Kinetika biotransformasi suksinonitril menjadi asam suksinat oleh Pseudomonas sp.

i

KINETIKA BIOTRANSFORMASI SUKSINONITRIL
MENJADI ASAM SUKSINAT OLEH Pseudomonas sp.

TUTI UTAMA SIREGAR

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

ii

ABSTRAK
TUTI UTAMA SIREGAR. Kinetika Biotransformasi Suksinonitril menjadi Asam
Suksinat oleh Pseudomonmas sp.. Dibimbing oleh GUSTINI SYAHBIRIN dan
BAMBANG SUNARKO.
Asam suksinat (HOOC(CH2)2COOH) merupakan senyawa komersial yang banyak
digunakan dalam bidang pangan, misalnya pada industri kecap, sari buah, anggur, dan

produk-produk susu lainnya. Selama ini asam suksinat yang kita gunakan dihasilkan
melalui serangkaian reaksi kimia yang sangat berbahaya sehingga diperlukan alternatif
baru yang lebih aman dan murah melalui proses biotransformasi dengan memanfaatkan
aktivitas Pseudomonas sp. Untuk mengetahui kemampuan Pseudomonas sp. dalam proses
biotransformasi digunakan sistem fermentasi batch untuk menentukan pola pertumbuhan,
perubahan pH, produksi amonium, laju penguraian substrat, dan pembentukan produk.
Analisis terhadap penguraian suksinonitril dan asam suksinat yang terbentuk
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi yang menggunakan metanol 80% sebagai
fase gerak, fase diam kolom organik C18 10 , dan detektor ultraviolet yang diukur pada
panjang gelombang 220 nm, sedangkan amonium yang terbentuk diukur dengan
menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 400 nm. Hasil penelitian
menunjukkan produksi optimum enzim terjadi pada fasa log. Laju pembentukan asam
suksinat sebesar 0.982 mM/mL.jam seiring dengan penurunan konsumsi substrat sebesar
1.235 mM/mL.jam. Perolehan asam suksinat setelah 81 jam fermentasi sebesar 81 %. pH
optimum, temperatur optimum, Km, dan Vmaks adalah 7, 27 °C, 90 mM, dan 0.0002
µM/mL.jam.

ABSTRACT

TUTI UTAMA SIREGAR. Biotransformation Kinetic of Succinonitrile to Succinic

Acid by Pseudomonas sp.. Supervised by GUSTINI SYAHBIRIN and BAMBANG
SUNARKO.
Succinic acid (HOOC(CH2)2COOH) is a commercial compound used in many food
industry, such as soy sauce, juice, wine, and dairy products. So far, succinic acid is
produced through a dangerous chemical reaction series, so a safer and cheaper alternative
is needed by means of biotransformation process with application of Pseudomonas sp.
activity. To investigate the ability of Pseudomonas sp. in biotransformation process
batch fermentation system was used in this research to determine the pattern of growth,
pH alteration, ammonium production, substrate degradation rate, and product formation.
Analysis towards the succinonitrile and succinic acid degradation was carried out using
high performance liquid chromatography with 80% methanol as mobile phase, organic
coloumn C18 10µ as stationary phase, and ultraviolet detector at 220 nm whereas the
ammonium formation was measured using spectrophotometer at 400 nm. The result of
this research showed that the production of optimum enzyme occurred on log phase.
Formation rate of succinic acid was 0.982 mM/mL.hr along with the decrease of substrate
consumption of 1.235 mM/mL.hr. The yield of succinic acid after 81 hours of
fermentation was 81%. Optimum pH, optimum temperature, Km, and Vmaks were 7, 27 ºC,
90 mM, and 0.0002 µM/mL.hr, respectively.

iii

KINETIKA BIOTRANSFORMASI SUKSINONITRIL
MENJADI ASAM SUKSINAT OLEH Pseudomonas sp.

TUTI UTAMA SIREGAR

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2006

iv

Judul

: Kinetika Biotransformasi Suksinonitril menjadi Asam Suksinat
oleh Pseudomonas sp.
: Tuti Utama Siregar
: G44201001

Nama
NIM

Disetujui

Pembimbing I

Pembimbing II

Dra. Gustini Syahbirin, M.S
NIP 131 842 414

Dr. Bambang Sunarko
NIP 320 004 933

Diketahui
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Prof. Dr.Ir. Yonny Koesmaryono, M.S
NIP 131 473 999

Tanggal lulus :

v

PRAKATA
Bismillaahirrahmaanirrahiim.
Alhamdulillah, segala puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT yang
telah melimpahkan rahmat dan hidayah-Nya serta shalawat beriring salam kepada Nabi
Muhammad SAW sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini. Penelitian ini
berjudul Kinetika Biotransformasi Suksinonitril oleh Pseudomonas sp. yang dilaksanakan
sejak bulan Oktober 2005 sampai April 2006 di Laboratorium Bioproses, Pusat Penelitian
Bioteknologi, LIPI, Cibinong dan Laboratorium Ekologi dan Fisiologi Mikrob, Bidang

Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu terutama
kepada Bapak Dr. Bambang Sunarko selaku pembimbing dari Puslit Bioteknologi-LIPI,
Cibinong dan Ibu Dra. Gustini Syahbirin, M.S selaku pembimbing dari Departemen
Kimia-FMIPA, IPB. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada seluruh staf,
peneliti, serta teman-teman di laboratorium atas segala bantuan dan diskusinya.
Ucapan terima kasih tak terhingga penulis sampaikan kepada Ayahanda dan Ibunda
serta kakak dan adikku atas kasih sayang, dukungan, cinta, dan doanya. Untuk Raja
terima kasih atas kebersamaan, cinta, dan doanya serta tak lupa untuk teman-teman
Kimia 38 dan anak-anak Ciwaluya 22.
Semoga apa yang penulis lakukan menjadi suatu amal ibadah dan diberikan
keridoan-Nya. Mudah-mudahan karya kecil ini bermanfaat bagi kemaslahatan manusia
dan perkembangan ilmu pengetahuan.

Bogor, September 2006

Tuti Utama Siregar

vi

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Medan, Sumatera Utara pada tanggal 22 Februari 1982 sebagai
putri ketiga dari empat bersaudara, dari ayah Tajuddin Siregar dan ibu Nuraini Tanjung.
Tahun 2001 penulis lulus dari SMUN 3 Sipirok dan pada tahun yang sama diterima di
Departemen Kimia, Institut Pertanian Bogor, melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB
(USMI). Tahun 2004, penulis melaksanakan praktik kerja lapangan di Laboratorim
Ekologi dan Fisiologi Mikrob, Bidang Mikrobiologi, LIPI, Bogor dan pada tahun 2005,
penulis melaksanakan penelitian tugas akhir di Laboratorim Bioproses, Pusat Penelitian
Bioteknologi, LIPI, Cibinong dan Laboratorium Ekologi dan Fisiologi Mikrob, Bidang
Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Bogor.
Selama mengikuti perkuliahan penulis aktif mengikuti berbagai organisasi dan
mengajar di lembaga Bimbingan Belajar Nurul Ilmi dan Private Community padaTahun
2005 sampai sekarang.

vii

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR..................................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................................. viii

PENDAHULUAN ........................................................................................................... 1
TINJAUAN PUSTAKA
Suksinonitril dan Asam Suksinat...........................................................................
Biokonversi Suksinonitril.......................................................................................
Enzim Pendegradasi Nitril ....................................................................................
Proses Fermentasi dan Kinetika Fermentasi ..........................................................
NHase dan Amidase...............................................................................................
Karakterisasi Enzim ...............................................................................................

