Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.).
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIBAKTERI
DARI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN SIRIH HIJAU
(Piper betle L.)
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Identifikasi
Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.)
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Ukhradiya Magharaniq Safira Purwanto
NIM G851130466
RINGKASAN
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO. Isolasi dan Identifikasi
Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.).
Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Salah satu penyebab terjadinya peningkatan kasus infeksi di Indonesia
adalah adanya resistensi bakteri patogen terhadap antibiotik. Karena itu, pencarian
dan penelusuran jenis dan sumber senyawa antibiotik baru, khususnya antibakteri,
menjadi perlu dilakukan. Bakteri endofit merupakan bakteri yang hidup
bersimbiosis dengan tanaman. Beberapa spesies bakteri endofit telah diteliti
memiliki kemampuan menghasilkan senyawa bioaktif, salah satunya antibakteri.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi isolat bakteri endofit
dari tanaman sirih hijau (Piper betle L.) yang memiliki aktivitas sebagai
antibakteri sekaligus mengidentifikasi senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat
tersebut.
Isolasi bakteri endofit dilakukan terhadap tanaman sirih hijau dalam kondisi
segar dengan metode sterilisasi permukaan. Isolat yang diperoleh berjumlah 14
isolat, 1 isolat berasal dari akar, 6 berasal dari batang dan 7 berasal dari daun.
Isolat-isolat tersebut diuji secara langsung terhadap 4 bakteri patogen, yaitu
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Salmonella
enteritidis. Berdasarkan hasil pengujian, diperoleh isolat dengan kode BS1
sebagai isolat yang mampu menghambat bakteri patogen paling banyak (ditandai
dengan terbentuknya zona hambat).
Identifikasi molekuler isolat BS1 dilakukan berdasarkan marka 16S rRNA
dan dianalisis menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool). Hasil identifikasi molekuler menunjukkan bahwa isolat BS1 memiliki
persentase kemiripan (identitiy) sebesar 94% dengan genus Pseudomonas sp.
Isolat BS1 difermentasi dalam media nutrient broth (NB) selama 48 jam.
Supernatan hasil fermentasi dipisahkan untuk kemudian diekstraksi. Ekstraksi
senyawa antibakteri hasil fermentasi isolat BS1 dilakukan dengan kloroform (1:1)
(v/v) menggunakan corong pisah. Hasil pengujian ekstrak kloroform terhadap
Staphylococcus aureus menunjukkan terbentuknya zona hambat. Analisis
senyawa dalam ekstrak kloroform BS1 menggunakan GC-MS menunjukkan
bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat BS1 tersebut adalah 1-methyl2,4-Imidazolidinedione dan piperazine.
Kata kunci: antibakteri, bakteri endofit, piperazine, Piper betle L., Pseudomonas
sp., 1-methyl-2,4-Imidazolidinedione
SUMMARY
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO. Isolation and
Identification of Antibacterial Compound from Green Betel’s (Piper betle L.)
Endophytic Bacteria. Supervised by MARIA BINTANG and FACHRIYAN
HASMI PASARIBU.
One factor that caused the increase of infectious case in Indonesia is
resistence of pathogenic bacteria to antibiotic. Thus, the exploration of new source
of antibiotic, especially antibacterial, is necessary. Endophytic bacteria are
bacteria that live symbiotically with plant. Some species of endophytic bacteria
have the ability to produce bioactive compound, one of them is antibacterial. The
objective of this research are to isolate and identify endophytic bacteria from
green betel (Piper betle L.) which has antibacterial activity and also to identify
antibacterial compound from the endophytic bacteria isolate.
Endophytic bacteria isolation from fresh green betel was done by surface
sterilization method. Total isolate obtained was 14 isolates, 1 isolate from root, 6
isolates from stem and 7 isolates from leaves. Those isolates was tested against 4
pathogenic bacteria, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus,
dan Salmonella enteritidis. Based on the test result, isolate code BS1 could inhibit
more pathogenic bacteria than other isolates (showed by inhibition zone).
Molecular identification of BS1 based on 16S rRNA gene and was analyze
using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programe. The result of
molecular identification showed that BS1 isolate has 94% correlation (identity)
with Pseudomonas sp. BS1 isolate was fermented in nutrient broth (NB) for 48
hours. The supernatant from fermentation separated for extraction. The extraction
of antibacterial compound from fermentation of BS1 isolate was done using
chloroform (1:1) (v/v). The test result of chloroform extract toward
Staphylococcus aureus showed inhibition zone. Analysis of BS1 chloroform
extract using GC-MS showed that the antibacterial compounds are 1-methyl-2,4Imidazolidinedione and piperazine.
Keywords: antibacterial, endophytic bacteria, piperazine, Piper betle L.,
Pseudomonas sp., 1-methyl-2,4-Imidazolidinedione
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIBAKTERI
DARI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN SIRIH HIJAU
(Piper betle L.)
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si
Judul Tesis : Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit
Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.).
Nama
: Ukhradiya Magharaniq Safira Purwanto
NIM
: G851130466
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof. Dr Drh Maria Bintang, MS
Ketua
Prof. Dr Drh Fachriyan H. Pasaribu
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr Drh Maria Bintang, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Penulis memanjatkan puji syukur kepada Allah SWT yang telah
melimpahkan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya tulis ini.
Karya tulis ini merupakan hasil penelitian tesis dengan judul “Isolasi dan
Identifikasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper
betle L.)”.
Melalui karya tulis ini penulis menyampaikan terima kasih kepada Prof. Dr
Drh Maria Bintang, MS dan Prof. Dr Drh Fachriyan Hasmi Pasaribu selaku Dosen
Pembimbing atas saran dan arahannya dalam penyusunan tulisan ini. Terima kasih
penulis sampaikan untuk teman-teman Program Akselerasi (Endah, Novi, Lusi,
dan Andin) atas semangat dan bantuan yang diberikan. Penulis juga ingin
mengucapkan terima kasih kepada Bapak Agus Sumantri, Mbak Eli dan Pak Jaka
atas bantuan teknis di laboratorium. Tak lupa untuk keluargaku tercinta (Ibu,
Ayah, Affan dan Ririn) yang selalu memberikan doa, semangat dan motivasi yang
tiada putus-putusnya. Serta, pihak-pihak lain yang ikut membantu. Penulis
menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam karya tulis ini. Walaupun
demikian, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat memberi manfaat.
Bogor, Agustus 2014
Ukhradiya Magharaniq Safira Purwanto
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
3
3
3
3
METODE
Alat
Bahan
Isolasi Bakteri Endofit
Seleksi untuk Memperoleh Bakteri Endofit Potensial
Identifikasi Bakteri Endofit Potensial dengan Marka 16S rRNA
Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri
3
3
4
4
4
4
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.)
Isolat Bakteri Endofit yang Berpotensi Menghasilkan
Senyawa Antibakteri
Identifikasi Isolat BS1 berdasarkan Marka 16S rRNA
Uji Antibakteri Ekstrak Kloroform BS1
Hasil Analisis Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform BS1
dengan GC-MS
5
5
10
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran
11
11
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
23
6
8
9
DAFTAR TABEL
1 Morfologi koloni dan kecepatan pertumbuhan isolat bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau
2 Diameter zona hambat yang terbentuk pada seleksi isolat bakteri
endofit dari sirih hijau terhadap bakteri patogen
6
7
DAFTAR GAMBAR
1 Tanaman sirih hijau (Piper betle L.)
2 Zona hambat yang terbentuk berdasarkan pengujian isolat BS1 terhadap
S. aureus (tanda panah)
3 Zona hambat yang terbentuk pada pengujian ekstrak kloroform BS1
terhadap S. aureus. (a) kontrol positif tetrasiklin 100µg/mL, (b) ekstrak
kloroform BS1 (tanda panah)
2
7
10
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
Bagan alir penelitian
Isolat bakteri endofit dari tanaman sirih hijau (Piper betle L.)
Sekuens DNA isolat BS1 hasil sequencing
Sekuens DNA isolat BS1 hasil pensejajaran
Hasil analisis sekuen konsensus BS1 dengan program BLAST
Kondisi GC-MS
Kromatogram GC-MS ekstrak kloroform isolat BS1
16
17
18
19
20
21
22
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit infeksi pada manusia merupakan jenis penyakit yang sangat
sering terjadi dan penyebarannya cukup luas. Penyakit infeksi sering disebut
sebagai penyakit menular, karena dapat berpindah dari satu individu ke individu
lain, baik melalui kontak langsung maupun tidak. Agen-agen pembawa penyakit
infeksi dapat berupa hewan, bakteri, virus atau jamur. Menurut WHO (2013),
kasus penyakit infeksi yang terdaftar di Indonesia tiap tahunnya cenderung berada
pada kisaran angka yang tetap. Data tahun 2009-2010 menunjukkan penurunan
kasus, sedangkan tahun 2010-2011 justru terjadi peningkatan kasus. Kasus infeksi
terbesar di Indonesia adalah penyakit tuberkulosis yang mencapai jumlah 328824
kasus pada tahun 2012.
Peningkatan kasus penyakit infeksi, terutama yang disebabkan oleh bakteri
patogen, salah satunya terkait dengan resistensi bakteri patogen terhadap
antibiotik komersil. Sebagai contoh, ditemukan adanya strain Staphylococcus
aureus yang resisten terhadap methicillin sehingga menyulitkan pengobatan
pasien yang terinfeksi bakteri tersebut (Ruhe et al. 2005). Oleh karena itu,
diperlukan kajian mengenai sumber dan jenis antibiotik baru yang bersifat lebih
alami dan aman bagi lingkungan. Salah satu sumber antibiotik, khususnya
antibakteri, adalah bakteri endofit.
Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang
tanpa menyebabkan gejala-gejala penyakit (Bhore & Sathisha 2010). Beberapa
jenis bakteri endofit diketahui mampu menghasilkan senyawa aktif yang bersifat
antibiotik (Castillo et al. 2003), antimalaria (Simanjuntak et al. 2004) dan
antifungi (Beck et al. 2003 dalam Ryan et al. 2008). Kemampuan bakteri endofit
menghasilkan senyawa aktif tersebut merupakan potensi yang dapat
dikembangkan mengingat umumnya senyawa aktif diperoleh dengan
mengekstraksi tanaman, khususnya tanaman obat. Untuk memperoleh senyawa
aktif dari tanaman dibutuhkan jumlah tanaman yang banyak dan hal ini terkait
dengan isu lingkungan serta kelestarian tanaman tersebut.
Salah satu tanaman obat yang sudah dikenal dan dimanfaatkan sejak lama
oleh masyarakat Indonesia adalah sirih hijau (Piper betle L.). Sirih hijau (Piper
betle L.) merupakan tanaman yang memiliki khasiat medis dan banyak digunakan
di Indonesia, India dan negara-negara di wilayah Indo-Cina lainnya, yaitu
Malaysia, Vietnam, Laos, Kamboja, Thailand, Myanmar dan Singapura. Bagian
tanaman sirih yang banyak digunakan adalah daunnya. Penggunaan daun sirih
telah lama diketahui memiliki efek penyembuhan antara lain mencegah dan
menyembuhkan batuk, mengurangi bau mulut serta mencegah infeksi yang
disebabkan fungi dan bakteri (Kumar et al. 2010).
Menurut Pradhan et al. (2013), tanaman sirih termasuk dalam divisi
Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Piperales, famili Piperaceae dan genus
Piper. Tanaman ini berupa semak yang tumbuh merambat, bentuk daun
menyerupai hati dengan batang semu. Daun sirih hijau segar mengandung air (8590%), protein (3-3.5%), lemak (0.4-1%), mineral (fosfor, kalium, kalsium, besi)
(2.3-3.3%), serat (2.3%), karbohidrat (0.5-6.1%), vitamin A dan C, tanin dan
2
minyak esensial (0.08-0.2%) (Guha 2006).
Selain itu, daun sirih juga
mengandung flavonoid, sterol, fenol (Chakraborty & Shah 2011) serta senyawa
yang memiliki sifat antibakteri seperti kavikol, asam dodekanoat, miristat,
palmitat dan oleat (Suliantari et al. 2012).
Gambar 1 Tanaman sirih hijau (Piper betle L.) (Sumber : koleksi pribadi, 2014)
Kajian mengenai sirih hijau dalam bidang kesehatan telah cukup banyak
dilakukan. Diantaranya, daun sirih yang diekstrak dengan akuades steril
menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap Streptococcus mutans secara in
vitro (Nalina & Rahim 2007). Al-Adhroey et al. (2011) menyatakan bahwa
esktrak metanol daun sirih memiliki aktivitas antimalaria terhadap Plasmodium
berghei. Senyawa hydroxychavicol (HC) yang diisolasi dari daun sirih hijau
diketahui memiliki aktivitas penghambatan terhadap xantin oksidase (Murata et al.
2009) dan juga bersifat antifungi terhadap genus Candida dan Aspergillus dalam
uji in vitro (Ali et al. 2010). Senyawa yang merupakan turunan HC, yaitu
hydroxychavicol acetate (HCA) memiliki berbagai aktivitas diantaranya sebagai
imunomodulator (Min et al. 2009) dan antibakteri (Sharma et al. 2009, Ali et al.
2011).
Allylpyrocatechol (APC) yang sebagian besar diisolasi dari daun sirih
memiliki efek terhadap pencernaan diantaranya melindungi lambung dari
timbulnya ulkus (luka lambung) (Tripathi 2008), menyembuhkan ulkus (Yadav et
al. 2009), antibakteri terhadap Staphylococcus aureus (Pradhan et al. 2013) dan
berperan sebagai anti-inflamasi (Santhakumari et al. 2006). Menurut (Zeng et al.
1997 dalam Kumar et al. 2010), senyawa piperbetol dalam sirih hijau memiliki
kemampuan selektif dalam menghambat agregasi platelet yang diinduksi oleh
mekanisme platelet activating factor (PAF) pada konsentrasi tertentu, sehingga
diharapkan dapat mencegah timbulnya penyakit kardiovaskular. Senyawa lain
yang merupakan turunan piperbetol antara lain metilpiperbetol, piperol A dan
piperol B juga telah berhasil diidentifikasi.
