Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas sp.AZM-1 Melalui Mutagenesis Dengan Transposon

ISOLASI GEN YANG TERLIBAT DALAM PELARUTAN
FOSFAT DARI Pseudomonas sp.AZM-1 MELALUI
MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON

ALI ZUM MASHAR

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul:
Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas sp. AZM1 Melalui Mutagenesis Dengan Transposon
adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada
perguruan tinggi manapun. Sumber data dan informasi yang dikutip dalam tesis ini
telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam daftar pustaka di bagian akhir
tesis ini. Oleh karena itu, semua isi tesis ini dapat dipertanggung jawabkan
kebenarannya.

Bogor,

April 2009

Ali Zum Mashar
NRP P055040071

ABSTRACT

ALI ZUM MASHAR. Isolation of a Gene Involved In Phosphate-solubilizing From
Pseudomonas sp. AZM-1 Through Transposon Mutagenesis. Under the direction of
SUHARSONO, ARIS TRIWAHYUDI.
Pseudomonas sp. AZM-1 is soil microbe which have phosphate-solubilizing
from enzyme metabolite activities mechanism so this bacterium have a gene related
to phosphate-solubilizing. The aim of this reseach was to isolate, clone and
characterize gene involved in phosphate-solubilizing. To isolate a gene involved in
phosphate-solubilizing, the mutant was contructed using transposon mini Tn5Km1
to yield become Non-Phosphate-Solubilizing (NPS) Pseudomonas sp. Transposon
delivery was carried out through conjugation between Pseudomonas sp. AZM-1 and
E. coli S17 ( pir) carrying pUTmini-Tn4Km1. The frequency of transconjugation

was abaut 3.0 x 10-9 cells per recipient. These NPS bacteria did not solubilize
phosphate contained in the pykovskaya medium. DNA fragment interrupted by
transposon (called flanking DNA) was isolated by Inverse Polymerase Chain
Reaction (Inverse PCR) and cloned into pGEM-T Easy. DNA sequence analysis
showed that the flanking DNA is 1006 bp and contains an Open Reading Frame
(ORF). This ORF contains 215 amino acids allignment analysis of amino acid
sequence reduced from this ORF showed that this ORF is identic with DNAse1
from Pseudomonas fluorescens strain Pf-5. This gene might function indirectly
in the phosphate solubilization in Pseudomonas sp. AZM-1.
Keyword: Pseudomonas sp. AZM-1, phosphate-solubilizing, Transposon mini Tn5,
DNAse1, endA gene.
.

RINGKASAN

ALI ZUM MASHAR. Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari
Pseudomonas sp. AZM-1 Melalui Mutagenesis Dengan Transposon. Dibimbing
oleh: SUHARSONO, ARIS TRIWAHYUDI
Pseudomonas sp.AZM-1 adalah mikroba tanah yang memiliki kemampuan
dalam pelarutan fosfat melalui mekanisme enzimatik sehingga bakteri ini memiliki

gen yang berhubungan dengan pelarutan fosfat. Mikroba gram negatif ini memiliki
respon positif terhadap transposon mini Tn5Km1. Tujuan penelitian ini adalah untuk
mengisolasi, mengklon dan mengkarakterisasi gen yang terlibat dalam pelarutan
fosfat.
Penelitian ini dimulai dengan mengisolasi bakteri pelarut fosfat, isolasi
fragmen DNA genom dari mutan negatif pelarut, amplifikasi fragmen DNA pengapit
menggunakan inverse PCR, pengklonan fragmen hasil PCR pada pGEM®-T Easy,
introduksi plasmid ke dalam bakteri E. coli galur DH5α. Fragmen DNA vektor
rekombinan dari mutan negatif pelarut fosfat yang didapat di sekuen dengan
menggunakan primer T7 dan SP6. Untuk mengisolasi gen yang terlibat dalam
pelarutan fosfat, bakteri ini dimutasikan dengan transposon mini Tn5Km1 sehingga
menjadi bakteri mutan yang tidak mampu melarutkan fosfat. Introduksi transposon
dilakukan melalui konjugasi antara Pseudomonas sp.AZM-1 dengan E. coli S17 (
pir) yang mengandung pUT mini–Tn5Km1. Frekuensi transkonjugasi sel bakteri
mutan negatif pelarut fosfat didapatkan dari media sebar adalah 3.00 x 10-9. Bakteri
mutan ini tidak dapat melarutkan fosfat di dalam media pykovskaya.
Fragmen DNA yang tersisipi transposon diisolasi dengan cara Polymerase
Chain Reaction terbalik (inverse PCR) dan diklon ke dalam pGEM®-T Easy.
Analisis mutan menunjukkan bahwa DNA pengapit transposon berukuran 1006 pb
dan mengandung kerangka baca (Open Reading Frame). Kerangka baca ini

mengandung 215 asam amino. Analisis penyejajaran urutan nukleotida dan asam
amino yang menggunakan program BLAST X, menunjukkan bahwa fragmen
tersebut adalah
endonuklease 1 yang memiliki kesamaan genom dengan
Pseudomonas fluorescens Pf-5. Analisis kesejajaran dari urutan asam amino yang
dideduksi dari ORF ini menunjukkan bahwa ORF ini memiliki kesamaan dengan
DNAse1 yang disandikan oleh gen endA dari Pseudomonas fluorescens galur Pf-5.
Gen ini mungkin secara tidak langsung dalam pelarutan fosfat di dalam
Pseudomonas sp. AZM-1.

Kata kunci: Pseudomonas sp. AZM-1. pelarut fosfat, Transposon mini Tn5, DNAse1,
gen endA

@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2009
Hak Cipta dilindungi Undang-undang
1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa
mencantumkan atau menyebut sumber
a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,
penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik
atau tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB
2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh
karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

ISOLASI GEN YANG TERLIBAT DALAM PELARUTAN
FOSFAT DARI Pseudomonas sp.AZM-1 MELALUI
MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON

ALI ZUM MASHAR

Tesis
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains pada
Program Studi BIOTEKNOLOGI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

Judul Penelitian

: Isolasi Gen Yang Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari

Pseudomonas sp.AZM-1 Melalui Mutagenesis Dengan
Transposon
Nama Mahasiswa :

Ali Zum Mashar

Nomor Pokok

: P055040071

Program Studi

: Bioteknologi

Menyetujui
Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Suharsono, DEA,

Dr. Aris Triwahyudi, M.Si.

Ketua

Anggota

Diketahui
Ketua Program
Studi Bioteknologi

Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA.

Tanggal ujian : 6 Februari 2009

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS.

Tanggal lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Ir. Iman Rusmana, MSi.

i
KATA PENGANTAR

Bismillairrahmanirrahiim,
Segala puji penulis panjatkan kepada Allah Subhanaahu Wa Ta’alaa atas
limpahan berkat dan rahmat-Nya yang tiada terhingga sehingga

penulis dapat

menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini yang berjudul ” Isolasi Gen Yang
Terlibat Dalam Pelarutan Fosfat Dari Pseudomonas aeroginosa Melalui Mutagenesis
Dengan Transposon”.
Terima kasih penulis sampaikan kepada pihak-pihak yang telah membimbing
dan membantu dengan penuh perhatian dan kecintaan selama proses penelitian ini baik
secara langsung maupun tidak langsung. Terimakasih disampaikan kepada Pusat

Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi IPB yang telah menyediakan fasilitas
penelitian ini. Untuk itu penulis menyampaikan terima kasih kepada:
1.

