Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk Meningkatkan Produksi Asam Indol Asetat melalui Mutagenesis dengan Transposon

KONSTRUKSI MUTAN Pseudomonas sp. CRB 17
UNTUK MENINGKATKAN PRODUKSI ASAM INDOL ASETAT
MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON

Mutiha Panjaitan
G34103046

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007

ABSTRAK
MUTIHA PANJAITAN. Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk Meningkatkan
Produksi Asam Indol Asetat melalui Mutagenesis dengan Transposon. Dibimbing oleh ARIS TRI
WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Banyak bakteri yang hidup di rizosfer yang berperan sebagai pemacu pertumbuhan
tanaman (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR). Salah satu di antaranya yaitu
Pseudomonas sp. Hasil isolasi dari tanah rizosfer kedelai didapatkan 100 isolat yang
dikategorikan Pseudomonas sp. Salah satu isolat yaitu Pseudomonas sp. CRB17 menghasilkan
asam indol asetat (IAA) tertinggi, yaitu sebesar 16.02 ppm. Untuk meningkatkan produksi IAA

yang dihasilkan, dilakukan mutagenesis dengan transposon menggunakan Escherichia coli S17-1
(λ pir) pembawa transposon miniTn5Km1 (pUTmini-Tn5Km1) sebagai donor dan Pseudomonas
sp. CRB17 sebagai resipien. Frekuensi konjugasi diperoleh berkisar 3.1 x 10-5 sel per resipien pada
konjugasi selama 24 jam. Sebanyak 49 mutan telah dianalisis produksi IAA yang dihasilkannya.
Mutan-mutan tersebut menghasilkan IAA dengan jumlah yang bervariasi mulai dari yang
mengalami penurunan IAA hingga 55.31 %, yang mengalami peningkatan produksi IAA hingga
77.52 %, dan sisanya menghasilkan IAA yang moderat. Dari hasil penelitian ini, mutagenesis
dengan transposon dapat digunakan untuk meningkatkan produksi IAA khususnya pada
Pseudomonas sp. CRB 17.

ABSTRACT
MUTIHA PANJAITAN. Construction of Mutant Pseudomonas sp. CRB 17 to Increase Indole
Acetic Acid Production by Transposon Mutagenesis. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and
NISA RACHMANIA MUBARIK.
Many bacteria living in the rhizosphere contribute as a plant growth promoter called as
plant growth promoting rhizobacteria. One of them is Pseudomonas sp.. One hundred isolates
categorized as Pseudomonas sp. was succesfully isolated from soybean rhizosphere soil. The
isolate Pseudomonas sp. CRB 17 produce highest amount of indole acetic acid (IAA) at 16.02
ppm. To increase IAA production, transposon mutagenesis had been done using Escherichia coli
S17-1 (λ pir), carrying miniTn5Km1 (pUTmini-Tn5Km1) as the donor and Pseudomonas sp. CRB

17 as the recipient strain. The frequency of conjugation obtained was approximately 3.1 x 10-5 cell
per recipient for 24 hours incubation time of conjugation. Forty nine mutants have been analyzed
for their IAA production. These mutants produced a varying amount of IAA, ranging from
mutants which have decreasing IAA production down to 55.31 %, mutants with moderate IAA
production, and the remaining with increasing IAA production up to 77.52 %. From the results of
this research can be concluded that transposon mutagenesis can be used to increase IAA
production of Pseudomonas sp. CRB 17.

KONSTRUKSI MUTAN Pseudomonas sp. CRB 17
UNTUK MENINGKATKAN PRODUKSI ASAM INDOL ASETAT
MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON

Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Sarjana Sains
pada Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Mutiha Panjaitan
G34103046

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007

Judul : Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk Meningkatkan
Produksi Asam Indol Asetat melalui Mutagenesis dengan Transposon
Nama : Mutiha Panjaitan
NRP : G34103046

Menyetujui:
Pembimbing I,

Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si
NIP. 131957319

Pembimbing II,

Dr. Nisa Rachmania Mubarik, M.Si
NIP. 132045531

Mengetahui:
Dekan Faklutas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor

Prof. Dr. Ir. Yonny Koesmaryono, MS
NIP 131473999

Tanggal lulus :

PRAKATA
Segala puji bagi Tuhan Yang Maha Kuasa atas berkat dan kasih-Nya, sehingga karya
ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari 2007 sampai dengan
Juli 2007, di Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi, Kampus IPB Baranang Siang,
Bogor.
Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si. dan Dr. Nisa
Rachmania Mubarik, M. Si. selaku pembimbing atas segala saran, dukungan dan waktu yang telah
diberikan. Penulis juga berterima kasih kepada Dr. Ir. Miftahudin, M.Si. atas perbaikan dan
masukan untuk penulisan karya ilmiah ini. Penelitian ini dibiayai oleh Program Insentif Penelitian
Dasar dari Kementerian Negara Riset dan Teknologi Indonesia kepada Dr. Aris Tri Wahyudi,

M.Si. dan untuk itu penulis mengucapkan terima kasih atas dukungan dananya. Terima kasih juga
penulis ucapkan kepada staf-staf laboratorium Mikrobiologi atas sarana dan bantuannya selama
penulis melakukan penelitian. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Pak Joni dan Mba Yeni
atas bantuan dan kerjasamanya.
Ucapan terima kasih dan rasa hormat juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta :
Ayah, Ibu, Kakak, Abang dan Adik untuk kasih, bantuan dan doanya. Terima kasih juga penulis
ucapkan kepada rekan-rekan dan teman satu lab: Sarah, Ka Rika, Mba Dini, Bibah, Andri, Ima,
Novan, Ai, Ika, Wahyu, Besty, Tri, Bu It, Mba Rina, Mba Widya, Bu Rene, dan Irni. Terima kasih
juga penulis ucapkan kepada Ka Deri, Icha, Rika, Ka Nita, Septi, Rosma, Merly, Bang Manaor, Ka
Sigit, Ka Nanda, dan teman-teman Bio 40 untuk bantuan, dukungan, dan tawanya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2007

Mutiha Panjaitan

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Hamburg tanggal 24 Mei 1985 dari ayah Maruli dan Ibu Irma.
Penulis merupakan anak ketiga dari empat bersaudara.
Penulis tamat SD tahun 1997 dan tamat SLTP tahun 2000. Tahun 2003 penulis lulus dari

SMU Negeri 1 Bogor dan pada tahun yang sama di diterima di Departemen Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Penelusuran Minat
dan Kemampuan (PMDK).
Selama mengikuti perkuliahan penulis pernah menjadi asisten Biologi Dasar,
Mikrobiologi Dasar dan Genetika Dasar. Penulis juga melaksanakan kegiatan praktik lapang pada
tahun 2006 di PT Actavis Indonesia, Jakarta Timur. Penulis juga pernah lolos seleksi PKMP
tingkat IPB dan mendapat dana penelitian PKMP dari Dikti. Penulis juga pernah mengikuti
seminar nasional Penelitian yang Dibiayai Hibah Kompetitif dalam Rangka Purnabakti Prof. Dr. Ir
Yayah Koswara sebagai presenter untuk mempresentasikan hasil penelitian ini, dan terpilih
sebagai presenter terbaik bidang bioteknologi.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL...................................................................................................................... vii
PENDAHULUAN.......................................................................................................................

1

METODE
Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai (Glycine max).....................

Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolat-isolat Pseudomonas sp. .................................
Esai Pemacuan Pertumbuhan ...................................................... ...............................
Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda dalam Seleksi Transkonjugan.................
Mutagenesis dengan Transposon................................................................................
Seleksi Transkonjugan dan Kuantifikasi Asam Indol Asetat.....................................

