Pengaruh Suplementasi PMSG dan hCG pada Proses Fertilisasi In Vitro dan Kultur Klon Embrio Sapi dengan IGF I

PENGARUII SUPLEMENTASI PMSG DAN hCG PADA PROSES
FERTlLlSASI IN MTRO DAN KULTUR
KLON EMBRIO SAP1 DENGAN IGF-I

Oleh
Machammad Sasmito Djati
92536/BIO

PROGRAM PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
1999

THE EFFECT OF SUPLEMENTATION O F PMSG AND hCG ON IN VITRO
FERTILIZATION AND IGF-I ON CLONE BOVINE EMBRYO CULTURE
Mochamrnad Sasmito Djati
(Under supervision of H-Yuhara Sukra. EI-Soewondo Djojosoebagjo, Syahrun
Hamdani Nasution,Bambang Purwantara,H.Ahmad Ansori Mattjik)
ABSTRACT
The objectives of this study were to examine the combination effect of PMSG,
hCG and FCS on maturation of bovine oocyte, fertilization. and in v i t r o embryo
development and suplementation o f IGF-I in cloned demi-embryo culture medium.

Oocytes were aspirated and selected according to the quallt? of oocytes. The basic
medium used for oocytes in vitro maturation (IVM) and embryo development (IVD) was
TCM 199. This medium was suplemented by either 10 % FCS. 10 IU PMSG, 10 IU hCG or
their combination. The maturation period was 22 to 24 hours. Incubation was done at 39°C
and 5 O h C 0 2 in humidified air. Matured oocytes were evaluated base on cumulus
expansion and nuclear transformation. Capacitation, acrosomc reaction and viability of
sperm were evaluated by sperm CTC staining method and tert~lizationrate were evaluated
by aceto orcein method. IVD was suplemented by the combination of 10% FCS, 3 IU
PMSG and 3 ILT hCG. Bovine embryo were microsurgically bisected and resulting in zona
free clone demi-embroys.
The results of these experiments indicate that the suplcmentation of 10 % FCS, I0
IU PMSG, and 10 IU hCG showed the highest maturation raic.96.8 % of cumulus enclosed
were fully expanded and 88,l % reached metaphase 11. Modified BO heparin-caffeine
with 37 mM concentration of NaHC03 had an effect on sperm penetrabilty (p0,05). When cumulus enclosed oocytes were fertilized and
incubated, high proportion of oocytes were penetrated by spermatozoa (91%) and there
was low proportion of polyspemic evidence (26,4%), in contrast denuded oocytes showed
high proportion of polyspemic evidence (44,4 %). It was found that spermatozoa has the
ability to penetrate oocytes within 2 hours of incubation. Furthermore, it was also found
that 8 hours of incubation that support penetration rate of 90,3 % yields cleaving rate of
90,O % after removing in IVD.The result indicates that TCM 199 suplemented by 10 % of

FCS, 3 IU PMSG and 3 IU hCG under cumulus cells coculture system can support the
development of embryo reach blastocysts stage (3 1,3 %). This showed the highest viability
as compare to other combination. The best way to produce a pair of clone demi-embryos
was microsurgically at blastocysts developmental stage of embryo and cultured in TCM
199 suplemented by IGF-I and FCS or FCS suplemented only.
It was concluded that suplementation of FCS, PMSG and hCG in IVM Supported
oocytes maturation rate. Modified BO medium and 8 hours of incubation resulted in
spermatozoa penetrated to oocyte perfectly and supported embryo development. It was also
concluded thzt nmicrosurgically bisected embryos produced 168,s '36 cloned embryos higher
than conventional IVF embryos.

MOCEAMMAD SASMITO DJATL 1998 .Pengar& Suplementasi PMSG dan hCG Pada
Proses Fertilisasi In Vitro hCG Dan Kultur klon Embrio Sapi Dengan IGF-I. Dibawah
bimbingan El-YUHARA SUKRA sebagai ketua. H. SOEWONDO D.SOJOSOEBAGJ0
(almarhum), SYAHRUN HAMDANI NASUTION,BAMBANG PURWANTARA, dan
H. A. ANSHORI MATIrJIK sebagai anggota.
Sapi merupkan salah satu jenis ternak yang telah memberikan kontribusi besar
guna memenuhi kebutuhan protein hewani masyarakat Indonesia Peran sapi semakin
penting, karena meskipun masih dalam keadaan laisis ekonomi kebutuhan daging maupun
susu diperkirakan masih cukup tinggi. Kebutuhan akan sapi tersebut kurang diimbangi

produktifitas sapi-sapi Indonesia, sehingga Indonesia mengimpor sapi baik berupa bakdan,
bibit sapi perah maupun susu. Kondisi sernacam ini harus segera diatasi, agar kondisi tidak
menjadi lebih buruk.
Salah satu dtematif untuk mengatasinya adalah memanfatkan teknologi rekayasa
biologi. Menurut Sukra (1986) salah satu bagim dari rekayasa biologi adalah teknologt
manipulasi embrio. Teknologi manipuiasi embrio yang paling s e d e r b adalah pembuatan
klon embrio, yaitu teknik kloning sederhana untuk membuat embrio kembar identik.
Pernanfaatan teknologi ini dapat meningkatkan stok embrio dengan kualitas k e u n d a n
sama dengan tetua. Peningkatan embrio bibit unggul diharapkan dapat meningkatkan
pasokan embrio kepusat-pusat embrio transfer, sehingga dalam jangka panjang produksi
daging dan susu dapat meningkat secara esensial. Disamping itu telmologi ini juga &pat
dimanfaatkan pada teknologi sexing, yaitu dengan memadaatkan sebagian sel-sel embrio
untuk d i d i s i s dengan kariotiping atau PCR, sedangkan bagian yang lain dibekukan dan
ditransfer sesuai dengan jenis kelamin yang dikehendaki (Hochman dkk., 19%). Aplikasi
penentuan jenis kelarnin ini mem*
perencaman pembanguam berdasarkan struktur
populasi ternak.
Teknologi manipulasi embrio membutuhkan embrio berkualitas baik, sehingga
diperlukan teknik-teknik fertilisasi in vitro yang &pat menghasilkan embrio-embrio siap di
rnani~ulasi.Meski~unhasil peneiitian fertilisasi in vitro pada hewan percobaan maupun

a pada teGaksapi kenunjukkan-perkernbanw yang cw berarti, t A p i peneraternak sam modukt~f keberhasxlannva relahfmasib belum memuaskan. Zendala a~likasi
oosit (Kanagawa dkk., 1989; Tervit, -1991;
fertilisasi' i; vitro adalah pem&
Pinyopwnintr dan Bavster, 1991) dan kttpasitasi sperma reaksi -om
( Fraser dkk.,
1995; Niwa dkk., 1992; Wang dkk., 1992) serta fenomena sel blok pada kdtur
pertumbuhan embrio (Sparks dkk., 1992; McGinnins dan Youngs,1992) . Sedangkan pada
kuitur Mon embrio masalah utama adalah adanya cekamm dan pemrdihan kondisi sel-sel
blastomer ataupun inner cell mass yang rusak akibat adanya penyayatan emtnio (William
dkk., 1985; Baker dm Shea, 1985; Takeda dlck.,1985; Gray dkk., 1991; Kippax dkk.,
1991).
Berdasarkan hal tersebut diatas. maka perlu upaya penelitian guna perbailcan sistem
kultur pada fertilisasi in v~h.0.Upaya tersebut diantaranya meWui proses pernatangan oosit,
kapasitasi dan reaksi akrosom sperma, serta tumbuh embrio maupun klon embrio. Dalarn