Berdasarkan hal tersebut, tanaman sirih hijau terutama bagian daunnya
memiliki banyak khasiat dan manfaat terutama di bidang medis. Bakteri endofit
yang berada dalam tanaman sirih hijau diduga mampu menghasilkan senyawa
aktif yang memiliki aktivitas dan manfaat serupa dengan tanaman inangnya.
Sejauh ini belum dilaporkan adanya isolasi bakteri endofit dari tanaman sirih hijau
serta pengujian terhadap senyawa aktif yang diproduksi bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau.
3
Perumusan Masalah
Bakteri endofit memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai sumber
antibiotik baru. Sirih hijau (Piper betle L.) merupakan salah satu tanaman obat
yang telah terbukti bersifat sebagai antibiotik. Penelitian terkait bakteri endofit
telah banyak dilakukan, namun penelitian tentang bakteri endofit pada tanaman
sirih hijau (Piper betle L.) sejauh ini belum dilaporkan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi isolat bakteri
endofit tanaman sirih hijau yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri sekaligus
mengidentifikasi senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat tersebut.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi mengenai kandungan
dan manfaat senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini mencakup isolasi bakteri endofit dari tanaman sirih hijau
(Piper betle L.). Isolat-isolat tersebut diseleksi untuk menentukan isolat yang
memiliki aktivitas antibakteri melalui uji terhadap Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Salmonella enteritidis. Isolat bakteri endofit
yang mampu menekan pertumbuhan bakteri uji diidentifikasi dengan marka 16S
rRNA dan dilanjutkan dengan isolasi serta identifikasi senyawa antibakteri yang
dihasilkan.
METODE
Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari – Agustus 2014 di Laboratorium
Bakteriologi, Bagian Mikrobiologi Medik Fakultas Kedokteran Hewan,
Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Laboratorium Pengujian
Hasil Hutan P3KKPHH Bogor.
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas,
autoklaf, inkubator, mesin sentrifugasi, corong pisah, mesin rotary evaporator,
kertas cakram, mesin Polymerase Chain Reaction (PCR), Applied Biosystems
model 3730XL automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA),
mesin GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) (Shimadzu Type
GCMS-QP2010).
4
Bahan
Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman sirih
hijau (Piper betle L.) yang diperoleh dari daerah Ciampea-Bogor dalam kondisi
segar, kultur Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, dan
Salmonella enteritidis (koleksi dari Laboratorium Bakteriologi Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor), media Nutrient Agar (NA), media
Nutrient Broth (NB), larutan natrium hipoklorit 5.25%, etanol 70%, akuades,
nistatin, InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA), primer 27F (5’-AGA GTT TGA
TCM TGG GTC AG-3’) dan 1492R (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT
T-3’), Montage PCR Clean Up kit (Milipore), primer 518F dan 800R, Big Dye
terminator cycle sequencing kit (Applied BioSystems, USA), kloroform,
tetrasiklin dan aseton.
Isolasi Bakteri Endofit (Modifikasi Desriani et al. 2013)
Bagian tanaman sirih yang digunakan adalah daun, batang dan akar dalam
kondisi segar. Sampel tanaman dalam keadaan segar dibersihkan dengan air
mengalir kemudian dipotong-potong sepanjang 1-3 cm dan dipisahkan menurut
bagian tanamannya. Potongan sampel direndam dalam etanol 70% selama 1 menit,
larutan natrium hipoklorit 5.25% selama 5 menit, dan dicuci dengan etanol 70%
sebanyak tiga kali. Potongan sampel diiris secara steril kemudian ditanam dalam
media nutrient agar (NA) yang mengandung nistatin. Media yang sudah
mengandung sampel tersebut diinkubasi pada suhu ruang dalam keadaan gelap
dan diamati setiap hari sampai ada pertumbuhan koloni. Jika selama 24 jam di
sekitar sampel tanaman belum menunjukkan adanya pertumbuhan mikroba,
sterilisasi permukaan dikatakan berhasil. Bakteri endofit yang tumbuh dimurnikan
satu per satu dan dikultivasi dalam agar miring. Isolat bakteri endofit yang telah
murni diidentifikasi secara morfologi berdasarkan warna koloni, bentuk tepian
koloni, elevasi koloni dan konsistensi koloni serta kecepatan pertumbuhan koloni.
Seleksi untuk Memperoleh Isolat Bakteri Endofit Potensial (Simarmata et al.
2007)
Isolat bakteri endofit dari agar miring diregenerasi ke media NA,
sedangkan bakteri uji diregenerasi ke dalam 5 mL media nutrient broth (NB) lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 °C. Sebanyak 0.4 mL kultur cair
bakteri uji dimasukkan ke dalam 80 mL media NA yang bersuhu ±40 °C. Lalu
dituangkan sebanyak 20 mL ke dalam cawan Petri steril dan ditunggu hingga
memadat. Isolat bakteri endofit yang akan diuji diinokulasikan ke media berisi
patogen menggunakan ose, kemudian diinkubasi selama 24 – 48 jam. Zona
hambat yang terbentuk diamati kemudian diameter zona hambat diukur. Isolat
bakteri endofit yang positif menunjukkan zona hambat terhadap semua patogen
dikatakan sebagai isolat potensial.
Identifikasi Isolat Bakteri Endofit Potensial berdasarkan Marka 16S rRNA
Isolasi DNA isolat bakteri endofit potensial. Koloni isolat bakteri
endofit potensial diambil dengan tusuk gigi steril dan disuspensikan dalam 0.5 mL
larutan garam steril kemudian disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit.
Pelet diresuspensikan dalam 0.5 mL InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA) kemudian
5
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 56°C dan dipanaskan selama 10 menit pada
100°C. Setelah dipanaskan, supernatan digunakan pada proses PCR.
PCR dan pengurutan basa (sequencing) gen 16S rRNA. Sebanyak 1 µL
DNA ditambahkan ke dalam 20 µL larutan reaksi PCR yang telah berisi primer
27F dan 1492R. Reaksi PCR dilakukan pada 94°C selama 45 detik, 55°C selama
60 detik dan 72°C selama 60 detik sebanyak 35 siklus. Hasil PCR dipurifikasi
menggunakan Montage PCR Clean up kit (Millipore). Hasil PCR yang telah
dipurifikasi kemudian disequencing menggunakan dua primer, yaitu primer 518F
dan 800R dan Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied BioSystems,
USA), kemudian dianalisis menggunakan Applied Biosystems model 3730XL
automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA).
Analisis hasil Sequencing. Hasil sequencing berupa urutan basa-basa DNA
disejajarkan menggunakan program BioEdit Sequence Alignment Editor ver. 7.2.0.
Hasil pensejajaran dianalisis lebih lanjut dengan program BLAST pada situs
www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mengetahui spesies isolat bakteri endofit potensial.
Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri
Fermentasi dan ekstraksi senyawa antibakteri (Modifikasi Melliawati et
al.. 2006). Sebanyak satu ose isolat bakteri endofit potensial ditumbuhkan dalam
50 mL media NB, kemudian difermentasi selama 48 jam dalam shaker (150 rpm,
pada suhu ruang 28-30°C) selama. Kemudian, hasil fermentasi disentrifugasi pada
kecepatan 5500 rpm selama 60 menit untuk memisahkan sel bakteri dan media.
Supernatan diekstraksi dengan pelarut kloroform (1:1) (v/v) menggunakan corong
pisah, lalu dievaporasi selama 15 menit pada suhu 50ºC. Ekstrak kloroform yang
diperoleh sebagian dilarutkan dalam Tween 80 untuk diuji daya antibakterinya
terhadap bakteri patogen dan sebagian lagi digunakan untuk analisis GC-MS.
Identifikasi ekstrak kloroform dengan GC-MS. Ekstrak kloroform
dilarutkan dalam aseton kemudian diinjeksikan ke alat GC-MS. Proses GC-MS
dilakukan menggunakan kolom kapiler tipe Phase Rtx-5MS dengan panjang 60 m
dan diameter 0.25 mm (Lampiran 6).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Bakteri Endofit dari Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.)
Sebanyak 14 isolat bakteri endofit telah diisolasi dari tanaman sirih hijau
yang berasal dari kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor. Bagian tanaman sirih
hijau dengan jumlah isolat bakteri endofit terbanyak adalah bagian daun (DS),
yaitu sebanyak 7 isolat, kemudian diikuti oleh bagian batang (BS) sebanyak 6
isolat dan terakhir adalah bagian akar (AS) sebanyak 1 isolat (Tabel 1). Bacon dan
Hinton (2006) menyatakan bahwa jumlah bakteri endofit di dalam tanaman tidak
dapat ditentukan secara pasti, namun bakteri ini dapat dideteksi dengan
mengisolasi pada media agar. Kecepatan pertumbuhan 11 isolat yang
ditumbuhkan pada media baru terhitung dalam kategori cepat, yaitu 24 jam (1
hari), sedangkan 2 isolat termasuk dalam kategori sedang, yaitu 48 jam (2 hari)
dan hanya 1 isolat yang pertumbuhannya lambat (lebih dari 2 hari) (Tabel 1).
6
Tabel 1 Morfologi koloni dan kecepatan pertumbuhan isolat bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau
Kode
isolat
AS1
DS1
DS2
DS3a
DS3b
DS4
DS5
DS6
BS1
Morfologi koloni
Kecepatan
Tepian
Elevasi
Berlendir pertumbuhan
Putih
Rata
Cembung
+++
Cepat
Putih tulang
Rata
Datar
+
Cepat
Putih
Rata
Datar
++
Cepat
Kuning cerah
Rata
Cembung
++
Sedang
Merah muda
Rata
Datar
+
Lambat
Krem
Rata
Datar
+
Sedang
Putih
Rata
Datar
+++
Cepat
Putih tulang
Bergerigi
Datar
+
Cepat
Putih kekuningan, bagian
Rata
Cembung
+++
Cepat
tepi transparan
BS2
Putih kekuningan
Rata, Licin
Cembung
+++
Cepat
BS3
Putih susu
Bergerigi
Datar
+++
Cepat
BS4
Putih mendekati transparan Rata, Licin
Cembung
+++
Cepat
BS5
Putih susu
Bergerigi
Datar
++
Cepat
BS6
Putih
Rata
Datar
++
Cepat
Keterangan : AS=akar sirih, DS=daun sirih, BS=batang sirih; kecepatan pertumbuhan
(pertumbuhan isolat pada media baru) : cepat = 1 hari, sedang = 2 hari, lambat = >2 hari
Warna
Bakteri endofit dari tanaman sirih hijau (Piper betle L.) mulai
menunjukkan pertumbuhan setelah potongan bagian tanaman diinokulasi pada
media NA selama ± 48 jam (2 hari). Pernyataan ini didukung oleh Zinniel et al.
(2002), Simarmata (2007), Arunachalam dan Gayathri (2010) dan Jalgaonwala et
al. (2010) yang menyatakan bahwa waktu pemilihan inkubasi selama minimal 2
hari bertujuan untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh merupakan bakteri
endofit, bukan bakteri filosfer, rizosfer atau kontaminan. Selain itu, penambahan
nistatin (antifungi) pada media juga bertujuan untuk mengoptimalkan hasil isolasi
(Kumala & Siswanto 2007).
Isolat bakteri endofit menunjukkan keragaman dari segi morfologi koloni.
Bakteri endofit masuk ke dalam jaringan tanaman umumnya melalui akar, namun
bagian tanaman yang terpapar udara langsung seperti bunga, batang dan kotiledon,
juga dapat menjadi jalur masuk bakteri endofit. Bakteri endofit yang telah masuk
ke dalam tanaman dapat tumbuh hanya di satu titik tertentu atau menyebar ke
seluruh tanaman. Bakteri ini dapat hidup di dalam pembuluh vaskular atau di
ruang intersel (Zinniel et al.. 2002), akar, batang, daun dan buah (Simarmata et al..
2007; Bacon & Hinton 2006). Jumlah bakteri endofit di dalam tanaman tidak
dapat ditentukan secara pasti, namun bakteri ini dapat dideteksi dengan
mengisolasi pada media agar (Bacon & Hinton 2006).
Bakteri endofit dapat bersifat obligat ataupun fakultatif dalam
mengkolonisasi inangnya. Bakteri endofit pada satu tanaman inang umumnya
terdiri dari beberapa genus dan spesies (Bhore & Sathisha 2010). Meskipun
bakteri ini memiliki kisaran inang yang luas, namun ada beberapa bakteri endofit
yang hanya dapat berasosiasi dengan inang dari famili tertentu.
Isolat Bakteri Endofit yang Berpotensi Menghasilkan Senyawa Antibakteri
Sebanyak 14 isolat bakteri endofit diuji terhadap 4 bakteri patogen, yaitu
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Salmonella
7
enteritidis. Hasil seleksi isolat bakteri endofit dari tanaman sirih hijau terhadap
bakteri patogen ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat berupa daerah
bening di sekitar koloni bakteri endofit (Gambar 2). Sebanyak 3 isolat bakteri
endofit, yaitu AS 1 (A), BS1 (I) dan BS2 (J) menunjukkan terbentuknya zona
hambat terhadap S. aureus (Tabel 2). Sedangkan isolat BS3 (K) hanya
menunjukkan sedikit penghambatan dan belum sepenuhnya membentuk daerah
bening seperti 3 isolat lainnya. Pengujian ke-14 isolat bakteri endofit terhadap S.
enteritidis bahkan tidak menunjukkan terbentuknya zona hambat.
Gambar 2
Zona hambat yang terbentuk berdasarkan pengujian isolat BS1
terhadap S. aureus (tanda panah)
Tabel 2 Diameter zona hambat yang terbentuk pada seleksi isolat bakteri endofit
dari sirih hijau terhadap bakteri patogen
Diameter zona hambat
E. coli
B. cereus
S.aureus
AS1 (A)
V
5 mm
DS1 (B)
DS2 (C)
DS3a (D)
DS3b (E)
DS4 (F)
DS5 (G)
DS6 (H)
BS1 (I)
V
V
3 mm
BS2 (J)
V
1 mm
BS3 (K)
V
BS4 (L)
BS5 (M)
BS6 (N)
keterangan : V = zona hambat sangat kecil dan sulit diukur
Kode isolat
S. enteritidis
-
Terbentuknya zona hambat di sekitar koloni isolat bakteri endofit
mengindikasikan kemungkinan adanya senyawa antibakteri yang mampu
membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Hal ini diperkuat oleh
Simarmata et al. (2007) dan Kumala & Siswanto (2007) yang melakukan uji
serupa dengan bakteri endofit asal tanaman obat Indonesia. Bakteri endofit yang
diisolasi menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen ditandai
dengan terbentuknya daerah bening di sekitar koloni bakteri endofit.
