Isolats Bakteri Indigenous Penghasil Milk-Clotting Protease untuk Fermentasi Keju
Vol. 9, No.2 Desember 2013
Enzyme-Linked lmmunosorbe.nt Assay for Detection of lnfecrious Bronchitis Antibody in
159
. Chickens using Local Isolate of PTS II1
Risa Indriani & NLP. Indi Dharmayanri
Karakterisasi Genetik Ternpuyung (Sonchus arvemis L.) Berdasarkan Penanda Molekuler
167
Sequence-Related Amplified Polymorphism
Dyah Subosiri & Rohiuat Mujabid
Karakteristik Populasi Labi-Iabi Amyda cartilaginea (Boddaerr, 1770) yang Tenangbp di
175
Sumatera Selatan
Agus Arifin Senrosa, Danu Wijaya & Asrri Suryandari
Pengarnh Jalan Terhadap Keragaman Jenis Tumbllhan Bawah dao Habitarnya cli Koridor
ＱＸｾ＠
Taman Nasiona! Gunung Halimun Salak, Jawa Barat
Jyan Robiansyah & Danang W. Purnomo
lso.lar Bakreri Indigenous Penghasil Milk-CLotting Protease Llntllk Fermenrasi Kejll
199
Nanik Rabmani, Yana Nurita Sari, Nurheni Sri Palupi & Yopi
Preferensi Ekologis Jenis-Jenis Tllmbuhan Dominan di Gunung Endur Barnen
209
EN. Sambas, C. Kllsmana, LB. Prasetyo & T. Partomihardjo
Perrumbuhan dan Procluksi Jagung PlIlur Loka! Sulawesi Selatan yang Ditanam di Polibag
219
Pada Berbagai K.ornbinasi Perlakuan Pupuk Organik
Tid Juhaeti, N Hidayati & M Rahmansyah
Kajian Pemilihan Jenis Twnbuhan Unrllk Restorasi Huran Berclasarkan Beberapa
Parameter FO[Qsinresis
Tinia ley!! Shofia Ahmad, Dede Seriadi, & Diclik Widyannoko
Diterbitkan olcb:
PERHlMPUNAN BIOLOG[ INDONESIA
Bekcrjasama (Iengan
PUSUT BlOLOGI - UPI
23.3
Jurnal Biologi Indonnesia 9(2): 199-208 (2013)
Isolats Bakteri Indigenous Penghasil Milk-Clotting Protease untuk
Fermentasi Keju
(Isolates of Indigenous Bacteria Producing Milk-Clotting Protease for Cheese
Fermentation)
Nanik RahmanP, Yana Nurita Sari2 , Nurheni Sri Palupi2 & YopP
ILaboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang Bioproses Puslit Bioteknologi-LIPI, JI. Raya Bogor Km. 46, Cibinong 169011, E-mail: rahmani_btk@yahoo.com
2Departemen Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pangan , Insriwt Pertanian Bogor
Memasukkan: Februari 2013, Diterima: April 2013
ABSTRACT
The aims of this research is to isolation of bacteria that potential to produce of milk clotting protease enzymes from
fermented food that will be used as a substitute for rennet in cheese making. 1here are five food fermentations such
as tauco, tempeh, red oncom, sticky tape, and pickled mustard greens that are used as a source for isolation of bacteria that could produce milk clotting protease. 1he results obtained four isolates proteolytic bacteria from two fermented food samples, three isolates bacteria from tauco (TeN 1, TeN 2, TeN 3) and one isolate from pickled
mustard greens (DSN I). Based on 16S rONA, these isolates were identified as Bacillus sp. Bacterial isolate TeN 1
has a milk clotting activity of29.17 U/mL, whereas bacteria isolates of TeN 2, TeN 3 and DSN 1 have activities of
70 U/mL achieved at the 24 hours incubation, respectively. 1he proteolytic activities of bacteria isolates TeN 1,
TeN 2, TeN 3 and DSN 1 at the 24 hours fermentation process were 0.0117 U/mL, 0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL,
and 0.200 U/mL , respectively. The ratio of milk clotting protease activity and the proteolytic activity for bacteria
isolates TeN 1, TeN 2, TeN 3 and DSN respectively were 5402, 175000, 7292, and 3333. 111is showed that the
enzyme from bacterial isolates TeN 2 can be used as an alternative to rennin in cheese making.
Keywords: milk clotting protease, cheese, calf rennet, fermentation food
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi bakteri penghasil enzim milk clotting protease dari pangan fermentasi
yang akan dimanfaatkan sebagai pengganti rennin dalam pembuatan keju. Ada lima pangan fermentasi yaitu tauco,
tempe, oncom merah, tape ketan, dan asinan sawi yang digunakan sebagai sumber bakteri penghasil enzim milk clotting protease. Dari hasil isolasi diperoleh em pat isolat bakteri proteolitik dari dua sampel pangan fermentasi , yakni
tiga isolat bakteri dari tauco (TeN 1, TeN 2, TeN 3) dan saw isolat bakteri dari asinan sawi (DSN I). Berdasarkan
analisa 16S rONA, keempat isolate tersebut diidentifikasi termasuk dalam kelompok Bacillus sp. Isolat bakteri TeN
1 memiliki aktivitas penggumpalan susu sebesar 29.17 U/mL sedangkan isolat bakteri TeN 2, TeN 3 dan DSN 1
memiliki aktivitas masing-masing 70 U/mL yang seluruhnya dicapai pada jam ke-24 inkubasi. Isolat bakteri TeN 1,
TeN 2, TeN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas protease pada jam ke-24 berturut-turut sebesar 0.0117 U/mL,
0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL, dan 0.200 U/mL. Rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease untuk isolat
bakteri TeN 1, TeN 2, TeN 3 dan DSN 1 secara berturut-turut adalah 5402, 175000, 7292, dan 3333. Dari
keempat isolat yang diperoleh menunjukkan bahwa enzim dari isolat bakteri TeN 2 dapat digunakan sebagai alternatif pengganti renin dalam pembuatan keju.