Dr. Ir. Suharsono, DEA selaku pembimbing yang telah meluangkan waktu
didalam memberikan pembimbingan dan wawasan berfikir yang sangat
berharga bagi penulis.

2.

Dr. Aris Triwahyudi, M.Si selaku pembimbing yang telah memberi bimbingan,
nasehat dan bahan selama proses penelitian bagi penulis.

3.

Dr. Ir.Muhammad Jusuf, DEA selaku ketua Program Studi Bioteknologi SPs
IPB.

4.

Anak dan Istriku tercinta atas segala pengorbanannya yang memberikan
dukungan moril dan materiil.

5.

Teman-temanku: Firdaus (Btk), mbak Pepy (Biorin), mbak Arie (Seafast), Rika
Indri Astuti (Biologi), Syahnada Jaya, Pak Mulya, Efrizal, dan teman-teman
se-angkatan bioteknologi 2004 yang banyak membantu.

Akhirnya berharap Allah SWT memberikan

balasan rahmat dan kebaikan

kepada kita semua. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi kita semua.

Bogor, April 2009

Ali Zum Mashar

ii

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bakung, Kec. Mijen, Kabupaten Demak, Propinsi Jawa
Tengah pada tanggal 19 Mei 1972. Penulis adalah anak keenam dari tujuh
bersaudara dari pasangan yang berbahagia H. M. Ali Mukti dan Hj. Sri Tasriah.
Saat ini penulis telah menikah dengan Sonni Anna, SPt. dan dikaruniai tiga orang
anak : Zumarizka Akbar Ibrahim, Kalyana Daeva Ali dan Mughni Vada Ali.
Penulis lulus dari SMU Negeri I Kudus tahun 1991 dan melanjutkan di
Fakultas Pertanian UNSOED Purwokerto. Penulis pada bulan September 2004
melanjutkan pendidikan Sekolah Pascasarjana di Institut Pertanian Bogor, Program
Studi Bioteknologi. Setelah lulus S1 (1997) bekerja sebagai PNS Deptrans dan
PPH Kalteng dan saat ini menjadi peneliti di Puslitbangtrans Depnakertrans serta
tenaga ahli di beberapa perusahaan swasta Nasional.
Selama mahasiswa penulis aktif di organisasi kegiatan kampus seperti ketua
Badan Pelaksana Harian SMPT Unsoed, ketua Unit Kerohanian Islam (UKI)
Faperta, ketua pembinaan UKKI Unsoed, ketua Perhimpunan Mahasiswa
Agroindustri Jateng, ketua KSIMP Faperta, dan lain.lain. Penulis aktif di dalam
kegiatan kompetisi keilmiahan antara lain mendapatkan Juara I LCTQ Unsoed
(1993), Juara I LP2P4 Unsoed dan antar perguruan tinggi se-Jawa Tengah (1994),
finalis Lomba Karya Inovatif Produktif Nasional LKIP (1994), Juara I LKTI
Mapres Unsoed (1995), Juara I LP2PA (1995), Juara II LKTI Nasional di UGM
(1996), juara harapan I pameran ilmiah PIMNAS IX dan menjadi mahasiswa
berprestasi utama I Faperta Unsoed dan Mahasiswa berprestasi utama dan teladan
Unsoed (1995), menerima beasiswa PERTAMINA, Supersemar dan PPA Dikti.
Beberapa hasil karya ilmiah penulis yang bersifat penemuan (invent) antara
lain: Teknologi Bio Perforasi

(International patent Reg: PCT/ID 01/00003.);

Teknologi Pupuk Hayati Bio P 2000 Z (patent: ID 0000348S), Komposisi produk
turunan dan cara pembuatan Pupuk Bio Perforasi (paten: ID 0016722, P20000368,
P20000367); 21 jenis galur kedelai unggul baru produktivitas; Rekor Guiness
Book MURI membuat ”Kedelai Raksasa” buah terlebat 2.400 – 3.030
polong/pohon dan setinggi “3,80 meter” dan ”4,5 meter”.

iii

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ......................................................................………….……..…… iv
DAFTAR LAMPIRAN....................................................................................……..…… vi
PENDAHULUAN
Latar Belakang.........................................................................................………….
Tujuan Penelitian .....................................................................................………….

1
3

TINJAUAN PUSTAKA
Mobilitas Unsur Phosfat ........................................................................………….
Mikroba Pelarut Phosfat .........................................................................................
Peran Transposom dalam Mutagenesis.................................................................

4
5
7

aBAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian................................................................………….
Bahan.....................................................................................................………….
Metode Penelitian..................................................................................………….
Isolasi bakteri pelarut fosfat...........................................................………….
Mutagenesis dengan Transposon ....................................................................
Seleksi mutan ................................................................................………….
Isolasi DNA genom mutan P. aeroginosa .....................................................
Pemotongan dan ligasi DNA yang mengandung mini-Tn5Km1...................
Amplifikasi DNA yang diapit mini Tn5Km1 .................................................
Pengklonan hasil amplifikasi fragmen DNA pengapit mini Tn5...................
Transformasi E. coli DH5α.............................................................................
Seleksi transforman rekombinan....................................................………….
Isolasi Plasmid ................................................................................................
Pengurutan nukleotida dan analisis bioinformatika ........................................

9
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
19
19

HASIL DAN PEMBAHASAN
Skrining Pseudomonas sp. mikroba pelarut fosfat ...............................................
Mutagenesis dengan Transposon dan seleksi mutan .............................................
Isolasi dan pemotongan DNA genom total mutan negatif pelarut fosfat P. aereus ..... ..........................................................................................
Amplifikasi Fragmen DNA Pengapit MiniTn5 Menggunakan Inverse PCR.........
Pengklonan dan Hasil Amplifikasi Fragmen DNA Pengapit mini Tn5.................
Pengurutan fragmen DNA pengapit miniTn5........................................................
Analisis Kesamaan Gen Sisipan Dengan Data Gen di Genbank ...........................
Peta Enzim Restriksi Endonuklease fragmen ........................................................
Urutan asam amino deduksi dari DNA yang disisipi Tn5……………......... .......
Analisis Domain Fragmen DNA Pengapit Tn5…………………….....................

22
23
24
26
28
31
31
33

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ...............................................................................................................
Saran .....................................................................................................................

35
35

DAFTAR PUSTAKA .....................................................................................................

36

LAMPIRAN....................................................................................................................

40

21
21

iv

DAFTAR GAMBAR
Halaman
1.

Peta plasmid pUT mini-Tn5Km1 (7.055 kb) yang berada dalam sel E. coli S171 (λ pir), peta restriksi transposon mini-Tn5Km1 (1.835 kb) yang membawa gen
resistensi .....................................................................................

9

2.

Peta plasmid pGEMT-Easy ..............................................................................

10

3.

Tahapan isolasi, pengklonan dan karakterisasi fragmen gen yang terlibat
dalam pelarutan fosfat dari P. aeroginosa..........................................................