8
Interaksi bakteri endofit dan tanaman merupakan suatu bentuk simbiosis.
Simbiosis antara tanaman dengan bakteri endofit bersifat netral, mutualisme atau
komensalisme (Bacon & Hinton 2006). Simbiosis mutualisme antara bakteri
endofit dengan tanaman, dalam hal ini bakteri endofit mendapatkan nutrisi dari
hasil metabolisme tanaman dan melindungi tanaman dalam melawan patogen,
sedangkan tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang
diperlukan selama hidupnya (Tanaka et al. 1999 dalam Simarmata et al. 2007).
Bagian akar dan batang tanaman sirih hijau memang tidak lazim
digunakan sebagai obat. Umumnya, bagian tanaman sirih hijau yang digunakan
adalah bagian daun, terutama daun yang berumur cukup tua. Namun, hal ini tidak
menutup kemungkinan bahwa bakteri endofit dari bagian akar dan batang sirih
hijau juga memiliki potensi sebagai sumber antibakteri baru. Sebagai contoh,
penelitian yang dilakukan oleh Miller et al. (1998) berhasil mengisolasi senyawa
antibiotik dari bakteri endofit tanaman non-obat, yaitu sejenis rumput.
Beberapa contoh bakteri endofit mampu menghasilkan produk potensial
antara lain : bakteri endofit Bacillus polymixa hasil isolasi dari tanaman Anuma
(Artemisia annua) dapat memproduksi senyawa kimia antimalaria artemisinin di
dalam media cair sintetik (Simanjuntak et al. 2004), Streptomyces griseus dari
tanaman Kandelia candel menghasilkan asam p-aminoacetophenonic sebagai
antimikroba (Guan et al. 2005 dalam Ryan et al. 2008), Streptomyces NRRL
30562 dari tanaman Kennedia nigriscans menghasilkan munumbicin (antibiotik)
dan munumbicin D (antimalaria) (Castillo et al. 2002 dalam Ryan et al. 2008),
Serratia marcescens dari tanaman Rhyncholacis penicillata menghasilkan oocydin
A sebagai antifungi (Strobel et al. 2004 dalam Ryan et al. 2008), Paenibacillus
polymyxa dari tanaman gandum menghasilkan fusaricidin A-D sebagai antifungi
(Beck et al. 2003 dalam Ryan et al. 2008). Castillo et al. (2003) juga berhasil
mengisolasi senyawa kakadumycin dari Streptomyces sp., yaitu bakteri endofit
asal tanaman Grevillea pteridifolia.
Identifikasi Isolat BS1 berdasarkan Marka 16S rRNA
Identifikasi isolat BS1 dilakukan dengan teknik molekuler, yaitu dengan
marka (penanda) gen 16S rRNA. Gen rRNA merupakan bagian DNA yang paling
terkonservasi di dalam setiap sel. Gen rRNA mampu mempertahankan susunan
basa-basa nitrogennya (conserved) selama berjuta-juta tahun proses adaptasi. Gen
rRNA berfungsi menyandikan protein subunit kecil ribosom (small subunit
ribosom) yang merupakan bagian dari kompleks sistem ribosom di dalam sel
(Stiegler et al. 1981).
Gen yang menyandikan RNA pada subunit kecil ribosom ini dipilih
sebagai marka karena beberapa alasan diantaranya : terdapat di semua sel,
memiliki fungsi yang sama di tiap sel, memiliki dua area yang dapat digunakan
untuk mendeteksi kekerabatan jauh maupun dekat serta terkonservasi baik
susunan basanya maupun bentuk strukturnya.
Gen 16S rRNA memiliki panjang sekitar 1550 pb. Ukuran ini termasuk
besar dengan tujuan memudahkan perhitungan statistik dan agar dapat dibedakan
dengan lebih mudah. Dibandingkan dengan dua gen ribosom lain, yaitu 5S (120
pb) dan 23S (2900 pb), ukuran gen 16S rRNA termasuk tepat karena tidak terlalu
9
kecil dan juga tidak terlalu besar sehingga lebih memudahkan proses amplifikasi
dengan PCR (Clarridge 2004).
Berdasarkan hasil seleksi isolat bakteri endofit terhadap bakteri patogen,
diperoleh isolat dengan kode BS1 sebagai isolat potensial. Isolat BS1 dipilih
sebagai isolat potensial karena mampu membentuk zona hambat terhadap 3 jenis
bakteri patogen yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan Bacillus
cereus. Hasil sequencing isolat BS1 yang telah disejajarkan menunjukkan bahwa
gen 16S rRNA pada isolat tersebut berukuran 1530 pb (pasang basa) (Lampiran 4).
Hasil analisis sekuens DNA gen 16S rRNA dengan program BLAST
menunjukkan bahwa isolat BS1 memiliki persentase kemiripan (identitiy) sebesar
94% dengan genus Pseudomonas sp. (Lampiran 5).
Pseudomonas merupakan genus bakteri Gram negatif yang dikenal sebagai
plant-associated bacteria. Persebaran genus ini di alam cukup luas. Menurut Ryan
et al. (2008), beberapa bakteri endofit merupakan anggota bakteri penghuni tanah,
seperti Pseudomonas, Burkholderia dan Bacillus. Genus-genus tersebut diketahui
memiliki kemampuan menghasilkan metabolit sekunder yang bersifat antibiotik,
antikanker, antifungi, antivirus, insektisida dan immunosuppressant agents.
Bakteri endofit dengan genus Pseudomonas juga berperan sebagai agens
biokontrol pada tanaman, agen fitoremediasi dan pemacu pertumbuhan tanaman.
Miller et al. (1998) berhasil mengisolasi senyawa ecomycin B dan C yang
bersifat antifungi dari bakteri endofit Pseudomonas viridiflava. Bakteri endofit
tersebut berasal dari sejenis rumput asal Amerika dan Eropa. Bakteri endofit
genus Pseudomonas juga berhasil diisolasi oleh Jose dan Christy (2013) dari
tanaman mangrove. Isolat bakteri endofit genus Pseudomonas tersebut telah
diteliti memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri dan fungi patogen,
diantaranya Streptococcus pyogenes dan Candida albicans.
Uji Antibakteri Ekstrak Kloroform BS1
Ekstrak kloroform isolat BS1 diperoleh dari ekstraksi hasil fermentasi
selama 48 jam. Hasil fermentasi yang digunakan adalah supernatan dari kultur
isolat BS1. Pemilihan supernatan berdasarkan asumsi bahwa senyawa antibakteri
yang dihasilkan bakteri endofit bersifat ekstraseluler. Hal ini diperkuat oleh hasil
seleksi awal antara bakteri endofit dan bakteri patogen yang menunjukkan
terbentuknya zona hambat berupa daerah bening di sekitar koloni endofit.
Ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut kloroform sebanyak satu kali
(1:1). Ekstrak selanjutnya diuji terhadap S. aureus. Hasil pengujian ditunjukkan
dengan terbentuknya zona hambat di sekitar cakram (Gambar 3). Pemilihan
bakteri uji yaitu S. aureus berdasarkan hasil seleksi awal isolat bakteri endofit
(Tabel 2). Hasil tersebut menunjukkan bahwa isolat BS1 mampu menghambat S.
aureus dengan diameter zona hambat yang lebih besar dibanding terhadap bakteri
uji lainnya.
Pemilihan kloroform sebagai pelarut dalam proses ekstraksi dikarenakan
sifatnya yang non-polar sehingga dapat melarutkan senyawa-senyawa organik,
diantaranya senyawa golongan lipid. Menurut Chakraborty dan Shah (2001), salah
satu senyawa yang termasuk dalam golongan lipid, yaitu sterol, banyak terdapat
dalam daun sirih hijau. Sterol tersebut memiliki aktivitas antibakteri dengan
mengganggu permeabilitas dinding sel terutama bakteri Gram positif. Selain itu,
10
hasil penelitian Shukla et al. (2009) menunjukkan ekstrak kloroform daun sirih
hijau segar yang diekstraksi menggunakan kloroform mampu menghambat S.
aureus dengan zona hambat sebesar 6 mm. Kemungkinan bakteri endofit dari sirih
hijau mampu menghasilkan senyawa antibakteri yang sama dengan ekstrak
tanaman sirih hijau.
(a)
(b)
Gambar 3 Zona hambat yang terbentuk pada pengujian ekstrak kloroform BS1
terhadap S. aureus. (a) kontrol positif tetrasiklin 100µg/mL, (b)
ekstrak kloroform BS1 (tanda panah).
Hasil Analisis Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform BS1 dengan GC-MS
Antibakteri secara garis besar terbagi menjadi dua kelompok, yaitu yang
bersifat bakteriostatik dan bakterisidal. Senyawa antibakteri yang bersifat
bakteriostatik bekerja dengan menghambat pertumbuhan atau penggandaan sel
bakteri. Dalam kasus penyakit infeksi, senyawa antibakteri yang bersifat
bakteriostatik memberi kesempatan bagi sistem imun untuk membersihkan bakteri
dari sistem-sistem dalam tubuh. Senyawa antibakteri yang bersifat bakterisidal
bersifat membunuh bakteri dengan atau tanpa adanya kompetisi dengan sistem
imun. Secara umum mekanisme senyawa antibakteri, baik yang bersifat
bakteriostatik maupun bakterisidal, antara lain menghambat sintesis dinding sel,
menghambat kerja ribosom, menghambat sintesis asam nukleat, menghambat
metabolisme folat dan menghambat fungsi membran sel (Sosa et al. 2010).
Ekstrak kloroform BS1 dianalisis dengan GC-MS. Hasil analisis GC-MS
berupa kromatogram yang menunjukkan waktu retensi dan kelimpahan senyawa
di dalam sampel ditandai dengan puncak-puncak spektrum (Lampiran 7). Ekstrak
kloroform BS1 menunjukkan banyaknya puncak yang muncul dan beberapa
puncak saling tumpang-tindih. Hal ini kemungkinan disebabkan kondisi ekstrak
yang belum terlalu murni.
Berdasarkan data yang dihasilkan spektrum GC-MS, senyawa dengan
kelimpahan terbanyak adalah 1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo[4.3.0] nonane yaitu
sebesar 38.28%. Senyawa dengan kelimpahan terbesar kedua adalah kloroform.
Namun, karena waktu retensi kloroform tersebut berada di awal kemungkinan
kloroform tersebut merupakan sisa pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi.
Meski demikian, kloroform sendiri memiliki kemampuan sebagai antibakteri.
Senyawa dengan kelimpahan terbesar ketiga adalah 1-methyl-2,4Imidazolidinedione (9.55%). Menurut Bharat et al. (2013), senyawa kelompok
11
imidazol dan imidazol alkaloid dari sianobakteri memiliki kemampuan
menghambat pertumbuhan S. aureus.
Selain itu, berdasarkan spektrum GC-MS senyawa piperazine dengan
kelimpahan 3.55% juga terdeteksi dari ekstrak kloroform BS1. Piperazine dan
turunannya
seperti
N-[4-(2-{4-[(S)-(4-chlorophenyl)(phenyl)methyl]-1piperazinyl}acetyl) phenyl] acetamide memiliki sifat antibakteri terhadap bakteri
Gram positif dan negatif (Amita et al.. 2011). Chue et al.. (2011) juga melaporkan
bahwa turunan piperazine yang direaksikan dengan asam betulonat, yaitu N-[3Oxo-20(29)-lupen-28-oyl]-4-(3,4-dichlorophenyl)-piperazine dan N-[3-Oxo20(29)-lupen-28-oyl]-4-(4-trifluoromethylphenyl)-piperazine
memiliki
sifat
antibakteri.
Senyawa asam propionat (propionic acid) dalam bentuk 3-pyrrolidin-2-ylpropionic acid (2.17%) terdeteksi dalam ekstrak kloroform. Asam propionat
secara teknis bersifat menghambat pertumbuhan kapang dan bersifat bakterisidal.
Senyawa ini digunakan dalam industri pengawetan pangan terutama produk
hewani dan biji-bijian (The Dow Chemical Company 2008). Senyawa 1octadecene dan fenol dalam persentase relatif kecil juga terdeteksi di dalam
ekstrak kloroform BS1. Menurut Mishra dan Sree (2007), senyawa 1-octadecene
dari Finlaysonia obovata memiliki sifat sebagai antibakteri terhadap bakteri
patogen ikan. Ekstrak daun sirih hijau telah diteliti juga mengandung senyawa
fenol (Chakraborty & Shah 2011). Diduga, senyawa fenol yang terkandung di
dalam ekstrak daun sirih hijau berasal dari bakteri endofit yang berada di batang.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Sebanyak 14 isolat bakteri endofit telah diisolasi dari tanaman sirih hijau.
Pengujian ke-14 isolat terhadap empat bakteri patogen memunculkan satu isolat
potensial, yaitu BS1. Hasil analisis gen 16S rRNA, menunjukkan bahwa isolat
BS1 memiliki persentase kemiripan sebesar 94% dengan genus Pseudomonas sp.
Berdasarkan analisis dengan GC-MS ekstrak kloroform isolat BS1 terdiri dari
senyawa yang bersifat antibakteri antara lain 1-methyl-2,4-Imidazolidinedione dan
piperazine.
Saran
Perlu dilakukan optimasi waktu fermentasi isolat BS1 agar menghasilkan
rendemen ekstrak yang lebih banyak. Pemurnian hasil ekstraksi dengan
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (KLT) juga perlu dilakukan agar
analisis GC-MS memiliki hasil yang lebih baik.