Kata Kunci : protease penggumpal susu, keju, rennet anak sapi, produk pangan fermentasi
PENDAHULUAN
rna yang banyak digunakan dalam produksi keju
sebagai reagen milk-clotting (Isam et
at.
2009).
Penggumpalan susu merupakan tahap
Renet tidak hanya berfungsi sebagai penggumpal
kunci dalam industri pembuatan keju dan enzim
susu tetapi juga memainkan peran penting selama
milk-clotting protease memainkan peran utama
proses pematangan keju yang merupakan proses
dalam proses tersebut. Calf rennet yang mengan-
utama dan komplek dalam pembentukan cita rasa
dung chymosin (EC 3.4.23.4) termasuk aspartate
dan tekstur dari keju (Vioque et
protease yang merupakan komponen enzim uta-
Makata 2002, Kumar et
at. 2000, Sausa &
at. 2005).
Beberapa studi
199
Rahmani, dkk.
telah dilakukan berkaitan dengan enzim milk clot-
red kojic rice, salah satu makanan tradisional Chi-
ting yang berasal dari mikroorganisme untuk ap-
na (Zhang et aL. 2011).
likasi dalam pembuatan keju (Poza et aL. 2003;
Oini et aL. 2010).
Penelitian isolasi mikroba penghasil protease dan karakternya sudah banyak dilakukan di
Oalam industri pembuatan keju secara
Indonesia, sedang untuk isolasi protease jenis milk
tradisional banyak menggunakan renet dari anak
clotting sebagai pengganti rennet masih sedikit
sapi. Penggumpalan susu oleh renet dari anak sapi
(Nunuk et aL. 2001) . Untuk tujuan produksi keju
terjadi akibat pemecahan ikatan Phe 105-Met 106
diperlukan penggunaan renin yang memiliki ak-
pada ikatan K-casein menghasilkan glikopeptida
tivitas milk clotting tinggi (MCA) dan PA yang
hidrofilik rantai pendek (106-169 residll) yang
rendah untuk meminimalkan larutnya curd (Wu
dilepas ke dalam whey. Para- K -casein menj adi
et al. 2008) . Oleh karena itu, dalam penelitian ini
bermuatan positif pada pH netral dan menyebab-
dipaparkan satu usaha untuk mencari pengganti
kan penurunan ikatan diantara micelle casein yang
renet, dengan melakukan proses isolasi enzim
menyebabkan agregasi (Green 1973).
milk clotting protease yang berasal dari produk
Penggunaan renet yang berasal dari anak
sapi berkaitan dengan masalah etika, sehingga
pangan fermentasi yang ban yak terdapat di Indonesia.
diperlukan usaha mencari alternatif substitusi renet yang berasal dari mikroorganisme yaitu enzim
BAHAN DAN CARA KERJA
milk clotting protease (Tubesha & Al-Oelaimy,
2003; Cavalcanti et aL. 2004) .
Sampel yang digunakan sebagai sumber
Produksi enzim milk clotting protease telah
isolat adalah produk pangan fermentasi antara
dilaporkan dari beberapa mikroorganisme seperti
lain sawi asin, oncom, tauco, tempe, dan tape
Penicillium oxalium (Hashem 2000), Nocardiopsis
ketan. Sampel dihancurkan hingga homogen, lalu
sp (Cavalcanti et aL. 2004) , Mucor circinelloides
diukur pH-nya. Masing-masing sam pel ditimbang
(Sathya et aL. 2009) dan Bacillus amyloliquefaciens
sebanyak 0.25 g dan disimpan pada suhu refriger-
04 (He at aL. 2011) . Beberapa mikroba yang po-
ator. Untuk sawi asin, diambil juga sampel airnya
tensial menghasilkan enzim milk clotting protease
untuk isolasi bakteri sebanyak 0.25 mL. Proses
dan potensial sebagai subtitusi calf rennet, yaitu
persiapan sampel dilakukan secara aseptis.
Penicillium oxalicum (Hashem, 2000) dan Nocar-
Media pertumbuhan bakteri menggunakan
diopsis sp (Cavalcanti et al. 2004). Untuk saat ini
medium Nutrient
produksi keju di dunia menggunakan sepertiga
penghasil enzim penggumpal susu menggunakan
renet dari mikroba yang berasal dari mikroorgan-
skim milk agar. Sample dari 5 produk fermentasi
isme jenis kapang (Preetha & Boopathy, 1994).
sebanyak 0.25 g dan 0.25 mL sample cair produk
Banyak peneliti telah memfokuskan untuk
melakukan isolasi
kllngan
tertentu
mikroorganisme dari linguntuk
mendapatkan
enzim
Broth
dan
isolasi bakteri
fermentasi sawi, masing-masing dimasukkan ke
dalam tabung reaksi yang telah berisi 2.5 mL medium Nutrient Broth untuk pertumbuhan bakteri.