penelitian ini dicobakan pendayagunaan PMSG dan hCG sebagai gonadotropin yang lebih
murah untuk pematangan oosit dan pertumbuhan embrio.Modifikasi BO sebagai medium
FIV serta peranan sel-sel kumulus pada saat FIV.Disamping itu perlu metode kultur klon
embrio dengan berbagai modifikasinya dan pemanfaatan IGF-I dan FCS pada medium
Lultur, sehingga akan dihasilkan klon embrio siap alih.

Penelitian dilakukan selama 27 bulan dari bulan Februari 1996 sampai dengan
-'
April 1998 dilaksanakan di Animal Reproduction Luboratoty, Division ofAnimal Sc~ence
und 7'eclmology. Fucul/y of Agrrculrure. Okayama UniversiN Japan dan dilanjutkan di
Laboratorium Sentral Biologi Molekuler dan Seluler Universitas Brawijaya Malang.
Oosit yang digunakan dalam penelitian ini berasal dari: Japanese Black, Japanese
Hntwn, F H yang berasal dari Rumah Potong Hewan di Okayama. Semen beku adalah
semen ./upnese Bluck yang diperoleh dari Okayama Animal Husbandry Research Station.
Disamping itu digunakan pula oosit yang berasal dari PFH dari Rumah Potong Hewan
Malang dan Semen Beku FH yang diperoleh dari Balai Inseminasi Buatan (BIB) Singosari.
Malang. Peralatan inkubasi digunakan inkubator C02 5 persen dengan kelembaban
maksimum (sekitar 95 persen). Pewarnaan oosit untuk pengamatan transfomasi inti clan
angka penetrasi menggunakan asetoorcein, pengamatan dilakukan dengan menggunakan
mikroskop inversi sedangkan pewarnaan sperma dengan menggunakan pewarnaan CTC
pengamatan digunakan mikrokop fluoresensi Medium koleksi ovarium adalah NaCl
fisiologis dengan penambahan penicilin 100 IU/ml dan streptomisin 100 lU/ml. Medium
dasar yang digunakan dalam pematangan oosit dan pertumbuhan embrio serta kultur
embrio adalah TCM 199, sedangkan untuk fertilisasi adalah medium BO kafein-heparin
(Niwa, 1991). Suplemantasi medium adalah PMSG dan hCG pada medium pematangan
oosit masing-masing 10 IUIml, pada medium pertumbuhan embrio 3 N/ml, pada kultur

klon embrio dengan IGF-I rekombinan IOngIml dan FCS.
Ovarium dibawa dari RPH ke laboratorium dengan menggunakan medium koleksi
ovarium &lam suhu 25-35°C &lam waktu 2-3 jam. Oosit diaspirasi dengan menggunakan
jarum dan di cuci serta diseleksi dengan menggunakan medium Pematangan sesuai dengan
perlakuan, dikultur dengan menggunakan medium &lam bentuk tetesan (drop) yang
ditutup dengan parafin oil dan diinkubasikan selama 24 jam. Evaluasi pematangan oosit
dilakukan dengan pengamatan ekspansi sel-sel kumulus dan transformasi inti setelah oosit
diwarnai dengan metode asetoorcein (Niwa dkk., 1991).
Semen beku setelah dithawing dan disentrifugasi, diinseminasikan kedalam tetesan
BO-heparin-kafein yang berisi oosit, kemudian diinkubasikan selama 8 jam atau sesuai
dengan perlakuan. Angka penetrasi dapat Qamati dengan metode pewarnaan aseto-orcein
seperti yang dilakukan oleh Niwa (1992). Sedangkan kapasitasi dan reaksi akrosom diamati
dengan menggunakan metode pewarnaan spema CTC seperti yang dikembangkan oleh
Fraser dkk.(1995).
Kultur tumbuh embrio dilakukan dengan menggunakan sistim kokultur seperti yang
dikembangkan oleh Goto dkk. (1988), yaitu dengan memanfaatkan sel-sel kumulus yang
tersisa setelah fertilisasi in vitro, pertukaran medium dilakukan setiap 48 jam sekali,
sedangkan pengamatan pertumbuhan ernbrio dilakukan setiap 24 jam.Suplementasi
medium pada percobaan pertumbuhan embrio adalah penggunakan PMSG dan hCG serta
kombinasinya.

W i p u l a s i embrio digunakan metode manipulasi tanpa menggunakan pipet holder,
penyayatan embrio dilakukan dengan membuat torehan salib sumbu pada bagian dasar
cawan petri sebagai tempat kedudukan embrio, penyayatan dilakukan ditempat kedudukan
tersebut dengan menggunakan microblade sehingga embrio morula dan blastosis menjadi
dua bagian yang sama besar. Setelah dikultur selama 24 jam klon embrio dievaluasi dan
dimasukan dalam katagori I (istimewa), II (cukup), dan III(degenerasi). Medium kultur
yang digunakan dalam kultur embrio adalah TCM 199, FCS 10 persen dan (1GF)-I 10
ng/ml.
Data dianalisis dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap seperti yang
dikernukakan oleh Steel dan Torrie (1987) yaitu untuk menganalisis angka pematangan
oosit dan angka-an& fertilisasi. Sedangkan untuk menganalisis percobaan pertumbuhan
embrio dan klon embrio digmidcan analisis profil seperti yang dilakukan oleh Momson
(1976).
Hssil percobaan seleksi oosit dengan mengklasifikasikan oosit menjadi A, B, C, dan
D menunjukkan bahwa oosit yang dapat digunakan claim percobaan ini adalah oosit &lam
Mas A dan B saja, oosit tersebut bila dikultur selama 24 jam, 90,2 persen dan 90,3 persen
mencapai metafase 2. Sedangkan apabila oosit A dan B dikultur bangsa maupun kondisi
Iingkungan tidak memberikan pengaruh yang nyata (*0,05) terhadap pematangan oosit.
Suplementasi PMSG dan hCG pada medium pematangan memberikan pengaruh