DAFTAR PUSTAKA
Al-Adhroey AH, Nor ZM, Al-Mekhlafi HM, Amran AA, Mahmud R. 2011.
Antimalarial Activity of Methanolic Leaf Extract of Piper betle L. Molecules
16 : 107-118. DOI:10.3390/molecules16010107.
12
Ali, I. et al.. 2010. In vitro antifungal activity of hydroxychavicol isolated from
Piper betle L. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 9 (7).
Amita T, Mridula M, Manju V. 2011. Piperazine : the molecule of diverse
pharmacologic importance. IJRAP 2(5) : 1547-1548.
Arunachalam C, Gayathri P. 2010. Studies on bioprospecting of endophytic
bacteria from the medicinal plant of Andrographis paniculata for their
antimicrobial activity and antibiotic susceptibility pattern. Int J of Curr Pharm.
Res. 2 (4) : 63-68.
Bacon CW, Hinton DM. 2006. Bacterial endophytes : the endophytic niche, its
occupants, and its utility. Di dalam : Gnanamanickam SS, editor. PlantAssociated Bacteria. Netherland : Springer.
Beck HC, Hansen AM, Lauritsen FR. 2003. Novel pyrazine metabolites found in
polymyxin biosynthesis by Paenibacillus polymyxa. FEMS Microbiol Lett
220: 67–73. Di dalam : Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling
DN. 2008. Bacterial endophytes: recent developments and applications Mini
Review. FEMS Microbiol Lett 278 : 1–9.
Bharat N, Irshad Md, Rizvi Md MA, Fatma T. 2013. Antimicrobial and cytotoxic
activities of cyanobacteria. Int. J. of Innovative Res. in Sci., Eng., and Technol.
2(9) : 4328-4343.
Bhore SJ, Sathisha G. 2010. Screening of endophytic colonizing bacteria for
cytokinin-like compounds: crude cell-free broth of endophytic colonizing
bacteria is unsuitable in cucumber cotyledon bioassay. World J. Agric. Sci. 6
(4): 345-352.
Castillo UF, Strobel GA, Ford EJ. 2002. Munumbicins,wide-spectrum antibiotics
produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans.
Microbiology 148:2675–2685. Di dalam : Ryan RP, Germaine K, Franks A,
Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes: recent developments and
applications Mini Review. FEMS Microbiol Lett 278 : 1–9.
Castillo U, et al.. 2003. Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces
sp.NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia. FEMS Microbiology
Letters 224: 180-190.
Chakraborty D, Shah B. 2011. Antimicrobial, antioxidative and antihemolytic
activity of Piper betle leaf extracts. Int. J. of Pharm. And Pharmaceutical Sci.
3 (3) : 192-199.
Chue KT, Chang MS, Ten LN. 2011. Synthesis and antibacterial activity of
betulonic acid amides with piperazine derivatives. Chem. of Natural
Compounds 47(5) : 759-763.
Clarridge JE. 2004. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification
of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin. Microbiol.
Rev. 17 (4) : 840-862.
Desriani, Kusumawati DE, Rivai A, Hasanah N, Amrinola W, Triratna L,
Sukma A. 2013. Potential endophytic bacteria for increasing paddy var
rojolele productivity. Int. J. on Adv. Sci., Eng. and Information Tech. 3 (1) :
76-78.
Guan SH, Sattler I, Lin WH, Guo DA, Grabley S. 2005. p-Aminoacetophenonic
acids produced by a mangrove endophyte: Streptomyces griseus subspecies. J
Nat Prod 68: 1198–1200. Di dalam : Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan
13
DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes: recent developments and
applications Mini Review. FEMS Microbiol Lett 278 : 1–9.
Guha P. 2006. Betel leaf : the neglected green gold of india. J. Hum. Ecol. 19 (2) :
87-93.
Jalgaonwala RE, Mohite BV, Mahajan RT. 2010. Evaluation of endophytes for
their antimicrobial activity from indigenous medicinal plants belonging to
north maharashtra region india . Int. J. on Pharm and Biomed Res. 1 (5) : 136141.
Jose AC, Christy PH. 2013. Assessment of antimicrobial potential of endophytic
bacteria isolated from Rhizophora mucronata. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci.
2 (10) : 188-194.
Kumala S, Siswanto EB. 2007. Isolation and Screening of Endophytic Microbes
from Morinda citrifolia and their Ability to Produce Anti-Microbial
Substances. Microbiol. Indones. 1 (3) : 145-148.
Kumar N, Misra P, Dube A, Bhattacharya S, Dikshit M, Ranade S. 2010. Piper
betle Linn. a maligned Pan-Asiatic plant with an array of pharmacological
activities and prospects for drug discovery. Curr. Sci. 99 (7) : 922-932.
Melliawati R, Widyaningrum DN, Djohan AC, Sukiman H. 2006. Pengkajian
bakteri endofit penghasil senyawa bioaktif untuk proteksi tanaman.
Biodiversitas 7(3) : 221-224.
Miller CM, Miller RV, Garton-Kenny D, Redgrave B, Sears J, Condron MM,
Teplow DB, Strobel GA. 1998. Ecomycins, unique antimycotics from
Pseudomonas viridiflava. J. of App. Microbiol. 84 : 937-944.
Min HJ, Nam JW, Yu ES, Hong JH, Seo EK, Hwang ES. 2009. Effect of naturally
occurring hydroxychavicol acetate on the cytokine production in T helper cells.
Int. Immunopharmacol. 9 : 448–454.
Mishra PM, Sree A. 2007. Antibacterial activity and GCMS analysis of the extract
of leaves of Finlaysonia obovata (a mangrove plant). Asian J. of Plant Sci.
6(1) : 168-172.
Murata K. et al.. 2009. Hydroxychavicol: a potent xanthine oxidase inhibitor
obtained from the leaves of betel. Piper betle. J. Nat.Med. 63 : 355–359.
Nalina T, Rahim ZHA. 2007. The crude aqueous extract of Piper betle L. and its
antibacterial effect towards Streptococcus mutans. American Journal of
Biotechnology and Biochemistry 3 (1): 10-15.
Pradhan D, Suri KA, Pradhan DK, Biswasroy P. 2013. Golden heart of the
nature : Piper betle L. J. of Pharmacognosy and Phytochem. 1 (6) : 147-167.
Ruhe JJ, Monson T, Bradsher, RW, Menon A. 2005. Use of Long-Acting
Tetracyclines for Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections:
Case Series and Review of the Literature. Clin. Inf. Dis. 40:1429–1434.
Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ , Dowling DN. 2008. Mini Review :
Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol
Lett 278:1–9.
Santhakumari P, Prakasam A, Pugalendi KV. 2006. Antihyperglycemic activity
of Piper betle leaf on streptozotocin-induced diabetic rats. J. Med. Food 9:
108–112.
Sharma S. et al.. 2009. Evaluation of the antimicrobial, antioxidant, and antiinflammatory activities of hydroxychavicol for its potential use as an oral care
agent. Antimicrob. Agents Chemother. 53 : 216–222.
14
Shukla R, Satish V, Singh VK, Kumar S, Gupta S, Gavani S. 2009. Antibacterial
Activity of Fresh leaves of “Piper betle Linn. The Pharma Research 1 : 110113.
Simanjuntak P, Bustanussalam, Otovina DM, Rahayuningsih M, Said EG. 2004.
Isolasi dan identifikasi artemisinin dari hasil kultivasi mikroba endofit dari
tanaman Artemisia annua. [studi mikroba endofitik tanaman Artemisia spp.].
Majalah Farmasi Indonesia 15 (2) : 68-74.
Simarmata R, Lekatompessy S, Sukiman H. 2007. Isolasi mikroba endofitik dati
tanaman obat sambung nyawa (Gymura procumbens) dan analisis potensinya
sebagai antimikroba. Berk Penel Hayati 13 : 85-90.
Sosa A.de J, Byarugaba DK, Amabile C, Hsueh PR, Kariuki S, Okeke IN. 2010.
Antimicrobial resistance in developing countries. Springer. Doi :10.1007/9780-387-89370-9_2.
Stiegler P, Carbon P, Zuker M, Ebel JP, Ehresmann C. 1981. Structural
organization of the 16S ribosomal RNA from E. coli : Topography and
secondary structure. Nucleic Acids Res. 9(9): 2153–2172.
Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J. 2004. Natural products from endophytic
microorganisms. J Nat Prod 67: 257–268. Di dalam : Ryan RP, Germaine K,
Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes: recent
developments and applications Mini Review. FEMS Microbiol Lett 278 : 1–9.
Suliantari, Jenie BSL, Suhartono MT. 2012. Aktivitas antibakteri fraksi-fraksi
ekstrak sirih hijau (Piper betle Linn.) terhadap patogen pangan. J. Teknol. dan
Industri Pangan 23 (2) : 217-220.
Tanaka M, Sukiman H, Takebayashi M, Saito K, Suto M, Prana MS, Tomita F.
1999. Isolation, screening and phylogenetic identification of endophytes from
plants in hokaido japan and java indonesia. Microbes and Environment 14(4):
237–241. Di dalam : Simarmata R, Lekatompessy S, Sukiman H. 2007. Isolasi
mikroba endofitik dati tanaman obat sambung nyawa (Gymura procumbens)
dan analisis potensinya sebagai antimikroba. Berk Penel Hayati 13 : 85-90.
The Dow Chemical Company. 2008. Product safety assessment : proopionic acid.
The Dow Chemical Company.
Tripathi S. 2008. Chemical investigation of betel vine (Piper betle L.) as
antioxidant agent [Ph D thesis]. Lucknow University, Lucknow.
[WHO] World Health Organization. 2013. Selected infectious diseases: Selected
diseases for latest years by country (latest years) [terhubung berkala]
http://www.apps.who.int/gho/data/view.main.1540?lang=en (3 Januari 2014).
Yadav SK, Adhikary B, Maity B, Bandyopadhyay SK, Chattopadhyay S. 2009.
The gastric ulcer-healing action of allylpyrocatechol is mediated by
modulation of arginase metabolism and shift of cytokine balance. Eur. J.
Pharmacol. 614 :106–113.
Zeng HW, Jiang YY, Cai DG, Bian J, Long K, Chen ZL. 1997. Piperbetol,
methylpiperbetol, piperol A and piperol B: a new series of highly specific
PAF receptor antagonists from Piper betle. Planta Med. 63 : 296–298. Di
dalam : Kumar N, Misra P, Dube A, Bhattacharya S, Dikshit M, Ranade S.
2010. Piper betle Linn. a maligned Pan-Asiatic plant with an array of
pharmacological activities and prospects for drug discovery. Curr. Sci. 99 (7) :
922-932.
15
Zinniel DK et al.. 2002. Isolation and characterization of endophytic colonizing
bacteria from agronomic crops and prairie plant. Appl. Environ. Microbiol. 68
(5) : 2198–2208.
16
Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Tanaman sirih
hijau
Isolasi bakteri
endofit
Isolat bakteri
patogen
Isolat bakteri
endofit
Regenerasi bakteri
patogen dan bakteri
endofit
Seleksi awal untuk memperoleh
bakteri endofit potensial
Identifikasi dengan
marka 16S rRNA
Spesies bakteri
endofit
Isolat bakteri endofit potensial
Fermentasi
Ekstraksi senyawa
antibakteri
Ekstrak
Identifikasi dengan
GC-MS
Uji antibakteri terhadap
bakteri patogen
Senyawa antibakteri
17
Lampiran 2 Isolat bakteri endofit dari tanaman sirih hijau (Piper betle L.)
18
Lampiran 3 Sekuens DNA isolat BS1 hasil sequencing
>BS1_518F
CGGGGGGGCCCTCTTCTCTAATCCTGGTATTAAAACGCGCGAACGTGGTTCCTTAGGTGG
ATGTCAAAGCCCCGGGCTCTCCTGGGAACTGCGTCGAAAACTGGCCACCTCTGCTACCGT
AGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAACGAACACCAG
TGGCCAACGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA
CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAATGATGTCCACTAGCCGTTGGAATCCT
TGAGATTTTATGGGCGCAGCTAACGCCTTACCTTGAGCGCCTGGGGAGTACGGCCGCACG
GTTAAAACTGATATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCTGCGGAGCATGTGGTTTAATTC
GAAGCAGCGCCAAGAACCTTACCAGGGCTTGCCATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATT
GGTGCCTTCGGGAACTCTGACACCGGTGCTGCATGGCTGTCGTCCGCTCGTGTCGTGAGA
TGTTGGGATAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGAGTTACCAGCACTTTATCGT
GGTCACTCTAAGGAGGACTGCCGGTGACCAACCGGAGGAACGTGGGGATGACGTCC
DARI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN SIRIH HIJAU
(Piper betle L.)
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Isolasi dan Identifikasi
Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.)
adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum
diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber
informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak
diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam
Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Agustus 2014
Ukhradiya Magharaniq Safira Purwanto
NIM G851130466
RINGKASAN
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO. Isolasi dan Identifikasi
Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.).
Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan FACHRIYAN HASMI PASARIBU.
Salah satu penyebab terjadinya peningkatan kasus infeksi di Indonesia
adalah adanya resistensi bakteri patogen terhadap antibiotik. Karena itu, pencarian
dan penelusuran jenis dan sumber senyawa antibiotik baru, khususnya antibakteri,
menjadi perlu dilakukan. Bakteri endofit merupakan bakteri yang hidup
bersimbiosis dengan tanaman. Beberapa spesies bakteri endofit telah diteliti
memiliki kemampuan menghasilkan senyawa bioaktif, salah satunya antibakteri.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi isolat bakteri endofit
dari tanaman sirih hijau (Piper betle L.) yang memiliki aktivitas sebagai
antibakteri sekaligus mengidentifikasi senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat
tersebut.
Isolasi bakteri endofit dilakukan terhadap tanaman sirih hijau dalam kondisi
segar dengan metode sterilisasi permukaan. Isolat yang diperoleh berjumlah 14
isolat, 1 isolat berasal dari akar, 6 berasal dari batang dan 7 berasal dari daun.