dengan aktivitas milk clotting protease yang tinggi
Inkubasi
dan aktivitas protease yang rendah at au per-
menggunakan shaker incubator dengan kecepatan
bandingan aktivitas milk clotting protease terhadap
150 rpm. Oari media pertumbllhan bakteri selan-
protease yang tinggi (He et aL. 2011) . Salah satu
jutnya dibuat pengenceran bertingkat (l0-QO-5)
diantaranya isolasi enzim milk clotting protease dari
masing-masing sebanyak 1 mL dan di inoku-
200
selama 24
jam
pada suhu
ruang
Isolat Baktcri lruJigenous Pcnghasil Mille-Clotting Protease
lasikan kedalam media padat. Bakteri penghasil
Aktivitas penggumpalan susu ditentukan ber-
enzim milk clotting protease diskrining dengan
dasarkan uji visual dari pembentukan gumpalan
menggunakan media skim milk agar. Isolat yang
susu pertama kali akibat penambahan enzim yang
memberikan zona bening selanjutnya diukur in-
dinotasikan dalam Soxhlet Unit (SU) . Satu SU
dek proteolitiknya dan selanjutnya diuji poten-
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat
sinya sebagai penghasil enzim milk clotting prote-
menggumpalkan 1 mL campuran yang mengan-
ase.
dung 0.1 g susu skim dan 0.001 g CaCl 2 dalam
Identifikasi bakteri dilakukan secara mole-
40 menit pada suhu 35"C (Arima et al. 1970).
kuler dengan menganalisis sebagian gen 16S
Sebanyak 0.5 mL enzim ditambahkan ke dalam 5
rDNAnya. Gen 16S rONA diamplifikasi dengan
mL susu skim (10 g susu skim/100 mL 0.01 M
menggunakan primer 9F (5'-AGRGTTTGAT
CaCl 2) yang telah diinkubasi pada suhu 40°C sela-
CMTGGCTCAG-3') and 1492R (5'-ACGGYTA
rna 5 menit. Campuran tersebut diaduk hingga
CCTTGTTAYGACTT-3').
dil-
terbentuk gumpalan. Pengukuran aktivitas enzim
akukan dengan campuran reaksi yang mengan-
milk-clotting menggunakan persamaan berikut ini:
dung DNA bakteri, primer 9F dan 1492R mas-
(MCA)
ing-masing 10 pmol 2
(promega) 26 ｾｉ＠
ｾｉＬ＠
Amplifikasi
=
2400 x 5 x 0
T x 0,5
larutan Go T aq
serta ddH20 20 ｾＱＮ＠
Adapun
kondisi reaksi PCR ialah 95 oC, 2 menit (1 siklus); 95 °C, 30 detik, 65 oC, 1 menit, 72 oc, 2
Kctcrangan:
MCA= aktivitas enzim milk-clotting (SU)
T
=
waktu pertama kali terbentuk gumpalan susu (detik)
o = faktor pengenceran
menit (10 siklus); 95 oc, 30 detik, 55 oc, 1 men-
Aktivitas
protease ditentukan
melalui
it, 72 oC, 2 menit (30 siklus) serta 72 oC, 2 menit
metode standar Lowry yang dimodifikasi (Meloan
(1 siklus) . PCR produk disequensing di First Base
& Pomeranz 1973). Sebanyak 0.2 ml substrat
Malaysia. Hasil sekuen selanjutnya dibandingkan
kasein
dengan database di Gen Bank menggunakan
dengan 0.1 mL larutan enzim kasar, kemudian
BLAST algorithm.
dicampur dan diinkubasi di shaker incubator sela-
Produksi enzim dilakukan dengan metode
dengan
konsentrasi
rna 20 menit pada suhu
0.1 % direaksikan
3rc. Setelah diinkubasi
fermentasi cair. Isolat bakteri dikulturkan pada
selama 20 men it, larutan reaksi tersebut ditambah
media Nutrient Broth yang telah ditambahkan
0.24 mL 0.4 M TCA, dicampur dan diinkubasi
substrat kasein lalu diinkubasi menggunakan
pada shaker incubator selama 20 menit pada suhu
shaker incubator pada 150 rpm, suhu ruang sela-
3rc. Setelah disentrifugasi selama 10 menit pada
rna 5 hari dan dilakukan sampling setiap 24 jam.
kecepatan 10.000 rpm, 0.1 mL supernatan diam-
Hasil sampling kemudian diukur pertumbuhan
bil dan disimpan pada tabung reaksi baru.
selnya menggunakan spektrofotometer pada A
Kemudian ditambahkan 0,5 mL 0.4 M Na2C03
660 nm. Hasil sampling tersebut disentrifugasi
dan 0.1 mL fenol folin, dihomogenkan dengan
pada 10.000 rpm selama 10 men it, kemudian
vorteks dan diinkubasi pada suhu
diambil supernatannya sebagai ekstrak enzim
menit. Larutan reaksi diukur absorbansinya pada
kasar untuk dianalisa aktivitas milk clotting prote-
A 660 nm dan diukur aktivitas proteasenya
ase (Milk clotting activity: MCA), aktivitas proteo-
dengan menggunakan rum us dibawah ini. Satu
litiknya (Proteolytic activity: PA) serta rasio aktivi-
unit (U) aktivitas protease didefinisikan sebagai
tas milk clotting protease terhadap protease
jumlah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi
3rC selama 20
(MCNPA).