yang nyata terhadap ekspansi kumulus (p-=0,05) yaitu 96,7 persen dari sel-sel kurnulus akan
terekspansi secara sempurna. Menurut Lu dkk. (1987) ekspansi sef-sel kumulus ini akibat
dari -&atan
CAMP intraseluler untuk mengaktiflcan resumsi meiosis. Demikian pula
pada proses transformasi inti oosit, kombinasi PMSG dan hCG dengan konsentrasi
masing-masing 10 IUIml merupakan kombinasi terbaik dibandingkan penarnbban PMSG
atau hCG saja, yaitu transformasi inti oosit mencapai tithap metafase 2 dengan medium
tersebut sebesar 88,I pers.cn. Proses pematangan oosit mempakan proses meiosis ysurg
diawali dengan segregasi kromosom (kondensasi DNA) pada spindel meiosis yang bersifat
haploid dari perkursor garnet yang bersifat diploid (Whitaker, 1996). Masalah yang sering
dihadapi &lam kultur pematangan oosit adalah adanya faktor pengharnbat meiosis yaitu
OM1 (Oocyte mumration inhibitor), OM1 merupakan polipeptida yang b e r m &lam
menghambat transformasi inti oosit secara in vivo (Ookata dkk;1992), tetapi sel-sel kumullts
aasih mensekresi OM' pada saat in vih.0 disekresi sel-sel kumulus (Tsafriri clkk., 1975;
Sat0 dan Ishibashi, 1990). Menurut Tsafiiri (1988) untuk mengumngi peran O M secara in
vitro perlu ada penambabn FSH pada medium kultur. Sedangkan menurut pen&pat
Talamantes dan Ogren (1988) peran FSH dapat digantikan oleh PMSG karena 90 persen
PMSG clan FSH bersifat homolog, perbedam Mya 14 peptida asatn amino yang terpasang
pada a-FSH, sedangkan f3-hCG 80 persen homolog dengan PLH.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsentrasi NaHC03 dalam medium 30

ideal -prig diperlukan untuk menunjang proses firtilisasi adalah 37rnM, kondisi ideal ini
dapat diindikasikan dengan penurunan viabiIitas spermatozoa yang diinkuSasikan selama 8
jam yaitu llfituk 37 mM mengalami penurunan sebesar 1 2 persen, penunman viabilitas ini
merupakan penunman ter kecil bila dibandingkan dengan konsentrasi NaHC03 sebesar 2 1
mM dan 45mM secara berhuut-turut 28,9 persen dan 172 persen, menHyne (1984)
NrtHCOs merupakan komponen dalam medium BO yang berperan dalam pembentukan

larutan penyangga. dengan adanya komponen penyangga ini proses fisiologis sel dapat
berlangsung secara normal, sehingga memungkinkan terjadi influx ca2+ k e d a h
spermatozoa (Lee dan Storey, 1986), reaksi akrosorn dan hiperaktifasi (Neil1 dan OldsClarke, 1987). Hasil penelitian ini juga ditunjang dari percobaan angka penetrasi sperma
terhadap oosit, dimana Larutan 30 dengan konsentrasi NaHCO, 37 rnM terdapat 92.3
persen oosit terpenetrasi, sedangkan untuk 21 mM dan 45 m M secara berturut-turut adalah
72.2 dan 71,1 persen oosit terpenetrasi.
d a m medium FIV terbaik adalah 8 jam, karena pa&
Lama inkubasi sperma--it
masa tersebut terjadi proses kapasitasi, reaksi akrosom sperma, pematangan oosit,
penetrasi sperma terhadap oosit dan pembentukan pronukleus jantan dan betina (Niwa dkk.,
1991; Abeydeera, 1994; Clarke dan Matsui, 1986). Dari hasil penelitian rnenunjukkan
bahwa sejak 2 jam di inkubasi sudah terjadi proses penetrasi sperma terhadap oosit
(14,lpersen), meningkat setelah 5 jam dan 8 jam yaitu sebesar 60 persen dan 90,3 persen,

tetapi apabila inkubasi dilanjutkan 1 1 jam dan 14 jam tidak menunjukkan peningkatan
yang nyata yaitu 89,s dan 91,5 persen. Lama inkubasi sperma-oosit dalam medium FIV
juga memberikan efek yang nyata pada kultur embrio pasca fertilisasi ( ~ O , 0 5 ) ,embrio
yang berasal dari sistim lama inkubasi 2 jam pertumbuhannya terhenti pada tahap
pertumbuhan 8 sel, sedangkan sistim lama inkubasi sperma-oosit 5, 8, 11 dan 14 jam
mencapai tahap perkembangan blastosis yaitu sebesar 21,7 persen, 36,7 persen, 6,6 persen
dan 8,6 persen. Menurut Kaye (1986) diperkirakan sistim lama inkubasi lebih dan 8 jam
mengakibatkan pertumbuhan ganggum terhadap embrio, karena kebutuhan nuhisional dan
lingkungan yang tidak memenuhi syanrt untuk perkembangan embrio pada medium FIV.
Menurut Niwa dkk. (1991) lama inkubasi sperma- omit selama 8 jam memberikan
kesempatan pada spermatozoa melakukan penetrasi terhadap oosit secara sempuma.
Apabila sperma di inkubasi dengan oosit berkumulus penuh, 2/3 dan 1/3 serta tanpa
sel-sel kumulus menunjukkan pola kapasiwi dan reaksi akrosom yang berbeda (+,05),
data ini menunjukkan bahwa sel-sel kumulus mempunyai peranan dalam proses kapasitasi
dan reaksi akrosom (Salustri dkk., 1992). Hal ini disebabkan karena sel-sel kurndus kaya
akan hyaluronidase (Veselsky dkk., 1992). disisi lain sel-sel kumulus mempunyai peran
dalam mengharnbat terjadinya polispermi, dimana oosit tanpa sel kumulus mengalami
kejadian polispermi terbanyak (44,4 persen).
Suplementasi FCS, PMSG dan hCG dengan sistim kokultur sel-sel kurnulus
memberikan pengaruh nyata pada pertumbuhan embrio *0,05)

dan juga menghasilkan
angka blastosis tertinggi (31,3 persen). DiperkirakaTl sel-sel kumulus mempunyai peran
dalam katabolisme glukosa, menurut Kreshner dkk, (1989) peran sel kurnulus memberikan
kontribusi perkembangan embrio melewati sel blok.
Dari hasil diketahui teknik terbaik dalam rnembuat klon embrio adalah
memanipulasi embrio pa& tahap blastosis. Menurut Reichelt d m N~eman(1994) pa&
embrio sitpi manipulasi dilaicukan pada tahap blastosis menghzsilkan jumlah sel ICM dan
trofoblits lebih banyak di bandingkan dengan morula. Dari hasil penelitian ini juga
diketahui apabila klon embrio di kultur lebih dari 24 jam, beberapa klon embrio mengalami
degenerasi.Hasi1 penelitian lain menunjukkan FCS dan IGF-I memberikan pengaruh nyata
terhadap kualitas Won embrio yang dikultur selama 24 jam.

Dapat disimpulkan bahwa suplementasi medium pematangan oosit dan
pertumbuhan embrio in vitro dengan FCS, PMSG dan hCG mernberikan penganih terhadap
pematangan oosit clan pertumbuhan embrio.Mediurn BO dengan konsentrasi NaHCOl 37
mM dan lama inkubasi 8 jam maghasilkan angka fertilisasi optimal dm mendukung
perkembangan embrio in vitro.Mikromanipulasi dengan FCS clan atau IG F-I meningkatkan
produksi embrio in vzrro.