Isolat-isolat tersebut diuji secara langsung terhadap 4 bakteri patogen, yaitu
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Salmonella
enteritidis. Berdasarkan hasil pengujian, diperoleh isolat dengan kode BS1
sebagai isolat yang mampu menghambat bakteri patogen paling banyak (ditandai
dengan terbentuknya zona hambat).
Identifikasi molekuler isolat BS1 dilakukan berdasarkan marka 16S rRNA
dan dianalisis menggunakan program BLAST (Basic Local Alignment Search
Tool). Hasil identifikasi molekuler menunjukkan bahwa isolat BS1 memiliki
persentase kemiripan (identitiy) sebesar 94% dengan genus Pseudomonas sp.
Isolat BS1 difermentasi dalam media nutrient broth (NB) selama 48 jam.
Supernatan hasil fermentasi dipisahkan untuk kemudian diekstraksi. Ekstraksi
senyawa antibakteri hasil fermentasi isolat BS1 dilakukan dengan kloroform (1:1)
(v/v) menggunakan corong pisah. Hasil pengujian ekstrak kloroform terhadap
Staphylococcus aureus menunjukkan terbentuknya zona hambat. Analisis
senyawa dalam ekstrak kloroform BS1 menggunakan GC-MS menunjukkan
bahwa senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat BS1 tersebut adalah 1-methyl2,4-Imidazolidinedione dan piperazine.
Kata kunci: antibakteri, bakteri endofit, piperazine, Piper betle L., Pseudomonas
sp., 1-methyl-2,4-Imidazolidinedione
SUMMARY
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO. Isolation and
Identification of Antibacterial Compound from Green Betel’s (Piper betle L.)
Endophytic Bacteria. Supervised by MARIA BINTANG and FACHRIYAN
HASMI PASARIBU.
One factor that caused the increase of infectious case in Indonesia is
resistence of pathogenic bacteria to antibiotic. Thus, the exploration of new source
of antibiotic, especially antibacterial, is necessary. Endophytic bacteria are
bacteria that live symbiotically with plant. Some species of endophytic bacteria
have the ability to produce bioactive compound, one of them is antibacterial. The
objective of this research are to isolate and identify endophytic bacteria from
green betel (Piper betle L.) which has antibacterial activity and also to identify
antibacterial compound from the endophytic bacteria isolate.
Endophytic bacteria isolation from fresh green betel was done by surface
sterilization method. Total isolate obtained was 14 isolates, 1 isolate from root, 6
isolates from stem and 7 isolates from leaves. Those isolates was tested against 4
pathogenic bacteria, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus,
dan Salmonella enteritidis. Based on the test result, isolate code BS1 could inhibit
more pathogenic bacteria than other isolates (showed by inhibition zone).
Molecular identification of BS1 based on 16S rRNA gene and was analyze
using BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) programe. The result of
molecular identification showed that BS1 isolate has 94% correlation (identity)
with Pseudomonas sp. BS1 isolate was fermented in nutrient broth (NB) for 48
hours. The supernatant from fermentation separated for extraction. The extraction
of antibacterial compound from fermentation of BS1 isolate was done using
chloroform (1:1) (v/v). The test result of chloroform extract toward
Staphylococcus aureus showed inhibition zone. Analysis of BS1 chloroform
extract using GC-MS showed that the antibacterial compounds are 1-methyl-2,4Imidazolidinedione and piperazine.
Keywords: antibacterial, endophytic bacteria, piperazine, Piper betle L.,
Pseudomonas sp., 1-methyl-2,4-Imidazolidinedione
© Hak Cipta Milik IPB, Tahun 2014
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIBAKTERI
DARI BAKTERI ENDOFIT TANAMAN SIRIH HIJAU
(Piper betle L.)
UKHRADIYA MAGHARANIQ SAFIRA PURWANTO
Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biokimia
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Syamsul Falah, S.Hut, M.Si
Judul Tesis : Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit
Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.).
Nama
: Ukhradiya Magharaniq Safira Purwanto
NIM
: G851130466
Disetujui oleh
Komisi Pembimbing
Prof. Dr Drh Maria Bintang, MS
Ketua
Prof. Dr Drh Fachriyan H. Pasaribu
Anggota
Diketahui oleh
Ketua Program Studi
Biokimia
Dekan Sekolah Pascasarjana
Prof. Dr Drh Maria Bintang, MS
Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr
Tanggal Ujian:
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Penulis memanjatkan puji syukur kepada Allah SWT yang telah
melimpahkan rahmat-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya tulis ini.
Karya tulis ini merupakan hasil penelitian tesis dengan judul “Isolasi dan
Identifikasi Senyawa Antibakteri dari Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper
betle L.)”.
Melalui karya tulis ini penulis menyampaikan terima kasih kepada Prof. Dr
Drh Maria Bintang, MS dan Prof. Dr Drh Fachriyan Hasmi Pasaribu selaku Dosen
Pembimbing atas saran dan arahannya dalam penyusunan tulisan ini. Terima kasih
penulis sampaikan untuk teman-teman Program Akselerasi (Endah, Novi, Lusi,
dan Andin) atas semangat dan bantuan yang diberikan. Penulis juga ingin
mengucapkan terima kasih kepada Bapak Agus Sumantri, Mbak Eli dan Pak Jaka
atas bantuan teknis di laboratorium. Tak lupa untuk keluargaku tercinta (Ibu,
Ayah, Affan dan Ririn) yang selalu memberikan doa, semangat dan motivasi yang
tiada putus-putusnya. Serta, pihak-pihak lain yang ikut membantu. Penulis
menyadari masih terdapat banyak kekurangan dalam karya tulis ini. Walaupun
demikian, penulis berharap semoga hasil penelitian ini dapat memberi manfaat.
Bogor, Agustus 2014
Ukhradiya Magharaniq Safira Purwanto
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Perumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Manfaat Penelitian
Ruang Lingkup Penelitian
1
1
3
3
3
3
METODE
Alat
Bahan
Isolasi Bakteri Endofit
Seleksi untuk Memperoleh Bakteri Endofit Potensial
Identifikasi Bakteri Endofit Potensial dengan Marka 16S rRNA
Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri
3
3
4
4
4
4
5
HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Bakteri Endofit Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.)
Isolat Bakteri Endofit yang Berpotensi Menghasilkan
Senyawa Antibakteri
Identifikasi Isolat BS1 berdasarkan Marka 16S rRNA
Uji Antibakteri Ekstrak Kloroform BS1
Hasil Analisis Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform BS1
dengan GC-MS
5
5
10
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran
11
11
11
DAFTAR PUSTAKA
11
LAMPIRAN
16
RIWAYAT HIDUP
23
6
8
9
DAFTAR TABEL
1 Morfologi koloni dan kecepatan pertumbuhan isolat bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau
2 Diameter zona hambat yang terbentuk pada seleksi isolat bakteri
endofit dari sirih hijau terhadap bakteri patogen
6
7
DAFTAR GAMBAR
1 Tanaman sirih hijau (Piper betle L.)
2 Zona hambat yang terbentuk berdasarkan pengujian isolat BS1 terhadap
S. aureus (tanda panah)
3 Zona hambat yang terbentuk pada pengujian ekstrak kloroform BS1
terhadap S. aureus. (a) kontrol positif tetrasiklin 100µg/mL, (b) ekstrak
kloroform BS1 (tanda panah)
2
7
10
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
Bagan alir penelitian
Isolat bakteri endofit dari tanaman sirih hijau (Piper betle L.)
Sekuens DNA isolat BS1 hasil sequencing
Sekuens DNA isolat BS1 hasil pensejajaran
Hasil analisis sekuen konsensus BS1 dengan program BLAST
Kondisi GC-MS
Kromatogram GC-MS ekstrak kloroform isolat BS1
16
17
18
19
20
21
22
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Penyakit infeksi pada manusia merupakan jenis penyakit yang sangat
sering terjadi dan penyebarannya cukup luas. Penyakit infeksi sering disebut
sebagai penyakit menular, karena dapat berpindah dari satu individu ke individu
lain, baik melalui kontak langsung maupun tidak. Agen-agen pembawa penyakit
infeksi dapat berupa hewan, bakteri, virus atau jamur. Menurut WHO (2013),
kasus penyakit infeksi yang terdaftar di Indonesia tiap tahunnya cenderung berada
pada kisaran angka yang tetap. Data tahun 2009-2010 menunjukkan penurunan
kasus, sedangkan tahun 2010-2011 justru terjadi peningkatan kasus. Kasus infeksi
terbesar di Indonesia adalah penyakit tuberkulosis yang mencapai jumlah 328824
kasus pada tahun 2012.
Peningkatan kasus penyakit infeksi, terutama yang disebabkan oleh bakteri
patogen, salah satunya terkait dengan resistensi bakteri patogen terhadap
antibiotik komersil. Sebagai contoh, ditemukan adanya strain Staphylococcus
aureus yang resisten terhadap methicillin sehingga menyulitkan pengobatan
pasien yang terinfeksi bakteri tersebut (Ruhe et al. 2005). Oleh karena itu,
diperlukan kajian mengenai sumber dan jenis antibiotik baru yang bersifat lebih
alami dan aman bagi lingkungan. Salah satu sumber antibiotik, khususnya
antibakteri, adalah bakteri endofit.
Bakteri endofit adalah bakteri yang hidup di dalam jaringan tanaman inang
tanpa menyebabkan gejala-gejala penyakit (Bhore & Sathisha 2010). Beberapa
jenis bakteri endofit diketahui mampu menghasilkan senyawa aktif yang bersifat
antibiotik (Castillo et al. 2003), antimalaria (Simanjuntak et al. 2004) dan
antifungi (Beck et al. 2003 dalam Ryan et al. 2008). Kemampuan bakteri endofit
menghasilkan senyawa aktif tersebut merupakan potensi yang dapat
dikembangkan mengingat umumnya senyawa aktif diperoleh dengan
mengekstraksi tanaman, khususnya tanaman obat. Untuk memperoleh senyawa
aktif dari tanaman dibutuhkan jumlah tanaman yang banyak dan hal ini terkait
dengan isu lingkungan serta kelestarian tanaman tersebut.
Salah satu tanaman obat yang sudah dikenal dan dimanfaatkan sejak lama
oleh masyarakat Indonesia adalah sirih hijau (Piper betle L.). Sirih hijau (Piper
betle L.) merupakan tanaman yang memiliki khasiat medis dan banyak digunakan
di Indonesia, India dan negara-negara di wilayah Indo-Cina lainnya, yaitu
Malaysia, Vietnam, Laos, Kamboja, Thailand, Myanmar dan Singapura. Bagian
tanaman sirih yang banyak digunakan adalah daunnya. Penggunaan daun sirih
telah lama diketahui memiliki efek penyembuhan antara lain mencegah dan
menyembuhkan batuk, mengurangi bau mulut serta mencegah infeksi yang
disebabkan fungi dan bakteri (Kumar et al. 2010).
Menurut Pradhan et al. (2013), tanaman sirih termasuk dalam divisi
Magnoliophyta, kelas Magnoliopsida, ordo Piperales, famili Piperaceae dan genus
Piper. Tanaman ini berupa semak yang tumbuh merambat, bentuk daun
menyerupai hati dengan batang semu. Daun sirih hijau segar mengandung air (8590%), protein (3-3.5%), lemak (0.4-1%), mineral (fosfor, kalium, kalsium, besi)
(2.3-3.3%), serat (2.3%), karbohidrat (0.5-6.1%), vitamin A dan C, tanin dan
2
minyak esensial (0.08-0.2%) (Guha 2006).
Selain itu, daun sirih juga
mengandung flavonoid, sterol, fenol (Chakraborty & Shah 2011) serta senyawa
yang memiliki sifat antibakteri seperti kavikol, asam dodekanoat, miristat,
palmitat dan oleat (Suliantari et al. 2012).
Gambar 1 Tanaman sirih hijau (Piper betle L.) (Sumber : koleksi pribadi, 2014)
Kajian mengenai sirih hijau dalam bidang kesehatan telah cukup banyak
dilakukan. Diantaranya, daun sirih yang diekstrak dengan akuades steril
menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap Streptococcus mutans secara in
vitro (Nalina & Rahim 2007). Al-Adhroey et al. (2011) menyatakan bahwa
esktrak metanol daun sirih memiliki aktivitas antimalaria terhadap Plasmodium
berghei. Senyawa hydroxychavicol (HC) yang diisolasi dari daun sirih hijau
diketahui memiliki aktivitas penghambatan terhadap xantin oksidase (Murata et al.
2009) dan juga bersifat antifungi terhadap genus Candida dan Aspergillus dalam
uji in vitro (Ali et al. 2010). Senyawa yang merupakan turunan HC, yaitu
hydroxychavicol acetate (HCA) memiliki berbagai aktivitas diantaranya sebagai
imunomodulator (Min et al. 2009) dan antibakteri (Sharma et al. 2009, Ali et al.
2011).
Allylpyrocatechol (APC) yang sebagian besar diisolasi dari daun sirih
memiliki efek terhadap pencernaan diantaranya melindungi lambung dari
timbulnya ulkus (luka lambung) (Tripathi 2008), menyembuhkan ulkus (Yadav et
al. 2009), antibakteri terhadap Staphylococcus aureus (Pradhan et al. 2013) dan
berperan sebagai anti-inflamasi (Santhakumari et al. 2006). Menurut (Zeng et al.
1997 dalam Kumar et al. 2010), senyawa piperbetol dalam sirih hijau memiliki
kemampuan selektif dalam menghambat agregasi platelet yang diinduksi oleh
mekanisme platelet activating factor (PAF) pada konsentrasi tertentu, sehingga
diharapkan dapat mencegah timbulnya penyakit kardiovaskular. Senyawa lain
yang merupakan turunan piperbetol antara lain metilpiperbetol, piperol A dan
piperol B juga telah berhasil diidentifikasi.
Berdasarkan hal tersebut, tanaman sirih hijau terutama bagian daunnya
memiliki banyak khasiat dan manfaat terutama di bidang medis. Bakteri endofit
yang berada dalam tanaman sirih hijau diduga mampu menghasilkan senyawa
aktif yang memiliki aktivitas dan manfaat serupa dengan tanaman inangnya.