201
Rahmani, dkk.
pelepasan 1 ｾｬｭｯ＠
Analisis sebagian gen 16S rDNA Bakteri
tirosin per menit
Aktivitas protease (PA) = X x FP x _IN x T
Amplifikasi
Keterangan :
sebagian
gen
165
rONA menghasilkan produk sekitar 1500 bp
PA
=
Protease activity (U/mL)
X
=
Konsentrasi enzim (mg/mL)
FP
=
Fakror pengenceran
V
=
Volume enzim yang dianalisis (mL)
=
waktu inkubasi (menit)
T
daerah
(Gambar 3). Analisis homologi untuk masingmasing isolat bisa dilihat pada Tabel 3.
Perhitungan rasio aktivitas penggumpalan
susu terhadap protease
Pengukuran Aktivitas Enzim dan Seleksi Isolat
Bakteri
Kurva Pertwnbuhan Isolat Bakteri
menggunakan rumus
Hasil pengukuran pertumbuhan sel pada
perhitungan pada persamaan berikut ini (Arima et
A 660 nm ditunjukkan pada Gambar 4. Empat
aL. 1%7) :
isolat bakteri memiliki profil pertumbuhan yang
R=MCA
sarna dengan pertumbuhan sel tertinggi pada jam
PA
ke-24.
Keterangan :
R: Rasio aktivitas penggumpulan susu terhadap protease
MeA : Milk Clotting Activity; Aktivitas penggumpalan
Data aktivitas milk clotting protease dari
susu (SU/mL)
PA
Aktivitas Enzim Penggumpal Susu
keempat isolat bakteri bisa dilihat pada Gambar
: Protease Activity ; Aktivitas protease (U/mL)
5. Pembentukan gumpalan susu oleh adanya ak-
HASIL
tivitas enzim milk clotting protease bisa dilihat pada Gambar 6. Tiga isolat bakteri dari produk fer-
Isolasi Bakteri dari Pangan Fermentasi
mentasi tau co memiliki aktivitas penggumpalan
Isolasi dilakukan terhadap lima sampel pangan
susu lebih tinggi dibanding isolat bakteri D5N
fermentasi yaitu tauco, tempe, oncom merah, tape
dari produk fermentasi sawi, meskipun proses
ketan, dan asinan sawi (Gambar 1).
penggumpalan susu optimum diperoleh setelah
24 jam.
Tabe11.
Ciri morfologi 4 bakteri hasil isolasi dari 5 produk fermentasi
No.
holat Bakteri
Sumber
TeN 1
Tauco
2
TeN 2
Tauco
3
TeN 3
Tauco
4
DSN 1
Asinan saw i
A B C
Gambar 1.
Ciri Koloni
benruk bulat. ukuran medium. berwarna putih opaqu e.
tepian entire
bentuk tidak b e raturan. ukuran large. berwarna putih
opaque. tepian undulate
ben tuk tidak ber a turan . ukuran large. berwarna
translusens. tepian undulate
bentuk bulat. ukuran large. berwarna putih opaque.
tepian undulate
0
E
Sampel pangan fermentasi yang digunakan sebagai sumber isolat: oncom merah (a), tempe (b), tape
ketan (c), tau co (d), asinan sawi (e)
202
Isolat Bakteri Indigenous PenghasU Milk-Clotting Protease
Aktivitas protease dan rasio aktivitas penggumpulan susu
Hasil uji aktivitas proteolitik terhadap 4
i isolat
Zona
-...;;.;;=......
ＭＫＮｾ＠
isolat bakteri menunjukkan hasil yang berbeda
dengan profil aktivitas penggumpalan susu. Satu
isolat bakteri produk fermentasi tauco yaitu
TCN2 menunjukkan aktivitas proteolitik paling
Gambar 2. Contoh zona bening dari isolat bakteri
kecil dibanding 3 isolat bakteri lainnya. Aktivitas
TCN 2 pada medium skim milk agar
tertinggi di peroleh oleh isolat bakteri TCN 1
dengan aktivitas sekitar 0.02 U/mL (Gambar 7).
penggumpalan susu tertinggi dibanding 3 isolat
Isolat yang telah diuji aktivitas penggumpalan
bakteri lainnya.
susu dan proteasenya kemudian dihitung rasio
aktivitas penggumpalannya terhadap protease.
PEMBAHASAN
Hasil perhitungan rasio enzim penggumpal susu
terhadap protease dari keempat isolat bakteri
dapat dilihat pada Tabel4. Tabel4 menunjukkan
bahwa
isolat
bakteri
TCN2
memiliki
rasio
Medium isolasi untuk memperoleh koloni
tunggal menggunakan medium selektif susu skim
agar yang umum digunakan untuk memperoleh
Tabel 2. Indeks Protease 4 bakteri hasil isolasi dari 5 produk fermentasi
No.
1
TeN 1
2
TeN 2
3
4
TeN 3
Diameter zona
bening (em)
1.30
1.60
1.20
1.40
D lam eter i.olate
bakteri (em)
0.40
0.40
0.40
0.40
Isolat B abed
DSN 1
2.0
2.0
.:;; 1.5
c
1.5
.