PENGARUH SUPLEMENTASI PMSG DAN hCG PADA
PROSES FERTILISASI IN VITRO D A N KULTUR KLON
EME3RTO SAP1 DENGAN IGF-I

Oleh
Mocharnmad Sasmito Djati
92536BIO

Disertasi sebagai salah satu syarat
untuk memperoleh gelar Doktor
pada
Program Studi Biologi
Program Pascasarjana,Institut Pertanian Bogor.

P R O G R A M PASCASARJANA
IN STITUT PERTAN IAN BOGOR
1999

Judul

:PENGARUH SUPLEMENTASI PMSG DAN hCG PADA
PROSES FERTILISASI IN WTRO DAN KULTUR KLON
EMBRIO SAP1 DENGAN IGF-I

Nama Mahasiswa

:Mochammad Sasmito Djati

Nomor pokok

:92536/BIO

K

Menyetujui:
OPembimbing
~

-(Prof.Dr.H.Yuhara Sukra,M.Sc.)
Ketua

(Dr.Syahrun Hamdani Nasution)
Anggota

(Dr.Bambang Purwantara,M.Sc.)
Anggota

@r.Ir.H.A.Ansori Mattjik,M.Sc.)
Anggota
Ketua Program Studi Biologi

frida Manuwoto

RIWAYAT EIDUP

MOCHAMMAD SASMlTO DJATI, lahir di Yogyakarta pada tanggal 4 Maret 1961, dari
pasangan ayah Drs.KSoedarpo Mas'udhy Mustari dan ibu Rr Soekiniwati Ermi Darmani.
Penulis mengikuti pendidikan sekolah dasar di SDN Jember Kidul 11 tamat 1973,
SMPN IV Surabaya tamat 1976 dan SMAN V I Surabaya tamat 1980. Kemudian penulis
meneruskan pendidikan di Fakultas Peternakan Universitas Brawijaya OJNEBRAW) dan
memperoleh geiar insinyur pada Agustus 1986. Pada 1987 mengikuti pendidikan
pascasarjana S2 di Fakultas Pascasajana Universitas Padjadjaran ( W A D ) memperoleh
gelar Magister Sains pa& tahm 1990. Sejak 1992 penulis melanjutkan studi Program S3
di Program pascasajana IPB, Program Studi Biologi, melalui program sandwich penulis
melakukan penelitian disertasi di Universitas Okayama Jepang pada 1996-1997.
Beberapa pengalaman penulis semasa menjadi mahasiswa S1 di UNIBRAW,
adalah: Wakil Ketua BPM (Badan Perwakilan U i s w a ) 1980-1982 clan Ketua umum
BPM 1982-1984, Ketm umum Unit Akiifitas Perguruan Seni Bela diri Indonesia "Tapak
Suci", Ketua Asrama Mahasiswa 1984-1985. Di Bidang olahraga penulis pemah menjadi
Pesilat Teladan pada porseni rnahasiswa 1981, beberapa kali menjadi juara di dalam
kejuaraan mahasiswa maupun &wasa putra dari berbagai kelas yang bedan terakhir
menjadi Juanr III nasional kelas 75 kg dewasa pufra pada Kejurnas Perguruan Seni Bela
Diri "Tapak Suci" pa& tahw 1986 di Surabaya.
Karir kerja di rnulai pada 1990, yaitu sejak penulis diangkat menjadi dosen tetap ai
Badan Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat (BPPM) Universitas Muhammadiyah
Jember. Sejak 1994 penulis kembdi ke almamater diangkat menjadi pegawai negeri di
lingkungan FMIPA jutusan Biologi, UNIBRAW.
Pada tahun 1990 penulis menikah dengan Dra Rustaningsih Mulyono dan kini di
karuniai seorang putri yang diberi nama Nabilah Azzahra Jatiatmaja. Pada saat ini penulis
beserta istri &m seorang
tinggal di J1 Rogonoto 150 Singosari Maim Telp/Fax
(034 1)450724.

vii

UCAPAN TERLlMAKASIH
Puji syukur yang sangat dalarn ke hadirat Allah swt, karena hanya dengan l i m m a n

kasih sayangnya penulis dapat menyelesaikan serangkaian m d i yang hams ditempuh unhrk
menyelesaikan program pendidikan S3 di Program Pascasajana lnstitut Pertanian Bogor.

Pada kesemparan ini penulis ingin sampaikan ucapan terirnakasih kepada ketua
komisi pembimbing yaitu Bapak Prof Dr.H. Yuhara Sukra. M.Sc., sebagai ketua komisi
beliau telah mernberikan perhatian yang sangat besar terhadap proses pendidikan 53
penulis, perhatian beliau bukan hanya curahan waktu dan tenaga saja, tetapi juga
memprakarsai penulis untuk mendapatkan beastswa program Sarrdwhich dari
(Associaiion of l~ernafzonalEd-ion,

ALEJ

Japun) dari pemerintah Jepang. tanpa adanya

sarana ini suiit rasanya penulis akan berhasil menjalani proses penelitian ini . Disamping
itu

ada ha1 yang menarik dari beliau, sebagai seorang guru besar, beliau mempunyai

panclangan

dan wawasan yang cukup Iuas, sehingga menurut hemat penulis beliau

mempakan figur yang patut diteladani bagi para dosen dan peneliti mu&.
Selanjutnya penulis ucapkan terimakasih kepada almarhum bapak Prof Dr. H.

Soewndo

Djojosoebagdjo

menyeiesaikan

meskipun

beliau

tidak

&pat

meny&ikan

penulis

studi tetapi saran maupun perhatian beliau cukup berarti bagi penulis.

Begitu pula penulis ucapkan tezima kasih cian penghargaan yang setinggi-tingginya kepada

bapak D r Syahnm Hamdani Nasution, Bapak Dr.Bambang Purwantar% MSG., clan Bapak
Dr.11. H. k Ansori Uattjik. M.Sc. atas segala perhaiian, curahan waktu dan temganya

dalam penyelesaian penulisan iaporan disertasi ini.

Tidak lupa pula penulis juga ucapkan penghargaan clan terimakasih pada semua staf
Iaboratorium Embriologi FKH IPB sepem. Ibu drh. Ita Djuwita. M.Phil., drh. M. Fachrudln

yang telah banyak rnembantu penulis pada saat awal penelitian berlangung.
Penulis juga sampaikan ucapan terima kasih dan pengkgaan khusus kepeda Sensei
Prof Dr. Koji Niwa, guru besar di Fakultas Pertanian Universitas Okayama, Dr Iliroaki
Funahashi, Dr Kiyoshi Okuda serta seIuwh teman-teman di laboratorium reproduksi he\\an
Universitas Okayama seperti Kasoke Iga, Ken Sawai, Chikage Nobuoka, Park Kwang
Hook, Choi S u n Ho, Oh Seh Hoon, Song Xue Xiong d m semuanya yang belurn sempat
saya sebutkan namanya, atas segala bantuannya di laboratorium

dan di Rumah Pntang

Hewan Okayama, serta keakraban mereka diluar kegiatan penelitian, membuat penulis
banyak belajar dari mereka baik dari segi etos keja, ketelitian kerja dan banyak ha1 lain
yang cukup berarti bagi penutis.