1
2
2
2
2
3

HASIL
Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai.........................................
Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolat-isolat Pseudomonas sp. ...............................
Esai Pemacuan Pertumbuhan...................................................... ..............................
Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda dalam Seleksi Transkonjugan.................
Mutagenesis dengan Transposon.................................................................................
Seleksi Transkonjugan dan Kuantifikasi Asam Indol Asetat......................................

3
3
3
5
5
5

PEMBAHASAN........................................................................................................................

6

SIMPULAN...............................................................................................................................

7

DAFTAR PUSTAKA.................................................................................................................

7

DAFTAR TABEL
Halaman
4

1

Uji produksi asam indol asetat isolat-isolat Pseudomonas sp...................................

2

Esai pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai oleh Pseudomonas sp. CRB 17..........

5

3

Persentase kenaikan asam indol asetat yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp.
CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon ................................................................

5

Persentase penurunan asam indol asetat yang dihasilkan oleh mutan Pseudomonas sp.
CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon ................................................................

6

4

PENDAHULUAN
Usaha ekstensifikasi dan intensifikasi
pertanian yang kian digalakkan untuk
mencapai swasembada pangan berimplikasi
terhadap penggunaan pupuk kimia yang terus
meningkat. Residu pupuk kimia diketahui
dapat mencemari perairan dan menimbulkan
eutrofikasi.
Teknologi
berwawasan
lingkungan yang dapat meningkatkan
efektivitas penggunaan pupuk kimia menjadi

penting untuk dikembangkan. Salah satu
produk teknologi alternatif yang ramah
lingkungan ialah dengan menggunakan
mikrob sebagai pupuk hayati.
Bakteri tanah hidup bebas di daerah
rizosfer yang menguntungkan dan telah
menunjukkan dapat memperbaiki kesehatan
atau meningkatkan hasil tanaman disebut
plant growth promoting rhizobacteria (PGPR)
(Dey et al. 2004). Mekanisme pemacuan
pertumbuhan tanaman yang dilakukan oleh
PGPR ialah melalui penambatan nitrogen,
produksi antibiotik, produksi siderofor,
pelarutan fosfat, dan produksi zat pengatur
tumbuh tanaman (Kapulnik & Okon 2002).
Beberapa PGPR mampu menghasilkan zat
pengatur tumbuh seperti auksin, giberelin,
dan sitokinin (Dey et al. 2004). Salah satu
genus PGPR yang banyak diteliti karena
kemampuannya dalam menghasilkan auksin
ialah
Pseudomonas.
Sebagai
contoh
Pseudomonas
putida
telah
diketahui
menghasilkan berbagai zat pemacu tumbuh
termasuk auksin dan giberelin, siderofor, asam
organik dan antibiotik (Premono & Widyastuti
1996, Patten & Glick 2002).
Asam indol asetat (IAA) adalah auksin
yang paling aktif untuk berbagai tanaman dan
berperan
penting
dalam
pemacuan
pertumbuhan,
seperti
inisiasi
akar,
pembesaran sel, diferensiasi pembuluh dan
pemacu pembungaan. Tanaman kurang
mampu menghasilkan IAA yang cukup untuk
pertumbuhan yang optimal. Sejumlah bakteri
telah diidentifikasi mensintesis IAA pada
biakan murni dan di tanah (Husen &
Saraswati 2003). Pseudomonas putida GR122 penghasil auksin berupa asam indol asetat
mampu memacu perpanjangan akar primer
dan pembentukan akar lateral (Patten & Glick
2002).
Berbagai jalur sintesis IAA digunakan
oleh prokariot. Suatu galur bakteri dapat
menggunakan lebih dari satu jalur sintesis
IAA.
Jalur-jalur
ini
dikelompokkan
berdasarkan jenis intermediatnya, yaitu jalur
indol asetamida (IAM), asam indol-3-piruvat

(IPA), triptamin, dan indol-3-asetonitril
(Manulis et al. 1998). Bakteri yang
menguntungkan bagi bakteri menggunakan
jalur IPA sebagai jalur utama untuk
mensintesis IAA (Patten & Glick 2002).
Mutagenesis
dengan
transposon
merupakan salah satu metode untuk membuat
mutan dengan cara menyisipkan segmen DNA
(transposon) ke dalam genom bakteri yang
bersangkutan (Wahyudi 2001). Secara umum
metode ini digunakan untuk isolasi dan
lokalisasi gen. Transposon merupakan suatu
fragmen DNA yang dapat meloncat dan
menyisip pada genom organisme (Wahyudi
2000). Transposon ini akan menyisip pada
DNA secara random. Dengan adanya
penyisipan transposon ini dapat menyebabkan
perubahan genetik yang memiliki kontribusi
penting dalam evolusi genom karena selain
dapat menyisip ke dalam genom, penyisipan
juga dapat terjadi pada sekuen DNA yang
berperan untuk regulasi proses fisiologi
tertentu sehingga dapat menyebabkan
modifikasi ekspresi gen dan menyebabkan
mutasi kromosom.
Transposon Tn5 sering digunakan untuk
kegiatan mutagenesis dengan transposon
seperti pada penelitian yang dilakukan oleh
Harayama et al. (1984) untuk menganalisis
operon gen jalur pemotongan meta dari
plasmid TOL Pseudomonas putida mt-2.
Selain itu, Wahyudi (2005) juga melakukan
mutagenesis dengan transposon dalam
penelitiannya untuk melaporkan konstruksi
pustaka genom Magnetospirillum magneticum
AMB-1 dan penapisan pustaka yang
membawa gen yang terlibat dalam biosintesis
magnetosom.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengkarakterisasi Pseudomonas sp. asal
rizosfer tanaman kedelai yang berpotensi
sebagai pemacu pertumbuhan tanaman, serta
mengkonstruksi mutan Pseudomonas sp.
CRB17 untuk meningkatkan produksi IAA
melalui mutagenesis dengan transposon.

METODE
Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer
Tanaman Kedelai (Glycine max)
Pseudomonas sp. diisolasi dari tanah
rizosfer kedelai daerah Cirebon. Isolasi
dilakukan
dengan
pengenceran
serial
menggunakan garam fisiologis 0.85 % hingga
10-4. Tiga pengenceran terakhir disebar pada
media agar King’s B (20 g pepton, 15 mL
gliserol, 1.5 g K2HPO4, 1.5 g MgSO4.7H2O,
15 g agar, 1 L akuades) dan diinkubasi selama

2

24 jam. Koloni-koloni yang tumbuh kemudian
diamati morfologinya dan diuji fisiologinya
yang meliputi pewarnaan Gram, bentuk sel,
motilitas, dan reaksi uji oksidase.
Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolatisolat Pseudomonas sp.
Uji produksi IAA dilakukan sesuai metode
Patten dan Glick (2002). Isolat-isolat
Pseudomonas sp. diinokulasikan ke dalam 5
ml media cair King’s B dengan penambahan
triptofan 0.5 mM, selanjutnya diinkubasi
selama 48 jam (120 rpm) pada suhu ruang.
Triptofan digunakan sebagai prekursor
terbentuknya IAA (Vande Broek et al. 2005).
Sebanyak 1.5 mL kultur disentrifus selama 15
menit pada 10000 rpm. Selanjutnya 1 mL
supernatannya dicampur dengan reagen
Salkowski (150 ml H2SO4 pekat, 250 mL
H2O destilata, 7.5 mL 0.5 M FeCl3·6H2O) dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit
untuk kemudian diukur absorbansinya pada
λ520 nm (Spectronic 20, Bausch & Lomb,
US). Konsentrasi IAA ditentukan dengan
membandingkannya terhadap kurva standar
IAA dengan kisaran konsentrasi 0–30 ppm.
Esai Pemacuan Pertumbuhan
Esai pemacuan pertumbuhan dilakukan
sesuai metode Dey et al. (2004). Isolat
Pseudomonas sp. CRB 17 yang memproduksi
IAA tinggi digoreskan secara penuh pada
media agar King’s B, diinkubasi selama 24
jam dan disuspensikan dengan kaldu nutrien
steril. Sebanyak 100 µL kultur dengan
konsentrasi 1010 sel per mL dipipet dan
diinokulasikan pada tiap kecambah kedelai
varietas Slamet berumur 24 jam pada media
agar semisolid dalam cawan petri. Kecambah
diinkubasi selama 7 hari. Uji ini dilakukan
dengan tiga ulangan cawan petri. Sebanyak 9
kecambah digunakan untuk tiap ulangannya.
Parameter yang diamati meliputi panjang akar
primer dan jumlah akar. Analisis data
dilakukan menggunakan uji Anova SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences)
12.0 for Windows.
Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda
dalam Seleksi Transkonjugan
Uji resistensi antibiotik dilakukan terhadap
Escherichia coli S-17 λ pir (donor) dan isolat
Pseudomonas sp. CRB 17. Jenis antibiotik
yang digunakan dalam pengujian yaitu
kanamisin, kloramfenikol, rifampisin, dan
ampisilin pada konsentrasi 50 µg/mL.
Masing-masing jenis antibiotik ditambahkan
pada media-media agar Luria (10 g tripton, 5

