatas 10 mm.
Sedangkan fraksi etil asetat tergolong aktivitas sedang terhadap Escherichia coli
dan Pseudomonas aeruginosa. Hal ini sesuai dengan Zahro & Agustini (2013)
yang menjelaskan pengelompokkan antibakteri ke dalam empat kelompok, yaitu
antibakteri dengan aktivitas rendah (20 mm).
Hasil uji aktivitas antibakteri menunjukkan bahwa fraksi etil asetat
metabolit bakteri endofit BH2 memiliki spektrum luas karena mampu
menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif. Berdasarkan
hasil tersebut, menunjukkan diameter zona hambat ekstrak etil asetat metabolit
bakteri endofit paling besar yaitu terhadap Bacillus subtillis yang dapat dilihat
pada Gambar 6. Kontrol positif yang digunakan adalah kloramfenikol karena
antibiotik ini sensitif terhadap bakteri Gram positif dan Gram negatif. Sedangkan
kontrol negatif yang digunakan adalah pelarut etil asetat. Pelarut etil asetat yang
diujikan sebagai kontrol negatif terhadap keempat bakteri uji tidak menunjukkan
aktivitas zona hambat. Hal ini membuktikan bahwa diameter zona hambat yang
dihasilkan oleh ekstrak etil asetat disebabkan oleh adanya senyawa-senyawa yang
berpotensi sebagai antibakteri dan bukan pengaruh dari pelarut etil asetat (Sugara
2011).
Besarnya diameter zona hambat terhadap Bacillus subtilis menunjukkan
bahwa bakteri Gram positif ini lebih sensitif terhadap fraksi etil asetat metabolit
isolat BH2 yang merupakan bakteri endofit Psedomonas aeruginosa. Charyulu et
al. (2012) melaporkan aktivitas antibakteri metabolit sekunder Pseudomonas
aeruginosa menunjukkan aktivitas bakterisidal terhadap Bacillus subtillis. Hasil
penelitian ini juga membuktikan bahwa isolat bakteri endofit Pseudomonas
aeruginosa yang diisolasi dari buah nyawai juga memiliki aktivitas antibakteri
seperti ekstrak tumbuhan inangnya. Rijai (2013) membuktikan bahwa zona
hambat yang dihasilkan oleh ekstrak fraksi etil asetat buah nyawai memiliki
aktivitas antibakteri dengan diameter zona hambat terbesar terhadap Bacillus
subtilli dibandingkan dengan Staphylococcus aureus, Escherichia coli dan
Psedomonas aeruginosa.
Identifikasi Senyawa dengan GC-MS
Bakteri endofit memiliki kemampuan mensintesis senyawa metabolit
sekunder yang termasuk ke dalam kelompok senyawa bioaktif (Baker & Satish
2013). Adanya aktivitas antibakteri dari ekstrak etil asetat metabolit BH2 terhadap
bakteri uji mengindikasikan keberadaan suatu senyawa antibakteri yang terdapat
dalam ekstrak tersebut. Untuk melihat identitas dari senyawa-senyawa yang
terdapat pada ekstrak tersebut maka dilakukan pengujian menggunakan Gas
Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS).
Hasil analisis GC-MS terhadap fraksi etil asetat metabolit isolat BH2 yang
diduga berperan sebagai antibakteri adalah asam nonanoat, dokosan, oktadekan,
asam tetrakosanoat, asam heksadekanoat, asam 9-oktadekanoat, asam 1,2benzenedikarboksilat bis (2-etilheksil) ester, tetradekan, eikosan, nonakosan, dan
triakontan. Senyawa-senyawa tersebut sebagian besar merupakan senyawa asam
lemak. Beberapa jenis asam lemak telah terbukti memiliki aktivitas antibakteri.
Asam lemak memiliki atom karbon lebih dari sepuluh yang dapat merusak
permeabilitas membran sitoplasma yang kemudian mengalami lisis dan