Talc lupa penulis ucapkan banyak terima kasih kepada Bapak D r Sutiman B.
Sumitro yang telah mernberikan sarana laboratorium pada saat penulis melanjutkan
penelitian di FMPA UNIBRAW, dan beberapa teman sejawat yang membantu proses
penelitian say% sehingga proses penelitian dapai berlangsung dengan baik.
Penghargaan setinggi-tingginya juga penulis sampaikan kepada bapak Ir. Dm. A.
Asri Harahap, Ketua Yayasan pembinaan Masyarakat Islam, atas segala bantuan yang tulus

ikhlas pa& saat penulis medgdaml kesulitan finansial terutama sebelum penulis menerima
&a siswa, bsntuan ini sangat hesar h n y a buat mendorong penulis untuk menyelesaikan
studi program S3, penulis seldu berdoa kehadirat Allah SWT. mudah-mudahan arnal
kebajikan beliau di baias oleh Ailah SWT.

Selanjutnya penulis mengucapkan terirna kasih kepada Team Manajemen Program
Doktor (TMPD) Ditjen Dikti, dimana penulis sejak 1995 hingga saat ini telah memberikan
beasiswa

kepada

pcnulis. Demikian

pula

kepada

Rektor lPB,

Direktur

Program

Pascasarjana dan Ket ua Program Studi Biologi, serta staf pengajar IPB, karyawan, maupun
segenap keluarga bssar IPB .
Tak lupa pula penulis ucapkan banyak terima kasih pada pengurus Lembaga
Swadaya Masyarakat PHP (I'euce Happiness und Prosperity) terutama bapat Robert
J.Wargo, yang telah mernbantu finansial penulis dalarn penyelesaian akhir disertasi ini.
Terakhir dan tcristimewa kepada seluruh sanak keluarga, Ayah dan Bunda yang
selalu rnernbesarkan penulis dengan penuh kasih sayang serta Istri tercinta yang telah
berkorban sedcm~kianbesar derni keberhasilan studi penulis, begitu pula sikecil Nabilah
yang lahir tatkala penulis sedang sibuk-sibuknya penelitian, semua pengorbanan mereka
penulis yakin tidak akan sia-sia dan mudah-mudahan Allah SWT membalasnya.

DAFTAR IS1

Halaman
ABSTRACT ..................................................................................................
RINGKASAN .........................................................................................
RIWAYAT HIDUP ...............................................................................
UCAPAN TERIMAKASI t l ........................................................................
DAFTAR IS1................................................................................................
DAFTAR TABEL .....................................................................................
DAFTAR GAMBAR..............................................................................
DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................
PENDAHLILIJAN ..................................................................................
Latar belakang
............................................................................
..
Tujuan penelltlan
................................................................................
..
Manfaat penel~t~an
..............................................................................
Hipotesis .............................................................................................
TINJAUAN PUSTAKA ..........................................................................
Pertumbuhan gamet. fenilisasi. dan c . l e v r ~ . r r ~.....................................
c.
Pertgrnbuhan garnet ..............................................................
Oosit ....................................................................
Spermatozoa ...........................................................
. . .
Fert~llsas~
............................................................................................
Kapasitasi dan reaksi akrosom ...............................................
Proses masuknya spermatozoa k e dalam oosit ......................
C.leuvuge ............................................................................................
Terjadinya kernbar identik alamiah.....................................................

Pematangan garnet. fertilisasi. dan pertumbuhan embrio in
virro..............................................................................
Pematangan oosit in vitro (PIV)............................................
Kapasitasi dan reaksi akrosom spermatozoa in vitro.............
Fertilisasi in vitro {FZV,.........................................................
Pertumbuhan embrio in vitro ..............................................
Bahan-bahan yang diperlukan dalam medium kultur in
vilro.......................................................................................

Karbohidrat ..............................................................
Asam amino .............................................................
Faktor penumbuh .....................................................
Gonadotropin ...........................................................
Lemak .....................................................................
Zat-zat bioaktif lainnya............................................
Serum.......................................................................
Mineral dan unsur jarang .........................................

1

..

ii

vii

...

Vlll
XI

xiv
x \'

xvii

Pemanfaatan sel-sel kumulus dalam sistim kokultur.............
Embrio kembar buatan (Kloning embrio).............................
MATERI DAN METODE PENELITIAN .................................................
Tempat percobaan.............................................................................
Percobaan pendahuluan.....................................................................
Percobaan pematangan oosit, fertilisasi, dan perturnbuhan embrio in
virro....................................................................................................

Percobaan pembuatan klon embrio.....................................................
Pelaksanaan .percobaan
.......................................................................
.
Materi penel~t~an
...............................................................................
. . .......................................................................
Metodologi penel~t~an
: Percobaan pematangan oosit............................
Tahap I
Persiapan pembuatan medium..................................
Klasifikasi ovarium..................................................
Koleksi ovarium .......................................................
.
.
Asp~rasioosit ...........................................................
Evaluasi pemetangan oosit ......................................
: Percobaan fertilisasi 1
i7 vifro............................
Tahap II
Medium
in vitro ........................................
. . fertilisasi
.
Fert111sas1in vifro.....................................................
Evaluasi sperma .......................................................
Evaluasi penetrasi sperma terhadap oosit .................
Tahap 111 : Percobaan pertumbuhan embrio in virro..........
Medium pertumbuhan embrio..................................
Tahap IV ~Percobaanpembuatan klon embrio...................
Medium manipulasi embrio......................................
Medium kultur klon embrio ......................................
Pembuatan klon embrio ............................................
. .
. .
Analisls s a t ~ s t ~..................................................................
ka

HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................................
Pematangan oosit in vilro...................................................................
Pengaruh perbedaan kualitas oosit terhadap pematangan in
virro.......................................................................................
Pengaruh perbedaan bangsa sapi terhadap pematangan oosit
in vitro ...................................................................................
Pengaruh musim terhadap oosit in vitro................................
Pengaruh suplementasi PMSG dan hCG terhadap ekspansi
sel-sel kumulus dan transformasi inti in vifro........................
Fenilisas~in vitro
Pengaruh NaI-ICQ3 pada medium fertilisasi in vitro ..............
Pengaruh lama -iakubasi sperma-oosit pada medium
fertilisasi in vitro terhadap angka penetrasi sperma-oosit.....

Pengaruh keberadaan sel-sel kumulus pada saat fertilisasi in
vilro............ . . . ............................. . .............. . ........... . . ...........
Perturnbuhan ernbrio in vilro............................................................
Pengaruh suplementasi PMSG dan hCG untuk
perturnbuhan dengan sistem kokultur...................................
Kultur klon ernbrio...........................................................................
..
Kultur klon embrio yang berasal dari embrio dengan tahap
perkembangan dan kondisi medium yang berbeda................
KESIMPlIl,AS DAN SARAN
Kcslmpulan..... . ............. .............. ............... . . . ........................ . . ........... .
Saran
. . . . ......... . . .............. . ................ . . . ........................................ . . . ..