1
1
2
3
4
4

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat....................................................................................................... 5
Metode ................................................................................................................... 5
HASIL DAN PEMBAHASAN

Fermentasi Pseudomonas sp. ................................................................................. 6
Aktivitas Enzim Pengkonversi Suksinonitril Selama Fermentasi ......................... 8
Pengaruh pH terhadap Aktivitas Enzim NHase .................................................... 9
Pengaruh suhu terhadap Aktivitas Enzim NHase ................................................. 9
Kinetika Biotransformasi Suksinonitril.................................................................. 9
Biotransformasi Suksinonitril ............................................................................... 10
SIMPULAN DAN SARAN............................................................................................. 11
DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................................... 11
LAMPIRAN..................................................................................................................... 13

viii

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1

Biokonversi suksinonitril ..................................................................................

2

2

Biokonversi senyawa nitril oleh NHase,amidase dan nitrilase.........................

2

3

Proses fermentasi ..............................................................................................

3

4

Struktur NHase dan Amidase............................................................................

4

5

Pola dan pH pertumbuhan Pseudomonas sp. dalam suksinonitril ...................

7

6

Penurunan konsentrasi suksinonitril dan pembentukan asam suksinat.............

7

7

Kromatogram standar suksinonitril...................................................................

8

8

Kromatogram standar asam suksinat.................................................................

8

9

Kromatogram sampel pada jam ke-0 ...............................................................

8

10

Kromatogram sampel pada jam ke-81.. ............................................................

8

11

Aktivitas total dan spesifik NHase selama fermentasi ......................................

9

12

Pengaruh pH terhadap aktivitas NHase..............................................................

9

13

Pengaruh suhu terhadap aktivitas NHase..........................................................

10

14

Pengaruh konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi NHase ............

10

15

Konsentrasi NH4+ yang dihasilkan pada kec.pembentukan NH4+ .....................

10

16
17

+

+

Konsentrasi NH4 yang dihasilkan pada kec. relatif pembentukan NH4 .........
+

Konsentrasi NH4 yang dihasilkan pada proses biokonversi suksinonitril ......

11
11

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1

Bagan alir penelitian ........................................................................................

14

+

2

Analisis NH4 dengan metode Nessler ............................................................. 15

3

Pengukuran kadar protein dengan metode Biuret ............................................

16

4

Kurva standar protein dan sampel protein selama fermentasi..........................

17

5

Kromatogram standar dan sampel berdasarkan analisis KCKT ......................

18

6

Konsentrasi suksinonitril dan asam suksinat selama fermentasi .....................

21

7

Pola pertumbuhan Pseudomonas sp.pada suksinonitril ...................................

21

8

Aktivitas enzim selama proses fermentasi......................................................... 22

9

Pengaruh substrat terhadap kec. reaksi enzimatik pada penentuan Km dan Vmaks 23

10

Analisis NH4+ pada proses biotransformasi suksinonitril ................................

23

1

PENDAHULUAN
Suksinonitril (CNCH2CH2CN) disebut
juga butanadinitril dan termasuk dalam
kelompok
senyawa
dinitril
alifatik.
Suksinonitril pada konsentrasi tinggi dapat
menyebabkan iritasi pada kulit dan gangguan
pada saluran pernafasan (Benesovsky 1981).
Suksinonitril ádalah senyawa yang dapat
digunakan sebagai substrat dan diubah
menjadi asam suksinat melalui proses
biokonversi dengan bantuan mikrob yang
mampu memproduksi enzim pendegradasi
suksinonitril (Komeda et al. 1996). Asam
suksinat (HOOC)2(CH2)2 merupakan senyawa
komersial yang banyak digunakan dalam
industri. Asam suksinat banyak digunakan
dalam bidang pangan, misalnya pada industri
kecap, sari buah, anggur, dan produk-produk
susu lainnya. Selain itu, asam suksinat juga
digunakan pada industri tekstil pada proses
pewarnaan, industri obat, pernis, cat, dan
lempeng fotografi.
Penggunaan asam suksinat yang cukup
luas menyebabkan kebutuhannya semakin
meningkat. Umumnya, asam suksinat yang
dihasilkan selama ini dibuat secara industri
melalui serangkaian reaksi kimia yang
menghasilkan
produk
samping
yang
berbahaya yaitu, asam sianida.
Perkembangan
bioteknologi
atau
bioproses memberikan alternatif yang lebih
aman dan murah dalam sintesis asam suksinat,
yaitu melalui proses biotransformasi dengan
memanfaatkan substrat yang berlimpah dan
murah, terutama substrat yang berasal dari
limbah industri.
Pembuatan
asam
suksinat
secara
mikrobial menggunakan mikrob yang dapat
melakukan proses degradasi atau dekomposisi
substrat yang melibatkan reaksi enzimatik.
Proses ini memiliki banyak keuntungan
dibandingkan dengan reaksi kimia biasa,
sebab dapat menghasilkan produk dengan
tingkat kemurnian tinggi, hemat energi, biaya
produksi rendah, dan aman terhadap
lingkungan.
Sel bakteri Pseudomonas sp. yang
diisolasi dari limbah PT Pusri Palembang,
merupakan koleksi bakteri Eko-Fisiologi
Mikrob, LIPI. Pseudomonas sp. tersebar luas
di alam dan galurnya memiliki kemampuan
beradaptasi
secara
genetis
terhadap
lingkungannya dan mampu mendegradasi
sejumlah besar senyawa. (Holloway et al.
1998). Bakteri ini dapat hidup dengan baik
dan memiliki rapat optis yang tinggi ketika

ditumbuhkan
dalam
medium
yang
mengandung suksinonitril. Bakteri ini
berpotensi menghasilkan asam suksinat
melalui proses biokonversi. Oleh karena itu,
perlu dipelajari kemampuan Pseudomonas sp.
dalam memproduksi asam suksinat dan enzim
yang
terlibat
di
dalam
biokonversi
suksinonitril oleh sel tersebut.
Penelitian
ini
bertujuan
untuk
mempelajari
kinetika
biotransformasi
suksinonitril menjadi asam suksinat oleh
Pseudomonas
sp.
serta
mempelajari
karakteristik enzim yang terlibat di dalamnya.
Hipotesis yang mendukung penelitian ini
adalah, enzim NHase yang diproduksi oleh
Pseudomonas sp. mampu mengkonversi
suksinonitril menjasi asam suksinat. Hasil
penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat
bagi
pengembangan
industri
yang
menggunakan asam suksinat dengan harga
yang lebih murah dan mengurangi kerusakan
lingkungan akibat akumulasi senyawa nitril.