11

Diagram skematis proses mutagenesis dengan transposon. Konjugasi dilakukan
di atas filter milipore (0.45 µm) pada media LB. Pada suspensi campuran donor
(D) dengan resipien (R) akan terjadi serangkaian proses transfer dan penyisipan
transposon .....................................................................

13

Proses mutagenesis dengan transposon. Konjugasi dilakukan di atas filter
milipore (0.45 µm) pada media LA modifikasi. Pada suspensi campuran donor
(D) dengan resipien (R) akan terjadi serangkaian proses transfer dan penyisipan
transposon .........................................................................................

15

Skema proses amplifikasi fragmen DNA genom pengapit transposon. a) DNA
genom Pseudomonas Aereus mutan non pelarut phosfat yang dipotong dengan
enzim EcoRV, b) Proses sirkularisasi menggunakan enzim T4 DNA ligase, c)
Proses amplifikasi DNA genom pengapit transposon dengan inverse PCR
.....................................................................................................................

16

4.

4.

5.

6.

Penampilan koloni P. aeroginosa pembawa gen pelarut fosfat pada media
phykovskaya: a. Peremajaan dari sel tunggal P. aeroginosa hasil isolasi, b.
Pertumbuhan fase logaritmatik, c. Penampilan pertumbuhan murni pada media
21
pykovskaya menunjukkan zona bening................................................................

7.

Mutan P. aeroginosa pada pikovskaya agar + Chl 50 µg/mL + Km 50 µg/mL
yang diinkubasi selama 24 jam ...........................................................................

22

8.

Penapisan terhadap mutan untuk mendapatkan mutan negatif pelarut fosfat: a.
koloni P. aeroginosa tipe liar pelarut fosfat, b. mutan P. aeroginosa negatif
22
pelarut fosfat.........................................................................................................

9.

Elektroforesis gel agarose DNA genom mutan P. aeroginosa yang bukan
pelarut fosfat.........................................................................................................

10. DNA hasil Inverse PCR (1. sampel; 2. penanda ukuran 1 kb plus). ................

23
24

v
11. Koloni-koloni E. coli DH5α berwarna biru (diduga tidak membawa plasmid
rekombinan dan putih diduga membawa palsmid rekombinan) pada media LA
yang mengandung 100 μg/ml ampisilin, 10 l 100 mM isopropiltio-βgalaktosida (IPTG) (Promega) dan 50 l 2%(b/v) X-gal (5-bromo-4-choloro-3indolyl-β-D-galactoside) (Promega) hasil inkubasi pada suhu 37°C
semalam............................................................................................…………....

24

12. Hasil PCR dengan koloni putih sebagai cetakan. 1. penanda 1 kb plus; 2. koloni
1; 3. koloni 2; 4. koloni 3; 5. koloni 4. ………………….………………

25

13. Verifikasi palsmid rekombinan dengan pemotongan enzim restriksi EcoRI (1.
penanda 1 kb plus; 2. plasmid tidak dipotong; 3. plasmid dipotong dengan
EcoRI)......................................................................................................................

26

14. Urutan nukleotida dari DNA sisipan di dalam pGEM®-T Easy ….…………….

27

15. Urutan gen sesungguhnya yang diinaktivasi oleh mini-Tn5 ..................................

28

16. Kesejajaran endonuklease 1 yang disandikan oleh gen endA dari Pseudomonas
Fluorescen Pf-5………………………………………….………………………..

29

17. Dendogram filogenetik berdasarkan urutan nukleotida menunjukkan kesejajaran
endonuklease P. aeroginosa dengan endonuklease I pada P. Fluorescens Pf-5.
Filogenetik berdasarkan urutan nukleotida………………………………...……..

30

18. Peta restriksi endonuklease1 (DNAse1) dari P. aeroginosa ……………..……….

31

19. Deduksi asam amino penyusun enzim DNAse1 berdasarkan kodon-kodon pada
daerah ORF fragmen gen pada P. aeroginosa ….…………………………………..

32

20. Kesejajaran asam amino lokal fragmen EcoRV dari P. aeroginosa dengan
endonuclease I (P. fluorescens Pf-5) YP_259205……………………………….

33

21. Daerah terjaga yang menunjukkan domain endonuclease 1 pada P. fluorescens
Pf-5…………………………………………………………………………………………. 34
.

vi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1. Hasil pengurutan nukleotida dengan primer T7 - SP6...............................................

40

2. Komposisi berbagai media pertumbuhan Pseudomonas sp. AZM-1…….................

42

3. Multiple aligment Pseudomonas sp. AZM-1dengan berbagai strain mikroba
kekerabat............ ........................................................... ............. .............

43

4. Filogenetik tree nukleotida model real branch dan model cladogram.....................

48

5. Jarak genetik berdasarkan pada urut-urutan enzim DNAse I di GenBank dengan gen
Pseudomonas spp ...................................................................................................... 49
6. Kesejajaran jarak genetik Pseudomonas sp. sesuai urutan enzim DNAseI………….. 50
7. Hasil analisis penyejajaran sesuai urutan nukleotida fragmen gen yang diperoleh
dengan transposon Tn5Km1 dari Pseudomonas sp.AZM-1 dengan yang dimiliki
Pseudomonas spp lain pada data Gene Bank dengan menggunakan program Blast-n
dan Blast-p................................................................................................................... 51
8. Pohon filogenetik dari fragmen gen yang diperoleh dengan transposon Tn5Km1
dari Pseudomonas sp.AZM-1 berdasarkan urutan nukleotida dan protein (aa)..........

52

vii

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
9. Hasil pengurutan nukleotida dengan primer T7.........................................................

40

10. Komposisi berbagai media pertumbuhan Pseudomonas sp.AZM-1..…….................

42

11. Multiple aligment Pseudomonas sp.AZM-1dengan berbagai strain mikroba
sekerabat................... .................................................................................

43

12. Filogenetik tree nukleotida model real branch dan model cladogram.....................

48

13. Jarak genetik berdasarkan pada urut-urutan enzim DNAse I di GenBank dengan
gen Pseudomonas sp Jarak Genetik berdasarkan pada urut-urutan nukleotida gen
DNAse I di GenBank dengan gen Pseudomonas sp.AZM-1 ......................................

49

14. Kesejajaran jarak genetik Pseudomonas sp.AZM-1 sesuai urutan enzim DNAseI....

50

15. Hasil analisis penyejajaran sesuai urutan nukleotida fragmen gen yang diperoleh
dengan transposon Tn5Km1 dari Pseudomonas sp.AZM-1 dengan yang dimiliki
Pseudomonas spp lain pada data Gene Bank dengan menggunakan program Blast-n
dan Blast-p................................................................................................................... 51
16. Pohon filogenetik dari fragmen gen yang diperoleh dengan transposon Tn5Km1
dari Pseudomonas sp.AZM-1berdasarkan urutan nukleotida dan protein (aa). .......... 52

PENDAHULUAN
Latar Belakang
Salah satu penyebab sulitnya melakukan peningkatan produksi pangan yang
cepat dan mencapai swasembada nasional adalah karena banyak hambatan dalam
pengembangan lahan pertanian pangan yang baru.

