Identifikasi Isolat RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase
IDENTIFIKASI ISOLAT RK2 BPPT CC DAN ISOLASI GEN
SELULASE
ANTIN FITRIANI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul berjudul Identifikasi Isolat
RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2013
Antin Fitriani
NIM G84090010
ABSTRAK
ANTIN FITRIANI. Identifikasi Isolat RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase.
Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan SISWA SETYAHADI
Selulase adalah enzim ekstraseluler yang dapat diproduksi oleh
mikroorganisme. Enzim ini dapat menghidrolisis selulosa untuk menghasilkan
glukosa. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi isolat RK2 BPPT CC dan
mengisolasi gen selulase dari isolat tersebut. Identifikasi isolat RK2 BPPT CC
dilakukan menggunakan urutan basa gen penyandi 16S-rRNA. Isolasi gen selulase
dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) touchdown
menggunakan primer yang telah didesain. Primer yang didesain adalah primer
degenerated hasil alignment dari berbagai gen selulase yang berasal dari bakteri
yang bergenus sama. Analisis gen 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC menunjukkan
bahwa isolat RK2 BPPT CC termasuk ke dalam genus Bacillus dan memiliki
kekerabatan yang dekat dengan Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens).
Isolasi gen selulase menghasilkan produk PCR yang spesifik sepanjang 1500 bp
yang diduga sebagai gen selulase. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan
bahwa gen selulase isolat RK2 BPPT CC memiliki 99% kemiripan sekuensnya
dengan gen selulase dari Bacillus subtilis (B. subtilis) dan B. amyloliquefaciens.
Kata kunci: gen selulase, 16S-rRNA, Bacillus, PCR touchdown
ABSTRACT
ANTIN FITRIANI. Identification of RK2 BPPT CC Isolate and Isolation of
Cellulase Gene. Supervised by I MADE ARTIKA and SISWA SETYAHADI.
Cellulase is an extracellular enzyme produced by microorganism. This
enzyme is able to hydrolize cellulose to produce glucose. The purpose of this
research was to carry out of identification RK2 BPPT isolate and isolation of
cellulase gene from this isolat. Identification of RK2 BPPT CC isolate was carried
out based on sequence of 16S ribosomal RNA gene and isolation of cellulase gen
was carried out using touchdown Polymerase Chain Reaction (PCR) methode
using primer that has been designed. The primer has been designed is the
degenerated primers based on alignment results of cellulase genes of bacteria of
the same genus. Analysis 16S-rRNA gene showed that the RK2 BPPT CC isolate
belongs to the genus of Bacillus and closely related to Bacillus amyloliquefaciens
(B. amyloliquefaciens) spesies. Isolation cellulase gene resulted a specific PCR
product along 1500 bp as a putative of cellulase gene. Nucleotide sequence
analysis showed that the cellulase gene of RK2 BPPT CC isolate has 99%
sequence-similarity to the celluase genes of Bacillus subtilis (B. subtilis) and
Bacillus amyloliquefaciens.
Keywords: cellulase gene, 16S-rRNA, Bacillus, touchdown PCR
IDENTIFIKASI ISOLAT RK2 BPPT CC DAN ISOLASI GEN
SELULASE
ANTIN FITRIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Identifikasi Isolat RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase
Nama
: Antin Fitriani
NIM
: G84090010
Disetujui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
Pembimbing I
Dr Ir Siswa Setyahadi, M.Sc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat-Nya
penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini dengan baik dan lancar. Shalawat
dan salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW dan
keluarganya.
Ucapan terima kasih terutama ditujukan kepada Dr. Ir. I Made Artika,
M.App.Sc selaku dosen pembimbing utama dan Dr. Siswa Setyahadi M.Sc selaku
pembimbing lapangan yang telah membimbing serta memberi saran dan kritik
yang membangun. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Djamil
S.Si, M.Si selaku Kepala Laboratorium Teknologi Bioindustri, Laboratorium
Pengembangan Teknologi Agroindustri dan Biomedika (LAPTIAB), beserta staf
Divisi Biokatalis, dan teman-teman Biokimia yang telah membantu selama
pengumpulan data penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
kedua orang tua atas doa dan dukungan yang selalu diberikan.
Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan khususnya
biokimia serta memberikan kemaslahatan bagi masyarakat.
Bogor, Desember 2013
Antin Fitriani
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Analisis Data
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Hasil
6
Pembahasan
8
SIMPULAN DAN SARAN
11
Simpulan
11
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
20
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Hasil elektroforesis DNA genom isolat RK2 BPPT CC
Hasil elektroforesis gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
Hasil BLAST gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
Pohon filogenetik isolat RK2 BPPT CC
Hasil elektroforesis amplifikasi gen selulase
Hasil BLAST gen selulase isolat RK2 BPPT CC
Prediksi model selulase isolat RK2 BPPT CC
6
6
6
7
7
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Diagram alir penelitian
Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA pimer 27 f
Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA pimer 1525 r
Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S-rRNA isolat
RK2 BPPT CC
Hasil alignment gen selulase Bacillus
Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer forward
Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer reverse
Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi selulase isolat RK2
BPPT CC
Alignment score selulase isolat RK2 BPPT CC
Urutan asam amino hasil translasi gen selulase isolat RK2 BPPT CC
13
14
15
16
16
17
18
19
19
19
PENDAHULUAN
Enzim selulase adalah enzim kompleks yang memotong secara bertahap
rantai selulosa (Gerhartz 1990). Selulase merupakan o-glikosil hidrolasis (GHs)
yang menghidrolisisi ikatan β-1,4-glikosidik dalam selulosa. Enzim ini
mengkatalis proses selulolisis (hidrolisis selulosa) dan menghasilkan glukosa,
selubiosa dan selooligosakarida (Sukumaran et al. 2005). Selulase dapat
diklasifikasikan menjadi tiga kelas utama yaitu endoglukanase (endo-1,4-βglukanase atau 1,4-β-D-glukan 4-glukanohidrolase) (EC 3.2.1.4), selobiohidrolase
(ekso-1,4-β-glukanase atau 1,4-β-D-glukan selobiohidrolase) (EC 3.2.1.19), dan
selobiase (β-glucosidase atau β-D-glukosida glukohidrolase) (EC 3.2.1.21)
(Nguyen dan Quyen 2010).
Kebutuhan akan enzim selulase saat ini semakin meningkat, terutama untuk
memenuhi kebutuhan bioenergi berupa bioetanol. Produksi bioetanol secara
massal membutuhkan banyak sumber glukosa sebagai bahan baku utama. Glukosa
tersebut akan terfermentasi dan menghasilkan bioetanol. Masalahnya ketersediaan
glukosa tidak banyak namun ketersediaan selulosa justru melimpah terutama yang
berasal dari limbah pertanian (Howard et al. 2003). Enzim selulase sangat
dibutuhkan untuk menguraikan limbah selulosa menjadi monomer glukosa
sehingga dapat digunakan untuk kebutuhan bioenergi. Selain itu, selulase juga
banyak digunakan dalam berbagai bidang industri temasuk industri bahan kimia,
bahan bakar, makanan, pembuatan bir, anggur, pulp dan kertas serta pertanian.
Mikroorganisme penghasil selulase dapat berupa kapang, bakteri atau
aktinomisetes. Lingkungan hidup yang mengandung selulosa akan memacu
mikroorganisme ini mensekresikan selulase. Mereka berlaku demikian karena
menginginkan produk hasil hidrolisis selulosa oleh selulase yaitu glukosa.
Glukosa akan digunakan sebagai sumber energi berupa sumber karbon (C).
Selulase yang dihasilkan dari mikroorganisme kapang jenis Trichoderma dan
Aspergillus umumnya memiliki aktivitas lebih tinggi dibandingkan selulase yang
berasal dari bakteri. Meskipun demikian, selulase dari bakteri memiliki beberapa
keunggulan, antara lain laju pertumbuhan bakteri lebih cepat, selulase dari bakteri
juga kurang terinhibisi oleh material yang telah dihidrolisis, selain itu bakteri
dapat beradaptasi dalam lingkungan yang ekstrim dan yang lebih menguntungkan
adalah selulase dari bakteri lebih mudah dilakukan rekayasa genetika (Ariffin et al.
2006).
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat RK2 BPPT CC
yang dihasilkan dari penapisan pada rayap. Isolat ini telah digunakan pada
penelitian sebelumnya dan terbukti menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas
8.45 U/mL pada substrat dedak (45%) dan air kelapa (15%) dengan pH dan suhu
masing-masing adalah 6 dan 42 oC (Bakti 2012). Upaya yang dapat dilakukakan
untuk meningkatkan aktivitas selulase dari bakteri adalah melakukan rekayasa
genetika seperti kloning gen selulase ke vektor ekspresi yang memiliki
kemampuan ekspresi gen yang baik sehingga produksi enzim selulase dapat
meningkat. Sebelum melakukan rekayasa genetika langkah awal yang dapat
dilakukan adalah mengidentifikasi isolat RK2 BPPT CC. Identifikasi dilakukan
menggunakan gen penyandi 16S-rRNA. 16S-rRNA adalah sub unit ribosom
prokariot yang urutan basa gen penyandinya bersifat spesifik pada masing-masing
2
spesies bakteri sehingga dapat dipilih sebagai dasar untuk identifikasi (Richana et
al. 2008). Isolasi dan amplifikasi gen selulase dilakukan menggunakan PCR
touchdown. PCR touchdown sering digunakan untuk proses PCR yang
menggunakan primer degenerated yaitu primer yang tidak spesifik karena
memiliki dua atau lebih kemungkinan perbedaan urutan basanya. Primer
degenerated biasanya memiliki suhu annealing (suhu penempelan primer) yang
tidak pasti karena mengandung dua atau lebih urutan basa yang berbeda. Salah
satu penyelesaian yang dapat dilakukakan adalah menggunakan teknik PCR
touchdown karena pada PCR ini suhu annealing akan mengalami penurunan di
setiap siklusnya. Teknik PCR ini pernah digunakan untuk mengamlifikasi sekuen
cDNA yang mengkode LIF (Leukemia Inhibitor Factor) dengan suhu anealing
awal adalah 65 0C dan mengalami penurunan 1 derajat di setiap siklusnya selama
10 kali siklus hingga mencapai suhu annealing akhir 55 0C (Don et al. 1991).
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi isolat RK2 BPPT CC sehingga
dapat dilakukan isolasi terhadap gen selulase dari bakteri tersebut. Setelah gen
selulase berhasil diisolasi diharapkan dapat mempermudah penelitian lanjutan
tentang rekayasa genetika sehingga dapat meningkatkan produksi dan aktifitas
enzim selulase.
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
bactotryptone, yeast extract, NaCl dan agar yang digunakan untuk media
pertumbuhan sedangkan untuk isolasi dan amplifikasi DNA digunakan
etilendiamintetraasetat (EDTA), HCl, NaOH, sodium dodesyl sulfate (SDS),
lisozim, proteinase K, Na asetat, asam asetat glasial, isopropanol, etanol (70%
96% 100% ), tris-HCl, dapar TAE (Tris base, Asam asetat, dan EDTA), dapar
tris-EDTA (TE), etidium bromide (EtBr), dNTP, primer selulase (telah didesain
dan disintesis sebelumnya), marker 1 kb Plus DNA ladder, loading dye,
aquabidestilata steril, aquadest, enzim Taq Polymerase, primer 16S-rRNA,
agarose, dan DNA fragment extraction kit dari Geneaid..
Sampel yang digunakan adalah isolat RK2 BPPT CC sebagai sumber gen
selulase. Bakteri isolat RK2 BPPT CC adalah bakteri koleksi Laboratorium
Bioseparasi, LABTIAP, PUSPIPTEK, BPPT.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
thermal cycler [Eppendorf Master Cycler Personal, Jerman], elektroforesis
[Mupid ex U Submarine Electrophoresis System], shaker [Koehner Shaker,
Heidolph Unimax 1010], sentrifuge [Sorval Fresco, Cool Sertrifuge Hitachi CR21G, Jepang, Eppendorf Mini Spin, Jerman], milipore [Simpak 1], pH meter,
autoklaf [Iwaki Autoclave ACV-2450], kamera digital [Kodak DC 290 200m
Digital Camera], neraca analitik [RAD WAG WAS 220/C/2], thermomixer
[Eppendorf Thermomixer Comfort, Jerman], vortex [Supermixer K], lemari es,
pH meter, Laminar Air Flow [ESCO Class II BSC], konsentrator [Eppendorf
3
Consentrator 5301, Jerman], microwave [Sharp], oven, inkubator, magnetic stirrer,
lemari asam, pipet berukuran ml dan μl, tube eppendorf, tips pipet, falkon, dan
alat-alat gelas.