TINJAUAN PUSTAKA
Suksinonitril dan Asam Suksinat
Suksinonitril (CNCH2CH2CN) disebut
juga butanadinitril, adalah substansi stabil
barupa padatan yang larut dalam air dengan
titik didih 265 ºC, titik leleh 54 ºC, dan titik
nyala 132 ºC. Senyawa ini memiliki kelarutan
sebesar 1.02 g/cm3 dalam air dan merupakan
senyawa toksik dengan toksisitas akut oral
LD50 pada tikus sebesar 450 mg/kg (Pollak
1991). Suksinonitril pada konsentrasi tinggi
dapat menyebabkan iritasi pada kulit dan
gangguan
pada
saluran
pernapasan
(Benesovsky 1981).
Asam suksinat (COOH)2 (CH2)2, disebut
juga asam butanadioat adalah substansi stabil
berupa padatan yang larut dalam air dengan
bobot molekul 118 g/mol dengan titik didih
235 ºC, titik leleh 185 ºC, dan titik nyala 206
ºC. Senyawa ini memiliki kelarutan 1.56
g/cm3 dalam air. Asam suksinat pada
konsentrasi tinggi dapat menyebabkan luka
bakar, iritasi pada kulit, dan kerusakan pada
mata. Asam suksinat banyak digunakan
sebagai perasa pada makanan dan minuman,
obat penghilang rasa sakit, sebagai
antioksidan, dan antiflek pada kosmetik.
Biokonversi Suksinonitril
Biokonversi adalah proses perubahan
substrat menjadi suatu produk oleh aktivitas

2

mikroorganisme yang melibatkan reaksi
enzimatik. Suatu mikrob dapat melakukan
reaksi biokonversi karena mikrob memiliki
enzim yang dapat mengkonversi substratnya
menjadi produk. Umumnya proses ini tanpa
pembentukan hasil samping yang berbahaya.
Suksinonitril yang merupakan produk
limbah dapat diubah menjadi asam suksinat
oleh mikrob yang memiliki aktivitas enzim
pendegradasi nitril dengan mengubah dua
gugus sianida menjadi gugus karboksilat yang
relatif
tidak toksik. Berikut adalah
biokonversi suksinonitril dengan bantuan
mikrob.

N
N
suksinonitril

mikrob
O
HO
O H
O

Penggunaan mikrob dalam skala industri
untuk memproduksi akrilamida, nikotin
amida, dan senyawa amida lainnya melalui
proses biokonversi menggunakan enzim
NHase yang telah terimobilisasi dalam bentuk
sel utuh dari Pseudomonas chloraphis B32,
Rhodococcus sp. R312, dan Rhodcoccus
rhodochorous J1 (Liese 2000).
Enzim Pendegradasi Nitril
Senyawa nitril digunakan secara luas
pada industri manufaktur dan industri kimia.
Senyawa tersebut sangat toksik dan pada
umumnya merupakan senyawa yang sulit
terdegradasi, tetapi beberapa mikroorganisme
mampu mendegradasi senyawa nitril dengan
cara menggunakan nitril sebagai sumber
karbon dan nitrogen.
Enzim yang terlibat dalam hidrolisis
senyawa nitril adalah NHase, amidase, dan
nitrilase. Secara umum terdapat dua tipe
reaksi utama metabolisme pada proses
hidrolisis senyawa nitril dengan menggunakan
aktivitas mikrob, masing-masing untuk
senyawa nitril alifatik dan senyawa nitril
aromatik.
1RCN NHase RCONH2 amidase RCOOH
+
+
+
H2O
H2O
NH4

asam suksinat
2 R’CN + H2O nitrilase

RCOOH + NH4

Gambar 1 Biokonversi Suksinonitril.
Menurut Crueger & Crueger (1984),
reaksi biokonversi memiliki beberapa
kelebihan dibandingkan dengan reaksi kimia
biasa antara lain, spesifik terhadap substrat,
spesifik terhadap situs tertentu (regioselektif),
memiliki kespesifikan stereo dan enansio
(stereoselektif dan enensioselektif), dan reaksi
biokonversi tidak membutuhkan kondisi
reaksi yang ekstrim.
Aplikasi reaksi biokonversi antara lain
untuk sintesis berbagai senyawa organik
seperti akrilamida dan nikotin amida
(Kobayashi 1993), sintesis asam askorbat oleh
Acetobacter suboxydans, dan sintesis berbagai
jenis antibiotik oleh mikrob penghasilnya,
misalnya sintesis penisilin dari Penicillium
crysogenum. Dalam bidang pertanian, reaksi
biokonversi digunakan untuk mendegradasi
pestisida dengan cara menggunakan pestisida
sebagai substrat untuk pertumbuhan mikrob
dan produksi energi (Crueger & Crueger
1984).

Gambar 2 Biokonversi senyawa nitril oleh
NHase ,amidase dan nitrilase.
Pada reaksi tahap pertama, NHase
mengubah senyawa nitril menjadi senyawa
amida dan dilanjutkan menjadi amidase untuk
mengubah senyawa amida menjadi amonium
(NH4+) dan asam karboksilat, sedangkan pada
reaksi kedua, nitrilase langsung mengubah
senyawa nitril menjadi asam karboksilat dan
amonium (NH4+) (Ciskanik et al. 1995).
Kedua tahap reaksi dapat bersama-sama
dalam suatu mikrob yang memiliki ketiga
enzim tersebut. Umumnya, nitrilase aktif
terhadap senyawa nitril aromatik (Tauber
2000). Beberapa mikrob yang dilaporkan
mampu memproduksi enzim NHase dan
amidase antara lain Corynebacterium D5,
Pseudomonas
chlororaphis,
(Kobayashi
1993, Ciskanik et al. 1994, Bandyopadhyay et
al. 1985, Sunarko 1996).

3

Proses Fermentasi dan Kinetika
Fermentasi
Proses fermentasi adalah suatu proses
mendayagunakan aktivitas metabolisme suatu
mikrob tertentu atau campuran dari beberapa
spesies mikrob untuk menghasilkan senyawa
tertentu (Rahman 1992). Terdapat tiga macam
proses fermentasi cair
yaitu, fermentasi
batch, kontinyu, dan feed batch.

Konsentrasi

Substrat

Sel

Konsentrasi

Sel

Konsentrasi

Sel

Feed Substrat

Substrat

Waktu

Waktu

(a)

(c)

Gambar 3 Tiga jenis proses fermentasi;
(a) batch (b) feed batch
(c) kontinyu.
Pada fermentasi batch, setelah inokulasi
tidak dilakukan penambahan substrat ke
dalam media. Pada fermentasi ini umumnya
dijumpai empat fase pertumbuhan mikrob
yaitu, fase lag, log, stasioner, dan fase
kematian. Kondisi fisiologi dan metabolisme
sel pada keempat fase tersebut berbeda.
Fase lag yang merupakan awal
pertumbuhan mikrob, dimulai sejak inokulasi
sampel ke media. Pada fase ini sel butuh
penyesuaian terhadap kondisi lingkungan
yang baru, sel mengalami perubahan
komposisi kimiawi, bertambah ukuran, dan
substansi seluler sehingga pertumbuhannya
sangat sedikit.
Pada
fase
eksponensial
terjadi
pembelahan dan pertumbuhan sel yang cepat.
Pada fase ini, populasi meningkat secara
signifikan
dan
mengikuti
persamaan
eksponensial yang kurva pertumbuhannya
berupa kurva linear. Sel yang berada pada fase
ini sering digunakan untuk mempelajari enzim
dan komponen lainnya. Fase ini sangat
dipengaruhi oleh temperatur dan komposisi
media kultur.
Fase stasioner merupakan fase yang tidak
terjadi peningkatan atau penurunan jumlah
sel. Pertambahan populasi dan kematian
mikrob berlangsung dengan seimbang. Pada
fase ini terjadi penumpukan produk beracun
atau kehabisan nutrien, sehingga sel mati dan
sebagian tumbuh membelah. Pada beberapa
organisme pertumbuhan yang lambat mungkin
terjadi pada masa ini. Setelah mencapai fase