Pembukaan lahan subur

pertanian pangan baru masih terbatas dan tidak berimbang dengan konversi lahan
pertanian produktif menjadi fungsi lain seperti pemukiman di pulau Jawa. Konversi
lahan pertanian ke industri dan pemukiman di Jawa mencapai 62.000 ha/tahun,
sementara itu pemerintah melalui Deptan RI hanya menggantinya dengan membuka
sawah baru seluas 18.000 ha/th. Padahal untuk mencapai swasembada pangan di
Indonesia saat ini, sekurangnya diperlukan tambahan luas tanam 1 juta hektar yang
berarti harus membuka lahan baru dan meningkatkan produktivitasnya.

Sangat

ironis jika melihat potensi lahan di Indonesia yang tersedia untuk pertanian masih
besar dan belum dimanfaatkan secara optimal.
Membuka dan mencetak lahan baru untuk pertanian pangan di luar pulau Jawa
melalui pengembangan lahan yang potensial untuk pertanian adalah solusi
kecukupan pangan jangka panjang. Indonesia mempunyai lahan tidur (alang-alang)
seluas 1,08 juta ha, lahan pasang surut potensial seluas 9,5 juta ha dan lahan
marginal kering 11 juta ha. Bahkan dilaporkan oleh Suhartanto (2006), bahwa di
Indonesia sebenarnya terdapat

45,79 juta ha tanah Podzolik Merah Kuning

(PMK/Ultisol), 14,11 juta Ha tanah Oxisol dan 27,06 juta ha Gambut (histosol)
yang merupakan potensi lahan yang bisa diupayakan untuk pertanian dan potensi
lahan yang sesuai untuk sawah di Indonesia ada sekitar 23 juta hektar. Jenis tanah
masam menempati 29,7 % dari luas total daratan Indonesia atau sekitar 90 juta
hektar dengan tanah PMK menempati urutan teratas dalam hal luasannya.
Jutaan hektar lahan di atas kurang menarik untuk diupayakan sebagai lahan
pertanian oleh karena banyaknya faktor pembatas produktivitas fisik dan kimia
tanah seperti keadaan asam sehingga untuk mengatasi keasaman tersebut dengan

2

cara-cara konvensional cukup mahal, seperti pemberian kapur/dolomit untuk
menetralisir pH. Penambahan pupuk fosfat (P) secara berkelebihan harus dilakukan
pada lokasi ini agar unsur tersebut tersedia dan dapat diambil oleh tanaman.
Disamping itu, kekurangan hara dan jasad renik penyubur di dalam tanah juga
menjadi faktor pembatas produksi petani sehingga produktivitas tanaman budidaya
yang dicapai rendah, seperti kedelai: 0,5 - 0,8 ton/ha, padi: 1,5 – 3,0 ton/ha, dan
jagung: 2 – 3 ton/ha yang masih jauh di bawah potensi genetis komoditas ini.
Kekurangtersediaan hara fosfat (P) menurunkan hasil panen biji-bijian sampai
35%, bahkan lebih mirip gejala cekaman fisik seperti kekurangan air. Permasalahan
fisiologis yang ditunjukkan oleh tanaman jika kekurangan unsur fosfat ini adalah
terhambatnya metabolisme sel tanaman karena energi aktivasi sel yang terbatas
sehingga ekspresinya akan menghambat tumbuhnya tunas secara normal, tanaman
kerdil, daun tumbuh tidak normal, hijau ungu tua dan cepat kuning yang pada
gilirannya menurunkan mutu dan jumlah/bobot hasil panen (Panday 1997)
Melalui Bioteknologi dengan rekayasa genetik yang diterapkan pada mikroba
tanah atau tanaman, cekaman fisik di atas dapat diatasi sehingga tanaman dapat
normal memanfaatkan unsur fosfat di alam secara cukup meskipun dalam jumlah
ketersediaan yang terbatas (Mashar 2006). Beberapa mikroba penghasil enzim
pelarut fosfat yang telah dikenal seperti Pseudomonas sp., Alcaligenes sp., Bacillus
pumillus, Mycorhiza glamous, Aspergillus niger, dll. telah mulai banyak
dimanfaatkan peranannya baik dalam pertanian, industri pupuk (Prihatini et al.
1966) bahkan industri pengolahan pangan dan pakan ternak. Fosfat yang dilarutkan
menjadi tersedia untuk dapat diserap sel tanaman atau hewan. Enzim pelarut fosfat
disandikan oleh suatu gen tertentu. Guna lebih memanfaatkan gen mikroba di atas
maka isolasi gen penyandi pelarut fosfat khususnya dari bakteri Pseudomonas
dilakukan dalam penelitian ini.
Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi gen yang terlibat dalam pelarutan
fosfat dari bakteri Pseudomonas sp. AZM-1 melalui teknik transposon. Transposon
yang digunakan dalam penelitian ini ialah mini-Tn5Km1 yang membawa gen

3

penanda resistensi terhadap kanamisin. Mini-Tn5Km1 merupakan salah satu tipe
transposon turunan dari transposon Tn5 (de Lorenzo et al. 1990). Transposon ini
dapat menyisip secara acak pada genom bakteri dan penyisipannya bersifat stabil
(Herrero et al. 1990). Penyisipan mini-Tn5Km1 ke dalam genom akan menyebabkan
bakteri tersebut memiliki sifat resisten terhadap kanamisin. Transposon mini Tn5
Km1 dalam penelitian ini digunakan sebagai pelacak dan penginaktivasi gen yang
terlibat dalam pelarutan fosfat pada bakteri Pseudomonas sp. AZM-1.

Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah :
1.

Melakukan pengklonan fragmen DNA genom

yang terlibat dalam proses

pelarutan fosfat melalui teknik mutagenesis dengan transposon.
2.

Melakukan karakterisasi fragmen gen yang terlibat dalam pelarutan fosfat.

TINJAUAN PUSTAKA

Mobilitas Unsur Fosfat
Tanah

asam

adalah

pembatas

bagi

pertumbuhan

tanaman

karena

menyebabkan ion Fe, Al, Mn, dan Ca akan mengikat kuat ion fosfat (P). pH tanah
berpengaruh terhadap bentuk ion P, jumlah dan tingkat dekomposisi bahan organik,
serta kegiatan jasad mikro (Brady 1974, Ismunadji et al. 1991). Toksik H+ lebih
mendominasi tanah lapisan atas dan ion hidrogen dari fosfat inorganic asam fosfat
(H3PO4) mengalami ionisasi membentuk ion H2PO4- , HPO42-, PO43- akan di ikat
menjadi Al-P, Fe-P dan Mn-P.

Dalam keadaaan netral atau alkalin akan diikat

menjadi Ca-P (Marschner 1995; Ismunadji et al. 1991).
Alumunium (Al) di dalam tanah larut dan bersifat racun bagi tanaman.
Kelarutan Al menjadi tinggi pada kondisi asam.

Pada kondisi asam Al lebih

mengikat ion fosfat dari H2PO4-, (HPO4)2- dan PO43-. Mula-mula ikatan tersebut
bersifat koloidal dan lambat, selanjutnya menjadi kristal varisit AlPO42H2- dan
strengit FePO42- (Nyakpa et al. 1988; Havlin et al. 1999).

Alumunium

mendominasi ikatan dengan –P pada lapisan sub soil dan pada kondisi asam (pH
4.0) bentuk ikatan Al3+ adalah Al(H2O2)63+.