Prosedur Analisis Data
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Satu koloni tunggal dari bakteri yang telah ditumbuhkan dalam petri agar
diinokulasikan dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang berisi 25 ml Luria-Bertani
(LB) cair. Kultur diinkubasi pada suhu 37 oC dan dikocok dengan kecepatan 120
rpm selama ±24 jam. Sel yang telah berumur 24 jam disentrifugasi selama 30
menit dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang secara
aseptis dan pelet bakteri diresuspensi dengan dapar TE sebanyak 1250 μl dengan
cara dipipet berulang-ulang. Suspensi bakteri disimpan dalam temperatur -80 ºC
selama 1 jam. Pemecahan dinding sel dilakukan dengan penambahkan larutan
lisozim 10 mg/ml sebanyak 125 μl ke dalam suspensi bakteri dilanjutkan dengan
mencairkan suspensi bakteri beku tersebut pada temperatur ruang. Tabung yang
berisi suspensi bakteri yang telah mencair kemudian ditaruh di dalam es selama
45 menit. Untuk tahap pelisisan sel ditambahkan larutan STEP sebanyak 250 μl
dan diinkubasi pada temperatur 50 ºC selama 1 jam dengan sesekali dilakukan
pengocokan. Tris-dapar fenol sebanyak 1500 μl ditambahkan dan dicampurkan
perlahan selama 5 menit tanpa menggunakan vortex. Kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm dalam temperatur 4 ºC selama 15 menit untuk
memisahkan lapisan DNA, lapisan DNA berada di lapisan bagian atas. Lapisan
bagian atas dipindahkan ke dalam tabung eppendorf steril yang baru, pada tahap
ini lapisan yang berada di bawah tidak boleh terambil. Selanjutnya dilakukan
tahap presipitasi. Ditambahkan larutan Na asetat 3 N sebanyak 0,1 dari volume
lapisan atas yang dipisahkan dan dicampurkan perlahan tanpa menggunakan
vortex. Ditambahkan etanol 100% sebanyak dua kali dari volume terakhir dan
diaduk dengan membolak-balik tabung. Untuk mengendapkan DNA dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm dalam temperatur 4 ºC selama 20 menit
dan supernatan dibuang. Pelet DNA dibersihkan dengan ditambahkan sebanyak
0.5 ml etanol 70% ke dalam tabung eppendorf dan kocok perlahan baru kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 5 menit. Pelet DNA
dikeringkan dalam konsentrator selama 15 menit dan kemudian dilarutkan dalam
aquabidestila steril (ddH2O). DNA selanjutnya disimpan pada temperatur -20ºC
(Sambrook dan Russell 2001).
Elektroforesis Gel Agarosa dan Pemurnian DNA
Sebanyak 0.25 gram agarosa ditambah dengan 25 mL TAE 1x, lalu
dipanaskan dalam microwave selama 2 menit. Setelah larut dengan sempurna,
larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian dituang ke dalam cetakan
yang telah dilengkapi dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan selama kira-kira
20 menit sampai gelnya benar-benar beku. Gel tersebut kemudian dimasukkan
dalam alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TAE 1x sampai terendam
sempurna.
Sebanyak 3 μL sampel DNA dicampurkan dengan 2 μL loading dye di atas
parafilm dengan menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam sumur
elektroforesis (110 volt, 25 menit). Setelah elektroforesis selesai, gel dikeluarkan
4
dari alat elektroforesis kemudian direndam dalam larutan EtBr selama 10 menit
dan hasilnya dilihat dengan bantuan sinar Ultra Violet (UV). Profil DNA yang
terlihat kemudian disimpan dalam perangkat dokumentasi gel (gel-documentation).
Perangkat dokumentasi gel adalah alat yang terdiri atas kotak berbahan metal
tempat penyinaran sinar UV yang dihubungkan dengan kamera digital. Kamera
digital tersebut terpasang pada komputer atau laptop yang sudah terdapat software
yang dapat menyimpan fotografi dari hasil elektroforeis. Dokumentasi gel
berfungsi untuk mengambil foto gel hasil elektroforesis kemudian menyimpannya
dalam bentuk data fotografi yang dapat dicetak. Hasil elektroforesis dipotong
selanjutnya dilakukan pemurinan DNA.
Pemurnian DNA dilakukan mengguakan DNA fragment extraction kit sesuai
dengan Protokol Geneaid. Sebayak ±300 mg potongan agar yang mengandung
pita DNA dimasukkan ke tabung ependrof 1.5 ml dan ditambahkan 500 µL buffer
lalu divortek. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55-60 0C atau sampai agar benarbenar mencair. Setelah agar mencair dinginkan pada suhu ruang. Langkah
selanjutnya tempatkan kolom DF pada 2 mL colection tube. Pindahkan 800 µL
campuran sampel dari langka sebelumnya ke kolom, sentrifugasi 14-16000 xg
selama 30 detik, buang larutannya dan tempatkan kembali kolom DF pada 2 mL
colection tube. Kemudian tambahkan 400 µL buffer W1 ke kolom DF dan
sentrifugasi 14-16000 xg selama 30 detik, buang larutannya dan tempatkan
kembali kolom DF pada 2 mL colection tube. Setelah itu buffer pencuci yang
mengandung ethanol ditambahkan ke dalam kolom dan biarkan dalam posisi
tegak selama 1 menit, sentrifugasi 14-16000 xg selama 30 detik dan buang
larutannya, tempatkan kembali kolom DF pada 2 mL colection tube. Sentrifugasi
14-16000 xg selama 30 detik untuk mengeringkan kolom. Kolom yang sudah
kering dipindahkan ke tabung ependrof 1.5 ml dan ditambahkan 20-50 µL buffer
elusi atau bauffer TE pada tengah-tengah kolom. Tabung dibiarkan dalam posisi
tegak selama 2 menit atau sampai buffernya terserap dalam matriks. Tahap
terakhir yaitu sentrifugasi 14-16000 xg selama 2 menit untuk memperoleh hasil
pemurnian yang selanjutnya disimpan pada suhu -4 oC.
Identifikasi Bakteri Menggunakan Analisis Gen Penyandi 16S-rRNA
Tahap awal analisis 16S-rRNA dilakukan dengan teknik PCR. Sebanyak 1
μL DNA yang telah diisolasi dilarutkan dalam campuran berisi 18.5 μL Molecular
Water (MW), 2.5 μL Bufer B with Mg2+ 10X, 1 μL dNTPs, 1 μL primer forward,
1 μL primer reverse dan 0.2 μL Taq polymerase. Campuran tersebut kemudian
dimasukkan dalam mesin PCR, proesesnya diawali dengan denaturasi pada suhu
94 oC selama 45 detik, annealing pada 61 oC selama 45 detik, dan suhu
pemanjangan 72 oC selama 2 menit. Program ini dilakukan sebanyak 35 siklus.
Proses PCR diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 10 menit.
Hasil amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan
tegangan 110 volt selama 25 menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan
dengan marker.
Tahap selanjutnya adalah pemurnian hasil PCR menggunakan DNA
fragment extraction kit sesuai dengan Protokol Geneaid seperti yang telah
dilakukan sebelumnya. Hasil PCR yang telah dimurnikan dikirim ke First Base
sequencing service (Genetika Science) di Singapura untuk dilakukan sekuensing.
Hasil sekuensing digunakan untuk mengetahui kemiripan sekuen DNA dengan
sekuen DNA bakteri lain yang ada pada GenBank menggunakan bantuan progam
5
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) di situs http://www.ncbi.nlm.
nih.gov. Kekerabatan bakteri disajikan dalam bentuk gambar pohon filogenenetik
yang dibuat dengan batuan program Phylogeny.fr. Program ini tersedia di situs
http://www.phylogeny.fr/.
Desain Primer
Primer didesain secara manual menggunakan lima nukleotida penyandi gen
selulase dari genus Bacillus yang diunduh di situs web http://www.ncbi.nlm.
nih.gov dengan nomor akses masing-masing sekuen adalah HQ214668.1,
DQ782954.1, KC477685.1, EF070194.1, dan CP000560.1. Sekuen dari kelima
bakteri tersebut di-align selanjutnya diambil 15-25 di awal sebagai primer
forward dan 15-25 di akhir sebagai primer reverse. Untuk primer reverse
dilakukan reverse complement terlebih dahulu. Setelah sekuen primer diperoleh
untuk mendapatkan temperature melting (Tm) masing-masing sekuen primer
tersebut dimasukkan dalam situs online http://www.basic.northwestern.edu
/biotools/OligoCalc.html.
Isolasi Gen Penyandi Selulase
Isolasi dan amplifikasi gen penyandi selulase dilakukan dengan teknik PCR.
Total volume PCR yang digunakan adalah 20 μL dengan komposisinya 15.8 μL
MW (Molecular Water), 2. μL Buffer B with Mg2+, 0.4 μL dNTPs, 0.8 μL primer
forward, 0.8 μL primer reverse, 2 μL DNA yang telah diisolasi dan 0.2 μL Kappa
Taq polymerase. Campuran tersebut kemudian dimasukkan dalam mesin PCR.
Program PCR yang digunakan adalah PCR Touchdown. Tahap pertama diawali
dengan denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit. Kemudian dilanjutkan dengan
annealing pada suhu 54 oC selama 35 detik (suhu annealing ini akan turun
sebanyak 0.3 oC setiap siklusnya) dilanjutkan dengan suhu pemanjangan 72 oC
selama 2 menit. Tahap pertama ini dilakukan sebanyak 25 siklus. Proses PCR
tahap ke-2 diawali dengan denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing
pada suhu 46 oC selama 35 detik dan dilanjutkan dengan suhu pemanjangan 72oC
selama 2 menit. Tahap ke dua dilakukan sebanyak 9 siklus. Tahap pertama dan
ke-2 diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 10 menit. Hasil
amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan tegangan
110 volt selama 25 menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan dengan marker.
Bagian gel yang menunjukkan adanya fragmen DNA hasil amplifikasi dipotong
menggunakan pemotong steril dan dimasukkan dalam tabung mikro untuk
dilakuakan pemurnian mengunakan DNA fragment extraction kit sesuai dengan
Protokol Geneaid. Gen hasil pemurnian dikirim ke First Base sequencing service
(Genetika Science) di Singapura untuk dilakukan sekuensing. Hasil sekuensing
digunakan untuk memverifikasi gen yang telah berhasil diisolasi dengan cara
membandingkan sekuen yang diperoleh dengan sekuen bakteri lain menggunakan
bantuan progam BLAST di situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Urutan nukleotida gen selulase yang berhasil diperoleh ditranslasi menjadi
urutan asam amino dengan bantuan porgram Translate tool di situs web
http://web.expasy.org/translate/. Hasil translsi digunakan untuk memprediksi
model struktur selulase isolat RK2 BPPT CC dengan program pemodelan dari
situs http://swissmodel.expasy.org. Selanjutnya hasil pemodelannya dianalisis
dengan bantuan program Viasual Molecular Dynamics (VMD).
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Ekstraksi genom isolat RK2 BPPT CC menghasilkan DNA berukuran lebih
dari 10000 bp (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil elektroforesis DNA genom isolat RK2 BPPT CC
Identifikasi Bakteri Menggunakan Gen Penyandi 16S-rRNA
Gen penyandi 16S-rRNA yang berada pada DNA genom isolat RK2 BPPT
CC berhasil diamplifikasi dengan PCR. Produk PCR yang dihasilkan berukuran
kurang lebih 1500 pb (Gambar 2).
Gambar 2 Hasil elektroforesis gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
Hasil sekuensing produk PCR gen penyandi 16S-rRNA ditampilkan pada
Lampiran 4. Urutan basa nukleotida hasil sekuensing selanjutnya di-BLAST di
situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Gambar 3). Hubungan kekerabatannya
digambarkan dengan pohon filogenetik (Gambar 4).