ｾ＠
'-
1.0
"----r
Indeks Protease
3.25
4.00
3.00
3.50
｛ ｾ＠
1.0
.Q
Enzyme-Linked lmmunosorbe.nt Assay for Detection of lnfecrious Bronchitis Antibody in
159
. Chickens using Local Isolate of PTS II1
Risa Indriani & NLP. Indi Dharmayanri
Karakterisasi Genetik Ternpuyung (Sonchus arvemis L.) Berdasarkan Penanda Molekuler
167
Sequence-Related Amplified Polymorphism
Dyah Subosiri & Rohiuat Mujabid
Karakteristik Populasi Labi-Iabi Amyda cartilaginea (Boddaerr, 1770) yang Tenangbp di
175
Sumatera Selatan
Agus Arifin Senrosa, Danu Wijaya & Asrri Suryandari
Pengarnh Jalan Terhadap Keragaman Jenis Tumbllhan Bawah dao Habitarnya cli Koridor
ＱＸｾ＠
Taman Nasiona! Gunung Halimun Salak, Jawa Barat
Jyan Robiansyah & Danang W. Purnomo
lso.lar Bakreri Indigenous Penghasil Milk-CLotting Protease Llntllk Fermenrasi Kejll
199
Nanik Rabmani, Yana Nurita Sari, Nurheni Sri Palupi & Yopi
Preferensi Ekologis Jenis-Jenis Tllmbuhan Dominan di Gunung Endur Barnen
209
EN. Sambas, C. Kllsmana, LB. Prasetyo & T. Partomihardjo
Perrumbuhan dan Procluksi Jagung PlIlur Loka! Sulawesi Selatan yang Ditanam di Polibag
219
Pada Berbagai K.ornbinasi Perlakuan Pupuk Organik
Tid Juhaeti, N Hidayati & M Rahmansyah
Kajian Pemilihan Jenis Twnbuhan Unrllk Restorasi Huran Berclasarkan Beberapa
Parameter FO[Qsinresis
Tinia ley!! Shofia Ahmad, Dede Seriadi, & Diclik Widyannoko
Diterbitkan olcb:
PERHlMPUNAN BIOLOG[ INDONESIA
Bekcrjasama (Iengan
PUSUT BlOLOGI - UPI
23.3
Jurnal Biologi Indonnesia 9(2): 199-208 (2013)
Isolats Bakteri Indigenous Penghasil Milk-Clotting Protease untuk
Fermentasi Keju
(Isolates of Indigenous Bacteria Producing Milk-Clotting Protease for Cheese
Fermentation)
Nanik RahmanP, Yana Nurita Sari2 , Nurheni Sri Palupi2 & YopP
ILaboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Bidang Bioproses Puslit Bioteknologi-LIPI, JI. Raya Bogor Km. 46, Cibinong 169011, E-mail: rahmani_btk@yahoo.com
2Departemen Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pangan , Insriwt Pertanian Bogor
Memasukkan: Februari 2013, Diterima: April 2013
ABSTRACT
The aims of this research is to isolation of bacteria that potential to produce of milk clotting protease enzymes from
fermented food that will be used as a substitute for rennet in cheese making. 1here are five food fermentations such
as tauco, tempeh, red oncom, sticky tape, and pickled mustard greens that are used as a source for isolation of bacteria that could produce milk clotting protease. 1he results obtained four isolates proteolytic bacteria from two fermented food samples, three isolates bacteria from tauco (TeN 1, TeN 2, TeN 3) and one isolate from pickled
mustard greens (DSN I). Based on 16S rONA, these isolates were identified as Bacillus sp. Bacterial isolate TeN 1
has a milk clotting activity of29.17 U/mL, whereas bacteria isolates of TeN 2, TeN 3 and DSN 1 have activities of
70 U/mL achieved at the 24 hours incubation, respectively. 1he proteolytic activities of bacteria isolates TeN 1,
TeN 2, TeN 3 and DSN 1 at the 24 hours fermentation process were 0.0117 U/mL, 0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL,
and 0.200 U/mL , respectively. The ratio of milk clotting protease activity and the proteolytic activity for bacteria
isolates TeN 1, TeN 2, TeN 3 and DSN respectively were 5402, 175000, 7292, and 3333. 111is showed that the
enzyme from bacterial isolates TeN 2 can be used as an alternative to rennin in cheese making.
Keywords: milk clotting protease, cheese, calf rennet, fermentation food
ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk melakukan isolasi bakteri penghasil enzim milk clotting protease dari pangan fermentasi
yang akan dimanfaatkan sebagai pengganti rennin dalam pembuatan keju. Ada lima pangan fermentasi yaitu tauco,
tempe, oncom merah, tape ketan, dan asinan sawi yang digunakan sebagai sumber bakteri penghasil enzim milk clotting protease. Dari hasil isolasi diperoleh em pat isolat bakteri proteolitik dari dua sampel pangan fermentasi , yakni
tiga isolat bakteri dari tauco (TeN 1, TeN 2, TeN 3) dan saw isolat bakteri dari asinan sawi (DSN I). Berdasarkan
analisa 16S rONA, keempat isolate tersebut diidentifikasi termasuk dalam kelompok Bacillus sp. Isolat bakteri TeN
1 memiliki aktivitas penggumpalan susu sebesar 29.17 U/mL sedangkan isolat bakteri TeN 2, TeN 3 dan DSN 1
memiliki aktivitas masing-masing 70 U/mL yang seluruhnya dicapai pada jam ke-24 inkubasi. Isolat bakteri TeN 1,
TeN 2, TeN 3 dan DSN 1 memiliki aktivitas protease pada jam ke-24 berturut-turut sebesar 0.0117 U/mL,
0.0021 U/mL, 0.0150 U/mL, dan 0.200 U/mL. Rasio aktivitas penggumpalan susu terhadap protease untuk isolat
bakteri TeN 1, TeN 2, TeN 3 dan DSN 1 secara berturut-turut adalah 5402, 175000, 7292, dan 3333. Dari
keempat isolat yang diperoleh menunjukkan bahwa enzim dari isolat bakteri TeN 2 dapat digunakan sebagai alternatif pengganti renin dalam pembuatan keju.