stasioner, populasi mikrob akan mengalami
fase kematian. Pada fase ini sebagian besar
mikrob mati, karena substrat atau media untuk
pertumbuhan sudah tidak memadai untuk
pertumbuhan mikrob.
Pada
fermentasi
kontinyu,
ada
penambahan dan pengurangan kultur selama
proses fermentasi, sehingga volume tetap dan
kondisi fisiologi sel cenderung konstan,
sedangkan pada fermentasi feedbatch, ada
penambahan substrat pada fase pertumbuhan
tertentu,
yang
bertujuan
untuk
memperpanjang fase pertumbuhan yang
diinginkan.
Mikroorganisme tumbuh dalam suatu
spektrum lingkungan fisik dan kimiawi yang
sangat luas, pertumbuhan dan kegiatankegiatan fisiologik lainnya merupakan suatu
respon
terhadap
lingkungan
fisikakimiawinya.
Kinetika
fermentasi
menggambarkan
pertumbuhan
dan
pembentukan produk oleh mikroorganisme,
bukan hanya pertumbuhan sel aktif tetapi juga
kegiatan sel istirahat dan sel mati (Said
1987).
Pertumbuhan sel didefenisikan sebagai
kenaikan biomassa sel persatuan waktu
(White 1995). Kecepatan pertumbuhan
merupakan perubahan dalam jumlah sel
persatuan waktu. Waktu penggandaan (td) atau
Generation Time adalah waktu yang
dibutuhkan untuk menggandakan sel pada fase
eksponensial.
Nt = No x 2n
td =

n
t

Keterangan
Nt = jumlah sel akhir
No = jumlah sel awal
n = jumlah generasi
µ = konstanta laju pertumbuhan
µ
digunakan
untuk
mengukur
jumlah/banyaknya generasi per unit waktu
dalam pertumbuhan eksponensial.

Pt − Po
t
Pt − Po
Perolehan/Yield (Y) =
St − So
Produktivitas (P)

=

Keterangan
Pt = konsentrasi akhir produk (mM)
Po = konsentrasi awal produk (mM)
St = konsentrasi akhir substrat (mM)
So = konsentrasi awal substrat (mM)
t = waktu fermentasi (jam)

4

NHase dan Amidase
Tauber et al. (2000) menyatakan bahwa
NHase dari sel Rhodococcus rhodochrous
merupakan enzim yang memiliki dua sub unit,
yaitu sub unit α yang memiliki 206 residu
asam amino dengan berat molekul (BM)
sebesar 22,786, g/mol dan sub unit β yang
memiliki 418 residu asam amino dengan BM
sebesar 23,428 g/mol. Enzim ini memiliki
kofaktor berupa ion kobal (Co) atau besi
untuk aktivitas katalitiknya.
Amidase
dari
sel
Pseudomonas
chlororaphis B23 merupakan enzim dengan
BM 105 g/mol yang memiliki dua sub unit
berupa homodimer dengan BM 54 g/mol
(Ciskanik 1995). Residu sisi aktif dari enzim
amidase pada sel Rhodococcus rhodochrous
Jl adalah Asp 191 dan Ser 195.
Asp 191 akan mengambil proton dari
residu Ser 195 sehingga Ser 195 bertindak
sebagai nukleofil terhadap gugus karbonil dari
ikatan amida pada substrat (Kobayashi 1997).
Amidase tidak membutuhkan kofaktor untuk
aktivitas katalitiknya. Umumnya, enzim
pentransformasi nitril terakumulasi pada fasa
log pertumbuhan sel.

A

B

Keterangan
A = NHase dengan kofaktor Fe3+
B = Amidase
Gambar 4 Struktur NHase dan Amidase.
Karakterisasi Enzim
Bakteri mengandung enzim konstitutif
dan induktif. Enzim konstitutif merupakan
enzim yang terdapat dalam sel bakteri dalam
jumlah tetap dan tidak bergantung pada
keadaan metabolisme organisme tersebut
seperti enzim yang terlibat dalam lintasan
glikolisis. Enzim induktif dalam sel bakteri
dalam sel bakteri terdapat dalam berbagai
konsentrasi. Dalam keadaan normal terdapat
dalam jumlah kecil, tetapi konsentrasinya
akan meningkat dengan cepat bila substratnya
terdapat dalam medium terutama jika substrat
tersebut merupakan sumber karbon satusatunya bagi sel (Lehninger 1994).

Rhodococcus
erythropolis
A10
bila
ditempatkan di media kultur yang berisi
asetonitril sebagai satu-satunya sumber
karbon, nitrogen, dan energi dalam waktu
yang relatif cepat akan mensintesis nitril
hidratase dan amidase dalam jumlah besar
(Acharya & Desai 1997). Bila bakteri yang
terinduksi asetonitril dipindahkan ke medium
yang mengandung glukosa dan garam
amonium, maka sintesis enzim NHase dan
amidase akan terhenti. Dengan kata lain,
induksi enzim merupakan proses yang
ekonomis, sebab enzim induktif sanya
dihasilkan bila diperlukan oleh sel. Senyawa
yang dapat menginduksi sintesis enzim
disebut penginduksi atau induktor (Lehninger
1994).
Beberapa enzim mempunyai spesifitas
yang tinggi terhadap substrat tertentu dan
tidak akan bekerja bahkan terhadap senyawa
yang mirip secara struktural (Lehninger.
1994). Kobayashi et al. (1997) melaporkan
bahwa enzim nitril hidratase
dari
Rhodococcus rhodochrous K22 spesifik pada
senyawa nitril alifatik, tetapi ada pula enzim
yang mempunyai spesifitas yang rendah,
artinya dapat bekerja pada berbagai senyawa
dengan ciri struktur yang sama seperti yang
dilaporkan oleh Acharya & Desai (1997),
misalnya enzim nitril hidratase oleh
Rhodococcus erythropolis A10 mempunyai
spesifitas terhadap substrat nitril alifatik dan
aromatik. Aktivitas enzim terhadap substrat
dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu, pH,
suhu, konsentrasi substrat, dan aktivator
(koenzim dan kofaktor) dan inhibitor.
pH
Efek pH pada enzim berkaitan dengan
keadaan ionisasi dari sistem yang dikatalisis,
termasuk substrat dan enzim itu sendiri.
Perubahan pH dapat mempengaruhi keadaaan
ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif
enzim
sehingga
akan
mempengaruhi
interaksinya dengan molekul substrat. Kadar
pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan
menyebabkan
ketidakstabilan
pada
konformasi enzim sehingga menyebabkan
struktur pada enzim rusak. Enzim mempunyai
pH optimum yang khas yang akan
menyebabkan aktivitas maksimal. Keadaan
optimum ini dihubungkan dengan saat gugus
pemberi proton atau penerima proton yang
aktif pada sisi enzim berada pada kondisi
ionisasi yang tepat. Keadaan optimum tidak
harus sama dengan pH lingkungannya.
Aktivitas enzim dalam sel sebagaian diatur

5

oleh pH media kulturnya (Lehninger 1994).
Enzim NHase memiliki pH optimum pada pH
7, sedangkan amidase pada pH 6 (Purnomo
2000; Adityarini 1999).
Suhu
Suhu mempunyai dua pengaruh yang
saling bertentangan. Suhu dapat meningkatkan
aktivitas enzim, tetapi dapat pula merusak
stuktur enzim. Suhu optimum merupakan
batas keduanya (Dixon & Webb 1978).
Peningkatan suhu sebelum tercapai suhu
optimum akan meningkatkan kecepatan reaksi
katalitik enzim karena energi kinetik molekulmolekul yang bereaksi, yaitu pada saat
kompleks enzim-substrat melampaui energi
aktivasi terlalu besar, sehingga memecah
ikatan sekunder pada konformasi enzim dan
sisi aktifnya. Hal ini mengakibatkan enzim
terdenaturasi dan kehilangan sifat katalitiknya
(Martin 1981). NHase mempunyai suhu
optimum pada 25 °C, sedangkan amidase pada
suhu 50 °C (Adityarini 1999).
Konsentrasi Substrat
Konsentrasi
substrat
sangat
mempengaruhi kecepatan reaksi enzimatik,
kecepatan maksimum (Vmaks) suatu enzim
dicapai ketika enzim telah jenuh oleh
substratnya sehingga tidak dapat berfungsi
lebih cepat. Konsentrasi substrat tertentu pada
saat enzim mencapai setengah kecepatan
maksimum disebut Km atau konstanta
Michaelis-Menten. Nilai Km bersifat khas
pada setiap enzim tertentu. Hubungan antara
Km dan Vmaks dinyatakan dalam persamaan
Michaelis-Menten (Lehninger 1982).