DAFTAR TABEL
Halaman
No
Teks
20
1 Pengaruh keberadaan sel-sel kumulus pada oosit pada saat pematangan
oosit terhadap tingkat fertilisasi (hawk,dkk., 1 992). ...................... ...........
2 Konsumsi oksigen dan konsentrasi CAMP dalam spermatozoa sapi
sesaat sebelum clan sesudah inkubasi dengan kokultur dan tanpa sel-sel
epitel sapi (White,dkk.,l992) ............. . ................... ................ ........... . . ....
3 Prosentase pembelahan embrio sapi yang dihasilkan melalui fertilisasi
in vitro dengan kokultur sel-sel ephitel ovidak
(Xu,dkk., 1992)........... . ............. . . . ........... ..... . . . ................. ... .......... . ........
4 Pengaruh serum fetus sapi terhadap kejadian penetrasi sperrna pada
oosit in vitro (Widt dkk., 1992)................................................................
5 Tingkat kebuntingan sapi dara dan induk resipien hasil transfer embrio
paruh dua buah embrio perempatan (Brebbacka, dkk.,1992) ....... . .......... .
Desain perwbaan pematangan oosit ..................................................... .
Desain percobaan tingkat penetrasi oosit ............ . ............ ............. . .........
Kondisi viabilitas sperma, sperma terkapasitasi, reaksi akrosom
sperma..
Lama inkubasi terhadap angka penetrasi sperma pada oosit ....................
Tingkat penetrasi sperma terhadap oosit dengan kondisi sel kumulus
berbeda.. ....... . .......... . ............ ...................................... ...........................
Pengaruh suplementasi hormon PMSG dan hCG pada medium PIV
terhadap tingkat penetrasi sperma terhadap oosit sapi ........ ............. ........
Kategorisasi pasangan klon embrio yang berasal dari embrio morula
maupun blastosis ..... ............ ..................................... . .............. . . . .......... . .
Jumlah klon embrio kategori I d i M t u r s.d. 96 jam ................................
Kategorisasi pasangan klon embrio yang dikultur dengan kondisi
medium berbeda selarna 24 jam ..............................................................

DAFTAR GAMBAR
Teks
Diagram proses spermatogenesis .......................... ......................... . ....
llustrasi proses fertilisasi secara lengkap sampai terjadinya
singami .....
Diagram proses teqadmya kembar monosigotik
.. . .....
Oosit yang telah diaspirasi dan di cuci siap untuk di kultur .................
Teknik penyayatan embrio menjadi dua bagian yang sama besar ........
Pengaruh perbedaan kualitas oosit (A,B,C,dan D) terhadap
transformasi inti oosit yang dikultur secara in vitro selama 24 jam .....
Transfomasi inti oosit pada saat meiosis............................................
Kualitas oosit hasil aspirasi dari ovarium sapi yang berbeda bangsa ...
Perbedaan transformasi inti oosit setelah dikultur selama 24 jam
dengan oosit yang berasal dari ovarium yang berbeda bangsa .............
Oosit hasil aspirasi dengan kualifikasi A ..............................................
Konsep umum pengaruh keadaan lingkungan terhadap mekanisme
reproduksi pada mamalia ....................................................................
Pengaruh musim terhadap kualitas yang dihasilkan oleh Japanese
Black cow
Transfomasi inti oosit yang di aspirasi dari ovarium sapi pada
musim yang berbeda dan setelah di M t u r secara in virro selama 24
jam. . . . .. ... . .. . . . .. . ... ... .. . .. . ... ... ... ... ... .. . ... ... ... .. . ... ... .. . ... ... .. .
Pengaruh suplementasi hormon PMSG dan hCG pada medium
pernatangan oosit in vitro terhadap tingkat ekspansi sel-sel kumulus..
Pengaruh suplementasi PMSG dan hCG pada medium PIV terhadap
transfomasi inti oosit sapi ..................................................................
Model hipotetik mekanisme transduksi LH modifikasi dari Mattioli
( 1994)................ ................................, , . , .................... . . . . .. . ................ .
Kualifikasi ekspansi sel-sel kumulus pada tingkat 2 (sel-sel kumulus
terekspansi secara sempurna) setelah dikultur selama 24 jam .............
Viabilitas sperma yang diinkubasi selama 8 jam dengan konsentrasi
NaHCO, dalam BO yang berbeda ........................ .
.
..........................
S p e m a dengan CTC (Chlortetracycline)......1............... ... ................. .
Pengaruh konsentrasi NaHC03 dalam BO terhadap angka penetrasi
sperma-oosit, transformasi inti sperma ................. . . . . ... ................ . ......
Pengaruh lama inkubasi sperma-oosit pada saat FIV terhadap
tumbuh embrio pasca FIV.......................... .
.
......................................
. .
Proses f e r t l ~ s a sin~ vitro......................................................................
Pengaruh suplementasi hormon PMSG dan hCG pada medium
turnbuh in vitro terhadap perturnbuhan embrio sapi............................
Monolayer sel-sel kumulus untuk kultur embrio ..................................
Embrio tahap morula ......... . ........... . .......................................... . .....

26

27

Embrio tahap blastosis awal (a) dan blastosis akhirlexpanded (b)
pada hari ke 6 kultur dan (c) embrio degenerasi ................. . ................
Blastosis tetas pada han ke 23 tampak ICM (Inner Cell M a s s )..........

xvi

84
84

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
Komponen-komponen medium 199......... ........... .. ............ .......... . . ........
Media Fertilisasi . . . ................. . .. ................. . . . ............ . ......... . . ......... . .....
Bahan-bahan kimia
untuk pembuatan medium ......................................
. .
Peralatan penel~t~an..
........ . .................................... ............ ....................
Pengaruh perbedaan kualitas oosit (A,B,C,D) terhadap transformasi
inti oosit yang dikultur secara in vitro selama 24 jam ............................
Kualitas oosit hasil aspirasi dari ovarium yang berasal dari sapi-sapi
berbeda bangsa.. . ............. . ........................... .... ..... . .......... .....................
Perbedaan bangsa sapi terhadap transformasi inti oosit yang dikultur
selama 24 jam .......................................................................................
Pengaruh musim terhadap kualitas oosit pa& oosit Japanese Black. ....
Pengaruh musim terhadap transformasi inti oosit Japanese Black ........
Pengaruh suplernentasi PMSG dan hCG pada medium pematangan
oosit m vitro terhadap ekspansi sel-sel kumulus ...................................
Pengamh suplementasi hormon PMSG dan hCG pada medium PIV
terhadap tingkat pematangan oosit sapi................................................
Lama inkubasi terhadap angka penetrasi sperma pada oosit ......... .........
Pengaruh lama inkubasi terhadap pertumbuhan embrio pasca FIV ........
Angka penetrasi sperma terhadap oosit dengan kondisi BO medium
yang konsentrasi NaHC03 berbeda ................. . .. .......... . .......... . . ...... . , . . ..
Angka penetrasi sperma terhadap oosit dengan kondisi se; kumulus
berbeda................ ................ . .. . . . . ................ . ............... ........... . ......... . ...
Pengaruh supleinentasi hormon PMSG dan hCG pada medium PIV
terhadap angka penetrasi sperma terhadap oosit sapi .............................
Pengaruh suplementasi PMSG dan hCG pada medium pertumbuhan
. .......................................................
embrio sapi
Klon embrio kategori I yang dikultur s.d. 96 jam dengan medium
yang berbeda... ........................................................................................
Kategorisasi pasangan klon embrio yang berasal dari embrio morula
maupun blastosis setelah di kultur selama 24 jam ..................................
Kategorisasi pasangan ambrio klon yang dikultur dengan kondisi
medium yang berbeda selama 24 jam .....................................................