Sejauh ini belum dilaporkan adanya isolasi bakteri endofit dari tanaman sirih hijau
serta pengujian terhadap senyawa aktif yang diproduksi bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau.
3
Perumusan Masalah
Bakteri endofit memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai sumber
antibiotik baru. Sirih hijau (Piper betle L.) merupakan salah satu tanaman obat
yang telah terbukti bersifat sebagai antibiotik. Penelitian terkait bakteri endofit
telah banyak dilakukan, namun penelitian tentang bakteri endofit pada tanaman
sirih hijau (Piper betle L.) sejauh ini belum dilaporkan.
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengidentifikasi isolat bakteri
endofit tanaman sirih hijau yang memiliki aktivitas sebagai antibakteri sekaligus
mengidentifikasi senyawa antibakteri yang dihasilkan isolat tersebut.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberi informasi mengenai kandungan
dan manfaat senyawa antibakteri yang dihasilkan oleh bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau.
Ruang Lingkup Penelitian
Penelitian ini mencakup isolasi bakteri endofit dari tanaman sirih hijau
(Piper betle L.). Isolat-isolat tersebut diseleksi untuk menentukan isolat yang
memiliki aktivitas antibakteri melalui uji terhadap Staphylococcus aureus,
Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Salmonella enteritidis. Isolat bakteri endofit
yang mampu menekan pertumbuhan bakteri uji diidentifikasi dengan marka 16S
rRNA dan dilanjutkan dengan isolasi serta identifikasi senyawa antibakteri yang
dihasilkan.
METODE
Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari – Agustus 2014 di Laboratorium
Bakteriologi, Bagian Mikrobiologi Medik Fakultas Kedokteran Hewan,
Laboratorium Penelitian Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor (IPB) dan Laboratorium Pengujian
Hasil Hutan P3KKPHH Bogor.
Alat
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas,
autoklaf, inkubator, mesin sentrifugasi, corong pisah, mesin rotary evaporator,
kertas cakram, mesin Polymerase Chain Reaction (PCR), Applied Biosystems
model 3730XL automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA),
mesin GC-MS (Gas Chromatography-Mass Spectrometry) (Shimadzu Type
GCMS-QP2010).
4
Bahan
Bahan – bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah tanaman sirih
hijau (Piper betle L.) yang diperoleh dari daerah Ciampea-Bogor dalam kondisi
segar, kultur Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, dan
Salmonella enteritidis (koleksi dari Laboratorium Bakteriologi Fakultas
Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor), media Nutrient Agar (NA), media
Nutrient Broth (NB), larutan natrium hipoklorit 5.25%, etanol 70%, akuades,
nistatin, InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA), primer 27F (5’-AGA GTT TGA
TCM TGG GTC AG-3’) dan 1492R (5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT
T-3’), Montage PCR Clean Up kit (Milipore), primer 518F dan 800R, Big Dye
terminator cycle sequencing kit (Applied BioSystems, USA), kloroform,
tetrasiklin dan aseton.
Isolasi Bakteri Endofit (Modifikasi Desriani et al. 2013)
Bagian tanaman sirih yang digunakan adalah daun, batang dan akar dalam
kondisi segar. Sampel tanaman dalam keadaan segar dibersihkan dengan air
mengalir kemudian dipotong-potong sepanjang 1-3 cm dan dipisahkan menurut
bagian tanamannya. Potongan sampel direndam dalam etanol 70% selama 1 menit,
larutan natrium hipoklorit 5.25% selama 5 menit, dan dicuci dengan etanol 70%
sebanyak tiga kali. Potongan sampel diiris secara steril kemudian ditanam dalam
media nutrient agar (NA) yang mengandung nistatin. Media yang sudah
mengandung sampel tersebut diinkubasi pada suhu ruang dalam keadaan gelap
dan diamati setiap hari sampai ada pertumbuhan koloni. Jika selama 24 jam di
sekitar sampel tanaman belum menunjukkan adanya pertumbuhan mikroba,
sterilisasi permukaan dikatakan berhasil. Bakteri endofit yang tumbuh dimurnikan
satu per satu dan dikultivasi dalam agar miring. Isolat bakteri endofit yang telah
murni diidentifikasi secara morfologi berdasarkan warna koloni, bentuk tepian
koloni, elevasi koloni dan konsistensi koloni serta kecepatan pertumbuhan koloni.
Seleksi untuk Memperoleh Isolat Bakteri Endofit Potensial (Simarmata et al.
2007)
Isolat bakteri endofit dari agar miring diregenerasi ke media NA,
sedangkan bakteri uji diregenerasi ke dalam 5 mL media nutrient broth (NB) lalu
diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28-30 °C. Sebanyak 0.4 mL kultur cair
bakteri uji dimasukkan ke dalam 80 mL media NA yang bersuhu ±40 °C. Lalu
dituangkan sebanyak 20 mL ke dalam cawan Petri steril dan ditunggu hingga
memadat. Isolat bakteri endofit yang akan diuji diinokulasikan ke media berisi
patogen menggunakan ose, kemudian diinkubasi selama 24 – 48 jam. Zona
hambat yang terbentuk diamati kemudian diameter zona hambat diukur. Isolat
bakteri endofit yang positif menunjukkan zona hambat terhadap semua patogen
dikatakan sebagai isolat potensial.
Identifikasi Isolat Bakteri Endofit Potensial berdasarkan Marka 16S rRNA
Isolasi DNA isolat bakteri endofit potensial. Koloni isolat bakteri
endofit potensial diambil dengan tusuk gigi steril dan disuspensikan dalam 0.5 mL
larutan garam steril kemudian disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit.
Pelet diresuspensikan dalam 0.5 mL InstaGene Matrix (Bio-Rad, USA) kemudian
5
diinkubasi selama 30 menit pada suhu 56°C dan dipanaskan selama 10 menit pada
100°C. Setelah dipanaskan, supernatan digunakan pada proses PCR.
PCR dan pengurutan basa (sequencing) gen 16S rRNA. Sebanyak 1 µL
DNA ditambahkan ke dalam 20 µL larutan reaksi PCR yang telah berisi primer
27F dan 1492R. Reaksi PCR dilakukan pada 94°C selama 45 detik, 55°C selama
60 detik dan 72°C selama 60 detik sebanyak 35 siklus. Hasil PCR dipurifikasi
menggunakan Montage PCR Clean up kit (Millipore). Hasil PCR yang telah
dipurifikasi kemudian disequencing menggunakan dua primer, yaitu primer 518F
dan 800R dan Big Dye terminator cycle sequencing kit (Applied BioSystems,
USA), kemudian dianalisis menggunakan Applied Biosystems model 3730XL
automated DNA sequencing system (Applied BioSystems, USA).
Analisis hasil Sequencing. Hasil sequencing berupa urutan basa-basa DNA
disejajarkan menggunakan program BioEdit Sequence Alignment Editor ver. 7.2.0.
Hasil pensejajaran dianalisis lebih lanjut dengan program BLAST pada situs
www.ncbi.nlm.nih.gov untuk mengetahui spesies isolat bakteri endofit potensial.
Isolasi dan Identifikasi Senyawa Antibakteri
Fermentasi dan ekstraksi senyawa antibakteri (Modifikasi Melliawati et
al.. 2006). Sebanyak satu ose isolat bakteri endofit potensial ditumbuhkan dalam
50 mL media NB, kemudian difermentasi selama 48 jam dalam shaker (150 rpm,
pada suhu ruang 28-30°C) selama. Kemudian, hasil fermentasi disentrifugasi pada
kecepatan 5500 rpm selama 60 menit untuk memisahkan sel bakteri dan media.
Supernatan diekstraksi dengan pelarut kloroform (1:1) (v/v) menggunakan corong
pisah, lalu dievaporasi selama 15 menit pada suhu 50ºC. Ekstrak kloroform yang
diperoleh sebagian dilarutkan dalam Tween 80 untuk diuji daya antibakterinya
terhadap bakteri patogen dan sebagian lagi digunakan untuk analisis GC-MS.
Identifikasi ekstrak kloroform dengan GC-MS. Ekstrak kloroform
dilarutkan dalam aseton kemudian diinjeksikan ke alat GC-MS. Proses GC-MS
dilakukan menggunakan kolom kapiler tipe Phase Rtx-5MS dengan panjang 60 m
dan diameter 0.25 mm (Lampiran 6).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Keragaman Bakteri Endofit dari Tanaman Sirih Hijau (Piper betle L.)
Sebanyak 14 isolat bakteri endofit telah diisolasi dari tanaman sirih hijau
yang berasal dari kecamatan Ciampea, Kabupaten Bogor. Bagian tanaman sirih
hijau dengan jumlah isolat bakteri endofit terbanyak adalah bagian daun (DS),
yaitu sebanyak 7 isolat, kemudian diikuti oleh bagian batang (BS) sebanyak 6
isolat dan terakhir adalah bagian akar (AS) sebanyak 1 isolat (Tabel 1). Bacon dan
Hinton (2006) menyatakan bahwa jumlah bakteri endofit di dalam tanaman tidak
dapat ditentukan secara pasti, namun bakteri ini dapat dideteksi dengan
mengisolasi pada media agar. Kecepatan pertumbuhan 11 isolat yang
ditumbuhkan pada media baru terhitung dalam kategori cepat, yaitu 24 jam (1
hari), sedangkan 2 isolat termasuk dalam kategori sedang, yaitu 48 jam (2 hari)
dan hanya 1 isolat yang pertumbuhannya lambat (lebih dari 2 hari) (Tabel 1).
6
Tabel 1 Morfologi koloni dan kecepatan pertumbuhan isolat bakteri endofit dari
tanaman sirih hijau
Kode
isolat
AS1
DS1
DS2
DS3a
DS3b
DS4
DS5
DS6
BS1
Morfologi koloni
Kecepatan
Tepian
Elevasi
Berlendir pertumbuhan
Putih
Rata
Cembung
+++
Cepat
Putih tulang
Rata
Datar
+
Cepat
Putih
Rata
Datar
++
Cepat
Kuning cerah
Rata
Cembung
++
Sedang
Merah muda
Rata
Datar
+
Lambat
Krem
Rata
Datar
+
Sedang
Putih
Rata
Datar
+++
Cepat
Putih tulang
Bergerigi
Datar
+
Cepat
Putih kekuningan, bagian
Rata
Cembung
+++
Cepat
tepi transparan
BS2
Putih kekuningan
Rata, Licin
Cembung
+++
Cepat
BS3
Putih susu
Bergerigi
Datar
+++
Cepat
BS4
Putih mendekati transparan Rata, Licin
Cembung
+++
Cepat
BS5
Putih susu
Bergerigi
Datar
++
Cepat
BS6
Putih
Rata
Datar
++
Cepat
Keterangan : AS=akar sirih, DS=daun sirih, BS=batang sirih; kecepatan pertumbuhan
(pertumbuhan isolat pada media baru) : cepat = 1 hari, sedang = 2 hari, lambat = >2 hari
Warna
Bakteri endofit dari tanaman sirih hijau (Piper betle L.) mulai
menunjukkan pertumbuhan setelah potongan bagian tanaman diinokulasi pada
media NA selama ± 48 jam (2 hari). Pernyataan ini didukung oleh Zinniel et al.
(2002), Simarmata (2007), Arunachalam dan Gayathri (2010) dan Jalgaonwala et
al. (2010) yang menyatakan bahwa waktu pemilihan inkubasi selama minimal 2
hari bertujuan untuk memastikan bahwa bakteri yang tumbuh merupakan bakteri
endofit, bukan bakteri filosfer, rizosfer atau kontaminan. Selain itu, penambahan
nistatin (antifungi) pada media juga bertujuan untuk mengoptimalkan hasil isolasi
(Kumala & Siswanto 2007).
Isolat bakteri endofit menunjukkan keragaman dari segi morfologi koloni.
Bakteri endofit masuk ke dalam jaringan tanaman umumnya melalui akar, namun
bagian tanaman yang terpapar udara langsung seperti bunga, batang dan kotiledon,
juga dapat menjadi jalur masuk bakteri endofit. Bakteri endofit yang telah masuk
ke dalam tanaman dapat tumbuh hanya di satu titik tertentu atau menyebar ke
seluruh tanaman. Bakteri ini dapat hidup di dalam pembuluh vaskular atau di
ruang intersel (Zinniel et al.. 2002), akar, batang, daun dan buah (Simarmata et al..
2007; Bacon & Hinton 2006). Jumlah bakteri endofit di dalam tanaman tidak
dapat ditentukan secara pasti, namun bakteri ini dapat dideteksi dengan
mengisolasi pada media agar (Bacon & Hinton 2006).
Bakteri endofit dapat bersifat obligat ataupun fakultatif dalam
mengkolonisasi inangnya. Bakteri endofit pada satu tanaman inang umumnya
terdiri dari beberapa genus dan spesies (Bhore & Sathisha 2010). Meskipun
bakteri ini memiliki kisaran inang yang luas, namun ada beberapa bakteri endofit
yang hanya dapat berasosiasi dengan inang dari famili tertentu.
Isolat Bakteri Endofit yang Berpotensi Menghasilkan Senyawa Antibakteri
Sebanyak 14 isolat bakteri endofit diuji terhadap 4 bakteri patogen, yaitu
Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, dan Salmonella
7
enteritidis. Hasil seleksi isolat bakteri endofit dari tanaman sirih hijau terhadap
bakteri patogen ditunjukkan dengan terbentuknya zona hambat berupa daerah
bening di sekitar koloni bakteri endofit (Gambar 2). Sebanyak 3 isolat bakteri
endofit, yaitu AS 1 (A), BS1 (I) dan BS2 (J) menunjukkan terbentuknya zona
hambat terhadap S. aureus (Tabel 2). Sedangkan isolat BS3 (K) hanya
menunjukkan sedikit penghambatan dan belum sepenuhnya membentuk daerah
bening seperti 3 isolat lainnya. Pengujian ke-14 isolat bakteri endofit terhadap S.
enteritidis bahkan tidak menunjukkan terbentuknya zona hambat.