Kata Kunci : protease penggumpal susu, keju, rennet anak sapi, produk pangan fermentasi
PENDAHULUAN
rna yang banyak digunakan dalam produksi keju
sebagai reagen milk-clotting (Isam et
at.
2009).
Penggumpalan susu merupakan tahap
Renet tidak hanya berfungsi sebagai penggumpal
kunci dalam industri pembuatan keju dan enzim
susu tetapi juga memainkan peran penting selama
milk-clotting protease memainkan peran utama
proses pematangan keju yang merupakan proses
dalam proses tersebut. Calf rennet yang mengan-
utama dan komplek dalam pembentukan cita rasa
dung chymosin (EC 3.4.23.4) termasuk aspartate
dan tekstur dari keju (Vioque et
protease yang merupakan komponen enzim uta-
Makata 2002, Kumar et
at. 2000, Sausa &
at. 2005).
Beberapa studi
199
Rahmani, dkk.
telah dilakukan berkaitan dengan enzim milk clot-
red kojic rice, salah satu makanan tradisional Chi-
ting yang berasal dari mikroorganisme untuk ap-
na (Zhang et aL. 2011).
likasi dalam pembuatan keju (Poza et aL. 2003;
Oini et aL. 2010).
Penelitian isolasi mikroba penghasil protease dan karakternya sudah banyak dilakukan di
Oalam industri pembuatan keju secara
Indonesia, sedang untuk isolasi protease jenis milk
tradisional banyak menggunakan renet dari anak
clotting sebagai pengganti rennet masih sedikit
sapi. Penggumpalan susu oleh renet dari anak sapi
(Nunuk et aL. 2001) . Untuk tujuan produksi keju
terjadi akibat pemecahan ikatan Phe 105-Met 106
diperlukan penggunaan renin yang memiliki ak-
pada ikatan K-casein menghasilkan glikopeptida
tivitas milk clotting tinggi (MCA) dan PA yang
hidrofilik rantai pendek (106-169 residll) yang
rendah untuk meminimalkan larutnya curd (Wu
dilepas ke dalam whey. Para- K -casein menj adi
et al. 2008) . Oleh karena itu, dalam penelitian ini
bermuatan positif pada pH netral dan menyebab-
dipaparkan satu usaha untuk mencari pengganti
kan penurunan ikatan diantara micelle casein yang
renet, dengan melakukan proses isolasi enzim
menyebabkan agregasi (Green 1973).
milk clotting protease yang berasal dari produk
Penggunaan renet yang berasal dari anak
sapi berkaitan dengan masalah etika, sehingga
pangan fermentasi yang ban yak terdapat di Indonesia.
diperlukan usaha mencari alternatif substitusi renet yang berasal dari mikroorganisme yaitu enzim
BAHAN DAN CARA KERJA
milk clotting protease (Tubesha & Al-Oelaimy,
2003; Cavalcanti et aL. 2004) .
Sampel yang digunakan sebagai sumber
Produksi enzim milk clotting protease telah
isolat adalah produk pangan fermentasi antara
dilaporkan dari beberapa mikroorganisme seperti
lain sawi asin, oncom, tauco, tempe, dan tape
Penicillium oxalium (Hashem 2000), Nocardiopsis
ketan. Sampel dihancurkan hingga homogen, lalu
sp (Cavalcanti et aL. 2004) , Mucor circinelloides
diukur pH-nya. Masing-masing sam pel ditimbang
(Sathya et aL. 2009) dan Bacillus amyloliquefaciens
sebanyak 0.25 g dan disimpan pada suhu refriger-
04 (He at aL. 2011) . Beberapa mikroba yang po-
ator. Untuk sawi asin, diambil juga sampel airnya
tensial menghasilkan enzim milk clotting protease
untuk isolasi bakteri sebanyak 0.25 mL. Proses
dan potensial sebagai subtitusi calf rennet, yaitu
persiapan sampel dilakukan secara aseptis.
Penicillium oxalicum (Hashem, 2000) dan Nocar-
Media pertumbuhan bakteri menggunakan
diopsis sp (Cavalcanti et al. 2004). Untuk saat ini
medium Nutrient
produksi keju di dunia menggunakan sepertiga
penghasil enzim penggumpal susu menggunakan
renet dari mikroba yang berasal dari mikroorgan-
skim milk agar. Sample dari 5 produk fermentasi
isme jenis kapang (Preetha & Boopathy, 1994).
sebanyak 0.25 g dan 0.25 mL sample cair produk
Banyak peneliti telah memfokuskan untuk
melakukan isolasi
kllngan
tertentu
mikroorganisme dari linguntuk
mendapatkan
enzim
Broth
dan
isolasi bakteri
fermentasi sawi, masing-masing dimasukkan ke
dalam tabung reaksi yang telah berisi 2.5 mL medium Nutrient Broth untuk pertumbuhan bakteri.