PENDAaULUAN

Latar belabng
Sapi merupakan salah satu jenis temak yang tetah memberikan kontibusi besar

dalam memenuhi kebutuhan protein hewani masyarakat Indonesia. Diperkirakan
kebutuhan daging maupun susu di masa yang akan &tang semakin meningkat sebagai
akibat turnbuhnya kesadaran masyarakat untuk mengkonsumsi protein hewani.
Disisi lain, perkembangan kuantitas maupun kualitas petemakan sapi rakyat yang
merupaksn pemasok terbesar kebutuhan daging maupun susu masyarakat, berlangsung
sangat lambat. Sebagai akibatnya, sejak tahun 1986 Indonesia mulai mengimpor daging
maupun sapi potong guna meningkatkan pasokart daging masyarakat (BPS, 1987).
Kondisi semacam ini bila di biarkan, akan semakin memperparah keadaan. Hal ini
memperbesar peningkatan impor sapi, dagng dan susu dari negara fain yang berakibat
pemborosan devisa negara. Gejala ini menjadi lebih buruk pa&

saat Indonesia

mengalami krisis ekonomi. Pada sektor pertanian subsektor peternakan mengalami
pukulan terberat dibanding subsektor lainnya. Untuk itu diperlukan upaya strategis
pembangunan peternakan yang terencana dan terarah khususnya di bidang pengadaan
bibit.
Salah satu alternatrf untuk mengatasi kondisi tersebut adalah pemanfaatan

teknologi reproduksi berupa transfer embrio. Dengan teknologi ini diharapkan embrioembrio bibit unggul dapat

didistribusikan kedaerah-daerah

pusat pembibitan dan

produksi daging serta susu untuk perbaikan mutu genetik dan produktifitasnya.
Penerapan pengembangan

transfer embrio sering terjadi berbagai kendala

rnisalnya, berupa adanya keterbatasan jumlah ernbrio yang siap di transferkan. Upaya-

upaya untuk meningkatkan jurnlah embrio dapat dilakukan dengan memanfaatkan
teknologi embrio Honing sederhana guna memproduksi kernbar identik. Teknologi
manipulasi embrio ini merupakan teknologi yang

dilakukan dengan cara pemisahan

blastomer (splitting) embrio menjadi dua bagian. Teknik ini akan menghasilkan klon
embrio yang mempunyai

genotip sama dengan tetua.

semacam ini dapat meningkatkan jurnlah embrio

Diharapkan dengan metode

dengan tidak mengurangi kualitas.

Menurut King dkk.(1992) klon embrio ini juga dapat dibekukan Dengan teknologi
pembekuan, klon embrio dapat disimpan dan dikirirnkan tanpa hambatan waktu dan
j d a h . Oleh karena itu teknologi manipulasi embrio merupakan bagian integral dari

rekayasa biologi yang diolah berdasarkan pendekatan padat i h u clan teknologi, serta
mencerminkan unsur prod*

proses dan pelayanan (Sukra, 1986). TeknoIogi ini juga

dapat dirnanfaatkan untuk embryo sexing. Bagian dari sel-sel embrio hasil manipulasi
&pat dirnanfaatkan untuk dianalisis

jenis kelaminnya dengan menggunakan teknik

kariotiping atau PCR (Hochrnan dkk-, 1996).
Teknologi manipdasi embrio membutuhkan ernbrio berkualitas baik, sehingga
diperlukan teknik fertilisasi in vitro yang dapat menghasilkan embrio-embrio siap di
manipulasi. Meskipun hasil penelitian fertilisasi in vitro pa& hewan percobaan maupun
pada sapi menunjukkan perkembangan yang cukup berarti, tetapi penerapannya pada
ternak-temak sapi procluktif keberhasilannya relatif masih belum memuaskan. Kendala
aplikasi fertilisasi in vitro adalah pematangan oosit clan kapasitasi sperma (Kanagawa
dkk. 1989; Tervit, 1991 ;Pinyopumintr clan Bavister, 1991).

Rangkaian proses fertilisasi in vitro (FIV) diawali dengan Penentuan kualitas
oosit dan

pematangan msit. Proses pematangan oosit dapat dilakukan berdasarkan

tingkat pembelahan meiosis, yaitu suatu proses pembelahan seI-sel gamet dari yang
bersifat diploid menjadi haploid (Whitaker, 1996). Proses ini merupakan rangkaian
peristiwa yang berawal dari tahap pembelahan profase, metafase I, anafase I, telofase I,
sampai metafase fl.Tahap ini merupakan tahap a i r terjadinya ovulasi secara alamiah

pa& sapi indikator pematangan oosit (Campbell dkk., 1996; Chian dkk., 1992; Sirard
dan Coenon, 1995). Pada omit. secara mikroskopis proses miosis ini dapat diamati
melaiui transformasi inti oosit, yaitu berupa tahap germinal vesicle (GV), germinal
vesicle break down (GVBD), prometafase (PM), metafase I, sampai dengan metafase I1
(Abeydeera dan Niwa, 1992; Yoshida, 1992).
Salah satu kondisi yang sangat penting pa& tahap pematangan oosit adalah
kondisi fisioiogis pematangan oosit sampai terjadinya proses ovulasi. Dari beberapa
penelitian menunjukkan bahwa ada beberapa hormon penting yang sangat berperan
&lam proses pematangan oosit yaitu FSH, LH. Estradiol (Gerrity, 1992; Kakenkintepe
dkk., 1994; Pawshe dkk., 1996). Hormon-hormon ini bekeja sama diantaranya dengan
faktor penumbuh insulin like growth factor-1 IGF-I (Yallampalli dkk.,1992), IGF-I ini
b e h g s i merangsang sel-sel granulosa

untuk mensekresi hormon FSH dan LH

(Lavranos dkk.,1996). Fungsi dan peran hormon-hormon gonadotropin secara teoritis
&pat

digantikan oleh honnon-hormon sejenis lainnya seperti PMSG (pregnant mare

serum gonadotropin) dm hCG (human chorionlc gonudofropin). Menurut Solomon
(1988) kedua hormon ini mempunyai bioaktifitas m ~ n pFSH dan LH, sehingga dengan
suplementasi PMSG dan
transfomasi inti oosit.