Vo =

V makss [S]
Km + S

Persamaan Michaelis–Menten merupakan
dasar bagi aspek kinetika kerja enzim.
Apabila nilai Km dan Vmaks diketahui, maka
kecepatan reaksi suatu enzim pada setiap
konsentrasi substrat dapat dihitung. Nilai Km
dan Vmaks yang lebih tepat dapat diperoleh
dengan memetakan data yang ada ke dalam
persamaan Lineweaver-Burk sebagai berikut.

K m
1
=
V makss
Vo

1
1
+
V makss
[S]

Aktivator (kofaktor dan koenzim) dan
Inhibitor
Lehninger (1994), menyatakan beberapa
enzim membutuhkan komponen tambahan
bagi aktivitasnya. Bila komponen tambahan
tersebut berupa senyawa anorganik disebut
kofaktor, sedangkan bila senyawa organik
disebut koenzim. Pada beberapa enzim,
kofaktor dan koenzim terlibat langsung pada
proses katalitik, tapi ada juga yang berfungsi
sebagai pembawa gugus fungsional tertentu.
Hampir semua enzim dapat dihambat oleh
senyawa kimia tertentu misalnya ion logam,
senyawa pengkelat, senyawa organik, bahkan
substrat enzim itu sendiri.

METODE PENELITIAN
Alat dan Bahan
Alat-alat
yang
digunakan
adalah
spektrofotometer UV/VIS, neraca analitik, pH
meter, sentrifuse, kromatografi cair kinerja
tinggi (KCKT), dan alat-alat gelas.
Bahan-bahan yang digunakan adalah
suksinonitril, asam suksinat, larutan standar
amonium, bufer fosfat, pereaksi Nessler,
NaOH, bovine serum albumin (BSA), dan
bakteri Pseudomonas sp. (koleksi kelompok
Eko-Fisiologi Mikrob, Bidang Mikrobiologi,
LIPI) yang diisolasi dari limbah PT Pusri
Palembang.
Media Tumbuh Pseudomonas sp.
Media
yang
digunakan
untuk
menumbuhkan Pseudomonas sp. adalah media
mineral dengan komposisi sebagai berikut:
Na2HPO4.2H2O 0.4475 g; KH2PO4 0.1 g;
MgSO4.7H2O 0.1 g; CaCl2.2H2O 0.01 g;
FeSO4.7H2O 0.001 g; yeast exstract 0.001 g;
mikroelemen 1 mL; dan ditambahkan akuades
sampai 1000 mL. Adapun komposisi
mikroelemen
adalah
sebagai
berikut;
ZnSO4.7H2O 0.1 g; MnCl2.4H2O 0.003 g;
H3BO3 0.3 g; CoCl2.6H2O 0.2 g; CoCl2.2H2O
0.01 g; NiCl2.2H2O 0.02g; Na2MO4.2H2O 0.9
g; Na2S2O3 0.02 g; dan ditambahkan akuades
samapai dengan 1000 mL.
Metode Penelitian
Fermentasi Pseudomonas sp.
Fermentasi diawali dengan pembuatan
inokulan
dengan
cara
menumbuhkan
Pseudomonas sp. di dalam Erlemeyer (100

6

mL) yang berisi 50 mL media mineral yang
mengandung 90 mM suksinonitril. Kultur
diinkubasi di atas shaker pada suhu kamar
selama 45 jam.
Pola pertumbuhan Pseudomonas sp.
dilakukan dengan cara menginokulasikan
sebanyak 45 mL inokulan ke dalam Erlemeyer
(2000 mL) yang berisi 800 mL media
pertumbuhan yang mengandung 90 mM
suksinonitril dan diinkubasi pada suhu kamar.
Setiap 3 jam, sampel diambil secara periodik
untuk diamati pertumbuhannya pada OD 600
nm, perubahan pH, aktivitas enzim, kadar
protein, konsentrasi NH4+ dan asam suksinat
yang terbentuk.
Produksi Biomassa Sel
Produksi biomassa sel dilakukan dalam
Erlemeyer 3 liter yang mengandung 1.5 liter
media pertumbuhan dan diinkubasi pada suhu
kamar. Sel dipanen pada waktu fermentasi
yang menunjukkan produksi sel optimum
(waktu yang menunjukkan nilai OD
maksimum selama fermentasi). Pemanenan
sel dilakukan dengan mensentrifus larutan
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15
menit pada 4 ºC. Pelet yang didapat dicuci
dengan bufer fosfat pH 7.2 sebanyak dua kali,
supernatan dibuang dan pelet dikumpulkan.
Pelet yang didapat adalah Pseudomonas sp.
(resting cells) yang akan digunkan untuk
penentuan karakteristik enzim dalam sel utuh.
Penentuan Aktivitas Enzim
Campuran reaksi yang telah mengandung
1.5 % (b/v) suksinonitril dalam bufer fosfat,
diinkubasi selama 15 menit pada suhu kamar.
Aktivitas
enzim
dihentikan
dengan
penambahan 0.20 mL HCl 4 N, kemudian
disentrifuse dan kadar NH4+ dalam supernatan
diuji dengan metode Nessler untuk
menentukan jumlah NH4+.
Biokonversi Suksinonitril Menggunakan
Sel Utuh
1.5 % (b/v) sel dan suksinonitril 90 mM
ditambahkan ke dalam Erlemeyer berisi 50
bufer fosfat pH 7.2, kemudian diinkubasi
diatas shaker dan setiap inteval waktu tertentu
sampel diambil dan kandungan NH4+
ditentukan dengan metode Nessler.

Penentuan Suhu dan pH Optimum
Pengaruh suhu ditentukan dengan cara
menambahkan sebanyak 1.5 % sel (b/v) ke
dalam 10 ml bufer fosfat pH 7.0 kemudian
diinkubasi pada kisaran suhu 5-60 ºC dalam
Erlemeyer
tertutup.
Aktivitas
enzim
ditentukan dengan cara seperti tersebut di atas.
Penentuan pengaruh pH dilakukan dengan
cara yang sama seperti pada penentuan suhu
tetapi diinkubasi pada kisaran pH 4−10.
Penentuan Km dan Vmaks
Sebanyak 1.5 % sel (b/v) ditambahkan ke
dalam bufer fosfat 10 mL pH 7.2 pada suhu
kamar, setelah itu substrat suksinonitril
ditambahkan dengan konsentrasi 0−120 mM.
Aktivitas enzim ditentukan dengan cara yang
telah disebutkan di atas.
Penentuan Kadar Protein
Kadar
protein
ditentukan
dengan
menggunakan metode Biuret. Konsentrasi
sampel ditentukan berdasarkan kurva standar
BSA (bovine serum albumin).
Penentuan Konsentrasi Asam Suksinat dan
Suksinonitril dengan Menggunakan
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)
Supernatan hasil fermentasi dilarutkan
dalam pelarut metanol. Larutan tersebut
diambil sebanyak beberapa µL lalu
disuntikkan dalam KCKT. Kromatogram
yang didapat dibandingkan dengan standar
suksinonitril atau asam suksinat
untuk
menentukan konsentrasi sampel dengan rumus
sebagai berikut (Lindsay 1992).
[Sampel] =

Luas area sampel
× [Standar]
Luas area standar

Kondisi KCKT adalah sebagai berikut, fasa
gerak metanol 80%, fasa diam kolom organik
C 18 10 µ, dan detektor UV (λ 220 nm).