Johnson dan Wood (1990)

menemukan kation Al3+ dapat mengikat PO43+ pada DNA sehingga menghambat
proses replikasi DNA bakteri bintil akar. Ketika pH meningkat, Al berada dalam
bentuk Al(OH)2+ dan Al(OH)2+ akan reaktif mengikat ion H2PO4-, HPO42- sebagai
unsur fosfat yang dapat diserap oleh tanaman. Ketika mendekati pH netral dalam
bentuk Al(OH)3, pada kondisi basa dalam bentuk Al(OH)4- dan akan berikatan
dengan PO43- membentuk komplek (Al(OH)4) 3 PO4 (Marschner 1995; Delhaize dan
Ryan 1995).

Ion Al ini memiliki afinitas yang tinggi dan sangat menganggu

terhadap biomolekul anionik seperti asam lemak, karbohidrat, protein dan asam
nukleat (Aniol 1984; de Lima & Copeland 1994; Kochian 1995; Sivaguru et al.
1999). Al juga dapat menimbulkan cekaman oksidatif dengan terbentuknya oksigen
radikal (ROS) (Panda et al., 2003).

5

Dalam tanah mineral, P terdiri atas dua bentuk yaitu P-organik (3,75% dari P
total) seperti fitin, fosfolipid, asam nukleat dan koenzim, dan P-inorganik (25 –
90%) dari P total)
Cosgrove 1967).

seperti Ca3(PO4)2 dan Al(OH)4)2H2PO4

(Sutedjo 1994;

Bahan-bahan penyumbang fosfat di tanah berasal dari pupuk

kandang, sisa tanaman, pupuk buatan dan mineral/batuan tanah. Asam fitat dan
fitin merupakan fraksi terbesar dari P-organik. Selain itu menurut Alexander
(1977) bahwa sel-sel mikroba sangat kaya dengan asam nukleat dan jika mikroba
itu mati maka asam nukleatnya siap untuk dimineralisasi.

Mikroba Pelarut Fosfat
Mikroba pelarut fosfat yang pertama dikomersialisasi adalah Fosfobacterin
dari bakteri Bacillus megaterium var.phosphaticum (Smith et al., 1965). Beberapa
jenis cendawan dilaporkan mampu melarutkan Al-P dan Fe-P seperti Aspergillus sp
dan Pinicillium (Das 1963), Sclerotium dan Fusarium (Alexander, 1978).
Banyak jenis bakteri

pelarut P antara lain genus

Pseudomonas, Bacillus,

Mycobacterium, Micrococcus, Flavobacterium,

Bacterium, Citrobacter, dan

enterobacter (Premono 1994; Illmer et al. 1995).

Bakteri Pseudomonas putida,

Citrobacter intermedium dan Serratia
kelarutan

mesenteroides mampu meningkatkan

batuan fosfat 6 – 19 kali lipat (Premono

et al. 1991)

sedangkan

Pseudomonas fluorescens dan P. putida mampu meningkatkan P terlarut pada
tanah asam sampai 50 % ( Premono, 1994). P. aeroginosa salah satu bakteri
pelarut fosfat, yang bersifat gram negatif. Hasil penelitian terhadap Pseudomonas
sp oleh Surya (2006) menunjukkan bahwa pertumbuhan optimal mikroba ini pada
pH 6 pada media modifikasi HKsuk dimana dalam 24 jam diperoleh populasi
maksimum 1.97 x 109 sel dengan laju pertumbuhan spesifik maksimum 0,5807 sel
per jam yang dicapai sampai pada jam ke-4 dalam kultur dan melambat setelah jam
ke-8.
Mekanisme pelarutan unsur P terikat oleh bakteri pelarut fosfat terjadi
karena

adanya beberapa enzim

fosfatase

(fosfomonoesterase, fosfodiesterase

6

trifosfomonoesterase dan fosfoamidase) yang terdapat di dalam tanah.
enzim tersebut bertanggung jawab

Enzim-

dalam hidrolisis bahan organik yang

mengandung fosfor menjadi fosfat organik (HPO4-2 dan HPO4-1) yang tersedia
bagi tanaman (Tabatabai 1982). Menurut Pikovskaya dalam Bora dan Bezbaruah
(1999) bahwa bakteri pelarut fosfat menghasilkan zona bening disekitar koloni
yang mengandung 20 gram batuan fosfat sebanding dengan 5 gram tricalcium
fosfat. Zona bening mengindikasikan fosfat terlarut yang disebabkan oleh aktivitas
enzim Fosfomonoesterase (FMEase).
hidrolase

Fosfomono esterase merupakan enzim

yang berperan dalam Penambahan H2O pada ikatan ester fosfat

(Lehninger 1995).

Enzim FMEase dihasilkan secara dominan dibawah kondisi

ketersediaan fosfat rendah.
Enzim
tergantung

FMEase dapat dibagi menjadi FMEase asam dan FMEase alkali
jenis subtrat dan pH optimumnya.

Dalam kisaran basa FMEase

intraseluler pada umumnya tinggi, sedangkan FMEase ekstraseluler tinggi pada
kondisi kisaran asam (Schinner et al., 1996).

Sumber fosfat yang mampu

menginduksi produksi enzim FMEase ini adalah fenilfosfat dan p-nitrofenilfosfat
yang mengindikasikan kemampuan hidrolisis bentuk p-organik (Ruiz et al. 2000).
FMEase mengubah subtrat menjadi gugus alkohol (ROH) dan asam fosfat. Reaksi
hidrololisis p-nitrofosfat oleh FMEase sebagai berikut:

p-nitrofenilfosfat + H2O -- FMEase Æ p-nitrofenol + H3PO4.

Selain oleh reaksi di atas, sumber fosfat organik adalah phytat (myo-inositol
1,2,3,4,5,6-hexakisphosphat) yang banyak

tersimpan dalam jaringan tanaman

seperti sereal dan biji-bijian. Fitat diuraikan
heksakisphosphate phosphohydrolase (EC 3.1.3.8))

oleh phytase (Myo-inositolmenjadi inositol dan asam

orthophosphoric pertama ditemukan oleh Suzuki et al., 1907 (Wang, X., et al.,
2004). Enzim phytase disandikan oleh gen Phy K-W seperti pada Klebseilla

7

pneumoniae XY-5.

Beberapa jenis

Bacillus

memproduksi phytase

yang

melarutkan fosfat dari Myo-inositol-heksakisphosphate.
Ekspresi gen promotor PhyC tergantung pada ketersediaan unsur fosfat dan
regulator PhoP yang penting dalam transkripsi gen PhyC. Ikatan PhoP~P pada
kotak PhoP mendorong transkripsi PhyC

dan menandakan

meningkatnya

konsentrasi PhoP~P. Letak posisi PhoP berada pada sekuen -35 dan – 30 sebelum
promotor PhyC. DNAse1 yang berada pada sekuen –80 dari lokasi PhyC bekerja
menguraikan ikatan PhoP~P menjadi PhoP yang kemudian berinteraksi dengan
promotor PhyC sehingga menjadi aktif melakukan transkripsi (Makarewicz et al.
2006).