hCG pa&

medium kultur akan mempengamhi proses

Sel-sel kumulus adalah sel-sel granulosa yang menempel pada oosit

dan

dindingnya berhngsi sebagai agen "komunikasi" antara sel dan penghubung mekanisme
hormonal dari menuju oosit, karena pa& sel-sel kumulus terdapat banyak reseptor FSH

dan LH yang juga dapat berfungsi sebagai reseptor PMSG dan hCG (Moore dan Ward,
1980; Licht dkk., 1979; Gillou dan Combamus, 1983; Stewart dan Allen, 1981; Haresign
dkk.,1994). Disamping itu berperan juga dalarn pemasokan nutrisi terhadap oosit. Sel-sel
kumdus akan mengalami ekspansi (mengembang) apabila terstimulasi akibat adanya
peningkatan aktifitas peran hormon gonadotropin d m metabolisme seluler tersebut
(DeHaan, 1994; Konishi dkk.,1996; Wandji dkk..1996). Sel-sel kumulus berperan sangat
penting dalam proses pematangan oosit dan

dengan pengamatan tingkat ekspansinya

dapat dievaluasi tingkat kematangannya. Peranan lain yang sangat penting dari sel-sel
kumulus pada saat fertilisasi in vifro adalah peranan sel-sel tersebut dalarn reaksi
akrosom spermatozoa fBavister,l982). Peran ini dikarenakan set-sel kumdus banyak
mengandung asam hyaluronat

(Talbot dan DiCarlantonio, 1984), sehingga sel-sel

kumulus tidak perlu dlepaskan dari oosit pa& saat fertilisasi in vifro.
Sel-sel kurnulus dapat pula

mensekresikan hormon-hormon

progresteron,

estradiol, clan prostaglandin dengan kadar yang relatif cukup tinggi dan dapat berperan
dalam proses suplai nutrisi yang dibutuhkan oleh embrio (Canipari. 1994; Liu dkk.,1987;
Mattioli, 1994, Ny dkk.,1987). Dari pendapat ini sel-sel kumulus ini masih dapat
dimanfaatkan untuk kultur embno. Pada saat setelah fertilisasi banyak terdapat sel-sel
kumulus yang rusak dan hancur, sehingga diperlukan penambahan hormon-hormon
gonadotropin pa& medium tumbuh embrio termasuk chorionic gonadatropm, yaitu

PMSG dan K G , PMSG secara in vitro &pat mengoptimalisasikan stimulasi sel-sel
kumulus tersisa untuk mensekresikan progresteron.
Fertilisasi adalah merupakan rangkaian proses yang dimulai ckri adanya peristiwa
penetrasi spermatozoa ke dalam oosit sampai tejadinya proses singami dari pronukleus
jantan dan betina (Yanagimachi. 1988; Kanagawa dkk, 1989). Peristiwa ini dapat
dilakukan secara buatan melalui teknologi fertilisasi jn vifro. Hambatan utama d a l m
aplikasi teknologi fertilisasi in vitro ( F N ) adalah adanya perbedaan men&sar kondisi in
vzvo dan in vitro. Hambatan dalarn fertilisasi in vitro dapat diatasi dengan menggunakan

medium fertilisasi yang sesuai dan mendekati kondisi in vivo. Salah satu medium dasar
FIV yang digunakan adalah medium BO (Brackett dan Oliphant. 1975). Medium BO

pa& dasarnya pengembangan dari medium yang digunakm untuk FIV pada kelinci dan
hewan percobaan laimya, sehingga perlu adanya modifikasi. Modifikasi BO tersebut
dilakukan dalam bentuk konsentrasi bahan kimia tertentu yang berbeda dengan medium
BO sebagairnana dilakukan pada FIV kelinci.
Senyawa

penting yang berperanan dalam

proses kapasitasi adalah sodium

bikarbonat (NaHC03, (Salustri dkk.,1992). Senyawa ini berperan sebagai penyangga
dalam medium FIV (Thompson,l996), dengan adanya senyawa penyangga &lam
medium FIV virtbiltas sperma akan tetap tejaga, sehingga proses kapasitasi, reaksi
akrosom, dan motilitas sperma selama di dalam media kultur akan tetap tejaga. Dengan
penambahan senyawa NaHC03 dengan konsentrasi tertentu dan dikuitur dalam waktu
tertentu, diharapkan spermatozoa akan mampu melakukan penetrasi terhadap oosit.
Dengan demikian suplementasi medium fertilisasi in virro (BO) dengan kafein dan
heparin serta NaHC03 mernpermudah terjadinya fertilisasi in vitro.

Pada kultur klon embrio masalah utama yang dihadapi adalah cekarnan dan
pemulihan kondisi sel-sel blastomer ataupun inner cell mass yang rusak akibat adanya
penyayatan embrio (Williams dkk., 1985; Baker dan Shea, 1985; ~ a k e d adkk., 1985;
Gray dkk., 1991; Kippax dkk 1991). Untuk mengatasi kendala tersebut, medium
manipulasi di tambah dengan senyawa penyangga HEPES yang dapat berpentnan untuk
mengatasi cekaman mekanis akibat manipulasi embrio. Pemulihan kondisi embrio akibat
manipulasi memerlukan penambahan bioaktif tertentu yang dapat mempercepat proses
pemulihan kembali klon embrio tersebut. Salah satu alternatifnya adalah penambahan
*

faktor penumbuh IGF-I. IGF-I ini merupakan faktor penumbuh yang berfungsi untuk
menstimulir pembelahan mitosis, proliferasi, differensiasi, dan morfogenesis set-sel
embrio (Armstrong dan Xia, 1993;Heyner dkk.,l993;Simmen dkk., 1993). Penambahan

IGF-I klon embrio dapat mempercepat rekonstmksi inner cell mass dan blastomer
sehingga berkembang menjadi embrio barn.
Berdasarkan ha1 tersebut diatas, maka perlu dilakukan upaya penelitian guna
perbaikan sistem kultur pada fertilisasi in virro. Upaya tersebut diantaranya melalui
proses pematangan oosit, kapasitasi dan reaksi akrosam sperma, serta pertumbuhan
embrio maupun klon embrio. Dalam penelitian ini di cobakan pendayagunaan PMSG
dan hCG sebagai gonadotropin yang lebih murah untuk pematangan oosit dan
pertumbuhan embrio. Moditikasi BO sebagai memum FIV serta peranan sel-sel kumulus
pada saat FIV. Disamping itu perlu adanya metode kultur klon embrio dengan berbagai
modifikasinya dan pemanfaatan IGF-I clan FCS pada medium kultur, sehingga akan
dihasilkan embrio-klon embno siap di transfer.

Penerapan teknik fertilisasi in vitro

dihadapkan pada

adanya kesenjangan

kondisi lingkungan antara in vitro dan in vivo, serta adanya cekaman oosit terlepas dari
foli