HASIL DAN PEMBAHASAN
Fermentasi Pseudomonas sp.
Hasil yang diperoleh pada penentuan pola
pertumbuhan Pseudomonas sp. dalam
suksinonitril dan perubahan pH diperlihatkan
pada Gambar 5.

7

7,4

6

pH

7,2
7

5

6,8

4

6,6

3

6,4

2

6,2

1

6
5,8

0
0

15

30

45

60

75

waktu (jam)

Gambar 5 Pola
dan pH pertumbuhan
Pseudomonas
sp. dalam
suksinonitril.
Keterangan :
( ) Pola pertumbuhan Pseudomonas sp.
( ) pH pertumbuhan Pseudomonas sp.
Pseudomonas sp. tumbuh melalui empat
fasa pertumbuhan yaitu, fasa lag, log,
stasioner, dan fasa kematian. Fasa lag
berlangsung ± 18 jam. Pada fasa ini
pertumbuhannya masih sangat lamban karena
bakteri masih beradaptasi dengan lingkungan
mediumnya dan amonia yang terbentuk dari
hasil hidrolisis suksinonitril masih sedikit,
tetapi selama fasa ini terjadi penurunan pH
medium pertumbuhan. Hal ini diduga karena
terakumulasinya asam suksinat yang terbentuk
sehingga pH turun dari 6.58 menjadi 6.41.
Pseudomonas sp. mengalami fasa log
selama ± 45 jam, (jam ke 18−63). Selama
fasa ini terjadi peningkatan konsentrasi
amonium secara cepat dan terjadi peningkatan
pH dari 6 menjadi 7. Hal ini dapat disebabkan
karena mikrob belum memanfaatkan seluruh
amonium
yang
terbentuk
untuk
metabolismenya
sehingga
amonium
terakumulasi dalam medium.
Pertumbuhan Pseudomonas sp. mencapai
maksimum pada jam ke-66 dengan pH 7.46
dan akhirnya masuk ke dalam fasa stasioner
yang singkat. Pada fasa ini penambahan
jumlah sel setara dengan kematian sel. Hal ini
mungkin
disebabkan
oleh
semakin
berkurangnya
persediaan
nutrien
dan
terjadinya produk samping yang menghambat
pertumbuhan. Jumlah sel aktif tetap, tetapi
produksi sel-sel baru sebanding dengan
kematian sel yang lain sehingga rata-rata
pertumbuhan nol. Fasa kematian diduga
terjadi setelah 90 jam pertumbuhan.

120

90
80

100

70

80

60
50

60

40

40

30
20

20

10

0

asam suksinat (mM)

8

7,6

Waktu penggandaan (td) dan laju
pertumbuhan spesifik ( ) untuk Pseudomonas
sp. masing-masing ditentukan sebesar 3 jam
dan 0.346 jam-1,
merupakan nilai yang
spesifik dan sangat ditentukan oleh jenis
mikroorganisme serta kondisi fermentasi.
pH medium selama pertumbuhan berkisar
antara 6.2−8.1 dan nilainya cenderung naik
seiring
dengan
meningkatnya
waktu
fermentasi. Kecenderungan medium bersifat
basa karena dihasilkan NH4+. Hasil yang sama
dilaporkan Fitri (2005), bahwa pH medium
fermentasi menggunakan isolat bakteri
Pseudomonas sp. dalam substrat adiponitril
cenderung bersifat basa.
Selama proses pertumbuhan sel produk
biotransformasi (NH4+ dan asam suksinat)
terbentuk seiring dengan konversi substrat.
mengikuti
pola
Pembentukan
NH4+
pertumbuhan sel (optimum terbentuk pada
akhir fasa log), sedangkan pembentukan asam
suksinat mengalami kenaikan seiring dengan
bertambahnya
waktu
fermentasi.
Berdasarkan hasil pengukuran dengan
menggunakan KCKT dan kromatogram yang
terbentuk, kecepatan penguraian suksinonitril
lebih cepat dibandingkan pembentukan asam
suksinat dengan laju penguraian suksinonitril
sebesar 1.235 mM/mL jam yang sudah terurai
pada
awal
pengukuran,
sedangkan
pembentukan asam suksinat atau produktivitas
sel dalam memproduksi asam suksinat sebesar
0.982 mM/mL jam yang terukur maksimum
pada akhir pengukuran (Gambar 6).

suksinonitril (mM)

7,8

pertumbuhan (600 nm)

7

0

0

9

18 27 36 45 54 63 72 81
waktu (jam)

Gambar 6 Penurunan konsentrasi suksinonitril
dan pembentukan asam suksinat.
Keterangan :
( ) Penurunan konsentrasi suksinonitril
( ) Pembentukan asam suksinat
Gambar 7 dan 8 masing-masing
menunjukkan standar suksinonitril dengan
luas area 5938905 dan waktu retensi 4.425

0.3

0.3

0.2

0.1

0.0

4.425

0.0

0.1

2.750

Volts

0.5
0.4

0.4

Volts

0.5

0.2

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Minutes

0.008

0.008

0.006

0.004

0.000

2.700

0.002
0.000

0.004

0.002

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

1.50

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

3.50

Minutes

3.500

Gambar 8 Strandar Asam Suksinat.

0.25

0.20

0.20

0.15

0.15

0.10

0.10

3.933

0.30

0.25

2.525

0.05

0.05

0.00

0.00

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

Minutes

Gambar 9 Pengukuran sampel pada jam
ke-0.

20

Volts

0.35

0.30

5.133

Volts

0.35

2.683

0.10

0.08

4.192

0.08

0.06
Volts

7.492

0.06

0.04

1.800

0.04

0.02

6.225

0.02

0.00

0.00

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Minutes

Gambar 10 Pengukuran sampel pada jam
ke-81.
Perbedaan
kecepatan
tersebut
mengindikasikan bahwa sebagian asam
suksinat yang terbentuk digunakan untuk
pertumbuhan Pseudomonas sp. Perolehan
(Yield) asam suksinat yang didapat sebesar
80% setelah 81 jam fermentasi. Pada sistem
fermentasi batch menggunakan Pseudomonas
sp. dalam mengkonversi akrilamida 62.5 mM
membutuhkan waktu selama 24 jam,
sedangkan apabila sel Pseudomonas sp.
diimobilisasi menggunakan kalsium alginat
konversi akrilamida hanya membutuhkan
waktu kurang dari 6 jam untuk membentuk
produknya (Nawaz et al. 1993).
Aktivitas Enzim Pengkonversi
Suksinonitril Selama Fermentasi

Volts

Volts

2.133

0.010

0.010

0.006

Gambar 7 Standar Suksinonitril.