Gambar 2
Zona hambat yang terbentuk berdasarkan pengujian isolat BS1
terhadap S. aureus (tanda panah)
Tabel 2 Diameter zona hambat yang terbentuk pada seleksi isolat bakteri endofit
dari sirih hijau terhadap bakteri patogen
Diameter zona hambat
E. coli
B. cereus
S.aureus
AS1 (A)
V
5 mm
DS1 (B)
DS2 (C)
DS3a (D)
DS3b (E)
DS4 (F)
DS5 (G)
DS6 (H)
BS1 (I)
V
V
3 mm
BS2 (J)
V
1 mm
BS3 (K)
V
BS4 (L)
BS5 (M)
BS6 (N)
keterangan : V = zona hambat sangat kecil dan sulit diukur
Kode isolat
S. enteritidis
-
Terbentuknya zona hambat di sekitar koloni isolat bakteri endofit
mengindikasikan kemungkinan adanya senyawa antibakteri yang mampu
membunuh atau menghambat pertumbuhan bakteri patogen. Hal ini diperkuat oleh
Simarmata et al. (2007) dan Kumala & Siswanto (2007) yang melakukan uji
serupa dengan bakteri endofit asal tanaman obat Indonesia. Bakteri endofit yang
diisolasi menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap bakteri patogen ditandai
dengan terbentuknya daerah bening di sekitar koloni bakteri endofit.
8
Interaksi bakteri endofit dan tanaman merupakan suatu bentuk simbiosis.
Simbiosis antara tanaman dengan bakteri endofit bersifat netral, mutualisme atau
komensalisme (Bacon & Hinton 2006). Simbiosis mutualisme antara bakteri
endofit dengan tanaman, dalam hal ini bakteri endofit mendapatkan nutrisi dari
hasil metabolisme tanaman dan melindungi tanaman dalam melawan patogen,
sedangkan tanaman mendapatkan derivat nutrisi dan senyawa aktif yang
diperlukan selama hidupnya (Tanaka et al. 1999 dalam Simarmata et al. 2007).
Bagian akar dan batang tanaman sirih hijau memang tidak lazim
digunakan sebagai obat. Umumnya, bagian tanaman sirih hijau yang digunakan
adalah bagian daun, terutama daun yang berumur cukup tua. Namun, hal ini tidak
menutup kemungkinan bahwa bakteri endofit dari bagian akar dan batang sirih
hijau juga memiliki potensi sebagai sumber antibakteri baru. Sebagai contoh,
penelitian yang dilakukan oleh Miller et al. (1998) berhasil mengisolasi senyawa
antibiotik dari bakteri endofit tanaman non-obat, yaitu sejenis rumput.
Beberapa contoh bakteri endofit mampu menghasilkan produk potensial
antara lain : bakteri endofit Bacillus polymixa hasil isolasi dari tanaman Anuma
(Artemisia annua) dapat memproduksi senyawa kimia antimalaria artemisinin di
dalam media cair sintetik (Simanjuntak et al. 2004), Streptomyces griseus dari
tanaman Kandelia candel menghasilkan asam p-aminoacetophenonic sebagai
antimikroba (Guan et al. 2005 dalam Ryan et al. 2008), Streptomyces NRRL
30562 dari tanaman Kennedia nigriscans menghasilkan munumbicin (antibiotik)
dan munumbicin D (antimalaria) (Castillo et al. 2002 dalam Ryan et al. 2008),
Serratia marcescens dari tanaman Rhyncholacis penicillata menghasilkan oocydin
A sebagai antifungi (Strobel et al. 2004 dalam Ryan et al. 2008), Paenibacillus
polymyxa dari tanaman gandum menghasilkan fusaricidin A-D sebagai antifungi
(Beck et al. 2003 dalam Ryan et al. 2008). Castillo et al. (2003) juga berhasil
mengisolasi senyawa kakadumycin dari Streptomyces sp., yaitu bakteri endofit
asal tanaman Grevillea pteridifolia.
Identifikasi Isolat BS1 berdasarkan Marka 16S rRNA
Identifikasi isolat BS1 dilakukan dengan teknik molekuler, yaitu dengan
marka (penanda) gen 16S rRNA. Gen rRNA merupakan bagian DNA yang paling
terkonservasi di dalam setiap sel. Gen rRNA mampu mempertahankan susunan
basa-basa nitrogennya (conserved) selama berjuta-juta tahun proses adaptasi. Gen
rRNA berfungsi menyandikan protein subunit kecil ribosom (small subunit
ribosom) yang merupakan bagian dari kompleks sistem ribosom di dalam sel
(Stiegler et al. 1981).
Gen yang menyandikan RNA pada subunit kecil ribosom ini dipilih
sebagai marka karena beberapa alasan diantaranya : terdapat di semua sel,
memiliki fungsi yang sama di tiap sel, memiliki dua area yang dapat digunakan
untuk mendeteksi kekerabatan jauh maupun dekat serta terkonservasi baik
susunan basanya maupun bentuk strukturnya.
Gen 16S rRNA memiliki panjang sekitar 1550 pb. Ukuran ini termasuk
besar dengan tujuan memudahkan perhitungan statistik dan agar dapat dibedakan
dengan lebih mudah. Dibandingkan dengan dua gen ribosom lain, yaitu 5S (120
pb) dan 23S (2900 pb), ukuran gen 16S rRNA termasuk tepat karena tidak terlalu
9
kecil dan juga tidak terlalu besar sehingga lebih memudahkan proses amplifikasi
dengan PCR (Clarridge 2004).
Berdasarkan hasil seleksi isolat bakteri endofit terhadap bakteri patogen,
diperoleh isolat dengan kode BS1 sebagai isolat potensial. Isolat BS1 dipilih
sebagai isolat potensial karena mampu membentuk zona hambat terhadap 3 jenis
bakteri patogen yaitu Staphylococcus aureus, Escherichia coli, dan Bacillus
cereus. Hasil sequencing isolat BS1 yang telah disejajarkan menunjukkan bahwa
gen 16S rRNA pada isolat tersebut berukuran 1530 pb (pasang basa) (Lampiran 4).
Hasil analisis sekuens DNA gen 16S rRNA dengan program BLAST
menunjukkan bahwa isolat BS1 memiliki persentase kemiripan (identitiy) sebesar
94% dengan genus Pseudomonas sp. (Lampiran 5).
Pseudomonas merupakan genus bakteri Gram negatif yang dikenal sebagai
plant-associated bacteria. Persebaran genus ini di alam cukup luas. Menurut Ryan
et al. (2008), beberapa bakteri endofit merupakan anggota bakteri penghuni tanah,
seperti Pseudomonas, Burkholderia dan Bacillus. Genus-genus tersebut diketahui
memiliki kemampuan menghasilkan metabolit sekunder yang bersifat antibiotik,
antikanker, antifungi, antivirus, insektisida dan immunosuppressant agents.
Bakteri endofit dengan genus Pseudomonas juga berperan sebagai agens
biokontrol pada tanaman, agen fitoremediasi dan pemacu pertumbuhan tanaman.
Miller et al. (1998) berhasil mengisolasi senyawa ecomycin B dan C yang
bersifat antifungi dari bakteri endofit Pseudomonas viridiflava. Bakteri endofit
tersebut berasal dari sejenis rumput asal Amerika dan Eropa. Bakteri endofit
genus Pseudomonas juga berhasil diisolasi oleh Jose dan Christy (2013) dari
tanaman mangrove. Isolat bakteri endofit genus Pseudomonas tersebut telah
diteliti memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri dan fungi patogen,
diantaranya Streptococcus pyogenes dan Candida albicans.
Uji Antibakteri Ekstrak Kloroform BS1
Ekstrak kloroform isolat BS1 diperoleh dari ekstraksi hasil fermentasi
selama 48 jam. Hasil fermentasi yang digunakan adalah supernatan dari kultur
isolat BS1. Pemilihan supernatan berdasarkan asumsi bahwa senyawa antibakteri
yang dihasilkan bakteri endofit bersifat ekstraseluler. Hal ini diperkuat oleh hasil
seleksi awal antara bakteri endofit dan bakteri patogen yang menunjukkan
terbentuknya zona hambat berupa daerah bening di sekitar koloni endofit.
Ekstraksi dilakukan menggunakan pelarut kloroform sebanyak satu kali
(1:1). Ekstrak selanjutnya diuji terhadap S. aureus. Hasil pengujian ditunjukkan
dengan terbentuknya zona hambat di sekitar cakram (Gambar 3). Pemilihan
bakteri uji yaitu S. aureus berdasarkan hasil seleksi awal isolat bakteri endofit
(Tabel 2). Hasil tersebut menunjukkan bahwa isolat BS1 mampu menghambat S.
aureus dengan diameter zona hambat yang lebih besar dibanding terhadap bakteri
uji lainnya.
Pemilihan kloroform sebagai pelarut dalam proses ekstraksi dikarenakan
sifatnya yang non-polar sehingga dapat melarutkan senyawa-senyawa organik,
diantaranya senyawa golongan lipid. Menurut Chakraborty dan Shah (2001), salah
satu senyawa yang termasuk dalam golongan lipid, yaitu sterol, banyak terdapat
dalam daun sirih hijau. Sterol tersebut memiliki aktivitas antibakteri dengan
mengganggu permeabilitas dinding sel terutama bakteri Gram positif. Selain itu,
10
hasil penelitian Shukla et al. (2009) menunjukkan ekstrak kloroform daun sirih
hijau segar yang diekstraksi menggunakan kloroform mampu menghambat S.
aureus dengan zona hambat sebesar 6 mm. Kemungkinan bakteri endofit dari sirih
hijau mampu menghasilkan senyawa antibakteri yang sama dengan ekstrak
tanaman sirih hijau.
(a)
(b)
Gambar 3 Zona hambat yang terbentuk pada pengujian ekstrak kloroform BS1
terhadap S. aureus. (a) kontrol positif tetrasiklin 100µg/mL, (b)
ekstrak kloroform BS1 (tanda panah).
Hasil Analisis Senyawa Antibakteri Ekstrak Kloroform BS1 dengan GC-MS
Antibakteri secara garis besar terbagi menjadi dua kelompok, yaitu yang
bersifat bakteriostatik dan bakterisidal. Senyawa antibakteri yang bersifat
bakteriostatik bekerja dengan menghambat pertumbuhan atau penggandaan sel
bakteri. Dalam kasus penyakit infeksi, senyawa antibakteri yang bersifat
bakteriostatik memberi kesempatan bagi sistem imun untuk membersihkan bakteri
dari sistem-sistem dalam tubuh. Senyawa antibakteri yang bersifat bakterisidal
bersifat membunuh bakteri dengan atau tanpa adanya kompetisi dengan sistem
imun. Secara umum mekanisme senyawa antibakteri, baik yang bersifat
bakteriostatik maupun bakterisidal, antara lain menghambat sintesis dinding sel,
menghambat kerja ribosom, menghambat sintesis asam nukleat, menghambat
metabolisme folat dan menghambat fungsi membran sel (Sosa et al. 2010).
Ekstrak kloroform BS1 dianalisis dengan GC-MS. Hasil analisis GC-MS
berupa kromatogram yang menunjukkan waktu retensi dan kelimpahan senyawa
di dalam sampel ditandai dengan puncak-puncak spektrum (Lampiran 7). Ekstrak
kloroform BS1 menunjukkan banyaknya puncak yang muncul dan beberapa
puncak saling tumpang-tindih. Hal ini kemungkinan disebabkan kondisi ekstrak
yang belum terlalu murni.
Berdasarkan data yang dihasilkan spektrum GC-MS, senyawa dengan
kelimpahan terbanyak adalah 1,4-diaza-2,5-dioxobicyclo[4.3.0] nonane yaitu
sebesar 38.28%. Senyawa dengan kelimpahan terbesar kedua adalah kloroform.
Namun, karena waktu retensi kloroform tersebut berada di awal kemungkinan
kloroform tersebut merupakan sisa pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi.
Meski demikian, kloroform sendiri memiliki kemampuan sebagai antibakteri.
Senyawa dengan kelimpahan terbesar ketiga adalah 1-methyl-2,4Imidazolidinedione (9.55%). Menurut Bharat et al. (2013), senyawa kelompok
11
imidazol dan imidazol alkaloid dari sianobakteri memiliki kemampuan
menghambat pertumbuhan S. aureus.
Selain itu, berdasarkan spektrum GC-MS senyawa piperazine dengan
kelimpahan 3.55% juga terdeteksi dari ekstrak kloroform BS1. Piperazine dan
turunannya
seperti
N-[4-(2-{4-[(S)-(4-chlorophenyl)(phenyl)methyl]-1piperazinyl}acetyl) phenyl] acetamide memiliki sifat antibakteri terhadap bakteri
Gram positif dan negatif (Amita et al.. 2011). Chue et al.. (2011) juga melaporkan
bahwa turunan piperazine yang direaksikan dengan asam betulonat, yaitu N-[3Oxo-20(29)-lupen-28-oyl]-4-(3,4-dichlorophenyl)-piperazine dan N-[3-Oxo20(29)-lupen-28-oyl]-4-(4-trifluoromethylphenyl)-piperazine
memiliki
sifat
antibakteri.
Senyawa asam propionat (propionic acid) dalam bentuk 3-pyrrolidin-2-ylpropionic acid (2.17%) terdeteksi dalam ekstrak kloroform. Asam propionat
secara teknis bersifat menghambat pertumbuhan kapang dan bersifat bakterisidal.
Senyawa ini digunakan dalam industri pengawetan pangan terutama produk
hewani dan biji-bijian (The Dow Chemical Company 2008). Senyawa 1octadecene dan fenol dalam persentase relatif kecil juga terdeteksi di dalam
ekstrak kloroform BS1. Menurut Mishra dan Sree (2007), senyawa 1-octadecene
dari Finlaysonia obovata memiliki sifat sebagai antibakteri terhadap bakteri
patogen ikan. Ekstrak daun sirih hijau telah diteliti juga mengandung senyawa
fenol (Chakraborty & Shah 2011). Diduga, senyawa fenol yang terkandung di
dalam ekstrak daun sirih hijau berasal dari bakteri endofit yang berada di batang.
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Sebanyak 14 isolat bakteri endofit telah diisolasi dari tanaman sirih hijau.