dengan aktivitas milk clotting protease yang tinggi
Inkubasi
dan aktivitas protease yang rendah at au per-
menggunakan shaker incubator dengan kecepatan
bandingan aktivitas milk clotting protease terhadap
150 rpm. Oari media pertumbllhan bakteri selan-
protease yang tinggi (He et aL. 2011) . Salah satu
jutnya dibuat pengenceran bertingkat (l0-QO-5)
diantaranya isolasi enzim milk clotting protease dari
masing-masing sebanyak 1 mL dan di inoku-
200
selama 24
jam
pada suhu
ruang
Isolat Baktcri lruJigenous Pcnghasil Mille-Clotting Protease
lasikan kedalam media padat. Bakteri penghasil
Aktivitas penggumpalan susu ditentukan ber-
enzim milk clotting protease diskrining dengan
dasarkan uji visual dari pembentukan gumpalan
menggunakan media skim milk agar. Isolat yang
susu pertama kali akibat penambahan enzim yang
memberikan zona bening selanjutnya diukur in-
dinotasikan dalam Soxhlet Unit (SU) . Satu SU
dek proteolitiknya dan selanjutnya diuji poten-
didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat
sinya sebagai penghasil enzim milk clotting prote-
menggumpalkan 1 mL campuran yang mengan-
ase.
dung 0.1 g susu skim dan 0.001 g CaCl 2 dalam
Identifikasi bakteri dilakukan secara mole-
40 menit pada suhu 35"C (Arima et al. 1970).
kuler dengan menganalisis sebagian gen 16S
Sebanyak 0.5 mL enzim ditambahkan ke dalam 5
rDNAnya. Gen 16S rONA diamplifikasi dengan
mL susu skim (10 g susu skim/100 mL 0.01 M
menggunakan primer 9F (5'-AGRGTTTGAT
CaCl 2) yang telah diinkubasi pada suhu 40°C sela-
CMTGGCTCAG-3') and 1492R (5'-ACGGYTA
rna 5 menit. Campuran tersebut diaduk hingga
CCTTGTTAYGACTT-3').
dil-
terbentuk gumpalan. Pengukuran aktivitas enzim
akukan dengan campuran reaksi yang mengan-
milk-clotting menggunakan persamaan berikut ini:
dung DNA bakteri, primer 9F dan 1492R mas-
(MCA)
ing-masing 10 pmol 2
(promega) 26 ｾｉ＠
ｾｉＬ＠
Amplifikasi
=
2400 x 5 x 0
T x 0,5
larutan Go T aq
serta ddH20 20 ｾＱＮ＠
Adapun
kondisi reaksi PCR ialah 95 oC, 2 menit (1 siklus); 95 °C, 30 detik, 65 oC, 1 menit, 72 oc, 2
Kctcrangan:
MCA= aktivitas enzim milk-clotting (SU)
T
=
waktu pertama kali terbentuk gumpalan susu (detik)
o = faktor pengenceran
menit (10 siklus); 95 oc, 30 detik, 55 oc, 1 men-
Aktivitas
protease ditentukan
melalui
it, 72 oC, 2 menit (30 siklus) serta 72 oC, 2 menit
metode standar Lowry yang dimodifikasi (Meloan
(1 siklus) . PCR produk disequensing di First Base
& Pomeranz 1973). Sebanyak 0.2 ml substrat
Malaysia. Hasil sekuen selanjutnya dibandingkan
kasein
dengan database di Gen Bank menggunakan
dengan 0.1 mL larutan enzim kasar, kemudian
BLAST algorithm.
dicampur dan diinkubasi di shaker incubator sela-
Produksi enzim dilakukan dengan metode
dengan
konsentrasi
rna 20 menit pada suhu
0.1 % direaksikan
3rc. Setelah diinkubasi
fermentasi cair. Isolat bakteri dikulturkan pada
selama 20 men it, larutan reaksi tersebut ditambah
media Nutrient Broth yang telah ditambahkan
0.24 mL 0.4 M TCA, dicampur dan diinkubasi
substrat kasein lalu diinkubasi menggunakan
pada shaker incubator selama 20 menit pada suhu
shaker incubator pada 150 rpm, suhu ruang sela-
3rc. Setelah disentrifugasi selama 10 menit pada
rna 5 hari dan dilakukan sampling setiap 24 jam.
kecepatan 10.000 rpm, 0.1 mL supernatan diam-
Hasil sampling kemudian diukur pertumbuhan
bil dan disimpan pada tabung reaksi baru.
selnya menggunakan spektrofotometer pada A
Kemudian ditambahkan 0,5 mL 0.4 M Na2C03
660 nm. Hasil sampling tersebut disentrifugasi
dan 0.1 mL fenol folin, dihomogenkan dengan
pada 10.000 rpm selama 10 men it, kemudian
vorteks dan diinkubasi pada suhu
diambil supernatannya sebagai ekstrak enzim
menit. Larutan reaksi diukur absorbansinya pada
kasar untuk dianalisa aktivitas milk clotting prote-
A 660 nm dan diukur aktivitas proteasenya
ase (Milk clotting activity: MCA), aktivitas proteo-
dengan menggunakan rum us dibawah ini. Satu
litiknya (Proteolytic activity: PA) serta rasio aktivi-
unit (U) aktivitas protease didefinisikan sebagai
tas milk clotting protease terhadap protease
jumlah enzim yang dapat mengkatalisis reaksi
3rC selama 20
(MCNPA).