Gambar 3 Hasil BLAST gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
7
Gambar 4 Pohon filogenetik isolat RK2 BPPT CC
Desain Primer
Sepasang primer didesain untuk mengisolasi gen selulase dari DNA
genom isolat RK2 BPPT CC. Primer forward yang berhasil didesain adalah
5’-ATGAAACGGTCAATYTC-3’ dengan Temperature melting (Tm) 45.4 oC.
Simbol Y dalam primer tersebut mewakili nukleotida timin atau sitosin untuk
degenerate primer sesuai dengan keterangan simbol di situs online
http://www.basic.morthwestern.edu/biotool/OligoCalc.html. Primer reverse yang
berhasil didesain adalah 5’CTAATTTGGTTCTGTTCC-3’ dengan Tm 45.2 oC.
Isolasi Gen Penyandi Selulase
Gen selulase diisolasi dan diamplifikasi dari DNA genom isolat RK2 BPPT
CC menggunakan PCR. Hasil elektroforesis produk PCR nya ditampilkan pada
Gambar 5. Berdasarkan gambar tersebut ukuran gen selulase berkisar 1500 pb.
Gambar 5 Hasil elektroforesis amplifikasi gen selulase
Gen selulase disekuensing untuk mengetahui urutan nukleotidanya
(Lampiran 7). Urutan nukleotida yang diperoleh di-BLAST untuk memverifikasi
gen yang diisolasi adalah gen selulasae (Gambar 6).
Gambar 6 Hasil BLAST gen selulase isolat RK2 BPPT CC
8
Urutan nukleotida gen selulase yang berhasil diperoleh ditranslasi menjadi
urutan asam amino dengan bantuan porgram Translate tool di situs web
http://web.expasy.org/translate/. Hasil translasi dari sekuen gen selulase
ditampilkan pada Lampiran 10. Urutan asam amino gen selulase digunakan untuk
memprediksi model struktur selulase isolat RK2 BPPT CC dengan program
pemodelan dari situs http://swissmodel.expasy.org. Selanjutnya hasil
pemodelannya dianalisis dengan bantuan program Viasual Molecular Dynamics
(VMD) (Gambar 7). Template yang digunakan adalah selulase dari B. subtilis 168
dengan nomor akses 3PZT.
Gambar 7 Prediksi model selulase isolat RK2 BPPT CC menggunakan program
VMD
Pembahasan
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Proses ini dilakukan untuk mengisolasi DNA genom dari isolat bakteri yang
nantinya akan digunakan sebagai DNA cetakan untuk proses amplifikasi gen yang
dibutuhkan. Proses ekstraksi DNA genom diawali dengan homogenisasi jaringan
yang dilakukan dengan menginokulasikan koloni tunggal dalam media
pertumbuhan berupa LB cair. Homogenisasi dilakukan untuk meningkatkan
jumlah sel identik yang akan dipanen. Selanjutnya untuk mengeluarkan DNA dari
dalam sel, dinding sel perlu dihancurkan terlebih dahulu. Metode umum yang
digunakan pada bakteri adalah dengan bantuan enzim lysozyme. Enzim ini akan
memotong peptidoglikan yang merupakan komponen utama pada dinding sel
(Clark dan Pazdernik 2009). Selanjutnya penambahan larutan STEP (SDS, Tris-Cl,
EDTA dan proteinase K) bertujuan meningkatkan permeabilitas membran sel dan
merusak proteinnya. SDS akan merusak dinding sel dengan cara menghilangkan
molekul lipid pada membran sel sedangkan EDTA akan mengkelat ion
magnesium yang penting dalam menjaga struktur dinding sel dan merupakan
kofaktor enzim-enzim selular perusak DNA (Brown 1991).
Pengotor utama dalam proses ekstraksi DNA genom adalah protein. Setelah
protein dirusak menggunakan proteinase K, protein dan DNA genom dipisahkan
menggunakan larutan fenol. Fenol dapat mengendapkan protein tetapi
9
membiarkan asam nukleat (DNA dan RNA) tetap dalam larutan (Brown 1991).
Hasil ekstrak genom yang masih kotor dimurnikan menggunakan DNA
fragment extraction kit. Keberhasilan ekstrak genom dapat divisualisasikan
menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. Hasil dokumentasinya ditampilkan
pada Gambar 1. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa ukuran DNA genom
isolat RK2 BPPT CC di atas 10000 pb karena posisi pitanya berada di atas marker.
Gambar hasil dokumentasi menunjukkan pita tunggal yang cukup bersih yang
menandakan jumlah pengotor yang sedikit.
Ukuran DNA genom suatu organisme sangat bervariasi tergantung pada
kerumitan organisme tersebut. Organisme prokariot umunya memiliki genom
yang lebih kecil, baik pada pasangan basanya maupun jumlah gennya
dibandingkan organisme eukariot. Menurut penelitian Kunst et al. (1997) bakteri
B. subtilis memiliki ukuran 4214810 pb yang mengkode 4100 protein. Bakteri
Bacillus thuringiensis, berdasarkan pola restriksinya diprediksi memiliki ukuran
DNA genom sekitar 1100-2600 kpb (Saputra 2008). Ukuran genom terbesar dari
organisme prokariot dimiliki oleh mikroba Amoeba dubia yang memiliki ukuran
genom lebih dari enam milyar pasang basa (Cavalier-Smith 1985).
Identifikasi Bakteri Menggunakan Gen Penyandi 16S-rRNA
Bakteri diidentifikasi meggunakan gen penyandi 16S-rRNA. 16S-rRNA
merupakan salah satu bagian dari 30S subunit ribosom prokariot yang disandi
oleh DNA sepanjang ±1500 pb. Identifikasi menggunakan gen penyandi 16SrRNA dipilih karena sifatnya yang spesifik untuk masing-masing spesies bakteri
dan merupakan daerah yang urutan basanya sangat konservatif secara evolusi.
Daerah konservatif tersebut dapat digunakan sebagai situs pelekatan primer
sehingga gen penyandi 16S-rRNA dapat disiolasi dan diidentifikasi untuk
membedakan suatu organisme ke dalam taksa yang lebih rendah seperti genus dan
spesies (Richana et al. 2008).
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen ini adalah primer yang
telah digunakan oleh Weisburg et al. (1991), yaitu: primer forward, 16S-27f
(5’GAGTTTGATCCTGGCTCA G-3’) dan primer reverse, 16S-1525r
(5’AGAAAGGAGGTGATCCAGGC-3’). Hasil dokumentasi gen penyandi 16SrRNA dari isolat RK2 BPPT CC yang telah dimurnikan ditampilkan pada Gambar
2. Pemurnian dilakukan untuk menghilangkan komponen-komponen sisa PCR
yang dapat mengganggu proses sekuensing.
Sekuensing dilakukan terhadap primer forward (16S-27f) dan primer
reverse (16S-1525r). Hasil sekuensing dikoreksi berdasarkan kromatogram
menggunakan bantuan program BioEdit sehingga diperoleh urutan nukleotida
yang lebih akurat. Berdasarkan primer yang digunakan nukleotida yang dihasilkan
sebenarnya berukuran 1498 pb. Akan tetapi, saat awal pembacaan sekuensing
sekitar 20 pb tidak dapat terbaca dengan baik karena reaksi kimianya belum stabil
sehingga sekitar 40 pb tidak digunakan. Setelah dikoreksi diperoleh urutan
nukleotida sepanjang 1442 pb (Lampiran 4). Urutan nukleotida yang telah
diperoleh selanjutnya digunakan untuk mencari kemiripan sekuennya dengan
database dari GeneBank menggunakan program BLAST di situs
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Berdasarkan hasil analisis urutan gen penyandi 16SrRNA, isolat ini termasuk ke dalam genus Bacillus dan memiliki kekerabatan
yang dekat dengan B. amyloliquefaciens dan B. subtilis. Untuk memvisualisasikan
hubungan kekerabatannya digunakan pohon filogenetik yang dibuat menggunakan
10
program Phylogeny.fr. Berdasarkan pohon filogenetiknnya (Gambar 4) isolat RK2
BPPT CC mempunyai jarak kekerabatan paling dekat dengan B.
amyloliquefaciens.
B. amyloliquefaciens memang memiliki kekerabatan yang sangat dekat
dengan B. subtilis. Bahkan sampai tahun 1980-an B. amyloliquefaciens masih satu
spesies dengan B. subtilis hingga akhirnya pada tahun 1987 kedua spesies tersebut
berhasil dibedakan menggunakan beberapa cara seperti kromatografi gas-cair
firolisis, analisis perbedaan ciri-ciri fenotip dan berdasarkan profil elektroforesis
enzim yang dihasilkan oleh masing-masing bakteri (Priest et al. 1987).
Isolasi Gen Penyandi Selulase
Tahap awal untuk mengisolasi gen selulase adalah mendesain primer.
Primer didesain menggunakan urutan nukleotida gen seluluse dari spesies B.
amyloliquefacies, B. subtilis, dan Bacillus sp. karena bakteri tersebut memiliki
kekerabatan yang paling dekat dengan isolat RK2 BPPT CC. Urutan nukleotida
yang akan digunakan diunduh dari situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Sebanyak
lima nukleotida di-align menggunakan program ClustalW di situs
http://www.genome.jp/tools/clustalw. Daerah yang terkonservasi diambil sebagai
basis untuk mendesain primer (Lampiran 5).
Primer yang berhasil didesain adalah primer degenerated dan masih
memiliki beberapa kekurangan antara lain komposisi basa nukleotida guanin dan
sitosin kurang dari 50% serta Tmnya yang rendah. Rendahnya suhu Tm akan
sangat berpengaruh dalam menentukan suhu annealing (Ta) secara pasti. Suhu
annealing adalah suhu dimana primer akan menempel pada DNA cetakan.
Pencarian konsisi optimal Ta sangat penting karena berkaitan dengan spesifitas
dan sensitifitas proses penempelan primer. Ta yang terlalu tinggi menyebabkan
penempelan primer tidak sensitif sehingga proses amplifikasi tidak terjadi.
Sebaliknya Ta yang terlalu rendah menyebabkan proses penempelan primer tidah
spesifik, primer akan menempel di sisi lain DNA cetakan yang bukan sisi
homolognya sehingga dapat menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan
(Asy’ari dan Noer 2005). Oleh karena itu, amplifikasi gen selulase dilakukan
dengan program PCR Touchdown, yaitu program PCR yang Ta nya mengalami
degradasi suhu di setiap siklusnya. Pada tahap pertama Ta yang digunakan adalah
54 oC dengan degradasi suhu di setiap siklusnya sebesar 0.3 oC sehingga tercapai
Ta sebesar 49.5 oC setelah 25 kali siklus. Program PCR dilanjutkan dengan 9 kali
siklus dengan Ta 46 oC. DNA cetakan yang digunakan adalah DNA genom isolat
RK2 BPPT CC. Hasil PCR yang telah dimurnikan dielektroforesis menggunakan
gel agarose 1% (Gambar 5). Melalui hasil elektroferis dapat dilihat bahwa gen
selulase isolat RK2 BPPT CC memiliki ukuran lebih dari 1500 pb.
Hasil pemurnian selanjutnya disekuesing untuk memastikan bahwa gen
yang teramplifikasi adalah gen selulase. Selain itu hasil sekuensing juga berguna
untuk mengetahui situs-situs pemotongan enzim restriksi yang terdapat di dalam
gen selulase. Situs-situs enzim restriksi ini akan sangat berguna untuk proses
rekayasa genetika. Hasil sekuensing tersebut di-BLAST untuk melihat tingkat
kesamaannya dengan nukleotida penyandi selulase dari bakteri lain (Gambar 6).
Hasilnya menunjukkan urutan nukleotida hasil sekuensing memiliki tingkat
kesamaan yang tinggi dengan bakteri B. Subtilis dan B. amyloliquefaciens dengan
tingkat kemiripan 99%. Hal ini menunjukkan bahwa gen yang yang teramplifikasi
11
adalah gen selulase dan primer yang didesain dapat digunakan untuk mengisolasi
gen selulase tersebut.