16

mengakibatkan kematian pada bakteri patogen (Naviner et al. 1999). Menurut
Murhadi (2009) asam-asam lemak yang paling dominan pada tanaman adalah
asam palmitat, asam stearat, asam oleat, dan asam laurat.
Asam nonanoat merupakan senyawa yang memiliki nilai kelimpahan
terbanyak yaitu 42%. Asam nonanoat atau pelargonic acid ini tidak larut air,
tetapi larut dalam pelarut organik, eter dan alkohol. Asam nonanoat juga
merupakan unsur utama dari minyak atsiri. Minyak atsiri dikenal memiliki
aktivitas antimikroba. Turunan asam nonanoat telah dilaporkan memiliki aktivitas
antimikroba yaitu mampu menghambat pertumbuhan Bacillus cereus, Salmonella
typhimirium, Mycobacterium smegmatis, Sarcina lutea, dan Candida utilis (Sahin
et al. 2006).
Senyawa asam heksadekanoat (asam palmitat) dan asam 9-oktadekanoat
(asam oleat) diketahui memiliki aktivitas antibakteri. Sugara (2011) melaporkan
bahwa ekstrak etil asetat tanaman obat bandotan memiliki aktivitas sebagai
antibakteri dengan komponen yang terkandung di dalamnya yaitu senyawa asam
heksadekanoat dan asam 9-oktadekanoat. Fitriani et al. (2015) juga menyatakan
ekstrak kasar bakteri endofit Pseudomonas yang diisolasi dari akar Ageratum
conyzoides L. mengandung senyawa asam 9-oktadekanoat. Asam 9-oktadekanoat
yang merupakan turunan dari asam oleat mampu menghambat pertumbuhan
Staphylococcus aureus dan Streptococcus pyogenes (Zheng et al. 2005).
Berdasarkan hasil analisa GC-MS didapatkan juga senyawa asam 1,2benzenedikarboksilat bis (2-etilheksil) ester. Senyawa asam 1,2benzenedikarboksilat juga ditemukan pada kapang endofit Taxus yunnanensis
yang mampu menghambat pertumbuhan Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis
dan (Chen et al. 2009). Penelitian yang dilakukan oleh Gohar et al. (2010)
menginformasikan keberadaan senyawa asam 1,2-benzenedikarboksilat bis (2etilheksil) ester pada ekstrak etil asetat metabolit sekunder Burkholderia cepacia
yang memiliki aktivitas antibakteri terhadap Aeromonas hydrophila, Edwardsiella
tarda dan Vibrio ordalli. Senyawa asam tetrakosanoat yang terkandung di dalam
ekstrak daun Finlaysonia obovata memiliki aktivitas antibakteri dengan
menghambat pertumbuhan bakteri patogen Aeromonas hydrophila, Pseudomonas
aeruginosa, Vibrio alginolticus, Staphylococcus aureus Eschericia colli,
Edwardsiella tarda dan Micrococcus sp. (Mishra & Sree 2007). Selain itu,
senyawa yang diperoleh dari ekstrak daun Azadirachta indica seperti tetradekan,
oktadekan, dokosan, eikosan, nonakosan, dan triakontan merupakan senyawa
yang juga memiliki aktivitas antibakteri terhadap Salmonella typhi (Akpuaka et al.
2013).

5 KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Bakteri endofit dapat diisolasi dari tumbuhan nyawai (Ficus variegata
Blume) yaitu sebanyak 29 isolat. Isolat BH2 merupakan isolat bakteri endofit
potensial yang mampu menghambat pertumbuhan keempat jenis bakteri uji. Hasil
identifikasi secara morfologi dan biokimia, menunjukkan isolat BH2 memiliki

17

kemiripan dengan Pseudomonas sp. Berdasarkan analisis sekuen 16S rRNA,
isolat BH2 memiliki presentase kemiripan dengan Pseudomonas aeruginosa strain
SV1 sebesar 99%. Hasil GC-MS menunjukkan bahwa senyawa aktif yang diduga
berperan sebagai antibakteri dari ekstrak etil asetat BH2 diantaranya asam
nonanoat, dokosan, oktadekan, asam tetrakosanoat, asam heksadekanoat, asam 9oktadekanoat, asam 1,2-benzenedikarboksilat bis (2-etilheksil) ester, tetradekan,
eikosan, nonakosan, dan triakontan.
Saran
Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terkait optimasi media dan waktu
fermentasi isolat BH2 dalam menghasilkan senyawa antibakteri dan meneliti
terkait mekanisme kerja dari senyawa antibakteri tersebut dalam menghambat
bakteri uji.

DAFTAR PUSTAKA
Akpuaka A, Ekwenchi EK, Dashak DA, Dildar A. 2013. Biological activities of
characterized isolate of n-hexan extract of Azadirachta Indica A.Juss
(Neem) leaves. New Yo