Lampiran 1 Prosedur analis is a. Total g ula dengan me tode Fenol-Sulfat Apriyantono
et al. 1989
Prinsip metode ini adalah bahwa gula sederhana, oligosakarida, polisakarida dan turunannya dapat bereaksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat
menghasilkan warna orange-kekuningan yang stabil. Pembuatan kurva standar
Sebanyak 2 mL larutan glukosa standar yang mengandung 0, 10, 20, 30, 40, dan 60 µ glukosa masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi la lu
ditambahkan 1 mL larutan fenol 5 dan dikocok. Selanjutnya ditambahkan dengan cepat 5 mL larutan asam sulfat pekat dan dibiarkan selama 10 menit,
dikocok lalu dipanaskan dalam penangas air selama 15 menit. Setelah dingin, absorbansi larutan standar diukur pada panjang gelombang 490 nm dan dibuat
kurva standar yang menunjukkan hubungan konsentrasi glukosa dengan absorbansi.
Penetapan sampel Untuk menetapkan total gula, sampel harus berupa cairan yang jernih.
Sebanyak 2 mL sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi lalu ditambahkan 1 mL larutan fenol 5 dan dikocok. Selanjutnya ditambahkan dengan cepat 5 mL
larutan asam sulfat pekat dan dibiarkan selama 10 menit, dikocok lalu dipanaskan dalam penangas air selama 15 menit. Setelah dingin, absorbansinya diukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm. Sampel sebelumnya diencerkan dengan tingkat pengenceran yang sesuai sehingga dapat terbaca pada
kisaran 20-80 absorban. Nilai rata-rata absorbansi sampel hasil pengukuran dimasukkan ke persamaan kurva standar sehingga didapatkan nilai konsentrasi
glukosa.
b. Total nitrogen dengan metode Kjeldahl Apriyantono et al. 1989
Sejum lah kecil sampel kira -kira akan membutuhkan 3-10 mL HCl 0,01 N atau 0,02 N dipindahkan ke dalam labu Kjeldahl 30 mL. Ke dalam labu
ditambahkan 1,9 ± 0,1 g K
2
SO
4
, 40 ± 10 mg HgO dan 2,0 ± 0,1 mL H
2
SO
4
. Jika
sampel lebih dari 15 mg maka ditambahkan 0,1 mL H
2
SO
4
untuk setiap kelebihan 10 mg bahan organik. Sampel didihkan dengan bantuan batu didih selama 1-1,5
jam sampai cairan menjadi jernih. Selanjutnya sampel didinginkan dan ditambahkan sejumlah kecil air secara perlahan-lahan kemudian didinginkan.
Isi labu dipindahkan ke dalam alat destilasi. Labu dicuci dan dibilas 5-6 kali dengan 1-2 mL air, air cucian dipindahka n ke dalam alat destilasi.
Erlenmeyer 125 mL yang berisi 5 mL larutan H
3
BO
3
dan 2-4 tetes indikator campuran metil merah 0,2 dalam alkohol : metilen blue 0,2 = 2:1 diletakkan
di bawah kondensor dimana ujung tabung kodensor harus terendam di bawah larutan H
3
BO
3
. Ke dalam erlenmeyer ditambahkan NaOH-Na
2
S
2
O
3
. Destilasi dilakukan sampai tertampung kira-kira 15 mL destilat. Tabung kondensor dibilas
dengan air dan bilasannya ditampung dalam Erlenmeyer yang sama. Isi Erlenmeyer diencerkan kira-kira sampai 50 mL lalu dititrasi dengan HCl 0,02 N
sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Prosedur yang sama juga dilakukan untuk penetapan blanko.
N = mL HCl sampel - mL HCl blanko x N HCl x 14,007 x 100
mg sampel
c. Konsentrasi sel dengan metode gravimetri
Sebanyak 1 mL kultur dipipet ke dalam tabung Eppendorf yang telah diketahui bobotnya, disentrifus dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit
untuk memisahkan sel dari media sisa. Supernatan digunakan untuk analisis total gula sisa. Pelet yang dihasilkan dicuci dengan akuades steril kemudian disentrifus
kembali dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit. Pelet dalam tabung Eppendorf dikeringkan di dalam oven 60
o
C sampai bobotnya tetap. Selisih bobot tabung Eppendorf yang berisi sel kering dengan bobot tabung Eppendorf kosong
merupakan berat kering sel dan dinyatakan sebagai konsentrasi sel kering gmL atau dikonversi menjadi gL. Pengukuran dilakukan sedikitnya triplo.
d. Isolasi PHA dengan metode NaOH digestion