Sekuen gen selulase juga dapat digunakan untuk memprediksi sekuen asam
amino dan struktur tersier selulase isoalat RK2 BPPT CC. Prediksi struktur tersier
selulase isolat RK2 BPPT CC dilakukan dengan salah satu metode pemodelan
protein komparatif yaitu pemodelan homologi. Pada metode ini struktur protein
target ditentukan berdasarkan protein lain yaitu protein templat yang sudah
diketakui struktur tersiernya. Protein templat yang dipilih adalah protein yang
memiliki kemiripan sekuens terbesar dengan sekuen protein target. Templat yang
digunakan adalah selulase dari B. subtilis 168 karena sekuens nya memiliki skor
alignment terbesar dibanding selulase bari bakteri lain yang ada di Protein Data
Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) (Lampiran 9). Nomor akses
sekuen asam amino selulase B. subtilis 168 adalah P10475 sedangkan nomor
akses sekuen lain yang digunakan sebagai pembanding adalah Q59232, Q85465,
Q86099, dan Q9X273. Proses pemodelan dilakukan menggunakan bantuan
program di situs http://swissmodel.expasy.org. Model protein yang dipilih adalah
model protein yang memiliki nilai QMEAN Z atau nilai kualitas yang paling baik.
Hasil pemodelan diunduh dalam bentuk file dengan tipe pdb sehingga dapat
dilakukan analis setrukturnya. Analalis struktrur enzim selulase dilakukan dengan
program VMD (Gambar 7). Hasil analisis menunjukkan bahwa ujung N ada di
asam amino nomor 12 dengan residu asparagin, sedangkan ujung C diisi oleh
asam amino glisin pada urutan ke 304. Melalui gambar tersebut juga dapat
ditentukan jumlah α-heliks (berbentuk tabung warna ungu) dan β-pleated sheet
(berbentuk panah berwarna kuning) yang menyusun selulase isolat RK2 BPPT CC.
Gambar 7 menunjukkan bahwa selulase isolat ini tersusun atas delapan rantai αheliks dan sebelas rantai β-pleated sheet.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Identifikasi isolat RK2 BPPT CC menggunakan gen penyandi 16S-rRNA
menunjukkan bahwa isolat ini memiliki kekerabatan terdekat dengan B.
amyloliquefaciens. Gen selulase berhasil diisolasi menggunakan primer yang telah
didesain dan memiliki tingkat kemiripan 99% dengan gen selulase dari B. subtilis
dan B. amyloliquefaciens.
Saran
Perlu dilakukan karakterisasi sifat-sifat biokimia terhadap isoalat RK2
BPPT CC. Selain itu perlu dilakukan penelitian biologi molekuler seperti kloning
gen selulase dari isolat ini ke vektor ekspresi yang potensial sehingga gen selulase
ini dapat terekspresi dengan lebih baik.
12
DAFTAR PUSTAKA
Ariffin H, Abdullah N, Kalsom MSU, Shirai Y, Hassan MA. 2006. Production
and characterisation of cellulase by Bacillus pumilus Eb3. I J of Eng. 3:47-53.
Asy’ary M, Noer As. 2005. Optimasi konsentrasi MgCl2 dan suhu annealing pada
proses amplifikasi multifragments mtDNA dengan metode PCR. JKSA. 3: 2425.
Bakti C P. 2012. Optimasi produksi enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC
RK2 dengan variasi pH dan suhu menggunakan response surface methodology
[skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Brown T. 2001. Gene cloning and DNA Analysis: an Introduction, 5th Ed.
Australia: Blackwell Publishing Asia Pty Ltd. 29-30
Cavalier-Smith T. 1985. Eukaryotic gene numbers, non-coding DNA, and genom
size. Di dalam: Calier-Smith, editor. The Evolution of Genome Size.
Chichester: John Wiley.
Clark DP, Pazdernik NJ. 2009. Biotechnologi Applying the Genetic Revolution.
Elsevier Press. 60-61
Don R H, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. 1991. ‘Touchdown’ PCR
to cirkumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res.
19: 4008
Gerhartz W. 1990. Enzyme in industry : production and applications. Starch.
43:161
Howard RL, Abotsi EJ, van Rensburg EL, Howard S. 2003. Lignocellulose
biotechnology: issue of bioconversion and enzyme production. African J
Biotech. 2: 602-619.
Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, Albertini AM, Alloni G, Azevedo V, Bertero
MG, Bessières P, Bolotin A, Borchert S et al. 1997. The complete genome
sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature. 390: 249256.
Nguyen VT, Quyen DT. 2010. Optimazing culture conditions for the production
of endo-1,4-glucanase by Aspergillus awamori strain vietnam type culture
collection (vtcc)-f099. J Biotechnol. 9:6337-6344.
Priest FG, Goodfellow M, Shute LA, Berkeley RCW. 1987. Bacillus
amyloliquefacies sp. nov., nom. rev. I J Systematic Bacteriol. 37: 69-71
Richana N, Irawadi TT, Nur A, Syamsu K. 2008. Isolasi identifikasi bakteri
pengkasilxilanase serta karakterisasi enzimnya. J AgroBiogen. 4: 24-34
Sambrook J, Russell D. 2001. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.
New york: Col Spring Harbor Laboratory Press.
Saputra A. 2008. Analisis ukuran kromosom dan pola restriksi Bacillus
thuringiensis dengan elektroforesis medan berpulsa [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Sukumaran RK, Singhania RR, Pandey A. 2005. Mikrobial cellulase production,
applications and challenges. Scientific & Industrial Research. 64: 823-844.
Weisbur WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. J Bacteriol. 173: 697-703.
13
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Studi Literatur
Pembuatan Media dan Kultur Bakteri
Isolasi DNA Genom
Analisis gen penyandi 16S-rRNA
Sekuensing
Elektroforesis
BLAST
Perancangan primer
PCR untuk Amplifikasi
Gen Selulase
Sekuensing
BLAST
Elektroforesis
14
Lampiran 2 Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA pimer 27 f
15
Lampiran 3 Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA primer 1525 r
16
Lampiran 4 Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S-rRNA isolat
RK2 BPPT CC
GTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACC
TGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTT
CAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGT
AACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACAC
GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG
CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAAT
AGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC
GTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGT
GAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGG
AATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGT
CTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG
TAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCC
GCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA
TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATA
GGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG
GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGA
CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC
ACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTT
CTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT
GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGA
AGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGA
Lampiran 5 Hasil alligment gen selulase Bacillus
17
Lampiran 6 Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer forward
18
Lampiran 7 Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer reverse
19
Lampiran 8 Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi selulase isolat
RK2 BPPT CC
CATCTGCAGCAGGGACAAAAACGCCAGCAGCCAAGAATGGTCAGCTTAGCATAAAAGGAACA
CAGCTCGTAAACCGGGACGGCAAAGCGGTACAATTGAAAGGGATCAGTTCACATGGACTGCA
ATGGTATGGCGATTTCGTCAATAAAGACAGCTTAAAATGGCTGAGAGACGATTGGGGCATAA
CCGTTTTCCGCGCGGCGATGTATACGGCAGACGGCGGTTATATTGATAATCCGTCCGTGAAA
AATAAAGTAAAAGAAGCGGTTGAAGCGGCAAAAGAACTTGGGATATATGTCATCATTGACTG
GCATATCTTAAATGACGGCAACCCAAACCAACATAAAGAGAAGGCAAAAGAATTTTTTAAGG
AAATGTCAAGTCTTTACGGAAACACGCCAAACGTCATTTATGAAATTGCAAACGAACCAAAC
GGTGATGTGAACTGGAAGCGTGATATTAAACCGTATGCGGAAGAAGTGATTTCCGTTATCCG
CAAAAATGATCCAGACAACATCATTATTGTCGGAACCGGTACATGGAGCCAAGATGTGAATG
ATGCAGCCGATGATCAGCTAAAAGATGCAAACGTCATGTACGCGCTTCATTTTTATGCCGGC
ACACACGGCCAATCTTTACGGGATAAAGCAAACTATGCACTCAGTAAAGGAGCGCCTATTTT
CGTGACGGAATGGGGAACAAGCGACGCGTCTGGAAATGGCGGTGTATTCCTTGACCAGTCGC
GGGAATGGCTGAATTATCTCGACAGCAAGAACATCAGCTGGGTGAACTGGAATCTTTCTGAT
AAGCAGGAATCATCCTCAGCGTTAAAGCCGGGAGCATCTAAAACAGGCGGCTGGCCGCTTAC
AGATTTAACTGCTTCAGGAACATTCGTAAGAGAAAACATTCTCGGCAACAAAGATTCAACGA
AAGAACGCCCTGAAACGCCAGCACAAGATAACCCCGCACAGGAAAACGGCATTTCTGTACAA
TACAAAGCAGGGGATGGGGGTGTGAACAGCAACCAAATCCGCCCGCAGCTTCACATAAAAAA
TAACGGCAATGCGACGGTTGATTTAAAAGATGTCACTGCCCGTTACTGGTATAACGCGAAAA
ACAAGGGCCAAAACTTTGACTGTGACTACGCGCAGATTGGATGCGGCAATCTGACCCACAAA
TTTGTGACGCTGCATAAACCTAAGCAAGGTGCAGATACCTATCTGGAACTGGGTTTTAAAAC
AGGAACGCTGTCACCGGGAGCAAGCACAGGGAATATTCAGCTTCGTCTTCACAATGATGACT
GGAGTAATTATGCACAAAGCGGCGATTATTCCTTTTTTCAATCAAATACGTTAAAACAACGA
AAAAAA
Lampiran 9 Alignment score selulase isolat RK2 BPPT CC
Lampiran 10 Urutan asam amino hasil translasi gen selulase isolat RK2 BPPT CC
SAAGTKTPAAKNGQLSIKGTQLVNRDGKAVQLKGISSHGLQWYGDFVNKDSLKWLRDDWGITV
FRAAMYTADGGYIDNPSVKNKVKEAVEAAKELGIYVIIDWHILNDGNPNQHKEKAKEFFKEMS
SLYGNTPNVIYEIANEPNGDVNWKRDIKPYAEEVISVIRKNDPDNIIIVGTGTWSQDVNDAAD
DQLKDANVMYALHFYAGTHGQSLRDKANYALSKGAPIFVTEWGTSDASGNGGVFLDQSREWLN
YLDSKNISWVNWNLSDKQESSSALKPGASKTGGWPLTDLTASGTFVRENILGNKDSTKERPET
PAQDNPAQENGISVQYKAGDGGVNSNQIRPQLHIKNNGNATVDLKDVTARYWYNAKNKGQNFD
CDYAQIGCGNLTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKTGTLSPGASTGNIQLRLHNDDWSNYAQSG
DYSFFQSNTLKQRKK
20
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Lampung pada tanggal 23 Maret 1992 dari ayah
Kodirun dan ibu Jariyah. Penulis merupakan putri keenam dari enam bersaudara.
Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Gadingrejo dan pada tahun yang
sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Penulis diterima di Program Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti program S1 di IPB
penulis pernah bergabung dengan perkumpulan mahasiswa pencinta alam IPB
(Lawalata) dan Gentra Kaheman pada 2009-2010. Tahun 2010-2011 penulis
bergabung dengan organisasi SERUM-G (Serambi Rukhiyah Mahasiswa
FMIPA). Pada tahun 2012 penulis melaksanakan praktik lapangan di Pusat
Penelitian Biologi LIPI, Bogor dengan judul Biodegradasi Asetonitril oleh
Bakteri Konsorsia yang Diisolasi dari Berbagai Limbah.
SELULASE
ANTIN FITRIANI
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul berjudul Identifikasi Isolat
RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase adalah benar karya saya dengan arahan
dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada
perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya
yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam
teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada
Institut Pertanian Bogor.
Bogor, Desember 2013
Antin Fitriani
NIM G84090010
ABSTRAK
ANTIN FITRIANI. Identifikasi Isolat RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase.
Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan SISWA SETYAHADI
Selulase adalah enzim ekstraseluler yang dapat diproduksi oleh
mikroorganisme. Enzim ini dapat menghidrolisis selulosa untuk menghasilkan
glukosa. Tujuan penelitian ini adalah mengidentifikasi isolat RK2 BPPT CC dan
mengisolasi gen selulase dari isolat tersebut. Identifikasi isolat RK2 BPPT CC
dilakukan menggunakan urutan basa gen penyandi 16S-rRNA. Isolasi gen selulase
dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) touchdown
menggunakan primer yang telah didesain. Primer yang didesain adalah primer
degenerated hasil alignment dari berbagai gen selulase yang berasal dari bakteri
yang bergenus sama. Analisis gen 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC menunjukkan
bahwa isolat RK2 BPPT CC termasuk ke dalam genus Bacillus dan memiliki
kekerabatan yang dekat dengan Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens).