g ekstrak khamir, 10 g NaCl, 15 g agar dan
akuades 1 L). Baik E. coli S17-1 λ pir
maupun CRB17 ditumbuhkan pada media
tersebut dengan cara digores, dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu ruang untuk CRB17
dan pada suhu 37 oC untuk E. coli .
Mutagenesis dengan Transposon
Konstruksi mutan dilakukan dengan
menyisipkan gen kanamisin resisten (Km1)
yang dibawa transposon mini-Tn5Km1 yang
berada pada plasmid
pUTmini-Tn5Km1
dalam E. coli S17-1 λ pir (donor) ke dalam
genom Pseudomonas sp. CRB17 (resipien)
secara diparental mating. Biakan resipien
CRB17 ditumbuhkan pada 50 mL King’s B
cair + Kloramfenikol (Kl) 50 µg/mL dalam
erlenmeyer 250 mL. Selanjutnya kultur
diinkubasi pada mesin bergoyang dengan
kecepatan 120 rpm pada suhu ruang selama 24
jam. Sementara biakan donor E. coli S17-1 (λ
pir) ditumbuhkan pada media 50 mL Luria
Broth (LB) + Kanamisin (Km) 50 µg/mL
dalam erlenmeyer 250 mL dinkubasi pada
inkubator bergoyang (120 rpm) pada suhu
370C selama 20 jam.
Perbandingan jumlah sel donor dan
resipien yang digunakan ialah 1:1 (kisaran
konsentrasi 108 : 108). Kultur sel donor dan
resipien disentrifugasi dan pelet yang
terbentuk dicuci sebanyak 3 kali dan
diresuspensi dalam garam fisiologis. Pelet sel
resipien yang telah dipanen ditambahkan LB
sebanyak 40 µL. Suspensi sel resipien
kemudian dipindahkan ke dalam tabung mikro
yang berisi pelet sel donor. Suspensi
campuran sel donor dan resipien diresuspensi
dan dipindahkan ke membran filter milipore
steril dan diletakan di atas media Luria Agar
(LA), begitu pula pelet sel donor dan pelet sel
resipien saja sebagai kontrol negatif. Inkubasi
dilakukan selama 24 jam. Masing-masing
membran milipore selanjutnya diangkat dan
dimasukkan ke dalam tabung mikro berisi 1
mL garam fisiologis. Setelah divorteks hingga
sel terlepas dari membran milipore, sebanyak
100 µL suspensi sel disebarkan pada agar
cawan King’s B + Km 50 µg/mL + Kl 50
µg/mL dan diinkubasi selama 24 jam pada
suhu ruang. Koloni yang muncul pada media
tersebut menunjukkan Pseudomonas sp.
CRB17 mutan yang telah tersisipi genomnya
oleh gen Km1 dari transposon Mini-Tn5Km1
sehingga selain resisten kloramfenikol juga
resisten kanamisin. Diagram skematik
mutagenesis dengan transposon dalam
kegiatan ini terlihat pada Gambar 1.

3

Gambar 1 Diagram skematik mutagenesis dengan transposon.
Seleksi Transkonjugan dan Kuantifikasi
Asam Indol Asetat
Seleksi dilakukan terhadap 49 mutan
Pseudomonas sp CRB17 yang ditentukan
secara random. Tiap mutan ditumbuhkan
dalam 5 mL media King’s B cair + 50 µg/mL
Kl dan diinkubasi di inkubator bergoyang
(120 rpm, suhu ruang) selama 24 jam sebagai
prekultur. Sebanyak 100 µL biakan prekultur
kemudian diinokulasikan ke dalam 5 mL
media King’s B cair + Kl 50 µg/mL yang
disuplementasi dengan 0.5 mM L-triptofan
dan dinkubasi pada suhu ruang serta digoyang
pada 100 rpm selama 48 jam. Sebanyak 1.5
mL kultur disentrifus selama 15 menit pada
10000 rpm, kemudian sebanyak 1 mL
supernatan dicampur rata dengan 4 ml reagen
Salkowski dan dibiarkan pada suhu ruang
selama 20 menit dalam keadaan gelap dan
selanjutnya diukur absorbansinya pada λ520
nm (Spectronic 20, Bausch & Lomb, US).
Konsentrasi
IAA
ditentukan
dengan
membandingkannya terhadap kurva standar
IAA dengan kisaran konsentrasi 0–30 ppm.
Konsentrasi IAA yang dihasilkan mutanmutan Pseudomonas sp. CRB17 dibandingkan
dengan konsentrasi IAA Pseudomonas sp.
CRB17 tipe liarnya.

HASIL
Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer
Tanaman Kedelai
Hasil isolasi dari tanah rizosfer kedelai
daerah Cirebon didapatkan 100 isolat yang

dikategorikan Pseudomonas sp. Isolat-isolat
tersebut memiliki karakter mampu tumbuh
pada media agar King’s B, berbentuk batang,
motil, Gram negatif, dan uji oksidasenya
positif (Holt et al. 1994, Gambar 2).
Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolatisolat Pseudomonas sp.
Berdasarkan hasil uji produksi IAA
menyatakan bahwa 98 isolat Pseudomonas sp.
yang telah berhasil diisolasi menghasilkan
IAA dengan konsentrasi yang berbeda-beda.
Salah satu isolat yaitu Pseudomonas sp.
CRB17 diketahui sebagai galur penghasil IAA
terbesar, yakni sebesar 16.02 ppm (Tabel 1).
Isolat tersebut diketahui mampu menghasilkan
pigmen fluoresen pada media King’s B,
sehingga dapat dikatakan Pseudomonas sp.
CRB17 termasuk kelompok Pseudomonads
yang berfluoresen. Isolat CRB17 ini
selanjutnya digunakan untuk telaah lebih
lanjut pada telaah pemacuan pertumbuhan dan
mutagenesis dengan transposon.
Esai Pemacuan Pertumbuhan
Hasil uji pemacuan pertumbuhan terhadap
kecambah kedelai menunjukkan bahwa isolat
Pseudomonas sp. CRB17 ternyata mampu
memacu
pertumbuhan
dengan
memperpanjang
akar
primer
dan
memperbanyak jumlah akar. Hal ini
dibuktikan dari nilai parameter esai pemacuan
pertumbuhan kecambah kedelai
yang
diinokulasi CRB 17 secara signifikan berbeda
nyata dengan kontrol pada taraf 5% (Tabel 2).