Peran Transposon dalam Mutagenesis
Metode transposon merupakan salah satu metode yang sering digunakan
untuk analisis genetika molekuler pada berbagai macam bakteri (Voelker dan
Dybvig 1998) dan fungi (Firon et al. 2003). Transposon merupakan elemen DNA
yang dapat meloncat atau menyisip dari satu tempat ke tempat lainnya di dalam
DNA (Snyder & Champness 2003).

Beberapa contoh penggunaan transposon

dalam teknik mutagenesis adalah seperti untuk mengidentifikasi gen yang terlibat
dalam virulensi bakteri Listeria monocytogenes pathogen pada manusia, analisis
penanda molukuler pada

Bradyrhyzobium japonicum (Wahyudi, et al. 1998),

isolasi gen yang berperan dalam pembentukan magnet pada Magnetospirillum
magneticum (Wahyudi et al., 2001), pengklonan fragmen DNA genom yang
terlibat dalam toleransi terhadap asam dan alumunium pada B. Japonicum (Astuti
et al. 2006).
Transposon seperti mini
pengklonan DNA

Tn5 telah digunakan dalam mutagenesis dan

bakteri gram negatif (Bruijn & Lupski 1984) seperti pada

Eubacteria (de Lorenzo et al. 1990).

Penggunaan Mini Tn5 transposon lebih

disukai karena frekuensi transposisinya tinggi, spesififas DNA target yang relatif
rendah (Goryshin et al. 1998), dan sedikit memiliki homologi dengan sekuen DNA

8

genom beberapa spesies bakteri (Berg & Ber 1983). Mini Tn5Km1 adalah salah
satu tipe turunan dari transposon Tn5 yang membawa gen penanda resistensi
kanamisin (de Lorenzo et al. 1990) sehingga penyisipannya ke dalam genom
bakteri

menyebabkan bakteri tersebut menjadi resisten terhadap kanamisin.

Penyisipan transposon ini bersifat acak dan penyisipannya bersifat stabil pada
genom bakteri (Herrero et al. 1990).
Reiznikoff and Wiliam (2002) menyatakan bahwa mekanisme transposisi
transposon terjadi melalui beberapa tahap dengan pemotongan dan penyambungan.
Pertama ikatan

Tnp 19 pb secara dimerisasi membentuk Tnp-DNA

struktur

komplek synaptic, kemudian melengkung (flanking) kedua ujungnya membentuk
ikatan cincin dan lepas dari utas DNA sebagai donor. Selanjutnya cincin DNA
yang mengandung transposon menempel pada untai DNA target. Dengan kehadiran
ion Mg 2+ cincin DNA transposon mengudar dan masuk tersambung dengan DNA
target sehingga membentuk untaian DNA mutagenesis.
Bakteri tanah gram negatif seperti Pseudomonas dapat dimutasikan dengan
transposon.

Mini transposons Tn5

memiliki situs gen resisten kanamisin,

kloramfenikol, streptomycin-spectinomycin, dan tetrasiklin yang digunakan sebagai
penanda seleksi pengklonan spesifik NotI yang diapit oleh terminal 19 pb urutan
sekuen dari Tn5 (de Lorenzo et.al. 1990).

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitiaan dimulai dari bulan April 2006 dan selesai pada bulan Juni 2007
di laboratorium mikrobiologi pangan Seafast Centre, di Laboratorium BIORIN
(Biotechnology

Research

Indonesian

The

Netherlands),

Pusat

Penelitian

Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi, IPB.

Bahan
Bahan yang digunakan adalah Pseudomonas sp. AZM-1, E. coli S 17-1 (
pir) sebagai sel donor pembawa plasmid pUTmini-Tn5Km1 dalam transposon
mutagenesis Gambar 1).

Gambar 1.

Peta plasmid pUT mini-Tn5Km1 (7.055 kb) yang berada
dalam sel E. coli S17-1 (λ pir), peta restriksi transposon
mini-Tn5Km1 (1.835 kb) yang membawa gen resistensi
kanamisin.

10

Media Pikovskaya (Bora dan Bezbaruah, 1999) digunakan sebagai media
dasar seleksi Pseudomonas sp. AZM-1 yang resisten terhadap antibiotik. Media LB
(Tripton 10 g/L, NaCl 10 g/L, ekstrak khamir 5 g/L, agar-agar 15 g/L yang
ditambahkan kanamisin 50 μg/ml) digunakan untuk menumbuhkan E. coli.
Primer hulu

KmO (5’-ACACTGATGAATGTTCCGTTG-3’) dan primer

hilir KmI (5’-ACCTGCAGGCATGCAAGCTTC-3’) digunakan untuk inverse
PCR, E. coli DH5α dan plasmid pGEMT-Easy

digunakan sebagai vektor

pengklonan (Gambar 2.)

Gambar 2. Peta plasmid pGEMT-Easy

Metode Penelitian
Penelitian ini dilakukan secara bertahap yaitu isolasi bakteri pelarut fosfat
dari pupuk hayati Bio P 2000 Z, seleksi dan pemurnian bakteri pelaruf fosfat,
mutasi bakteri pelarut fosfat, seleksi yang tidak dapat melarutkan fosfat,
pengklonan gen yang disisipi transposon, isolasi gen sasaran dan karakterisasi gen
sasaran seperti ditunjukkan pada gambar 3.

11

Pupuk Hayati
Bio P 2000 Z

Seleksi bakteri
pelarut fosfat

E. coli
S 17-1 (λ pir)

Bakteri pelarut

MUTAGENESIS
diparental matting

Mutan Bakteri

Pengklonan
Gen

Gen Sasaran

Karakterisasi gen
Sasaran

Gambar 3. Tahapan isolasi, pengklonan dan karakterisasi fragmen gen

yang

terlibat dalam pelarutan fosfat dari Pseudomonas sp. AZM-1.

Isolasi bakteri pelarut fosfat. Mikroba yang membawa sifat pelarut fosfat
dari pupuk hayati dengan media seleksi pikovskaya (Bora dan Bezbaruah, 1999;
Hesham, 2004), kemudian mikroba diidentifikasi. Hasil identifikasi mikroba

12

pelarut phosfat yang didapat adalah Pseudomonas sp. AZM-1.

Kemudian

dimurnikan dan diperbanyak untuk diliofilisasi agar terjaga kemurniannya.
Sebelum bahan mikroba digunakan untuk penelitian, dilakukan peremajaan
kembali dengan menginokulasikan koloni yang ditumbuhkan dari ampul liofilisasi
ke dalam plate agar pikovskaya. Kondisi inkubasi dilakukan pada suhu ruang
selama 24 jam, kemudian bakteri ditambahkan pada cawan Pikovskaya selama 4-5
jam untuk mendapatkan fase logaritmatiknya (Surya, 2006). Selanjutnya
diinokulasikan pada media (1) Pikovskaya + Chl 50 µg/ml, (2) Pikovskaya +
kanamisin (Km) 50 μg/ml, (3) Pikovskaya + ampisilin (Ap) 50 μg/ml, dan (4)
Pikovskaya saja sebagai kontrol positif terhadap resistensi antibiotik.
Mutagenesis dengan Transposon. Mutasi Pseudomonas sp.AZM-1 menjadi
tidak dapat melarutkan fosfat dilakukan dengan menyisipkan transposon miniTn5Km1, yang terdapat di dalam plasmid pUTmini-Tn5Km1 (Gambar 2) yang
dibawa E. coli S 17-1 (λ pir) ke dalam genom Pseudomonas sp. AZM-1 melalui
metode diparental mating. E. coli S 17-1 (λ pir) disebut sebagai donor (D) dan
Pseudomonas sp. AZM-1 disebut sebagai resipien (R). R ditumbuhkan pada 50 ml
Pikovskaya