Isolasi gen selulase menghasilkan produk PCR yang spesifik sepanjang 1500 bp
yang diduga sebagai gen selulase. Analisis sekuen nukleotida menunjukkan
bahwa gen selulase isolat RK2 BPPT CC memiliki 99% kemiripan sekuensnya
dengan gen selulase dari Bacillus subtilis (B. subtilis) dan B. amyloliquefaciens.
Kata kunci: gen selulase, 16S-rRNA, Bacillus, PCR touchdown
ABSTRACT
ANTIN FITRIANI. Identification of RK2 BPPT CC Isolate and Isolation of
Cellulase Gene. Supervised by I MADE ARTIKA and SISWA SETYAHADI.
Cellulase is an extracellular enzyme produced by microorganism. This
enzyme is able to hydrolize cellulose to produce glucose. The purpose of this
research was to carry out of identification RK2 BPPT isolate and isolation of
cellulase gene from this isolat. Identification of RK2 BPPT CC isolate was carried
out based on sequence of 16S ribosomal RNA gene and isolation of cellulase gen
was carried out using touchdown Polymerase Chain Reaction (PCR) methode
using primer that has been designed. The primer has been designed is the
degenerated primers based on alignment results of cellulase genes of bacteria of
the same genus. Analysis 16S-rRNA gene showed that the RK2 BPPT CC isolate
belongs to the genus of Bacillus and closely related to Bacillus amyloliquefaciens
(B. amyloliquefaciens) spesies. Isolation cellulase gene resulted a specific PCR
product along 1500 bp as a putative of cellulase gene. Nucleotide sequence
analysis showed that the cellulase gene of RK2 BPPT CC isolate has 99%
sequence-similarity to the celluase genes of Bacillus subtilis (B. subtilis) and
Bacillus amyloliquefaciens.
Keywords: cellulase gene, 16S-rRNA, Bacillus, touchdown PCR
IDENTIFIKASI ISOLAT RK2 BPPT CC DAN ISOLASI GEN
SELULASE
ANTIN FITRIANI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biokimia
DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2013
Judul Skripsi : Identifikasi Isolat RK2 BPPT CC dan Isolasi Gen Selulase
Nama
: Antin Fitriani
NIM
: G84090010
Disetujui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
Pembimbing I
Dr Ir Siswa Setyahadi, M.Sc
Pembimbing II
Diketahui oleh
Dr Ir I Made Artika, M.App.Sc
Ketua Departemen
Tanggal Lulus:
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas segala rahmat-Nya
penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah ini dengan baik dan lancar. Shalawat
dan salam semoga selalu tercurahkan kepada Nabi Muhammad SAW dan
keluarganya.
Ucapan terima kasih terutama ditujukan kepada Dr. Ir. I Made Artika,
M.App.Sc selaku dosen pembimbing utama dan Dr. Siswa Setyahadi M.Sc selaku
pembimbing lapangan yang telah membimbing serta memberi saran dan kritik
yang membangun. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Djamil
S.Si, M.Si selaku Kepala Laboratorium Teknologi Bioindustri, Laboratorium
Pengembangan Teknologi Agroindustri dan Biomedika (LAPTIAB), beserta staf
Divisi Biokatalis, dan teman-teman Biokimia yang telah membantu selama
pengumpulan data penelitian. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada
kedua orang tua atas doa dan dukungan yang selalu diberikan.
Semoga tulisan ini bermanfaat dalam bidang ilmu pengetahuan khususnya
biokimia serta memberikan kemaslahatan bagi masyarakat.
Bogor, Desember 2013
Antin Fitriani
DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL
vi
DAFTAR GAMBAR
vi
DAFTAR LAMPIRAN
vi
PENDAHULUAN
1
METODE
2
Bahan
2
Alat
2
Prosedur Analisis Data
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
6
Hasil
6
Pembahasan
8
SIMPULAN DAN SARAN
11
Simpulan
11
Saran
11
DAFTAR PUSTAKA
12
LAMPIRAN
13
RIWAYAT HIDUP
20
DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
Hasil elektroforesis DNA genom isolat RK2 BPPT CC
Hasil elektroforesis gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
Hasil BLAST gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
Pohon filogenetik isolat RK2 BPPT CC
Hasil elektroforesis amplifikasi gen selulase
Hasil BLAST gen selulase isolat RK2 BPPT CC
Prediksi model selulase isolat RK2 BPPT CC
6
6
6
7
7
7
8
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Diagram alir penelitian
Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA pimer 27 f
Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA pimer 1525 r
Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S-rRNA isolat
RK2 BPPT CC
Hasil alignment gen selulase Bacillus
Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer forward
Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer reverse
Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi selulase isolat RK2
BPPT CC
Alignment score selulase isolat RK2 BPPT CC
Urutan asam amino hasil translasi gen selulase isolat RK2 BPPT CC
13
14
15
16
16
17
18
19
19
19
PENDAHULUAN
Enzim selulase adalah enzim kompleks yang memotong secara bertahap
rantai selulosa (Gerhartz 1990). Selulase merupakan o-glikosil hidrolasis (GHs)
yang menghidrolisisi ikatan β-1,4-glikosidik dalam selulosa. Enzim ini
mengkatalis proses selulolisis (hidrolisis selulosa) dan menghasilkan glukosa,
selubiosa dan selooligosakarida (Sukumaran et al. 2005). Selulase dapat
diklasifikasikan menjadi tiga kelas utama yaitu endoglukanase (endo-1,4-βglukanase atau 1,4-β-D-glukan 4-glukanohidrolase) (EC 3.2.1.4), selobiohidrolase
(ekso-1,4-β-glukanase atau 1,4-β-D-glukan selobiohidrolase) (EC 3.2.1.19), dan
selobiase (β-glucosidase atau β-D-glukosida glukohidrolase) (EC 3.2.1.21)
(Nguyen dan Quyen 2010).
Kebutuhan akan enzim selulase saat ini semakin meningkat, terutama untuk
memenuhi kebutuhan bioenergi berupa bioetanol. Produksi bioetanol secara
massal membutuhkan banyak sumber glukosa sebagai bahan baku utama. Glukosa
tersebut akan terfermentasi dan menghasilkan bioetanol. Masalahnya ketersediaan
glukosa tidak banyak namun ketersediaan selulosa justru melimpah terutama yang
berasal dari limbah pertanian (Howard et al. 2003). Enzim selulase sangat
dibutuhkan untuk menguraikan limbah selulosa menjadi monomer glukosa
sehingga dapat digunakan untuk kebutuhan bioenergi. Selain itu, selulase juga
banyak digunakan dalam berbagai bidang industri temasuk industri bahan kimia,
bahan bakar, makanan, pembuatan bir, anggur, pulp dan kertas serta pertanian.
Mikroorganisme penghasil selulase dapat berupa kapang, bakteri atau
aktinomisetes. Lingkungan hidup yang mengandung selulosa akan memacu
mikroorganisme ini mensekresikan selulase. Mereka berlaku demikian karena
menginginkan produk hasil hidrolisis selulosa oleh selulase yaitu glukosa.
Glukosa akan digunakan sebagai sumber energi berupa sumber karbon (C).
Selulase yang dihasilkan dari mikroorganisme kapang jenis Trichoderma dan
Aspergillus umumnya memiliki aktivitas lebih tinggi dibandingkan selulase yang
berasal dari bakteri. Meskipun demikian, selulase dari bakteri memiliki beberapa
keunggulan, antara lain laju pertumbuhan bakteri lebih cepat, selulase dari bakteri
juga kurang terinhibisi oleh material yang telah dihidrolisis, selain itu bakteri
dapat beradaptasi dalam lingkungan yang ekstrim dan yang lebih menguntungkan
adalah selulase dari bakteri lebih mudah dilakukan rekayasa genetika (Ariffin et al.
2006).
Bakteri yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat RK2 BPPT CC
yang dihasilkan dari penapisan pada rayap. Isolat ini telah digunakan pada
penelitian sebelumnya dan terbukti menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas
8.45 U/mL pada substrat dedak (45%) dan air kelapa (15%) dengan pH dan suhu
masing-masing adalah 6 dan 42 oC (Bakti 2012). Upaya yang dapat dilakukakan
untuk meningkatkan aktivitas selulase dari bakteri adalah melakukan rekayasa
genetika seperti kloning gen selulase ke vektor ekspresi yang memiliki
kemampuan ekspresi gen yang baik sehingga produksi enzim selulase dapat
meningkat. Sebelum melakukan rekayasa genetika langkah awal yang dapat
dilakukan adalah mengidentifikasi isolat RK2 BPPT CC. Identifikasi dilakukan
menggunakan gen penyandi 16S-rRNA. 16S-rRNA adalah sub unit ribosom
prokariot yang urutan basa gen penyandinya bersifat spesifik pada masing-masing
2
spesies bakteri sehingga dapat dipilih sebagai dasar untuk identifikasi (Richana et
al. 2008). Isolasi dan amplifikasi gen selulase dilakukan menggunakan PCR
touchdown. PCR touchdown sering digunakan untuk proses PCR yang
menggunakan primer degenerated yaitu primer yang tidak spesifik karena
memiliki dua atau lebih kemungkinan perbedaan urutan basanya. Primer
degenerated biasanya memiliki suhu annealing (suhu penempelan primer) yang
tidak pasti karena mengandung dua atau lebih urutan basa yang berbeda. Salah
satu penyelesaian yang dapat dilakukakan adalah menggunakan teknik PCR
touchdown karena pada PCR ini suhu annealing akan mengalami penurunan di
setiap siklusnya. Teknik PCR ini pernah digunakan untuk mengamlifikasi sekuen
cDNA yang mengkode LIF (Leukemia Inhibitor Factor) dengan suhu anealing
awal adalah 65 0C dan mengalami penurunan 1 derajat di setiap siklusnya selama
10 kali siklus hingga mencapai suhu annealing akhir 55 0C (Don et al. 1991).
Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi isolat RK2 BPPT CC sehingga
dapat dilakukan isolasi terhadap gen selulase dari bakteri tersebut. Setelah gen
selulase berhasil diisolasi diharapkan dapat mempermudah penelitian lanjutan
tentang rekayasa genetika sehingga dapat meningkatkan produksi dan aktifitas
enzim selulase.
METODE
Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
bactotryptone, yeast extract, NaCl dan agar yang digunakan untuk media
pertumbuhan sedangkan untuk isolasi dan amplifikasi DNA digunakan
etilendiamintetraasetat (EDTA), HCl, NaOH, sodium dodesyl sulfate (SDS),
lisozim, proteinase K, Na asetat, asam asetat glasial, isopropanol, etanol (70%
96% 100% ), tris-HCl, dapar TAE (Tris base, Asam asetat, dan EDTA), dapar
tris-EDTA (TE), etidium bromide (EtBr), dNTP, primer selulase (telah didesain
dan disintesis sebelumnya), marker 1 kb Plus DNA ladder, loading dye,
aquabidestilata steril, aquadest, enzim Taq Polymerase, primer 16S-rRNA,
agarose, dan DNA fragment extraction kit dari Geneaid..
Sampel yang digunakan adalah isolat RK2 BPPT CC sebagai sumber gen
selulase. Bakteri isolat RK2 BPPT CC adalah bakteri koleksi Laboratorium
Bioseparasi, LABTIAP, PUSPIPTEK, BPPT.
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut:
thermal cycler [Eppendorf Master Cycler Personal, Jerman], elektroforesis
[Mupid ex U Submarine Electrophoresis System], shaker [Koehner Shaker,
Heidolph Unimax 1010], sentrifuge [Sorval Fresco, Cool Sertrifuge Hitachi CR21G, Jepang, Eppendorf Mini Spin, Jerman], milipore [Simpak 1], pH meter,
autoklaf [Iwaki Autoclave ACV-2450], kamera digital [Kodak DC 290 200m
Digital Camera], neraca analitik [RAD WAG WAS 220/C/2], thermomixer
[Eppendorf Thermomixer Comfort, Jerman], vortex [Supermixer K], lemari es,
pH meter, Laminar Air Flow [ESCO Class II BSC], konsentrator [Eppendorf
3
Consentrator 5301, Jerman], microwave [Sharp], oven, inkubator, magnetic stirrer,
lemari asam, pipet berukuran ml dan μl, tube eppendorf, tips pipet, falkon, dan
alat-alat gelas.