4

A

B

4 µm

0.17 cm

Gambar 2 (A) Penampilan koloni Pseudomonas sp. CRB 17 pada agar King’s B berumur 48 jam,
dan (B) penampilan sel Pseudomonas sp. CRB 17 berbentuk batang hasil pewarnaan
Gram.
Tabel 1 Uji produksi asam indol asetat isolat-isolat Pseudomonas sp.
No
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36

Nama
Isolat
Crb-7
Crb-38
Crb-89
Crb-88
Crb-84
Crb-82
Crb-81
Crb-27
Crb-25
Crb-3
Crb-37
Crb-32
Crb-29
Crb-34
Crb-33
Crb-19
Crb-14
Crb-22
Crb-41
Crb-44
Crb-39
Crb-30
Crb-36
Crb-90
Crb-73
Crb-42
Crb-16
Crb-75
Crb-43
Crb-20
Crb-31
Crb-80
Crb-97
Crb-71
Crb-78
Crb-57

Konsentrasi IAA
(ppm) yang dihasilkan
0.00
0.00
0.33
0.81
1.13
1.44
1.52
1.98
2.20
2.32
2.34
2.60
2.64
2.82
3.26
3.37
3.45
3.45
3.73
3.73
3.91
4.31
4.39
4.39
4.45
4.61
4.89
5.04
5.08
5.16
5.45
5.45
5.85
6.04
6.26
6.31

No
51
52
53
54
55
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86

Nama
Isolat
Crb-68
Crb-18
Crb-70
Crb-55
Crb-60
Crb-6
Crb-11
Crb-62
Crb-40
Crb-51
Crb-9
Crb-48
Crb-52
Crb-59
Crb-92
Crb-96
Crb-100
Crb-4
Crb-2
Crb-67
Crb-45
Crb-93
Crb-49
Crb-50
Crb-1
Crb-47
Crb-58
Crb-61
Crb-98
Crb-54
Crb-94
Crb-86
Crb-53
Crb-66
Crb-65
Crb-28

Konsentrasi IAA
(ppm) yang dihasilkan
7.72
7.82
7.86
8.04
8.12
8.35
8.35
8.43
8.66
8.79
8.98
8.98
9.18
9.18
9.18
9.18
9.30
9.46
9.58
9.62
9.65
9.74
10.01
10.17
10.21
10.36
10.60
10.68
10.93
11.27
11.52
11.60
11.66
11.74
11.90
12.16

5

Lanjutan
No
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
Tabel 2

Nama
Isolat
Crb-77
Crb-72
Crb-91
Crb-74
Crb-12
Crb-99
Crb-69
Crb-85
Crb-79
Crb-8
Crb-13
Crb-95
Crb-83
Crb-10

Konsentrasi IAA
(ppm) yang dihasilkan
6.31
6.40
6.48
6.63
6.68
6.88
7.13
7.24
7.26
7.40
7.40
7.44
7.60
7.64

Esai pemacuan pertumbuhan
kecambah
kedelai
oleh
Pseudomonas sp. CRB 17

Perlakuan

Panjang
akar
primer
(cm)
21.4*

Jumlah
akar

75*
Pseudomonas
sp. CRB 17
Kontrol
11.4
32
* berbeda nyata secara stastistik pada taraf
5%
Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda
dalam Seleksi Transkonjugan
Berdasarkan hasil uji resistensi diketahui
bahwa E. coli S17-1 λ pir (donor) sensitif
terhadap kloramfenikol 50 µg/ml, namun
resisten kanamisin 50 µg/ml. Sedangkan
Pseudomonas sp. CRB17 diketahui sensitif
terhadap kanamisin 50 µg/ml, namun resisten
kloramfenikol 50 µg/ml. Dengan demikian
antibiotik kanamisin dan kloramfenikol dapat
digunakan
sebagai
marker
seleksi
transkonjugan/mutan
Pseudomonas
sp.
CRB17 hasil mutagenesis dengan transposon.
Mutagenesis dengan Transposon
Hasil mutagenesis dengan transposon
menunjukkan bahwa gen kanamisin resisten
(Km1) telah berhasil diintegrasikan ke dalam
genom Pseudomonas sp. CRB17 melalui
konjugasi diparental mating. Frekuensi
transkonjugasi hasil transposon mutagenesis
tersebut yang didapat dari masa inkubasi
konjugasi selama 24 jam sekitar 3.1 x 10-5 sel
per resipien.

No
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100

Nama
Isolat
Crb-56
Crb-26
Crb-35
Crb-5
Crb-23
Crb-87
Crb-15
Crb-21
Crb-63
Crb-64
Crb-76
Crb-24
Crb-46
Crb-17

Konsentrasi IAA
(ppm) yang dihasilkan
12.29
12.53
12.53
12.75
13.17
13.55
13.99
14.15
14.42
14.46
14.63
15.16
15.80
16.02

Seleksi Transkonjugan dan Kuantifikasi
IAA
Seleksi mutan Pseudomonas sp. CRB17
terhadap produksi IAA telah dilakukan
terhadap 49 mutan hasil mutagenesis dengan
transposon. Dari hasil seleksi diperoleh
sebanyak 21 transkonjugan menghasilkan
IAA yang lebih tinggi daripada tipe liarnya
yaitu mengalami kenaikan produksi IAA-nya
hingga 77.52 % (Tabel 3). Transkonjugan I 3
diketahui
merupakan
mutan
yang
menghasilkan IAA paling tinggi yaitu
kenaikan produksi IAA-nya hingga 77.52 %
dibandingkan tipe liarnya (Tabel 3). Sebanyak
28 mutan menghasilkan IAA yang lebih
rendah dibandingkan dengan tipe liarnya yaitu
dengan persentase penurunan hingga 55.31 %.
Salah satu transkonjugan yaitu II 73
mengalami
penurunan
(downregulated)
sebanyak 55.31% (Tabel 4).
Tabel 3 Persentase kenaikan asam indol asetat
yang
dihasilkan
oleh
mutan
Pseudomonas sp. CRB17 hasil
mutagenesis dengan transposon
Mutan
III 73
II 20
I 25
I 33
III 41
III 14
II 30
V 11
II 7
I 31
I 32

Kenaikan
produksi
IAA (%)
1.80
2.93
5.12
8.13
8.33
9.53
9.83
10.29
10.62
14.76
17.81

Mutan
I 22
II 99
V 20
I 23
I8
II 11
I2
I1
I 11
I3

Kenaikan
produksi
IAA (%)
22.99
30.41
32.67
37.94
48.43
49.58
51.48
65.59
70.54
77.52

6

Tabel 4

Mutan
I 18
II 41
II 4
III 20
I 16
II 23
II 52
II 33
I 30
I 27
III 4
I 29
III 63
II 63

Persentase penurunan asam indol
asetat yang dihasilkan oleh mutan
Pseudomonas sp. CRB17 hasil
mutagenesis dengan transposon
Penurunan
produksi
IAA (%)
2.66
4.39
7.68
8.64
10.39
11.37
11.49
14.37
14.63
14.76
17.90
19.58
20.04
21.62

Mutan
III 52
III 2
I 26
III 11
II 83
V14
II 92
V7
III 23
III 83
V 23
I 28
III 30
II 73

Penurunan
Produksi
IAA (%)
22.79
30.12
31.47
32.94
33.71
34.56
39.68
39.96
40.61
47.31
47.68
54.61
54.73
55.31