201
Rahmani, dkk.
pelepasan 1 ｾｬｭｯ＠
Analisis sebagian gen 16S rDNA Bakteri
tirosin per menit
Aktivitas protease (PA) = X x FP x _IN x T
Amplifikasi
Keterangan :
sebagian
gen
165
rONA menghasilkan produk sekitar 1500 bp
PA
=
Protease activity (U/mL)
X
=
Konsentrasi enzim (mg/mL)
FP
=
Fakror pengenceran
V
=
Volume enzim yang dianalisis (mL)
=
waktu inkubasi (menit)
T
daerah
(Gambar 3). Analisis homologi untuk masingmasing isolat bisa dilihat pada Tabel 3.
Perhitungan rasio aktivitas penggumpalan
susu terhadap protease
Pengukuran Aktivitas Enzim dan Seleksi Isolat
Bakteri
Kurva Pertwnbuhan Isolat Bakteri
menggunakan rumus
Hasil pengukuran pertumbuhan sel pada
perhitungan pada persamaan berikut ini (Arima et
A 660 nm ditunjukkan pada Gambar 4. Empat
aL. 1%7) :
isolat bakteri memiliki profil pertumbuhan yang
R=MCA
sarna dengan pertumbuhan sel tertinggi pada jam
PA
ke-24.
Keterangan :
R: Rasio aktivitas penggumpulan susu terhadap protease
MeA : Milk Clotting Activity; Aktivitas penggumpalan
Data aktivitas milk clotting protease dari
susu (SU/mL)
PA
Aktivitas Enzim Penggumpal Susu
keempat isolat bakteri bisa dilihat pada Gambar
: Protease Activity ; Aktivitas protease (U/mL)
5. Pembentukan gumpalan susu oleh adanya ak-
HASIL
tivitas enzim milk clotting protease bisa dilihat pada Gambar 6. Tiga isolat bakteri dari produk fer-
Isolasi Bakteri dari Pangan Fermentasi
mentasi tau co memiliki aktivitas penggumpalan
Isolasi dilakukan terhadap lima sampel pangan
susu lebih tinggi dibanding isolat bakteri D5N
fermentasi yaitu tauco, tempe, oncom merah, tape
dari produk fermentasi sawi, meskipun proses
ketan, dan asinan sawi (Gambar 1).
penggumpalan susu optimum diperoleh setelah
24 jam.
Tabe11.
Ciri morfologi 4 bakteri hasil isolasi dari 5 produk fermentasi
No.
holat Bakteri
Sumber
TeN 1
Tauco
2
TeN 2
Tauco
3
TeN 3
Tauco
4
DSN 1
Asinan saw i
A B C
Gambar 1.
Ciri Koloni
benruk bulat. ukuran medium. berwarna putih opaqu e.
tepian entire
bentuk tidak b e raturan. ukuran large. berwarna putih
opaque. tepian undulate
ben tuk tidak ber a turan . ukuran large. berwarna
translusens. tepian undulate
bentuk bulat. ukuran large. berwarna putih opaque.
tepian undulate
0
E
Sampel pangan fermentasi yang digunakan sebagai sumber isolat: oncom merah (a), tempe (b), tape
ketan (c), tau co (d), asinan sawi (e)
202
Isolat Bakteri Indigenous PenghasU Milk-Clotting Protease
Aktivitas protease dan rasio aktivitas penggumpulan susu
Hasil uji aktivitas proteolitik terhadap 4
i isolat
Zona
-...;;.;;=......
ＭＫＮｾ＠
isolat bakteri menunjukkan hasil yang berbeda
dengan profil aktivitas penggumpalan susu. Satu
isolat bakteri produk fermentasi tauco yaitu
TCN2 menunjukkan aktivitas proteolitik paling
Gambar 2. Contoh zona bening dari isolat bakteri
kecil dibanding 3 isolat bakteri lainnya. Aktivitas
TCN 2 pada medium skim milk agar
tertinggi di peroleh oleh isolat bakteri TCN 1
dengan aktivitas sekitar 0.02 U/mL (Gambar 7).
penggumpalan susu tertinggi dibanding 3 isolat
Isolat yang telah diuji aktivitas penggumpalan
bakteri lainnya.
susu dan proteasenya kemudian dihitung rasio
aktivitas penggumpalannya terhadap protease.
PEMBAHASAN
Hasil perhitungan rasio enzim penggumpal susu
terhadap protease dari keempat isolat bakteri
dapat dilihat pada Tabel4. Tabel4 menunjukkan
bahwa
isolat
bakteri
TCN2
memiliki
rasio
Medium isolasi untuk memperoleh koloni
tunggal menggunakan medium selektif susu skim
agar yang umum digunakan untuk memperoleh
Tabel 2. Indeks Protease 4 bakteri hasil isolasi dari 5 produk fermentasi
No.
1
TeN 1
2
TeN 2
3
4
TeN 3
Diameter zona
bening (em)
1.30
1.60
1.20
1.40
D lam eter i.olate
bakteri (em)
0.40
0.40
0.40
0.40
Isolat B abed
DSN 1
2.0
2.0
.:;; 1.5
c
1.5
.
ｾ＠
'-
1.0
"----r
Indeks Protease
3.25
4.00
3.00
3.50
｛ ｾ＠
1.0
.Q