Prosedur Analisis Data
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Satu koloni tunggal dari bakteri yang telah ditumbuhkan dalam petri agar
diinokulasikan dalam labu Erlenmeyer 250 ml yang berisi 25 ml Luria-Bertani
(LB) cair. Kultur diinkubasi pada suhu 37 oC dan dikocok dengan kecepatan 120
rpm selama ±24 jam. Sel yang telah berumur 24 jam disentrifugasi selama 30
menit dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 4 oC. Supernatan dibuang secara
aseptis dan pelet bakteri diresuspensi dengan dapar TE sebanyak 1250 μl dengan
cara dipipet berulang-ulang. Suspensi bakteri disimpan dalam temperatur -80 ºC
selama 1 jam. Pemecahan dinding sel dilakukan dengan penambahkan larutan
lisozim 10 mg/ml sebanyak 125 μl ke dalam suspensi bakteri dilanjutkan dengan
mencairkan suspensi bakteri beku tersebut pada temperatur ruang. Tabung yang
berisi suspensi bakteri yang telah mencair kemudian ditaruh di dalam es selama
45 menit. Untuk tahap pelisisan sel ditambahkan larutan STEP sebanyak 250 μl
dan diinkubasi pada temperatur 50 ºC selama 1 jam dengan sesekali dilakukan
pengocokan. Tris-dapar fenol sebanyak 1500 μl ditambahkan dan dicampurkan
perlahan selama 5 menit tanpa menggunakan vortex. Kemudian disentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm dalam temperatur 4 ºC selama 15 menit untuk
memisahkan lapisan DNA, lapisan DNA berada di lapisan bagian atas. Lapisan
bagian atas dipindahkan ke dalam tabung eppendorf steril yang baru, pada tahap
ini lapisan yang berada di bawah tidak boleh terambil. Selanjutnya dilakukan
tahap presipitasi. Ditambahkan larutan Na asetat 3 N sebanyak 0,1 dari volume
lapisan atas yang dipisahkan dan dicampurkan perlahan tanpa menggunakan
vortex. Ditambahkan etanol 100% sebanyak dua kali dari volume terakhir dan
diaduk dengan membolak-balik tabung. Untuk mengendapkan DNA dilakukan
sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm dalam temperatur 4 ºC selama 20 menit
dan supernatan dibuang. Pelet DNA dibersihkan dengan ditambahkan sebanyak
0.5 ml etanol 70% ke dalam tabung eppendorf dan kocok perlahan baru kemudian
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 5 menit. Pelet DNA
dikeringkan dalam konsentrator selama 15 menit dan kemudian dilarutkan dalam
aquabidestila steril (ddH2O). DNA selanjutnya disimpan pada temperatur -20ºC
(Sambrook dan Russell 2001).
Elektroforesis Gel Agarosa dan Pemurnian DNA
Sebanyak 0.25 gram agarosa ditambah dengan 25 mL TAE 1x, lalu
dipanaskan dalam microwave selama 2 menit. Setelah larut dengan sempurna,
larutan tersebut dibiarkan sampai hangat, kemudian dituang ke dalam cetakan
yang telah dilengkapi dengan sisir. Campuran tersebut didiamkan selama kira-kira
20 menit sampai gelnya benar-benar beku. Gel tersebut kemudian dimasukkan
dalam alat elektroforesis dan direndam dengan bufer TAE 1x sampai terendam
sempurna.
Sebanyak 3 μL sampel DNA dicampurkan dengan 2 μL loading dye di atas
parafilm dengan menggunakan mikropipet kemudian dimasukkan ke dalam sumur
elektroforesis (110 volt, 25 menit). Setelah elektroforesis selesai, gel dikeluarkan
4
dari alat elektroforesis kemudian direndam dalam larutan EtBr selama 10 menit
dan hasilnya dilihat dengan bantuan sinar Ultra Violet (UV). Profil DNA yang
terlihat kemudian disimpan dalam perangkat dokumentasi gel (gel-documentation).
Perangkat dokumentasi gel adalah alat yang terdiri atas kotak berbahan metal
tempat penyinaran sinar UV yang dihubungkan dengan kamera digital. Kamera
digital tersebut terpasang pada komputer atau laptop yang sudah terdapat software
yang dapat menyimpan fotografi dari hasil elektroforeis. Dokumentasi gel
berfungsi untuk mengambil foto gel hasil elektroforesis kemudian menyimpannya
dalam bentuk data fotografi yang dapat dicetak. Hasil elektroforesis dipotong
selanjutnya dilakukan pemurinan DNA.
Pemurnian DNA dilakukan mengguakan DNA fragment extraction kit sesuai
dengan Protokol Geneaid. Sebayak ±300 mg potongan agar yang mengandung
pita DNA dimasukkan ke tabung ependrof 1.5 ml dan ditambahkan 500 µL buffer
lalu divortek. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 55-60 0C atau sampai agar benarbenar mencair. Setelah agar mencair dinginkan pada suhu ruang. Langkah
selanjutnya tempatkan kolom DF pada 2 mL colection tube. Pindahkan 800 µL
campuran sampel dari langka sebelumnya ke kolom, sentrifugasi 14-16000 xg
selama 30 detik, buang larutannya dan tempatkan kembali kolom DF pada 2 mL
colection tube. Kemudian tambahkan 400 µL buffer W1 ke kolom DF dan
sentrifugasi 14-16000 xg selama 30 detik, buang larutannya dan tempatkan
kembali kolom DF pada 2 mL colection tube. Setelah itu buffer pencuci yang
mengandung ethanol ditambahkan ke dalam kolom dan biarkan dalam posisi
tegak selama 1 menit, sentrifugasi 14-16000 xg selama 30 detik dan buang
larutannya, tempatkan kembali kolom DF pada 2 mL colection tube. Sentrifugasi
14-16000 xg selama 30 detik untuk mengeringkan kolom. Kolom yang sudah
kering dipindahkan ke tabung ependrof 1.5 ml dan ditambahkan 20-50 µL buffer
elusi atau bauffer TE pada tengah-tengah kolom. Tabung dibiarkan dalam posisi
tegak selama 2 menit atau sampai buffernya terserap dalam matriks. Tahap
terakhir yaitu sentrifugasi 14-16000 xg selama 2 menit untuk memperoleh hasil
pemurnian yang selanjutnya disimpan pada suhu -4 oC.
Identifikasi Bakteri Menggunakan Analisis Gen Penyandi 16S-rRNA
Tahap awal analisis 16S-rRNA dilakukan dengan teknik PCR. Sebanyak 1
μL DNA yang telah diisolasi dilarutkan dalam campuran berisi 18.5 μL Molecular
Water (MW), 2.5 μL Bufer B with Mg2+ 10X, 1 μL dNTPs, 1 μL primer forward,
1 μL primer reverse dan 0.2 μL Taq polymerase. Campuran tersebut kemudian
dimasukkan dalam mesin PCR, proesesnya diawali dengan denaturasi pada suhu
94 oC selama 45 detik, annealing pada 61 oC selama 45 detik, dan suhu
pemanjangan 72 oC selama 2 menit. Program ini dilakukan sebanyak 35 siklus.
Proses PCR diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 10 menit.
Hasil amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan
tegangan 110 volt selama 25 menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan
dengan marker.
Tahap selanjutnya adalah pemurnian hasil PCR menggunakan DNA
fragment extraction kit sesuai dengan Protokol Geneaid seperti yang telah
dilakukan sebelumnya. Hasil PCR yang telah dimurnikan dikirim ke First Base
sequencing service (Genetika Science) di Singapura untuk dilakukan sekuensing.
Hasil sekuensing digunakan untuk mengetahui kemiripan sekuen DNA dengan
sekuen DNA bakteri lain yang ada pada GenBank menggunakan bantuan progam
5
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) di situs http://www.ncbi.nlm.
nih.gov. Kekerabatan bakteri disajikan dalam bentuk gambar pohon filogenenetik
yang dibuat dengan batuan program Phylogeny.fr. Program ini tersedia di situs
http://www.phylogeny.fr/.
Desain Primer
Primer didesain secara manual menggunakan lima nukleotida penyandi gen
selulase dari genus Bacillus yang diunduh di situs web http://www.ncbi.nlm.
nih.gov dengan nomor akses masing-masing sekuen adalah HQ214668.1,
DQ782954.1, KC477685.1, EF070194.1, dan CP000560.1. Sekuen dari kelima
bakteri tersebut di-align selanjutnya diambil 15-25 di awal sebagai primer
forward dan 15-25 di akhir sebagai primer reverse. Untuk primer reverse
dilakukan reverse complement terlebih dahulu. Setelah sekuen primer diperoleh
untuk mendapatkan temperature melting (Tm) masing-masing sekuen primer
tersebut dimasukkan dalam situs online http://www.basic.northwestern.edu
/biotools/OligoCalc.html.
Isolasi Gen Penyandi Selulase
Isolasi dan amplifikasi gen penyandi selulase dilakukan dengan teknik PCR.
Total volume PCR yang digunakan adalah 20 μL dengan komposisinya 15.8 μL
MW (Molecular Water), 2. μL Buffer B with Mg2+, 0.4 μL dNTPs, 0.8 μL primer
forward, 0.8 μL primer reverse, 2 μL DNA yang telah diisolasi dan 0.2 μL Kappa
Taq polymerase. Campuran tersebut kemudian dimasukkan dalam mesin PCR.
Program PCR yang digunakan adalah PCR Touchdown. Tahap pertama diawali
dengan denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit. Kemudian dilanjutkan dengan
annealing pada suhu 54 oC selama 35 detik (suhu annealing ini akan turun
sebanyak 0.3 oC setiap siklusnya) dilanjutkan dengan suhu pemanjangan 72 oC
selama 2 menit. Tahap pertama ini dilakukan sebanyak 25 siklus. Proses PCR
tahap ke-2 diawali dengan denaturasi pada suhu 94 oC selama 1 menit, annealing
pada suhu 46 oC selama 35 detik dan dilanjutkan dengan suhu pemanjangan 72oC
selama 2 menit. Tahap ke dua dilakukan sebanyak 9 siklus. Tahap pertama dan
ke-2 diakhiri dengan pemanjangan akhir pada suhu 72 oC selama 10 menit. Hasil
amplifikasi diverifikasi dengan elektroforesis gel agarosa 1% dengan tegangan
110 volt selama 25 menit. Pita DNA yang terbentuk dibandingkan dengan marker.
Bagian gel yang menunjukkan adanya fragmen DNA hasil amplifikasi dipotong
menggunakan pemotong steril dan dimasukkan dalam tabung mikro untuk
dilakuakan pemurnian mengunakan DNA fragment extraction kit sesuai dengan
Protokol Geneaid. Gen hasil pemurnian dikirim ke First Base sequencing service
(Genetika Science) di Singapura untuk dilakukan sekuensing. Hasil sekuensing
digunakan untuk memverifikasi gen yang telah berhasil diisolasi dengan cara
membandingkan sekuen yang diperoleh dengan sekuen bakteri lain menggunakan
bantuan progam BLAST di situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Urutan nukleotida gen selulase yang berhasil diperoleh ditranslasi menjadi
urutan asam amino dengan bantuan porgram Translate tool di situs web
http://web.expasy.org/translate/. Hasil translsi digunakan untuk memprediksi
model struktur selulase isolat RK2 BPPT CC dengan program pemodelan dari
situs http://swissmodel.expasy.org. Selanjutnya hasil pemodelannya dianalisis
dengan bantuan program Viasual Molecular Dynamics (VMD).
6
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Ekstraksi genom isolat RK2 BPPT CC menghasilkan DNA berukuran lebih
dari 10000 bp (Gambar 1).
Gambar 1 Hasil elektroforesis DNA genom isolat RK2 BPPT CC
Identifikasi Bakteri Menggunakan Gen Penyandi 16S-rRNA
Gen penyandi 16S-rRNA yang berada pada DNA genom isolat RK2 BPPT
CC berhasil diamplifikasi dengan PCR. Produk PCR yang dihasilkan berukuran
kurang lebih 1500 pb (Gambar 2).
Gambar 2 Hasil elektroforesis gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
Hasil sekuensing produk PCR gen penyandi 16S-rRNA ditampilkan pada
Lampiran 4. Urutan basa nukleotida hasil sekuensing selanjutnya di-BLAST di
situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov (Gambar 3). Hubungan kekerabatannya
digambarkan dengan pohon filogenetik (Gambar 4).