PEMBAHASAN
Pseudomonas sp. yang berpotensi dalam
penghasilan IAA yang mampu memacu
pertumbuhan banyak terdapat di rizosfer suatu
tanaman (Dey et al. 2004). Oleh karenanya,
dalam penelitian ini untuk mendapatkan isolat
Pseudomonas sp. penghasil IAA maka
dilakukan isolasi Pseudomonas sp. dari
rizosfer tanaman kedelai. Sebanyak 100 isolat
dikategorikan sebagai Pseudomonas sp.
Karakter-karakter umum yang dimiliki
Pseudomonas sp. tersebut adalah berbentuk
batang, motil, Gram negatif, memiliki
oksidase positif dan mampu tumbuh pada
media semiselektif King’s B (Holt et al.
1994).
Berdasarkan hasil uji produksi IAA
didapatkan bahwa Pseudomonas sp. CRB17
merupakan isolat penghasil IAA tertinggi
yaitu sebesar 16.02 ppm (Tabel 1). Isolat
CRB17 ini selanjutnya dipilih untuk
dikonstruksi mutan yang menghasilkan IAA
lebih tinggi. Karakter lain yang dimiliki
CRB17 ialah menghasilkan pigmen fluoresen
pada media King’s B. Banyak spesies
Pseudomonas sp. yang mampu menghasilkan
pigmen yang berfluoresen terutama pada
kondisi pertumbuhan miskin besi misalnya
jika ditumbuhkan pada media King’s B yang
tidak ditambahkan zat besi. Beberapa pigmen
ini dan turunannya berperan sebagai siderofor
(zat pengkelat besi) yang berpotensi
menghambat pertumbuhan patogen (Garibaldi
1967).

Berdasarkan
hasil
esai
pemacuan
pertumbuhan diketahui bahwa Pseudomonas
sp. CRB17 mampu memacu pertumbuhan
kecambah kedelai. Hal ini dibuktikan dari
nilai parameter esai pemacuan pertumbuhan
kecambah yang diinokulasi CRB17 yang
secara signifikan berbeda nyata dengan
kontrol. Panjang akar primer kecambah yang
diinokulasi CRB17 memiliki rataan sebesar
21.4 cm dan jumlah akarnya sebanyak 75
buah. Sedangkan panjang akar primer kontrol
sebesar 11.4 cm dan jumlah akarnya sebanyak
32 buah (Tabel 2). Dari hasil ini dapat
dikatakan bahwa isolat Pseudomonas sp.
CRB17 dengan konsentrasi IAA yang
dihasilkannya, dapat berperan sebagai
rhizobakteria pemacu pertumbuhan tanaman
khususnya kedelai.
IAA yang disekresikan oleh suatu bakteri
kemungkinan dapat memacu pertumbuhan
baik secara langsung dengan merangsang
pemanjangan atau pembelahan sel atau secara
tidak langsung dengan mempengaruhi
aktivitas
asam
1-aminocyclopropane-1carboxylic (ACC) deaminase. Enzim ini
menghidrolisis ACC tanaman, prekursor
fitohormon etilen, sehingga mencegah
produksi etilen dengan konsentrasi yang
menghambat pertumbuhan. IAA eksogenus
dapat meningkatkan transkripsi dan aktivitas
sintesis ACC pada tanaman. ACC ini memacu
aktivitas ACC deaminase bakteri (Patten &
Glick 2002).
Dari hasil uji resistensi didapatkan bahwa
Pseudomonas sp. CRB17 sensitif kanamisin
50 µg/ml dan resisten kloramfenikol 50
µg/ml. Sehingga E. coli S17-1 λ pir pembawa
plasmid pUTmini-Tn5Km1 yang memiliki
transposon resistensi kanamisin dapat
digunakan dalam proses mutagenesis CRB17.
Selain itu, dari hasil uji resistensi ini
didapatkan bahwa antibiotik kanamisin dan
kloramfenikol dapat digunakan sebagai
marker
seleksi
transkonjugan/mutan
Pseudomonas sp. CRB17 hasil mutagenesis
dengan transposon.
Frekuensi transkonjugasi hasil transposon
mutagenesis tersebut yang didapat dari masa
inkubasi konjugasi selama 24 jam sekitar 3.1
x 10-5 sel per resipien. Frekuensi ini lebih
tinggi dibandingkan penelitian Rukayadi
(1998)
yang
mendapatkan
frekuensi
transkonjugasi pada Xanthomonas campestris
sebesar 8.3 x 10-6 menggunakan galur E. coli
yang sama. Mutan-mutan Pseudomonas sp.
CRB17 yang dihasilkan melalui mutagenesis
dengan transposon diekspresikan melalui
kemampuannya tumbuh pada media King’s B

7

yang ditambah kloramfenikol dan kanamisin.
Hal ini mengindikasikan bahwa gen Km1
yang dibawa transposon mini-Tn5Km1 telah
berhasil disisipkan ke dalam genom
Pseudomonas sp. CRB17.
Transposon Tn5 merupakan salah satu
transposon yang telah banyak dikaji karena
menyediakan model sistem transposisi cut(potong) dan paste- (pindah) yang baik.
Transposon mini-Tn5Km1 merupakan turunan
dari Tn5 yang sangat berguna untuk
mutagenesis pada bakteri
Gram negatif
(Holtwick et al. 1997).
Selama konjugasi plasmid pUTminiTn5Km1 dipotong menjadi utas tunggal dan
utas tunggal ini pindah ke dalam sel resipien
melalui pili. Pada sel resipien transposon
penyandi resistensi kanamisin ini akan
menyisip acak pada genom resipien sehingga
menghasilkan transkonjugan yang resisten
kanamisin. Oleh karena itu pada media untuk
seleksi transkonjugan ditambahkan antibiotik
kanamisin sebagai penanda adanya penyisipan
transposon.
Penyisipan transposon mini-Tn5Km1 ini
bersifat stabil karena gen transposase berada
di luar transposon sehingga setelah transposon
menyisip pada genom resipien tidak terjadi
transposisi lagi yang diperantarai transposase.
Selain itu juga karena plasmid pUTminiTn5Km1 merupakan plasmid bunuh diri.
Plasmid ini tidak dapat bereplikasi dalam sel
resipien karena hanya dapat bereplikasi dalam
sel yang menyediakan protein pir (protein
initiation replication). Kemudian akhirnya
plasmid ini akan terdegradasi oleh DNAase.
.
Dari hasil seleksi diperoleh sebanyak 21
transkonjugan menghasilkan IAA yang lebih
tinggi daripada tipe liarnya yaitu mengalami
kenaikan produksi IAA-nya hingga 77.52 %
(Tabel 3). Hal ini diduga karena adanya
penyisipan transposon di daerah represor dan
mengakibatkan terjadinya perubahan pada
gen-gen yang terlibat dalam regulasi
biosintesis IAA sehingga produksi IAA
menjadi meningkat (Pratiwi et al. 2001).
Selain itu juga didapatkan 28 mutan
menghasilkan IAA yang lebih rendah
dibandingkan dengan tipe liarnya yaitu
dengan persentasi penurunan hingga 55.31 %
dari hasil uji produksi IAA ini (Tabel 4).
Mutan yang mengalami penurunan produksi
IAA ini mungkin disebabkan oleh adanya
penghambatan salah satu gen dalam
penghasilan IAA.
Melalui transposon mutagenesis ini tidak
didapatkan mutan yang tidak menghasilkan
IAA. Hal ini mungkin dikarenakan banyaknya

jalur sintesis yang digunakan dalam
penghasilan IAA yang kemungkinan dimiliki
oleh galur Pseudomonas. Jika salah satu jalur
saja terhambat karena salah satu gen yang
berperan dalam jalur tersebut tidak dapat
diekspresikan akibat penyisipan transposon
maka bakteri penghasil IAA dapat mengambil
jalur sintesis alternatif. Hal serupa juga
ditemui dalam penelitian Pratiwi et al. (2001)
yaitu didapatkan mutan-mutan Azospirillum
braziliense menghasilkan IAA yang lebih
tinggi dan lebih rendah melalui transposon
mutagenesis.