Pengujian ke-14 isolat terhadap empat bakteri patogen memunculkan satu isolat
potensial, yaitu BS1. Hasil analisis gen 16S rRNA, menunjukkan bahwa isolat
BS1 memiliki persentase kemiripan sebesar 94% dengan genus Pseudomonas sp.
Berdasarkan analisis dengan GC-MS ekstrak kloroform isolat BS1 terdiri dari
senyawa yang bersifat antibakteri antara lain 1-methyl-2,4-Imidazolidinedione dan
piperazine.
Saran
Perlu dilakukan optimasi waktu fermentasi isolat BS1 agar menghasilkan
rendemen ekstrak yang lebih banyak. Pemurnian hasil ekstraksi dengan
kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis (KLT) juga perlu dilakukan agar
analisis GC-MS memiliki hasil yang lebih baik.
DAFTAR PUSTAKA
Al-Adhroey AH, Nor ZM, Al-Mekhlafi HM, Amran AA, Mahmud R. 2011.
Antimalarial Activity of Methanolic Leaf Extract of Piper betle L. Molecules
16 : 107-118. DOI:10.3390/molecules16010107.
12
Ali, I. et al.. 2010. In vitro antifungal activity of hydroxychavicol isolated from
Piper betle L. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 9 (7).
Amita T, Mridula M, Manju V. 2011. Piperazine : the molecule of diverse
pharmacologic importance. IJRAP 2(5) : 1547-1548.
Arunachalam C, Gayathri P. 2010. Studies on bioprospecting of endophytic
bacteria from the medicinal plant of Andrographis paniculata for their
antimicrobial activity and antibiotic susceptibility pattern. Int J of Curr Pharm.
Res. 2 (4) : 63-68.
Bacon CW, Hinton DM. 2006. Bacterial endophytes : the endophytic niche, its
occupants, and its utility. Di dalam : Gnanamanickam SS, editor. PlantAssociated Bacteria. Netherland : Springer.
Beck HC, Hansen AM, Lauritsen FR. 2003. Novel pyrazine metabolites found in
polymyxin biosynthesis by Paenibacillus polymyxa. FEMS Microbiol Lett
220: 67–73. Di dalam : Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ, Dowling
DN. 2008. Bacterial endophytes: recent developments and applications Mini
Review. FEMS Microbiol Lett 278 : 1–9.
Bharat N, Irshad Md, Rizvi Md MA, Fatma T. 2013. Antimicrobial and cytotoxic
activities of cyanobacteria. Int. J. of Innovative Res. in Sci., Eng., and Technol.
2(9) : 4328-4343.
Bhore SJ, Sathisha G. 2010. Screening of endophytic colonizing bacteria for
cytokinin-like compounds: crude cell-free broth of endophytic colonizing
bacteria is unsuitable in cucumber cotyledon bioassay. World J. Agric. Sci. 6
(4): 345-352.
Castillo UF, Strobel GA, Ford EJ. 2002. Munumbicins,wide-spectrum antibiotics
produced by Streptomyces NRRL 30562, endophytic on Kennedia nigriscans.
Microbiology 148:2675–2685. Di dalam : Ryan RP, Germaine K, Franks A,
Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes: recent developments and
applications Mini Review. FEMS Microbiol Lett 278 : 1–9.
Castillo U, et al.. 2003. Kakadumycins, novel antibiotics from Streptomyces
sp.NRRL 30566, an endophyte of Grevillea pteridifolia. FEMS Microbiology
Letters 224: 180-190.
Chakraborty D, Shah B. 2011. Antimicrobial, antioxidative and antihemolytic
activity of Piper betle leaf extracts. Int. J. of Pharm. And Pharmaceutical Sci.
3 (3) : 192-199.
Chue KT, Chang MS, Ten LN. 2011. Synthesis and antibacterial activity of
betulonic acid amides with piperazine derivatives. Chem. of Natural
Compounds 47(5) : 759-763.
Clarridge JE. 2004. Impact of 16S rRNA gene sequence analysis for identification
of bacteria on clinical microbiology and infectious diseases. Clin. Microbiol.
Rev. 17 (4) : 840-862.
Desriani, Kusumawati DE, Rivai A, Hasanah N, Amrinola W, Triratna L,
Sukma A. 2013. Potential endophytic bacteria for increasing paddy var
rojolele productivity. Int. J. on Adv. Sci., Eng. and Information Tech. 3 (1) :
76-78.
Guan SH, Sattler I, Lin WH, Guo DA, Grabley S. 2005. p-Aminoacetophenonic
acids produced by a mangrove endophyte: Streptomyces griseus subspecies. J
Nat Prod 68: 1198–1200. Di dalam : Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan
13
DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes: recent developments and
applications Mini Review. FEMS Microbiol Lett 278 : 1–9.
Guha P. 2006. Betel leaf : the neglected green gold of india. J. Hum. Ecol. 19 (2) :
87-93.
Jalgaonwala RE, Mohite BV, Mahajan RT. 2010. Evaluation of endophytes for
their antimicrobial activity from indigenous medicinal plants belonging to
north maharashtra region india . Int. J. on Pharm and Biomed Res. 1 (5) : 136141.
Jose AC, Christy PH. 2013. Assessment of antimicrobial potential of endophytic
bacteria isolated from Rhizophora mucronata. Int. J. Curr. Microbiol. App. Sci.
2 (10) : 188-194.
Kumala S, Siswanto EB. 2007. Isolation and Screening of Endophytic Microbes
from Morinda citrifolia and their Ability to Produce Anti-Microbial
Substances. Microbiol. Indones. 1 (3) : 145-148.
Kumar N, Misra P, Dube A, Bhattacharya S, Dikshit M, Ranade S. 2010. Piper
betle Linn. a maligned Pan-Asiatic plant with an array of pharmacological
activities and prospects for drug discovery. Curr. Sci. 99 (7) : 922-932.
Melliawati R, Widyaningrum DN, Djohan AC, Sukiman H. 2006. Pengkajian
bakteri endofit penghasil senyawa bioaktif untuk proteksi tanaman.
Biodiversitas 7(3) : 221-224.
Miller CM, Miller RV, Garton-Kenny D, Redgrave B, Sears J, Condron MM,
Teplow DB, Strobel GA. 1998. Ecomycins, unique antimycotics from
Pseudomonas viridiflava. J. of App. Microbiol. 84 : 937-944.
Min HJ, Nam JW, Yu ES, Hong JH, Seo EK, Hwang ES. 2009. Effect of naturally
occurring hydroxychavicol acetate on the cytokine production in T helper cells.
Int. Immunopharmacol. 9 : 448–454.
Mishra PM, Sree A. 2007. Antibacterial activity and GCMS analysis of the extract
of leaves of Finlaysonia obovata (a mangrove plant). Asian J. of Plant Sci.
6(1) : 168-172.
Murata K. et al.. 2009. Hydroxychavicol: a potent xanthine oxidase inhibitor
obtained from the leaves of betel. Piper betle. J. Nat.Med. 63 : 355–359.
Nalina T, Rahim ZHA. 2007. The crude aqueous extract of Piper betle L. and its
antibacterial effect towards Streptococcus mutans. American Journal of
Biotechnology and Biochemistry 3 (1): 10-15.
Pradhan D, Suri KA, Pradhan DK, Biswasroy P. 2013. Golden heart of the
nature : Piper betle L. J. of Pharmacognosy and Phytochem. 1 (6) : 147-167.
Ruhe JJ, Monson T, Bradsher, RW, Menon A. 2005. Use of Long-Acting
Tetracyclines for Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus Infections:
Case Series and Review of the Literature. Clin. Inf. Dis. 40:1429–1434.
Ryan RP, Germaine K, Franks A, Ryan DJ , Dowling DN. 2008. Mini Review :
Bacterial endophytes: recent developments and applications. FEMS Microbiol
Lett 278:1–9.
Santhakumari P, Prakasam A, Pugalendi KV. 2006. Antihyperglycemic activity
of Piper betle leaf on streptozotocin-induced diabetic rats. J. Med. Food 9:
108–112.
Sharma S. et al.. 2009. Evaluation of the antimicrobial, antioxidant, and antiinflammatory activities of hydroxychavicol for its potential use as an oral care
agent. Antimicrob. Agents Chemother. 53 : 216–222.
14
Shukla R, Satish V, Singh VK, Kumar S, Gupta S, Gavani S. 2009. Antibacterial
Activity of Fresh leaves of “Piper betle Linn. The Pharma Research 1 : 110113.
Simanjuntak P, Bustanussalam, Otovina DM, Rahayuningsih M, Said EG. 2004.
Isolasi dan identifikasi artemisinin dari hasil kultivasi mikroba endofit dari
tanaman Artemisia annua. [studi mikroba endofitik tanaman Artemisia spp.].
Majalah Farmasi Indonesia 15 (2) : 68-74.
Simarmata R, Lekatompessy S, Sukiman H. 2007. Isolasi mikroba endofitik dati
tanaman obat sambung nyawa (Gymura procumbens) dan analisis potensinya
sebagai antimikroba. Berk Penel Hayati 13 : 85-90.
Sosa A.de J, Byarugaba DK, Amabile C, Hsueh PR, Kariuki S, Okeke IN. 2010.
Antimicrobial resistance in developing countries. Springer. Doi :10.1007/9780-387-89370-9_2.
Stiegler P, Carbon P, Zuker M, Ebel JP, Ehresmann C. 1981. Structural
organization of the 16S ribosomal RNA from E. coli : Topography and
secondary structure. Nucleic Acids Res. 9(9): 2153–2172.
Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J. 2004. Natural products from endophytic
microorganisms. J Nat Prod 67: 257–268. Di dalam : Ryan RP, Germaine K,
Franks A, Ryan DJ, Dowling DN. 2008. Bacterial endophytes: recent
developments and applications Mini Review. FEMS Microbiol Lett 278 : 1–9.
Suliantari, Jenie BSL, Suhartono MT. 2012. Aktivitas antibakteri fraksi-fraksi
ekstrak sirih hijau (Piper betle Linn.) terhadap patogen pangan. J. Teknol. dan
Industri Pangan 23 (2) : 217-220.
Tanaka M, Sukiman H, Takebayashi M, Saito K, Suto M, Prana MS, Tomita F.
1999. Isolation, screening and phylogenetic identification of endophytes from
plants in hokaido japan and java indonesia. Microbes and Environment 14(4):
237–241. Di dalam : Simarmata R, Lekatompessy S, Sukiman H. 2007. Isolasi
mikroba endofitik dati tanaman obat sambung nyawa (Gymura procumbens)
dan analisis potensinya sebagai antimikroba. Berk Penel Hayati 13 : 85-90.
The Dow Chemical Company. 2008. Product safety assessment : proopionic acid.
The Dow Chemical Company.
Tripathi S. 2008. Chemical investigation of betel vine (Piper betle L.) as
antioxidant agent [Ph D thesis]. Lucknow University, Lucknow.
[WHO] World Health Organization. 2013. Selected infectious diseases: Selected
diseases for latest years by country (latest years) [terhubung berkala]
http://www.apps.who.int/gho/data/view.main.1540?lang=en (3 Januari 2014).
Yadav SK, Adhikary B, Maity B, Bandyopadhyay SK, Chattopadhyay S. 2009.
The gastric ulcer-healing action of allylpyrocatechol is mediated by
modulation of arginase metabolism and shift of cytokine balance. Eur. J.
Pharmacol. 614 :106–113.
Zeng HW, Jiang YY, Cai DG, Bian J, Long K, Chen ZL. 1997. Piperbetol,
methylpiperbetol, piperol A and piperol B: a new series of highly specific
PAF receptor antagonists from Piper betle. Planta Med. 63 : 296–298. Di
dalam : Kumar N, Misra P, Dube A, Bhattacharya S, Dikshit M, Ranade S.
2010. Piper betle Linn. a maligned Pan-Asiatic plant with an array of
pharmacological activities and prospects for drug discovery. Curr. Sci. 99 (7) :
922-932.
15
Zinniel DK et al.. 2002. Isolation and characterization of endophytic colonizing
bacteria from agronomic crops and prairie plant. Appl. Environ. Microbiol. 68
(5) : 2198–2208.
16
Lampiran 1 Bagan alir penelitian
Tanaman sirih
hijau
Isolasi bakteri
endofit
Isolat bakteri
patogen
Isolat bakteri
endofit
Regenerasi bakteri
patogen dan bakteri
endofit
Seleksi awal untuk memperoleh
bakteri endofit potensial
Identifikasi dengan
marka 16S rRNA
Spesies bakteri
endofit
Isolat bakteri endofit potensial
Fermentasi
Ekstraksi senyawa
antibakteri
Ekstrak
Identifikasi dengan
GC-MS
Uji antibakteri terhadap
bakteri patogen
Senyawa antibakteri
17
Lampiran 2 Isolat bakteri endofit dari tanaman sirih hijau (Piper betle L.)
18
Lampiran 3 Sekuens DNA isolat BS1 hasil sequencing
>BS1_518F
CGGGGGGGCCCTCTTCTCTAATCCTGGTATTAAAACGCGCGAACGTGGTTCCTTAGGTGG
ATGTCAAAGCCCCGGGCTCTCCTGGGAACTGCGTCGAAAACTGGCCACCTCTGCTACCGT
AGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATAGGAACGAACACCAG
TGGCCAACGCGACCACCTGGACTGATACTGACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAA
CAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAATGATGTCCACTAGCCGTTGGAATCCT
TGAGATTTTATGGGCGCAGCTAACGCCTTACCTTGAGCGCCTGGGGAGTACGGCCGCACG
GTTAAAACTGATATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCTGCGGAGCATGTGGTTTAATTC
GAAGCAGCGCCAAGAACCTTACCAGGGCTTGCCATGCAGAGAACTTTCCAGAGATGGATT
GGTGCCTTCGGGAACTCTGACACCGGTGCTGCATGGCTGTCGTCCGCTCGTGTCGTGAGA
TGTTGGGATAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGAGTTACCAGCACTTTATCGT
GGTCACTCTAAGGAGGACTGCCGGTGACCAACCGGAGGAACGTGGGGATGACGTCC