Gambar 3 Hasil BLAST gen penyandi 16S-rRNA isolat RK2 BPPT CC
7
Gambar 4 Pohon filogenetik isolat RK2 BPPT CC
Desain Primer
Sepasang primer didesain untuk mengisolasi gen selulase dari DNA
genom isolat RK2 BPPT CC. Primer forward yang berhasil didesain adalah
5’-ATGAAACGGTCAATYTC-3’ dengan Temperature melting (Tm) 45.4 oC.
Simbol Y dalam primer tersebut mewakili nukleotida timin atau sitosin untuk
degenerate primer sesuai dengan keterangan simbol di situs online
http://www.basic.morthwestern.edu/biotool/OligoCalc.html. Primer reverse yang
berhasil didesain adalah 5’CTAATTTGGTTCTGTTCC-3’ dengan Tm 45.2 oC.
Isolasi Gen Penyandi Selulase
Gen selulase diisolasi dan diamplifikasi dari DNA genom isolat RK2 BPPT
CC menggunakan PCR. Hasil elektroforesis produk PCR nya ditampilkan pada
Gambar 5. Berdasarkan gambar tersebut ukuran gen selulase berkisar 1500 pb.
Gambar 5 Hasil elektroforesis amplifikasi gen selulase
Gen selulase disekuensing untuk mengetahui urutan nukleotidanya
(Lampiran 7). Urutan nukleotida yang diperoleh di-BLAST untuk memverifikasi
gen yang diisolasi adalah gen selulasae (Gambar 6).
Gambar 6 Hasil BLAST gen selulase isolat RK2 BPPT CC
8
Urutan nukleotida gen selulase yang berhasil diperoleh ditranslasi menjadi
urutan asam amino dengan bantuan porgram Translate tool di situs web
http://web.expasy.org/translate/. Hasil translasi dari sekuen gen selulase
ditampilkan pada Lampiran 10. Urutan asam amino gen selulase digunakan untuk
memprediksi model struktur selulase isolat RK2 BPPT CC dengan program
pemodelan dari situs http://swissmodel.expasy.org. Selanjutnya hasil
pemodelannya dianalisis dengan bantuan program Viasual Molecular Dynamics
(VMD) (Gambar 7). Template yang digunakan adalah selulase dari B. subtilis 168
dengan nomor akses 3PZT.
Gambar 7 Prediksi model selulase isolat RK2 BPPT CC menggunakan program
VMD
Pembahasan
Ekstraksi DNA Genom Isolat RK2 BPPT CC
Proses ini dilakukan untuk mengisolasi DNA genom dari isolat bakteri yang
nantinya akan digunakan sebagai DNA cetakan untuk proses amplifikasi gen yang
dibutuhkan. Proses ekstraksi DNA genom diawali dengan homogenisasi jaringan
yang dilakukan dengan menginokulasikan koloni tunggal dalam media
pertumbuhan berupa LB cair. Homogenisasi dilakukan untuk meningkatkan
jumlah sel identik yang akan dipanen. Selanjutnya untuk mengeluarkan DNA dari
dalam sel, dinding sel perlu dihancurkan terlebih dahulu. Metode umum yang
digunakan pada bakteri adalah dengan bantuan enzim lysozyme. Enzim ini akan
memotong peptidoglikan yang merupakan komponen utama pada dinding sel
(Clark dan Pazdernik 2009). Selanjutnya penambahan larutan STEP (SDS, Tris-Cl,
EDTA dan proteinase K) bertujuan meningkatkan permeabilitas membran sel dan
merusak proteinnya. SDS akan merusak dinding sel dengan cara menghilangkan
molekul lipid pada membran sel sedangkan EDTA akan mengkelat ion
magnesium yang penting dalam menjaga struktur dinding sel dan merupakan
kofaktor enzim-enzim selular perusak DNA (Brown 1991).
Pengotor utama dalam proses ekstraksi DNA genom adalah protein. Setelah
protein dirusak menggunakan proteinase K, protein dan DNA genom dipisahkan
menggunakan larutan fenol. Fenol dapat mengendapkan protein tetapi
9
membiarkan asam nukleat (DNA dan RNA) tetap dalam larutan (Brown 1991).
Hasil ekstrak genom yang masih kotor dimurnikan menggunakan DNA
fragment extraction kit. Keberhasilan ekstrak genom dapat divisualisasikan
menggunakan elektroforesis gel agarosa 1%. Hasil dokumentasinya ditampilkan
pada Gambar 1. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa ukuran DNA genom
isolat RK2 BPPT CC di atas 10000 pb karena posisi pitanya berada di atas marker.
Gambar hasil dokumentasi menunjukkan pita tunggal yang cukup bersih yang
menandakan jumlah pengotor yang sedikit.
Ukuran DNA genom suatu organisme sangat bervariasi tergantung pada
kerumitan organisme tersebut. Organisme prokariot umunya memiliki genom
yang lebih kecil, baik pada pasangan basanya maupun jumlah gennya
dibandingkan organisme eukariot. Menurut penelitian Kunst et al. (1997) bakteri
B. subtilis memiliki ukuran 4214810 pb yang mengkode 4100 protein. Bakteri
Bacillus thuringiensis, berdasarkan pola restriksinya diprediksi memiliki ukuran
DNA genom sekitar 1100-2600 kpb (Saputra 2008). Ukuran genom terbesar dari
organisme prokariot dimiliki oleh mikroba Amoeba dubia yang memiliki ukuran
genom lebih dari enam milyar pasang basa (Cavalier-Smith 1985).
Identifikasi Bakteri Menggunakan Gen Penyandi 16S-rRNA
Bakteri diidentifikasi meggunakan gen penyandi 16S-rRNA. 16S-rRNA
merupakan salah satu bagian dari 30S subunit ribosom prokariot yang disandi
oleh DNA sepanjang ±1500 pb. Identifikasi menggunakan gen penyandi 16SrRNA dipilih karena sifatnya yang spesifik untuk masing-masing spesies bakteri
dan merupakan daerah yang urutan basanya sangat konservatif secara evolusi.
Daerah konservatif tersebut dapat digunakan sebagai situs pelekatan primer
sehingga gen penyandi 16S-rRNA dapat disiolasi dan diidentifikasi untuk
membedakan suatu organisme ke dalam taksa yang lebih rendah seperti genus dan
spesies (Richana et al. 2008).
Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi gen ini adalah primer yang
telah digunakan oleh Weisburg et al. (1991), yaitu: primer forward, 16S-27f
(5’GAGTTTGATCCTGGCTCA G-3’) dan primer reverse, 16S-1525r
(5’AGAAAGGAGGTGATCCAGGC-3’). Hasil dokumentasi gen penyandi 16SrRNA dari isolat RK2 BPPT CC yang telah dimurnikan ditampilkan pada Gambar
2. Pemurnian dilakukan untuk menghilangkan komponen-komponen sisa PCR
yang dapat mengganggu proses sekuensing.
Sekuensing dilakukan terhadap primer forward (16S-27f) dan primer
reverse (16S-1525r). Hasil sekuensing dikoreksi berdasarkan kromatogram
menggunakan bantuan program BioEdit sehingga diperoleh urutan nukleotida
yang lebih akurat. Berdasarkan primer yang digunakan nukleotida yang dihasilkan
sebenarnya berukuran 1498 pb. Akan tetapi, saat awal pembacaan sekuensing
sekitar 20 pb tidak dapat terbaca dengan baik karena reaksi kimianya belum stabil
sehingga sekitar 40 pb tidak digunakan. Setelah dikoreksi diperoleh urutan
nukleotida sepanjang 1442 pb (Lampiran 4). Urutan nukleotida yang telah
diperoleh selanjutnya digunakan untuk mencari kemiripan sekuennya dengan
database dari GeneBank menggunakan program BLAST di situs
http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Berdasarkan hasil analisis urutan gen penyandi 16SrRNA, isolat ini termasuk ke dalam genus Bacillus dan memiliki kekerabatan
yang dekat dengan B. amyloliquefaciens dan B. subtilis. Untuk memvisualisasikan
hubungan kekerabatannya digunakan pohon filogenetik yang dibuat menggunakan
10
program Phylogeny.fr. Berdasarkan pohon filogenetiknnya (Gambar 4) isolat RK2
BPPT CC mempunyai jarak kekerabatan paling dekat dengan B.
amyloliquefaciens.
B. amyloliquefaciens memang memiliki kekerabatan yang sangat dekat
dengan B. subtilis. Bahkan sampai tahun 1980-an B. amyloliquefaciens masih satu
spesies dengan B. subtilis hingga akhirnya pada tahun 1987 kedua spesies tersebut
berhasil dibedakan menggunakan beberapa cara seperti kromatografi gas-cair
firolisis, analisis perbedaan ciri-ciri fenotip dan berdasarkan profil elektroforesis
enzim yang dihasilkan oleh masing-masing bakteri (Priest et al. 1987).
Isolasi Gen Penyandi Selulase
Tahap awal untuk mengisolasi gen selulase adalah mendesain primer.
Primer didesain menggunakan urutan nukleotida gen seluluse dari spesies B.
amyloliquefacies, B. subtilis, dan Bacillus sp. karena bakteri tersebut memiliki
kekerabatan yang paling dekat dengan isolat RK2 BPPT CC. Urutan nukleotida
yang akan digunakan diunduh dari situs http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Sebanyak
lima nukleotida di-align menggunakan program ClustalW di situs
http://www.genome.jp/tools/clustalw. Daerah yang terkonservasi diambil sebagai
basis untuk mendesain primer (Lampiran 5).
Primer yang berhasil didesain adalah primer degenerated dan masih
memiliki beberapa kekurangan antara lain komposisi basa nukleotida guanin dan
sitosin kurang dari 50% serta Tmnya yang rendah. Rendahnya suhu Tm akan
sangat berpengaruh dalam menentukan suhu annealing (Ta) secara pasti. Suhu
annealing adalah suhu dimana primer akan menempel pada DNA cetakan.
Pencarian konsisi optimal Ta sangat penting karena berkaitan dengan spesifitas
dan sensitifitas proses penempelan primer. Ta yang terlalu tinggi menyebabkan
penempelan primer tidak sensitif sehingga proses amplifikasi tidak terjadi.
Sebaliknya Ta yang terlalu rendah menyebabkan proses penempelan primer tidah
spesifik, primer akan menempel di sisi lain DNA cetakan yang bukan sisi
homolognya sehingga dapat menghasilkan produk PCR yang tidak diinginkan
(Asy’ari dan Noer 2005). Oleh karena itu, amplifikasi gen selulase dilakukan
dengan program PCR Touchdown, yaitu program PCR yang Ta nya mengalami
degradasi suhu di setiap siklusnya. Pada tahap pertama Ta yang digunakan adalah
54 oC dengan degradasi suhu di setiap siklusnya sebesar 0.3 oC sehingga tercapai
Ta sebesar 49.5 oC setelah 25 kali siklus. Program PCR dilanjutkan dengan 9 kali
siklus dengan Ta 46 oC. DNA cetakan yang digunakan adalah DNA genom isolat
RK2 BPPT CC. Hasil PCR yang telah dimurnikan dielektroforesis menggunakan
gel agarose 1% (Gambar 5). Melalui hasil elektroferis dapat dilihat bahwa gen
selulase isolat RK2 BPPT CC memiliki ukuran lebih dari 1500 pb.
Hasil pemurnian selanjutnya disekuesing untuk memastikan bahwa gen
yang teramplifikasi adalah gen selulase. Selain itu hasil sekuensing juga berguna
untuk mengetahui situs-situs pemotongan enzim restriksi yang terdapat di dalam
gen selulase. Situs-situs enzim restriksi ini akan sangat berguna untuk proses
rekayasa genetika. Hasil sekuensing tersebut di-BLAST untuk melihat tingkat
kesamaannya dengan nukleotida penyandi selulase dari bakteri lain (Gambar 6).
Hasilnya menunjukkan urutan nukleotida hasil sekuensing memiliki tingkat
kesamaan yang tinggi dengan bakteri B. Subtilis dan B. amyloliquefaciens dengan
tingkat kemiripan 99%. Hal ini menunjukkan bahwa gen yang yang teramplifikasi
11
adalah gen selulase dan primer yang didesain dapat digunakan untuk mengisolasi
gen selulase tersebut.