dalam erlenmeyer 250 ml di dalam inkubator bergoyang dengan

kecepatan 140 rpm, pada suhu ruang selama 12 jam. D ditumbuhkan pada media
50 ml LB yang mengandung kanamisin 50 μg/ml dalam erlenmeyer 250 ml di
dalam inkubator bergoyang dengan kecepatan 140 rpm, suhu 370C selama 18-20
jam.
Sel R dicuci dan diresupensi dalam garam fisiologis (NaCl 0.85%) sebanyak
3 kali dengan cara disentrifugasi selama 10 menit pada 17500 g. Supernatan yang
didapat dibuang, dan pelet dicuci dengan garam fisiologis, demikian pula bagi sel
D, namun sel D disentrifugasi pada 800 g selama 5 menit.
Pelet sel R yang telah dipanen ditambahkan LB sebanyak 40µl. Suspensi sel
R kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml yang berisi pelet sel D.
Suspensi campuran D dan R kemudian diresuspensi perlahan dan dipindahkan ke
atas membran milipore steril yang diletakkan di atas media LB padat. Inkubasi

13

dilakukan selama 12, 18, dan 24 jam. Pelet sel donor maupun resipien juga
diletakkan di atas membran milipore sebagai kontrol negatif. Pada masing-masing
jam inkubasi yang telah ditentukan, membran milipore diangkat dan dimasukkan
ke dalam tabung mikro 1.5 ml yang berisi 1 ml garam fisiologis, kemudian dikocok
untuk melepaskan sel dari membran. Masing-masing 100 µl suspensi disebarkan di
atas media Pikovskaya (+ Chl 50 µg/ml + Km 50 µg/ml) dan diinkubasi selama 34 hari. Tahapan proses mutagenesis seperti ditunjukkan pada Gambar 4.

Gambar 4.

Diagram skematis proses mutagenesis dengan transposon. Konjugasi
dilakukan di atas filter milipore (0.45 µm) pada media LB. Pada
suspensi campuran donor (D) dengan resipien (R) akan terjadi
serangkaian proses transfer dan penyisipan transposon.

Seleksi Mutan. Sel transkonjugan yang tumbuh pada masing-masing
cawan Pikovskaya + Chl 50 μg/ml + Km 50 μg/ml dibuat replikanya pada media
yang sama. Inkubasi dilakukan pada suhu 320C selama 12 jam. Koloni konjugan
yang

tumbuh dengan tidak menunjukkan zona bening merupakan koloni

Pseudomonas sp. AZM-1 yang termutasi (mikroba tidak mampu melarutkan fosfat)
sebagai mutan negatif pelarut fosfat.
Pseudomonas sp. AZM-1

Selanjutnya setiap koloni mutan

dilakukan verifikasi ulang pada media pikovskaya

14

dengan menggoreskan satu lup penuh koloni mutan dan diverifikasi juga melalui
pengamatan terhadap bentuk sel secara mikroskopis. Jika tidak terdapat
pertumbuhan zona bening dan verifikasi morfologi secara mikroskop memiliki
bentuk sel yang sama maka koloni Pseudomonas sp. AZM-1 tersebut digunakan
untuk analisa lebih lanjut.
Isolasi DNA genom mutan Pseudomonas sp. AZM-1. Isolasi DNA
genom dilakukan dengan menggunakan metode CTAB. Satu lup Pseudomonas sp.
AZM-1 dibiakkan di dalam 50 ml media King’s B (Lampiran 2.), pada suhu ruang
di inkubator bergoyang dengan kecepatan 60 rpm selama 24 jam. Sebanyak 50 ml
kultur sel mutan Pseudomonas sp. AZM-1 diambil dan dimasukkan ke dalam 2
tabung sentrifugasi 50 ml steril masing-masing 25 ml, kemudian disentrifugasi
selama 10 menit pada kecepatan 8500xg. Pelet yang didapat kemudian diresuspensi
dengan 250 µl bufer TE 1x (10 mM Tris HCL pH 8.0, 1mM EDTA), dan
dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml steril. Kemudian

disentrifugasi

kembali pada kecepatan 9000xg selama 10 menit, proses ini diulang 2-3 kali.
Suspensi kemudian ditambahkan 5 µl lisozim, tabung mikro 1.5 ml dibolak-balik
untuk mempercepat lisis sel. Selanjutnya, suspensi diinkubasi pada suhu 370C
selama 30 menit. Proses lisis sel dilanjutkan dengan menambahkan 500 µl SDS
10% dan proteinase K sebanyak 10 µl, tabung mikro 1.5 ml kemudian dibolakbalik. Suspensi diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit. Sebanyak 80 µl NaCl
dan 100 µl CTAB 10% ditambahkan ke dalam suspensi, kemudian diinkubasi pada
suhu 650C selama 20 menit, tabung kembali dibolak-balik.
Purifikasi

DNA dilakukan dengan menambahkan 650 µl fenol :

kloroform : isoamilalkohol (25:24:1). DNA dipisahkan dari debris sel dengan cara
disentrifugasi pada 13000xg selama 10 menit. Supernatan yang mengandung DNA
dipurifikasi dengan menambahkan 650 µl kloroform:isoamil alkohol (24:1) dan
selanjutnya disentrifugasi pada 13000xg selama 10 menit. Untuk pengendapan
DNA, supernatan yang didapat ditambahkan etanol absolut sebanyak 2 kali volume
supernatan dan sodium asetat 3M 10 % volume, pengendapan dibantu dengan
inkubasi di dalam mesin pembeku (-200C) selama 30 menit dan kemudian
dilakukan sentrifugasi pada 13000xg selama 15 menit. Pelet yang didapatkan
ditambahkan 70% etanol dingin untuk mengikat air. Suspensi kembali

15

disentrifugasi (13000xg; 15 menit), fase supernatan dibuang sedangkan pelet
dikeringudarakan dengan cara membuka tutup tabung mikro 1.5 ml dan dibiarkan
selama beberapa jam (2-3 jam). Kemudian pelet DNA dilarutkan dalam 20 µl
ddH2O steril.
Pemotongan dan ligasi DNA yang mengandung mni-Tn5Km1. DNA
genom Pseudomonas sp. AZM-1 dipotong dengan EcoRV kemudian potonganpotongan ini diligasikan kembali sehingga membentuk DNA linier seperti Gambar
6.