0.10

Volts

serta asam suksinat dengan luas area 2891620
dan waktu retensi 2.700 yang dijadikan
pembanding terhadap sampel yang akan
diukur. Pada Gambar 9, terlihat bahwa puncak
yang muncul adalah suksinonitril dengan luas
area 5939034 dan waktu retensi 4308 dengan
konsentrasi optimum 100.0021 mM dibanding
pengukuran sampel pada waktu yang lain.
Konsentrasi optimum suksinonitril pada
waktu awal pengukuran membuktikan bahwa
laju penguraian suksinonitril lebih cepat
dibandingkan laju optimum pembentukan
asam suksinat dengan konsentrasi 86.8488
mM pada waktu akhir pengukuran dengan
luas area 2511340 dan waktu retensi 2683
(Gambar 10).

3.550

8

Aktivitas enzim sangat dipengaruhi oleh
konsentrasi substrat yang berikatan dengan
sisi aktif enzim. Aktivitas total enzim NHase
mempunyai pola yang sama dengan pola
pertumbuhan sel, hal ini dapat dilihat dari
aktivitas enzim dari total enzim yang memiliki
nilai maksimum pada jam ke-66 dengan
produk akhir berupa amonium. Terbentuknya
amonium dalam biotransformasi suksinonitril
selain menunjukkan adanya enzim NHase
juga mengindikasikan bahwa enzim amidase
bekerja dengan baik. Hal ini sesuai dengan
Wu & Li (2002), yang mengatakan bahwa
enzim pentransformasi nitril biasanya
optimum terbentuk pada fasa log sel. Aktivitas
total NHase tertinggi sebesar 1.04 U.

120

120

1

100

100

0,8

80

0,6

60

0,4

40

0,2

20
0

0
0

9

18 27 36 45 54 63 72
waktu fermentasi (jam)

Gambar 11 Aktivitas total dan spesifik
NHase selama fermentasi.
Keterangan :
( ) Aktivitas total NHase selama fermentasi
( )Aktivitas
spesifik
NHase
selama
fermentasi
Walaupun tidak dilakukan pengukuran
secara kuantitatif, diduga aktivitas total enzim
amidase pada suksinonitril mirip dengan
aktivitas total amidase pada adiponitril yang
juga merupakan dinitril alifatik jenuh. Fitri
(2005) melaporkan bahwa dengan substrat
adiponitril yang juga merupakan dinitril
alifatik jenuh, aktivitas total amidase memiliki
nilai 4 kali lebih tinggi dari aktivitas NHase.
Tingginya aktivitas amidase dapat diakibatkan
karena kondisi medium yang menunjang
aktivitas enzim amidase tersebut yaitu suhu,
pH, tekanan oksigen, konsentrasi substrat,
dan produk-produk yang terdapat dalam
media ( Sa’id 1987).
Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim
NHase
Salah satu faktor yang mempengaruhi
aktivitas enzim adalah pH. Pengaruh pH
terhadap aktivitas enzim ditunjukkan pada
Gambar 12. Aktivitas maksimum NHase dari
Pseudomonas sp. ditunjukkan pada pH 7.

aktivitas relatif (%)

1,2

aktivitas relatif (U/mg)

aktivitas total (U)

9

80
60
40
20
0
0

5

10

15

pH

Gambar 12 Pengaruh pH terhadap aktivitas
relatif
NHase
dari
sel
Pseudomonas sp..
Aktivitas
enzim
menurun
akibat
perubahan pH di bawah dan di atas pH
optimum, karena perubahan pH medium
menyebabkan perubahan pada sifat ionik
gugus karboksilat dan gugus amino enzim
sehingga daerah katalitik dan konformasi
enzim berubah. Enzim merupakan protein
yang juga memiliki sifat asam atau basa
tergantung dari asam amino penyususnnya.
Penurunan pH satu satuan dari pH optimum
menurunkan aktivitas relatifnya sebesar
26.13%, sedangkan kenaikan pH satu satuan
dari pH optimum menurunkan aktivitas
relatifnya sebesar 16.11%. Perubahan pH
lingkungan akan mempengaruhi lipatan
struktur
tersier
dan
juga
struktur
kwartenernya. Oleh karena itu, perlakuan pH
yang terlalu ekstrim (terlalu asam atau terlalu
basa) dapat menyebabkan enzim mengalami
denaturasi.
Pengaruh Suhu TerhadapAktivitas NHase
Pengaruh suhu terhadap aktivitas relatif enzim
dapat dilihat pada Gambar 13. Suhu optimum
bagi aktivitas NHase berada pada kisaran
25−30 °C

120

0,6

100

0,5

Vo (uM/mL.min)

aktivitas relatif (%)

10

80
60
40
20

0,4
0,3
0,2
0,1

0
0

20

40

60

0

80

0

suhu (celcius)

Penurunan suhu satu satuan akan
menurunkan aktivitas relatifnya sebesar
32.72%, sedangkan kenaikan suhu satu satuan
akan menurunkan aktivitas relatifnya sebesar
37.13%. Perbedaan nilai ini diakibatkan
karena penurunan suhu satu satuan lebih dekat
pada kisaran suhu optimum sehingga aktivitas
relatif
yang
diturunkan
lebih
kecil
dibandingkan kenaikan suhu satu satuan.
Suhu di atas 40 °C mengakibatkan aktivitas
enzim turun dengan tajam. Hal ini disebabkan
enzim sebagai protein akan mengalami
denaturasi jika suhunya dinaikkan. dan
menurut
Lee
(1992),
protein
akan
terdenaturasi pada suhu sekitar 40−50 °C.
Kinetika Biotransformasi Suksinonitril
Km dan Vmax NHase
Penentuan nilai Km dan Vmax berguna
untuk mengetahui kinetika enzim sehingga
dapat diketahui karakteristik dan kecepatan
reaksi enzim dalam menguraikan substrat,
selain itu Km dan Vmax dapat digunakan untuk
analisis lebih lanjut tentang penghambatan
akrivitas enzim dan untuk mengetahui
efisiensi aktivitas katalitik enzim. Pengaruh
substrat terhadap kecepatan reaksi enzimatik
NHase dapat dilihat pada Lampiran 9.
Gambar 14 menunjukkan bahwa enzim
NHase memiliki kecepatan reaksi (Vo) akan
mengikuti pola Michaelis-Menten. Fitri
(2005) melaporkan bahwa amidase dengan
substrat adiponitril juga mengikuti pola
Michaelis-Menten
sehingga
dapat
disimpulkan bahwa kedua enzim merupakan
enzim alosterik.

200

300

suksinonitril (mM)

Gambar 14 Pengaruh konsentrasi substrat
terhadap kecepatan awal reaksi
enzimatik NHase.
Nilai Km dan Vmaks enzim didapat dengan
memplot kurva pada Gambar 14 ke dalam
persamaan Line-wever Burk. Nilai Km NHase
sebesar 90 mM dan Vmaks 0.0002 µM/mL.min.
Nilai Km yang tinggi dapat diartikan bahwa
enzim dapat dengan mudah membentuk
kompleks enzim substrat (E-S). sedangkan
nilai Km yang kecil menunjukkann bahwa
energi yang diperlukan untuk memulai
terjadinya reaksi enzimatik lebih sedikit
sehingga reaksi lebih mudah terjadi.
Biotransformasi Suksinonitril
Pola transformasi suksinonitril dan
suksinamida oleh Pseudomonas sp. dapat
dilihat pada Gambar 15, 16, dan17.

N H 4 + (m M )

Gambar 13 Pengaruh suhu terhadap aktivitas
relatif enzim NHase dari sel
Pseudomonas sp..