SIMPULAN
Sebanyak 100 isolat Pseudomonas sp. telah
berhasil diisolasi dari tanah rizosfer tanaman
kedelai daerah Cirebon. Sebanyak 98 isolat di
antaranya menghasilkan asam indol asetat.
Salah satu isolat yaitu Pseudomonas sp. CRB
17 merupakan penghasil IAA tertinggi yakni
sebesar 16.02 ppm dan mampu memacu
pertumbuhan tanaman kedelai melalui
pemacuan perpanjangan akar primer dan
pembentukan akar. Melalui mutagenesis
dengan transposon dapat dikonstruksi mutan
Pseudomonas sp. CRB17 yang menghasilkan
IAA dengan konsentrasi yang meningkat
hingga 77.52%. Dari hasil penelitian ini,
mutagenesis dengan transposon dapat
digunakan untuk meningkatkan produksi IAA,
khususnya pada Pseudomonas sp. CRB17.

DAFTAR PUSTAKA
Dey R, Pal KK, Bhatt DM, Chauhan SM.
2004. Growth promotion and yield
enhancement
of
peanut
(Arachis
hypogaea L.) by application of plant
growth-promoting
rhizobacteria.
Microbiol Res 159 : 371-394.
Garibaldi JA. 1967. Media for the
enhancement of fluorescent pigment
production by Pseudomonas species. J
Bacteriol 94 :1296-1299.
Harayama S, Lehrbach PR, Timmis KN.
1984. Transposon mutagenesis analysis
of meta-cleavage pathway operon genes
of the TOL plasmid of Pseudomonas
putida mt-2. J Bacteriol 160 : 251-255
Holt JG, et al. 1994. Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology. Ed ke-9.
Philadelphia: Lippincott William &
Wilkins

8

Holtwick R, Meinhardt F, Keweloh H. 1997.
Cis- trans isomerization of unsatturated
fatty acids: cloning and sequencing of the
cti gene from Pseudomonas putida P8.
Appl Environ Microbiol 63:4292-4297.
Husen E, Saraswati R. 2003. Effect of IAAproducing bacteria on the growth of hot
pepper. J Mikrobiol Indones 8 : 22-26
Kapulnik Y, Okon Y. 2002. Plant growth
promotion by rhizosphere bacteria. Di
dalam : Warsel Y, Eshel A, Kafkafi U
,editor. Plant Roots: The Hidden Half. Ed
ke-3. New York: Marcel Dekker. hlm.
869-885.
Manulis S, Haviv-Chesner A, Brandl MT,
Lindow SE, Barash I. 1998. Differential
involvement of Indole-3-Acetic Acid
biosynthetic pathways in pathogenicity
and epiphytic fitness of Erwinia herbicola
pv. gypsophilae. Mol Plant Microbe
Interac 11: 634–642.
Patten CL, Glick BR. 2002. Role of
Pseudomonas putida indoleacetic acid in
development of the host plant root
system. Appl Environ Microbiol 68 :
3795-3801.
Pratiwi E, Suwanto A, Gunarto L, Adijuwana
H. 2001. Karakterisasi mutan biosintesis
asam indol asetat pada Azospirillum
lipoferum J21.4 yang dihasilkan dari
mutagnesis transposon. Hayati 8 : 18-22

Premono ME. Widyastuti R. 1996. Status hara
tanaman jagung yang diinokulasi dengan
Pseudomonas putida L27A4A1. Hayati 3
: 55-60
Rukayadi Y, Suwanto A, dan Tjahjono B.
1998.
Konstruksi
plasmid
yang
mengandung situs PacI dan PmeI untuk
transposon
mutagenesis
pada
Xanthomonas campestris. Hayati 5 :7985
Vande Broek et al. 2005. Transcriptional
analysis of the Azospirillum brasilense
Indole-3-Pyruvate decarboxylase gene
and identification of a cis-Acting
sequence involved in auxin responsive
expression. Mol Plant Mirobec Interac 18
: 311–323.
Wahyudi AT. 2000. Inverse polymerase chain
reaction. Hayati 7: 121-123
Wahyudi AT. 2001. Perpustakaan gen :
bagaimana mengkonstruksinya. Hayati 8:
27-30
Wahyudi AT. 2005. Konstruksi pustaka
genom Magnetospirillum magneticum
AMB-1 dan penapisan gen yang terlibat
dalam sintesis magnetosom. Hayati 10:
91-95

9

KONSTRUKSI MUTAN Pseudomonas sp. CRB 17
UNTUK MENINGKATKAN PRODUKSI ASAM INDOL ASETAT
MELALUI MUTAGENESIS DENGAN TRANSPOSON

Mutiha Panjaitan
G34103046

DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2007

ABSTRAK
MUTIHA PANJAITAN. Konstruksi Mutan Pseudomonas sp. CRB17 untuk Meningkatkan
Produksi Asam Indol Asetat melalui Mutagenesis dengan Transposon. Dibimbing oleh ARIS TRI
WAHYUDI dan NISA RACHMANIA MUBARIK.
Banyak bakteri yang hidup di rizosfer yang berperan sebagai pemacu pertumbuhan
tanaman (plant growth promoting rhizobacteria, PGPR). Salah satu di antaranya yaitu
Pseudomonas sp. Hasil isolasi dari tanah rizosfer kedelai didapatkan 100 isolat yang
dikategorikan Pseudomonas sp. Salah satu isolat yaitu Pseudomonas sp. CRB17 menghasilkan
asam indol asetat (IAA) tertinggi, yaitu sebesar 16.02 ppm. Untuk meningkatkan produksi IAA
yang dihasilkan, dilakukan mutagenesis dengan transposon menggunakan Escherichia coli S17-1
(Ȝ pir) pembawa transposon miniTn5Km1 (pUTmini-Tn5Km1) sebagai donor dan Pseudomonas
sp. CRB17 sebagai resipien. Frekuensi konjugasi diperoleh berkisar 3.1 x 10-5 sel per resipien pada
konjugasi selama 24 jam. Sebanyak 49 mutan telah dianalisis produksi IAA yang dihasilkannya.
Mutan-mutan tersebut menghasilkan IAA dengan jumlah yang bervariasi mulai dari yang
mengalami penurunan IAA hingga 55.31 %, yang mengalami peningkatan produksi IAA hingga
77.52 %, dan sisanya menghasilkan IAA yang moderat. Dari hasil penelitian ini, mutagenesis
dengan transposon dapat digunakan untuk meningkatkan produksi IAA khususnya pada
Pseudomonas sp. CRB 17.

ABSTRACT
MUTIHA PANJAITAN. Construction of Mutant Pseudomonas sp. CRB 17 to Increase Indole
Acetic Acid Production by Transposon Mutagenesis. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI and
NISA RACHMANIA MUBARIK.
Many bacteria living in the rhizosphere contribute as a plant growth promoter called as
plant growth promoting rhizobacteria. One of them is Pseudomonas sp.. One hundred isolates
categorized as Pseudomonas sp. was succesfully isolated from soybean rhizosphere soil. The
isolate Pseudomonas sp. CRB 17 produce highest amount of indole acetic acid (IAA) at 16.02
ppm. To increase IAA production, transposon mutagenesis had been done using Escherichia coli
S17-1 (Ȝ pir), carrying miniTn5Km1 (pUTmini-Tn5Km1) as the donor and Pseudomonas sp. CRB
17 as the recipient strain. The frequency of conjugation obtained was approximately 3.1 x 10-5 cell
per recipient for 24 hours incubation time of conjugation. Forty nine mutants have been analyzed
for their IAA production. These mutants produced a varying amount of IAA, ranging from
mutants which have decreasing IAA production down to 55.31 %, mutants with moderate IAA
production, and the remaining with increasing IAA production up to 77.52 %. From the results of
this research can be concluded that transposon mutagenesis can be used to increase IAA
production of Pseudomonas sp. CRB 17.