Pemotongan DNA dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut bufer

restriksi 2 µl, BSA 1 µl, dan enzim EcoRV 0.1 µl, kemudian campuran ditera
dengan ddH2O hingga volume akhir 20 µl. Campuran diinkubasi pada suhu 370C
selama 3 jam. DNA yang telah dipotong dengan enzim EcoRV, kemudian
diekstraksi dengan menggunakan metode ekstraksi fenol/kloroform. Proses
ekstraksi dilakukan dengan menambahkan 80 µl ddH2O pada tabung mikro 1.5 ml
yang berisi DNA hasil pemotongan dengan enzim EcoRV, kemudian ditambahkan
larutan fenol: kloroform: isoamilalkohol (25:24:1) satu kali volume DNA (100 µl).
Suspensi tersebut kemudian disentrifugasi pada 13000 xg selama 15 menit, fase
cair (aquosa) kemudian dipindahkan pada tabung mikro 1.5 ml baru dan steril.
DNA dipresipitasi dengan etanol absolut dan 0.1 volume sodium asetat 3 M, untuk
kemudian diinkubasi pada -200C selama 30 menit. DNA yang terpotong kemudian
dicuci dua kali dengan menggunakan etanol 70% dan disentrifugasi pada 13000 xg
selama 15 menit. Pelet DNA kemudian dikeringudarakan selama 2-3 jam. Pelet
DNA dilarutkan dalam 5 μL ddH2O steril.
DNA yang telah dipotong kemudian diligasi dengan menggunakan enzim
T4 DNA ligase sehingga membentuk molekul DNA sirkuler yang mengandung
mini Tn5Km1 yang diapit oleh primer Km O dan Km I. Ligasi dilakukan dengan
mencampurkan bufer ligase sebanyak 2 µl, DNA sebanyak 5 µl, enzim T4 DNA
ligase sebanyak 1 µl, campuran dilarutkan dengan ddH2O hingga volume reaksi 20
μL. Kemudian diinkubasi pada suhu 40C selama semalam.

16

Amplifikasi

DNA yang diapit mini-Tn5Km1.

Fragmen DNA yang

diapit mini-tn5 diamplifikasi menggunakan primer Km(O) dan primer Km(I)
dengan menggunakan cetakan DNA yang telah diligasikan pada Eco RV sehingga
menjadi bentuk sirkuler. Fragmen sirkuler DNA yang mengapit transposon miniTn5Km1 diamplifikasi dengan menggunakan mesin PCR dengsn komposisi PCR
adalah 1 l DNA hasil religasi, 1x buffer taq, 4 mM dNTP mix, 20 pmol primer
Km(0), 20 pmol primer Km(1), 4% DMSO, 0.25 U enzim taq DNA polymerase
(Generay) dan ddH2O sampai volume reaksi 20 l. Kondisi PCR adalah pra-PCR
95°C selama 3 menit, denaturasi 94°C selama 30 detik, penempelan primer 56°C
selama 30 detik dan pemanjangan 72°C selama 2 menit, siklus 35 kali, pasca-PCR
72°C selama 5 menit.
Eco RV

Eco RV

Km (O)
Mini-Tn5 Km1

DNA genom
Km (I)
Digesti dengan

EcoRV

Km (O)

Km (I)
Self ligation
(Circularization)

Amplifikasi dengan

inverse PCR
Km (I)

Km (O)

Gambar 5.

Skema proses amplifikasi fragmen DNA genom pengapit transposon.
a) DNA genom Pseudomonas sp. AZM-1 mutan non pelarut phosfat
yang dipotong dengan enzim EcoRV, b) Proses sirkularisasi
menggunakan enzim T4 DNA ligase, c) Proses amplifikasi DNA
genom pengapit transposon dengan inverse PCR.

17

Pengklonan hasil amplifikasi fragmen DNA pengapit

mini Tn5.

Pengklonan fragmen hasil PCR dilakukan dengan cara menyisipkan fragmen hasil
PCR yang telah dimurnikan pada pGEM®-T Easy. Hasil PCR diligasikan ke dalam
pGEM®-T Easy mengikuti petunjuk Promega. Sebelum diligasikan hasil PCR
dipurifikasi menggunakan Wizard® SV Gel & PCR Clean-up System (Promega,
USA). Metode purifikasi ini berperan dalam mengisolasi DNA dari gel agarosa
hasil elektroforesis. Setelah elektroforesis, gel yang berisi pita DNA dipotong
dan hasil cacahan dari gel tersebut dimasukkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml. Ke
dalam tabung tersebut ditambahkan 10 l membrane binding solution per 10 mg
cacahan gel, lalu dikocok dan diinkubasi pada suhu 50-65oC sampai gel benarbenar larut. Setelah larut, larutan dimasukkan ke dalam tabung penampung yang
dilengkapi dengan minikolom dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit.
Selanjutnya tabung penampung tersebut disentrifugasi pada kecepatan 10000 xg
selama 1 menit, cairan yang melewati minikolom dibuang
dimasukkan kembali pada tabung penampung.

dan

mini kolom

Proses pencucian dilakukan

dengan menambahkan 700 l membrane wash solution yang mengandung etanol
dan disentifugasi pada kecepatan 10.000 xg selama 1 menit. Cairan dibuang dan
minikolom dimasukkan kembali pada tabung penampung.
Tahap pencucian diulang dengan menambahkan 500 l membrane wash
solution dan disentrifugasi kembali pada kecepatan yang sama selama 5 menit.
Untuk proses elusi, minikolom dipindahkan dengan hati-hati pada tabung mikro 1.5
ml yang baru dan ditambahkan 50 l air bebas nuklease pada minikolom. Lalu
diinkubasi pada suhu ruang selama 1 menit dan disentrifugasi pada kecepatan
10000 xg selama 1 menit. Minikolom dibuang dan DNA yang tertampung pada
tabung mikro 1.5 ml disimpan pada suhu 4oC atau –20oC.
DNA hasil purifikasi kemudian diligasikan dengan

vektor plasmid

pGEM®-T Easy. Ligasi dilakukan dengan mencampurkan berturut-turut 3 l hasil
PCR, 1 l (10 ng) pGEM®-T Easy, 1 l (1U) T4 DNA ligase, 1 l 10x rapid buffer
ligation, dan ddH2O hingga volume reaksi 20 μL kemudian diinkubasi pada suhu

18

30°C selama semalam.

Plasmid rekombinan yang terbentuk kemudian

dintroduksikan ke dalam sel E. coli DH5α.
Transformasi E. coli DH5α. Hasil penyisipan produk PCR pada vektor
pGMT-Easy diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α mengikuti metode yang
dipublikasikan Suharsono (2002) yang meliputi dua tahap yaitu pembuatan sel
kompeten dan transformasi genetik bakteri. (1) Pembuatan bakteri kompeten,
koloni tunggal E. coli DH5α dibiakkan dalam 2 ml media LB [1% bakto-tryptona,
0,5% bakto-ekstrak khamir, 1% (b/v) NaCl] pada suhu 37°C semalam dan
bergoyang 250 rpm. Sebanyak 100 l E. coli DH5α dibiakkan kembali dalam 10
ml LB pada suhu 37°C di inkubator bergoyang sampai densitas bakteri

4.107 –

7.107 sel/ml (OD600nm sama dengan 0.4 sampai 0.5). Sebanyak 1.5 ml kultur bakteri
disentrifugasi 3000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit, endapan bakteri
disuspensikan dengan larutan penyangga transformasi (TB) (10 mM PIPES, 15
mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl2.4H2O, pH 6.7) sebanyak 0.33μl
volume kultur bakteri dan diinkubasi di es selama 10 menit. Selanjutnya
disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4°C selama 10 menit,
endapan bakteri diresuspensi dengan TB sebanyak 1/12 volume TB awal, ditambah
3.3 μl DMSO dan diinkubasi di es selama 10 me