100

70
60
50
40
30
20
10
0

0

50

100

150

200

waktu menit)

Gambar 15 Konsentrasi
NH4+
yang
dihasilkan
pada
kecepatan
pembentukan NH4+.

ke ce pa tan p em b en tu kan
N H 4+ (mM /m L.min )

11

Pada menit pertama. NH4+ yang dihasilkan
dari biokonversi senyawa amida lebih banyak
terbentuk dibandingkan senyawa dinitril,
tetapi
pada
menit-menit
berikutnya
pembentukan NH4+ dari biokonversi dinitril
lebih banyak dibandingkan amidase dan terus
menurun secara signifikan pada menit-menit
berikutnya (Fitri 2005).

12
10
8
6
4
2
0
0

50

100
150
waktu (menit)

200

yang
Konsentrasi
NH4+
dihasilkan pada kecepatan
relatif pembentukan NH4+.

Gambar 16

ke ce pa ta n p em b en tu ka n
re latif N H 4+ (% )

120
100
80
60
40

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Sel Pseudomonas sp. yang ditumbuhkan
dalam suksinonitril memiliki optical dencity
yang tinggi. Laju pembentukan asam suksinat
sebesar 0.982 mM/mL.jam sedangkan laju
penguraian suksinonitril adalah 1.235 mM
mL.jam.
pH optimum enzim NHase adalah 7
sedangkan suhu optimumnya 27 °C. Km dan
Vmaks enzim NHase adalah 90 mM dan 0.0002
µM/mL/min.
Saran

20
0
0

50

100
150
waktu (menit)

200

yang
Gambar 17 Konsentrasi
NH4+
dihasilkan
pada
proses
biokonversi suksinonitril dengan
menggunakan
resting
cell
Pseudomonas sp..
Secara stoikiometri, apabila aktivitas
amidase tinggi maka jumlah asam suksinat
dan amonium yang terbentuk menunjukkan
aktivitas NHase yang tinggi juga, karena asam
suksinat dan amonium yang dihasilkan oleh
aktivitas amidase yang berasal dari
suksinamida
yang
merupakan
produk
hidrolisis suksinonitril oleh NHase.
Pada Gambar 15, dapat dilihat bahwa
konversi suksinonitril selama 180 menit-1
menghasilkan NH4+ sebanyak 59.68 mM
dengan produktivitas sel sebesar 0.33 mM/mL
min. Pada biokonversi suksinonitril kecepatan
pembentukan relatifnya berkisar antara
51.51%−100%. Biokonversi dengan isolat
bakteri terpilih BA 12 (Pamuji 2003) sebesar
4.44 mM pada menit ke-180. Dengan
demikian biokonversi Pseudomonas sp. lebih
tinggi dibandingkan dengan isolat BA 12.

Sebaiknya perlu dilakukan penelitian
lebih lanjut mengenai optimasi media tumbuh
dan imobilisasi sel untuk lebih meningkatkan
efisiensi pembentukan produk

DAFTAR PUSTAKA
Acharya A, Desai AJ. 1997. Studies on
utilization of acetonitrile by Rhodococcus
erythropolis A 10. J Microbiol Biotechnol
13:175−178.
Adityarini. 1999. Isolasi dan seleksi mikrob
pendegradasi
asetonitril
serta
karakterisasi enzim yang berperan di
dalamnya [tesis]. Depok: Program Pasca
Sarjana. Universitas Indonesia.
Bandyopadhyay AK et al. 1986. Purification
and characterization of benzonitrilases
from Arthrobacter sp. strain J-1. Appl
Environ Microbiol 51:302−306.
Benesovsky F. 1981. Encyclopedia
Chemical Technology. New York:
Wiley.

of
J

Ciskanik LM, Jolanta MW, Robert DF. 1995.
Purification and characterization of an
enantioselective
amidase
from

12

Pseudomonas
chlororaphis B23.
Appl .Environ Microbiol 61:998−1003.
Crueger W, Crueger A. 1984. Biotechnology:
A Text Book of Industrial Microbiology.
Madison: Science Tech.
Dixon M & Webb EC. 1978. Enzymes. New
York: Academic Press.
Fitri EY. 2005. Kinetika fermentasi dan
karakterisasi Enzim yamg terlibat dalam
proses produksi asam adipat oleh
Pseudomonas sp. [skripsi]. Bogor:
Fakultas
Matematika
dan
Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Holloway et al. 1998. Ability of microbe in
strain from Rhodococcus rhodochrous.
Am Society for Biochem and Molecul Biol
291:15546−15692.
Kobayashi M, Hidenobu K, Toru N, Hideaki
Y, Sakayu S. 1993. Occurrence of
amidases in the industrial microbe
Rhodococcus
rhodochrous
J1.
Biosci Biotech Biochem 57:1949−1950.
Komeda H, Kobayashi M, Sakayu S. 1996. A
novel gene cluster including the
Rhodococcus rhodochrous J1 nhIBA
genes encoding a low molecular mass
nitrile hidratase (L-NHase) induced by its
reaction product. Am Society for Biochem
and Molecul Biol 271:15796−15802.
Kobayashi M, Yoshie F, Masahiko G,
Hidenobu
K,
Sakayu
S.
1997.
Identification of active sites in amidase:
evolutionary relationship betwen amidae
bond and peptide bond-cleaving enzymes.
Proc Natl Acad Sci 94:11986−11991.
Lee. 1992. Analysis Protein Method. New
York: Academic Press.
Liese A, Seelbach K, Wandrey C. 2000.
Industrial
Biotransformations.
Weinheim: Wiley,VCH.
Lehninger AL. 1994. Dasar-Dasar Biokimia.
Jakarta: Erlangga.
Linsay S. 1992. High Performance Liquid
Chromatography.. London: J Willey.
Martin DW. 1981. Harper’s Review of
Biochemistry.
Calipornia:
Medical
Publication.

Nawaz MS, Franklin W, Cerniglia CE. 1997.
Degradation
of
acrylamide
by
immobilized cells of Pseudomonas sp.
And Xanthomonas maltophilia. Can J
Microbial.73:465−576.
Pamuji EW. 2003. Biokonversi Adiponitril
menjadi Asam Adipat oleh Isolat Bakteri
Terpilih [skripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,
Institut Pertanian Bogor.
Pollak P, Romeder G, Hagedorn F, Heinz
PG. 1991. Nitriles. Biotechnol 17:349361.
Purnomo D.1999. Biokonversi Akrilonitril
menjadi Akrilamida dan Asam Akrilat
oleh Sel Corynebacterium D5 [skripsi].
Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Rahman A. 1992. Teknologi Fermentasi.
Jakarta: Arcan.
Sa’id EG. 1987. Bioindustri: Penerapan
Teknologi
Fermentasi.
Jakarta:
Mediatama Sarana Perkasa.
Sunarko B. 1996. Kemampuan Isolat Bakteri
dalam Mendegradasi Asetonitril J.
Mikrob Trop. 1: 13−19
Tauber MM, Cavaco-Paulo A, Robra KH,
Gubitz GM. 2000. Nitrile hidratase and
amidase from Rhodococcus rhodochrous
hydrolyze acrilic fibers and granular
polyacrylonitriles.
Appl
Environ
Microbial 66:1634−1638.
White D. 1995. The Physiology and
Biochemistry of Prokaryotes. New York:
Oxford University Press.
Wu ZL & Li ZY. 2002. Enhancement of
enzyme activity and enentioselectivity in
nitrile via cultivation metabolism by
Rhodococcus sp. Biotechnol Appl
Biochem.97:1615−1705.

15

Lampiran 2 Analisis NH4+ dengan metode Nessler (Gerhardt & Krieg 1994