PENDAHULUAN
Usaha ekstensifikasi dan intensifikasi
pertanian yang kian digalakkan untuk
mencapai swasembada pangan berimplikasi
terhadap penggunaan pupuk kimia yang terus
meningkat. Residu pupuk kimia diketahui
dapat mencemari perairan dan menimbulkan
eutrofikasi.
Teknologi
berwawasan
lingkungan yang dapat meningkatkan
efektivitas penggunaan pupuk kimia menjadi
penting untuk dikembangkan. Salah satu
produk teknologi alternatif yang ramah
lingkungan ialah dengan menggunakan
mikrob sebagai pupuk hayati.
Bakteri tanah hidup bebas di daerah
rizosfer yang menguntungkan dan telah
menunjukkan dapat memperbaiki kesehatan
atau meningkatkan hasil tanaman disebut
plant growth promoting rhizobacteria (PGPR)
(Dey et al. 2004). Mekanisme pemacuan
pertumbuhan tanaman yang dilakukan oleh
PGPR ialah melalui penambatan nitrogen,
produksi antibiotik, produksi siderofor,
pelarutan fosfat, dan produksi zat pengatur
tumbuh tanaman (Kapulnik & Okon 2002).
Beberapa PGPR mampu menghasilkan zat
pengatur tumbuh seperti auksin, giberelin,
dan sitokinin (Dey et al. 2004). Salah satu
genus PGPR yang banyak diteliti karena
kemampuannya dalam menghasilkan auksin
ialah
Pseudomonas.
Sebagai
contoh
Pseudomonas
putida
telah
diketahui
menghasilkan berbagai zat pemacu tumbuh
termasuk auksin dan giberelin, siderofor, asam
organik dan antibiotik (Premono & Widyastuti
1996, Patten & Glick 2002).
Asam indol asetat (IAA) adalah auksin
yang paling aktif untuk berbagai tanaman dan
berperan
penting
dalam
pemacuan
pertumbuhan,
seperti
inisiasi
akar,
pembesaran sel, diferensiasi pembuluh dan
pemacu pembungaan. Tanaman kurang
mampu menghasilkan IAA yang cukup untuk
pertumbuhan yang optimal. Sejumlah bakteri
telah diidentifikasi mensintesis IAA pada
biakan murni dan di tanah (Husen &
Saraswati 2003). Pseudomonas putida GR122 penghasil auksin berupa asam indol asetat
mampu memacu perpanjangan akar primer
dan pembentukan akar lateral (Patten & Glick
2002).
Berbagai jalur sintesis IAA digunakan
oleh prokariot. Suatu galur bakteri dapat
menggunakan lebih dari satu jalur sintesis
IAA.
Jalur-jalur
ini
dikelompokkan
berdasarkan jenis intermediatnya, yaitu jalur
indol asetamida (IAM), asam indol-3-piruvat

(IPA), triptamin, dan indol-3-asetonitril
(Manulis et al. 1998). Bakteri yang
menguntungkan bagi bakteri menggunakan
jalur IPA sebagai jalur utama untuk
mensintesis IAA (Patten & Glick 2002).
Mutagenesis
dengan
transposon
merupakan salah satu metode untuk membuat
mutan dengan cara menyisipkan segmen DNA
(transposon) ke dalam genom bakteri yang
bersangkutan (Wahyudi 2001). Secara umum
metode ini digunakan untuk isolasi dan
lokalisasi gen. Transposon merupakan suatu
fragmen DNA yang dapat meloncat dan
menyisip pada genom organisme (Wahyudi
2000). Transposon ini akan menyisip pada
DNA secara random. Dengan adanya
penyisipan transposon ini dapat menyebabkan
perubahan genetik yang memiliki kontribusi
penting dalam evolusi genom karena selain
dapat menyisip ke dalam genom, penyisipan
juga dapat terjadi pada sekuen DNA yang
berperan untuk regulasi proses fisiologi
tertentu sehingga dapat menyebabkan
modifikasi ekspresi gen dan menyebabkan
mutasi kromosom.
Transposon Tn5 sering digunakan untuk
kegiatan mutagenesis dengan transposon
seperti pada penelitian yang dilakukan oleh
Harayama et al. (1984) untuk menganalisis
operon gen jalur pemotongan meta dari
plasmid TOL Pseudomonas putida mt-2.
Selain itu, Wahyudi (2005) juga melakukan
mutagenesis dengan transposon dalam
penelitiannya untuk melaporkan konstruksi
pustaka genom Magnetospirillum magneticum
AMB-1 dan penapisan pustaka yang
membawa gen yang terlibat dalam biosintesis
magnetosom.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengkarakterisasi Pseudomonas sp. asal
rizosfer tanaman kedelai yang berpotensi
sebagai pemacu pertumbuhan tanaman, serta
mengkonstruksi mutan Pseudomonas sp.
CRB17 untuk meningkatkan produksi IAA
melalui mutagenesis dengan transposon.

METODE
Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer
Tanaman Kedelai (Glycine max)
Pseudomonas sp. diisolasi dari tanah
rizosfer kedelai daerah Cirebon. Isolasi
dilakukan
dengan
pengenceran
serial
menggunakan garam fisiologis 0.85 % hingga
10-4. Tiga pengenceran terakhir disebar pada
media agar King’s B (20 g pepton, 15 mL
gliserol, 1.5 g K2HPO4, 1.5 g MgSO4.7H2O,
15 g agar, 1 L akuades) dan diinkubasi selama

PENDAHULUAN
Usaha ekstensifikasi dan intensifikasi
pertanian yang kian digalakkan untuk
mencapai swasembada pangan berimplikasi
terhadap penggunaan pupuk kimia yang terus
meningkat. Residu pupuk kimia diketahui
dapat mencemari perairan dan menimbulkan
eutrofikasi.
Teknologi
berwawasan
lingkungan yang dapat meningkatkan
efektivitas penggunaan pupuk kimia menjadi
penting untuk dikembangkan. Salah satu
produk teknologi alternatif yang ramah
lingkungan ialah dengan menggunakan
mikrob sebagai pupuk hayati.
Bakteri tanah hidup bebas di daerah
rizosfer yang menguntungkan dan telah
menunjukkan dapat memperbaiki kesehatan
atau meningkatkan hasil tanaman disebut
plant growth promoting rhizobacteria (PGPR)
(Dey et al. 2004). Mekanisme pemacuan
pertumbuhan tanaman yang dilakukan oleh
PGPR ialah melalui penambatan nitrogen,
produksi antibiotik, produksi siderofor,
pelarutan fosfat, dan produksi zat pengatur
tumbuh tanaman (Kapulnik & Okon 2002).
Beberapa PGPR mampu menghasilkan zat
pengatur tumbuh seperti auksin, giberelin,
dan sitokinin (Dey et al. 2004). Salah satu
genus PGPR yang banyak diteliti karena
kemampuannya dalam menghasilkan auksin
ialah
Pseudomonas.
Sebagai
contoh
Pseudomonas
putida
telah
diketahui
menghasilkan berbagai zat pemacu tumbuh
termasuk auksin dan giberelin, siderofor, asam
organik dan antibiotik (Premono & Widyastuti
1996, Patten & Glick 2002).
Asam indol asetat (IAA) adalah auksin
yang paling aktif untuk berbagai tanaman dan
berperan
penting
dalam
pemacuan
pertumbuhan,
seperti
inisiasi
akar,
pembesaran sel, diferensiasi pembuluh dan
pemacu pembungaan. Tanaman kurang
mampu menghasilkan IAA yang cukup untuk
pertumbuhan yang optimal. Sejumlah bakteri
telah diidentifikasi mensintesis IAA pada
biakan murni dan di tanah (Husen &
Saraswati 2003). Pseudomonas putida GR122 penghasil auksin berupa asam indol asetat
mampu memacu perpanjangan akar primer
dan pembentukan akar lateral (Patten & Glick
2002).
Berbagai jalur sintesis IAA digunakan
oleh prokariot. Suatu galur bakteri dapat
menggunakan lebih dari satu jalur sintesis
IAA.
Jalur-jalur
ini
dikelompokkan
berdasarkan jenis intermediatnya, yaitu jalur
indol asetamida (IAM), asam indol-3-piruvat