Sekuen gen selulase juga dapat digunakan untuk memprediksi sekuen asam
amino dan struktur tersier selulase isoalat RK2 BPPT CC. Prediksi struktur tersier
selulase isolat RK2 BPPT CC dilakukan dengan salah satu metode pemodelan
protein komparatif yaitu pemodelan homologi. Pada metode ini struktur protein
target ditentukan berdasarkan protein lain yaitu protein templat yang sudah
diketakui struktur tersiernya. Protein templat yang dipilih adalah protein yang
memiliki kemiripan sekuens terbesar dengan sekuen protein target. Templat yang
digunakan adalah selulase dari B. subtilis 168 karena sekuens nya memiliki skor
alignment terbesar dibanding selulase bari bakteri lain yang ada di Protein Data
Bank (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) (Lampiran 9). Nomor akses
sekuen asam amino selulase B. subtilis 168 adalah P10475 sedangkan nomor
akses sekuen lain yang digunakan sebagai pembanding adalah Q59232, Q85465,
Q86099, dan Q9X273. Proses pemodelan dilakukan menggunakan bantuan
program di situs http://swissmodel.expasy.org. Model protein yang dipilih adalah
model protein yang memiliki nilai QMEAN Z atau nilai kualitas yang paling baik.
Hasil pemodelan diunduh dalam bentuk file dengan tipe pdb sehingga dapat
dilakukan analis setrukturnya. Analalis struktrur enzim selulase dilakukan dengan
program VMD (Gambar 7). Hasil analisis menunjukkan bahwa ujung N ada di
asam amino nomor 12 dengan residu asparagin, sedangkan ujung C diisi oleh
asam amino glisin pada urutan ke 304. Melalui gambar tersebut juga dapat
ditentukan jumlah α-heliks (berbentuk tabung warna ungu) dan β-pleated sheet
(berbentuk panah berwarna kuning) yang menyusun selulase isolat RK2 BPPT CC.
Gambar 7 menunjukkan bahwa selulase isolat ini tersusun atas delapan rantai αheliks dan sebelas rantai β-pleated sheet.
SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Identifikasi isolat RK2 BPPT CC menggunakan gen penyandi 16S-rRNA
menunjukkan bahwa isolat ini memiliki kekerabatan terdekat dengan B.
amyloliquefaciens. Gen selulase berhasil diisolasi menggunakan primer yang telah
didesain dan memiliki tingkat kemiripan 99% dengan gen selulase dari B. subtilis
dan B. amyloliquefaciens.
Saran
Perlu dilakukan karakterisasi sifat-sifat biokimia terhadap isoalat RK2
BPPT CC. Selain itu perlu dilakukan penelitian biologi molekuler seperti kloning
gen selulase dari isolat ini ke vektor ekspresi yang potensial sehingga gen selulase
ini dapat terekspresi dengan lebih baik.
12
DAFTAR PUSTAKA
Ariffin H, Abdullah N, Kalsom MSU, Shirai Y, Hassan MA. 2006. Production
and characterisation of cellulase by Bacillus pumilus Eb3. I J of Eng. 3:47-53.
Asy’ary M, Noer As. 2005. Optimasi konsentrasi MgCl2 dan suhu annealing pada
proses amplifikasi multifragments mtDNA dengan metode PCR. JKSA. 3: 2425.
Bakti C P. 2012. Optimasi produksi enzim selulase dari Bacillus sp BPPT CC
RK2 dengan variasi pH dan suhu menggunakan response surface methodology
[skripsi]. Depok (ID): Universitas Indonesia.
Brown T. 2001. Gene cloning and DNA Analysis: an Introduction, 5th Ed.
Australia: Blackwell Publishing Asia Pty Ltd. 29-30
Cavalier-Smith T. 1985. Eukaryotic gene numbers, non-coding DNA, and genom
size. Di dalam: Calier-Smith, editor. The Evolution of Genome Size.
Chichester: John Wiley.
Clark DP, Pazdernik NJ. 2009. Biotechnologi Applying the Genetic Revolution.
Elsevier Press. 60-61
Don R H, Cox PT, Wainwright BJ, Baker K, Mattick JS. 1991. ‘Touchdown’ PCR
to cirkumvent spurious priming during gene amplification. Nucleic Acids Res.
19: 4008
Gerhartz W. 1990. Enzyme in industry : production and applications. Starch.
43:161
Howard RL, Abotsi EJ, van Rensburg EL, Howard S. 2003. Lignocellulose
biotechnology: issue of bioconversion and enzyme production. African J
Biotech. 2: 602-619.
Kunst F, Ogasawara N, Moszer I, Albertini AM, Alloni G, Azevedo V, Bertero
MG, Bessières P, Bolotin A, Borchert S et al. 1997. The complete genome
sequence of the gram-positive bacterium Bacillus subtilis. Nature. 390: 249256.
Nguyen VT, Quyen DT. 2010. Optimazing culture conditions for the production
of endo-1,4-glucanase by Aspergillus awamori strain vietnam type culture
collection (vtcc)-f099. J Biotechnol. 9:6337-6344.
Priest FG, Goodfellow M, Shute LA, Berkeley RCW. 1987. Bacillus
amyloliquefacies sp. nov., nom. rev. I J Systematic Bacteriol. 37: 69-71
Richana N, Irawadi TT, Nur A, Syamsu K. 2008. Isolasi identifikasi bakteri
pengkasilxilanase serta karakterisasi enzimnya. J AgroBiogen. 4: 24-34
Sambrook J, Russell D. 2001. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.
New york: Col Spring Harbor Laboratory Press.
Saputra A. 2008. Analisis ukuran kromosom dan pola restriksi Bacillus
thuringiensis dengan elektroforesis medan berpulsa [skripsi]. Bogor (ID):
Institut Pertanian Bogor.
Sukumaran RK, Singhania RR, Pandey A. 2005. Mikrobial cellulase production,
applications and challenges. Scientific & Industrial Research. 64: 823-844.
Weisbur WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ. 1991. 16S ribosomal DNA
amplification for phylogenetic study. J Bacteriol. 173: 697-703.
13
Lampiran 1 Diagram alir penelitian
Studi Literatur
Pembuatan Media dan Kultur Bakteri
Isolasi DNA Genom
Analisis gen penyandi 16S-rRNA
Sekuensing
Elektroforesis
BLAST
Perancangan primer
PCR untuk Amplifikasi
Gen Selulase
Sekuensing
BLAST
Elektroforesis
14
Lampiran 2 Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA pimer 27 f
15
Lampiran 3 Sekuensing gen penyandi 16S-rRNA primer 1525 r
16
Lampiran 4 Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi 16S-rRNA isolat
RK2 BPPT CC
GTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACC
TGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTT
CAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGT
AACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACAC
GGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACG
CCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAAT
AGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATAC
GTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGT
GAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGG
AATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGT
CTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCG
TAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCC
GCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCA
TGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATA
GGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTG
GGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGA
CTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTAC
ACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTT
CTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT
GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGA
AGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGA
Lampiran 5 Hasil alligment gen selulase Bacillus
17
Lampiran 6 Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer forward
18
Lampiran 7 Sekuensing gen selulase isolat RK2 BPPT CC primer reverse
19
Lampiran 8 Susunan nukleotida hasil sekuensing gen penyandi selulase isolat
RK2 BPPT CC
CATCTGCAGCAGGGACAAAAACGCCAGCAGCCAAGAATGGTCAGCTTAGCATAAAAGGAACA
CAGCTCGTAAACCGGGACGGCAAAGCGGTACAATTGAAAGGGATCAGTTCACATGGACTGCA
ATGGTATGGCGATTTCGTCAATAAAGACAGCTTAAAATGGCTGAGAGACGATTGGGGCATAA
CCGTTTTCCGCGCGGCGATGTATACGGCAGACGGCGGTTATATTGATAATCCGTCCGTGAAA
AATAAAGTAAAAGAAGCGGTTGAAGCGGCAAAAGAACTTGGGATATATGTCATCATTGACTG
GCATATCTTAAATGACGGCAACCCAAACCAACATAAAGAGAAGGCAAAAGAATTTTTTAAGG
AAATGTCAAGTCTTTACGGAAACACGCCAAACGTCATTTATGAAATTGCAAACGAACCAAAC
GGTGATGTGAACTGGAAGCGTGATATTAAACCGTATGCGGAAGAAGTGATTTCCGTTATCCG
CAAAAATGATCCAGACAACATCATTATTGTCGGAACCGGTACATGGAGCCAAGATGTGAATG
ATGCAGCCGATGATCAGCTAAAAGATGCAAACGTCATGTACGCGCTTCATTTTTATGCCGGC
ACACACGGCCAATCTTTACGGGATAAAGCAAACTATGCACTCAGTAAAGGAGCGCCTATTTT
CGTGACGGAATGGGGAACAAGCGACGCGTCTGGAAATGGCGGTGTATTCCTTGACCAGTCGC
GGGAATGGCTGAATTATCTCGACAGCAAGAACATCAGCTGGGTGAACTGGAATCTTTCTGAT
AAGCAGGAATCATCCTCAGCGTTAAAGCCGGGAGCATCTAAAACAGGCGGCTGGCCGCTTAC
AGATTTAACTGCTTCAGGAACATTCGTAAGAGAAAACATTCTCGGCAACAAAGATTCAACGA
AAGAACGCCCTGAAACGCCAGCACAAGATAACCCCGCACAGGAAAACGGCATTTCTGTACAA
TACAAAGCAGGGGATGGGGGTGTGAACAGCAACCAAATCCGCCCGCAGCTTCACATAAAAAA
TAACGGCAATGCGACGGTTGATTTAAAAGATGTCACTGCCCGTTACTGGTATAACGCGAAAA
ACAAGGGCCAAAACTTTGACTGTGACTACGCGCAGATTGGATGCGGCAATCTGACCCACAAA
TTTGTGACGCTGCATAAACCTAAGCAAGGTGCAGATACCTATCTGGAACTGGGTTTTAAAAC
AGGAACGCTGTCACCGGGAGCAAGCACAGGGAATATTCAGCTTCGTCTTCACAATGATGACT
GGAGTAATTATGCACAAAGCGGCGATTATTCCTTTTTTCAATCAAATACGTTAAAACAACGA
AAAAAA
Lampiran 9 Alignment score selulase isolat RK2 BPPT CC
Lampiran 10 Urutan asam amino hasil translasi gen selulase isolat RK2 BPPT CC
SAAGTKTPAAKNGQLSIKGTQLVNRDGKAVQLKGISSHGLQWYGDFVNKDSLKWLRDDWGITV
FRAAMYTADGGYIDNPSVKNKVKEAVEAAKELGIYVIIDWHILNDGNPNQHKEKAKEFFKEMS
SLYGNTPNVIYEIANEPNGDVNWKRDIKPYAEEVISVIRKNDPDNIIIVGTGTWSQDVNDAAD
DQLKDANVMYALHFYAGTHGQSLRDKANYALSKGAPIFVTEWGTSDASGNGGVFLDQSREWLN
YLDSKNISWVNWNLSDKQESSSALKPGASKTGGWPLTDLTASGTFVRENILGNKDSTKERPET
PAQDNPAQENGISVQYKAGDGGVNSNQIRPQLHIKNNGNATVDLKDVTARYWYNAKNKGQNFD
CDYAQIGCGNLTHKFVTLHKPKQGADTYLELGFKTGTLSPGASTGNIQLRLHNDDWSNYAQSG
DYSFFQSNTLKQRKK
20
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Lampung pada tanggal 23 Maret 1992 dari ayah
Kodirun dan ibu Jariyah. Penulis merupakan putri keenam dari enam bersaudara.
Tahun 2009 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Gadingrejo dan pada tahun yang
sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Penulis diterima di Program Biokimia, Departemen Biokimia, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti program S1 di IPB
penulis pernah bergabung dengan perkumpulan mahasiswa pencinta alam IPB
(Lawalata) dan Gentra Kaheman pada 2009-2010. Tahun 2010-2011 penulis
bergabung dengan organisasi SERUM-G (Serambi Rukhiyah Mahasiswa
FMIPA). Pada tahun 2012 penulis melaksanakan praktik lapangan di Pusat
Penelitian Biologi LIPI, Bogor dengan judul Biodegradasi Asetonitril oleh
Bakteri Konsorsia yang Diisolasi dari Berbagai Limbah.