(IPA), triptamin, dan indol-3-asetonitril
(Manulis et al. 1998). Bakteri yang
menguntungkan bagi bakteri menggunakan
jalur IPA sebagai jalur utama untuk
mensintesis IAA (Patten & Glick 2002).
Mutagenesis
dengan
transposon
merupakan salah satu metode untuk membuat
mutan dengan cara menyisipkan segmen DNA
(transposon) ke dalam genom bakteri yang
bersangkutan (Wahyudi 2001). Secara umum
metode ini digunakan untuk isolasi dan
lokalisasi gen. Transposon merupakan suatu
fragmen DNA yang dapat meloncat dan
menyisip pada genom organisme (Wahyudi
2000). Transposon ini akan menyisip pada
DNA secara random. Dengan adanya
penyisipan transposon ini dapat menyebabkan
perubahan genetik yang memiliki kontribusi
penting dalam evolusi genom karena selain
dapat menyisip ke dalam genom, penyisipan
juga dapat terjadi pada sekuen DNA yang
berperan untuk regulasi proses fisiologi
tertentu sehingga dapat menyebabkan
modifikasi ekspresi gen dan menyebabkan
mutasi kromosom.
Transposon Tn5 sering digunakan untuk
kegiatan mutagenesis dengan transposon
seperti pada penelitian yang dilakukan oleh
Harayama et al. (1984) untuk menganalisis
operon gen jalur pemotongan meta dari
plasmid TOL Pseudomonas putida mt-2.
Selain itu, Wahyudi (2005) juga melakukan
mutagenesis dengan transposon dalam
penelitiannya untuk melaporkan konstruksi
pustaka genom Magnetospirillum magneticum
AMB-1 dan penapisan pustaka yang
membawa gen yang terlibat dalam biosintesis
magnetosom.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan
mengkarakterisasi Pseudomonas sp. asal
rizosfer tanaman kedelai yang berpotensi
sebagai pemacu pertumbuhan tanaman, serta
mengkonstruksi mutan Pseudomonas sp.
CRB17 untuk meningkatkan produksi IAA
melalui mutagenesis dengan transposon.

METODE
Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer
Tanaman Kedelai (Glycine max)
Pseudomonas sp. diisolasi dari tanah
rizosfer kedelai daerah Cirebon. Isolasi
dilakukan
dengan
pengenceran
serial
menggunakan garam fisiologis 0.85 % hingga
10-4. Tiga pengenceran terakhir disebar pada
media agar King’s B (20 g pepton, 15 mL
gliserol, 1.5 g K2HPO4, 1.5 g MgSO4.7H2O,
15 g agar, 1 L akuades) dan diinkubasi selama

2

24 jam. Koloni-koloni yang tumbuh kemudian
diamati morfologinya dan diuji fisiologinya
yang meliputi pewarnaan Gram, bentuk sel,
motilitas, dan reaksi uji oksidase.
Uji Produksi Asam Indol Asetat Isolatisolat Pseudomonas sp.
Uji produksi IAA dilakukan sesuai metode
Patten dan Glick (2002). Isolat-isolat
Pseudomonas sp. diinokulasikan ke dalam 5
ml media cair King’s B dengan penambahan
triptofan 0.5 mM, selanjutnya diinkubasi
selama 48 jam (120 rpm) pada suhu ruang.
Triptofan digunakan sebagai prekursor
terbentuknya IAA (Vande Broek et al. 2005).
Sebanyak 1.5 mL kultur disentrifus selama 15
menit pada 10000 rpm. Selanjutnya 1 mL
supernatannya dicampur dengan reagen
Salkowski (150 ml H2SO4 pekat, 250 mL
H2O destilata, 7.5 mL 0.5 M FeCl3·6H2O) dan
diinkubasi pada suhu ruang selama 20 menit
untuk kemudian diukur absorbansinya pada
λ520 nm (Spectronic 20, Bausch & Lomb,
US). Konsentrasi IAA ditentukan dengan
membandingkannya terhadap kurva standar
IAA dengan kisaran konsentrasi 0–30 ppm.
Esai Pemacuan Pertumbuhan
Esai pemacuan pertumbuhan dilakukan
sesuai metode Dey et al. (2004). Isolat
Pseudomonas sp. CRB 17 yang memproduksi
IAA tinggi digoreskan secara penuh pada
media agar King’s B, diinkubasi selama 24
jam dan disuspensikan dengan kaldu nutrien
steril. Sebanyak 100 µL kultur dengan
konsentrasi 1010 sel per mL dipipet dan
diinokulasikan pada tiap kecambah kedelai
varietas Slamet berumur 24 jam pada media
agar semisolid dalam cawan petri. Kecambah
diinkubasi selama 7 hari. Uji ini dilakukan
dengan tiga ulangan cawan petri. Sebanyak 9
kecambah digunakan untuk tiap ulangannya.
Parameter yang diamati meliputi panjang akar
primer dan jumlah akar. Analisis data
dilakukan menggunakan uji Anova SPSS
(Statistical Package for the Social Sciences)
12.0 for Windows.
Uji Resistensi Antibiotik sebagai Penanda
dalam Seleksi Transkonjugan
Uji resistensi antibiotik dilakukan terhadap
Escherichia coli S-17 λ pir (donor) dan isolat
Pseudomonas sp. CRB 17. Jenis antibiotik
yang digunakan dalam pengujian yaitu
kanamisin, kloramfenikol, rifampisin, dan
ampisilin pada konsentrasi 50 µg/mL.
Masing-masing jenis antibiotik ditambahkan
pada media-media agar Luria (10 g tripton, 5

g ekstrak khamir, 10 g NaCl, 15 g agar dan
akuades 1 L). Baik E. coli S17-1 λ pir
maupun CRB17 ditumbuhkan pada media
tersebut dengan cara digores, dan diinkubasi
selama 24 jam pada suhu ruang untuk CRB17
dan pada suhu 37 oC untuk E. coli .
Mutagenesis dengan Transposon
Konstruksi mutan dilakukan dengan
menyisipkan gen kanamisin resisten (Km1)
yang dibawa transposon mini-Tn5Km1 yang
berada pada plasmid
pUTmini-Tn5Km1
dalam E. coli S17-1 λ pir (donor) ke dalam
genom Pseudomonas sp. CRB17 (resipien)
secara diparental mating. Biakan resipien
CRB17 ditumbuhkan pada 50 mL King’s B
cair + Kloramfenikol (Kl) 50 µg/mL dalam
erlenmeyer 250 mL. Selanjutnya kultur
diinkubasi pada mesin bergoyang dengan
kecepatan 120 rpm pada suhu ruang selama 24
jam. Sementara biakan donor E. coli S17-1 (λ
pir) ditumbuhkan pada media 50 mL Luria
Broth (LB) + Kanamisin (Km) 50 µg/mL
dalam erlenmeyer 250 mL dinkubasi pada
inkubator bergoyang (120 rpm) pada suhu
370C selama 20 jam.
Perbandingan jumlah sel donor dan
resipien yang digunakan ialah 1:1 (kisaran
konsentrasi 108 : 108). Kultur sel donor dan
resipien disentrifugasi dan pelet yang
terbentuk dicuci sebanyak 3 kali dan
diresuspensi dalam garam fisiologis. Pelet sel
r