Rancang Bangun Penghitung Koloni Selektif Berdasarkan Pigmen Fluoresein pada Pseudomonas aeruginosa

RANCANG BANGUN PENGHITUNG KOLONI SELEKTIF
BERDASARKAN PIGMEN FLUORESEIN PADA
Pseudomonas aeruginosa

SUYONO

PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

ABSTRAK
SUYONO. Rancang Bangun Penghitung Koloni Selektif Berdasarkan Pigmen
Fluoresein pada Pseudomonas aeruginosa. Dibimbing oleh AE ZAINAL
HASAN, I MADE ARTIKA, dan M. MAMAN R.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa bersifat patogen, mudah tumbuh dalam
media sederhana, dan masuk Standar Nasional Indonesia (SNI) 2006 untuk air
minum dalam kemasan. Bakteri ini dapat diidentifikasi dengan uji genetik,
biokimia, dan induksi pigmen. Uji genetik dan biokimia memerlukan prosedur
yang rumit, berbeda dengan induksi pigmen. Pigmen ini merupakan sinyal

biologis yang dapat menunjukkan keberadaan bakteri. Bakteri Pseudomonas
aeruginosa dapat menghasilkan pigmen fluoresein yang membedakannya dari
bakteri selain genusnya dan piosianin dari spesies lain dalam genus Pseudomonas.
Tujuan penelitian ini untuk klarifikasi metode cepat tersebut terhadap isolat P.
aeruginosa lokal dan desain penghitung koloni untuk membantu kuantifikasi
selektif terhadap koloni bakteri berfluoresensi ini. Bakteri lokal diisolasi dari air
minum dengan penyaringan milipore 0.45 µm, lalu diuji biokimia dengan
menggunakan kit, dan induksi pigmen. Kuantifikasi koloni didukung oleh alat
penghitung koloni, terdiri atas perangkat keras dan program. Program dibuat
dengan Visual Basic dengan metode plotting (merajah) 24 bit menggunakan
pointer (penunjuk) dan metode kuantifikasi menggunakan simulasi sel. Uji
biokimia menunjukkan tingkat kepercayaan P. aeruginosa 97% dan nitrase
negatif. Panjang gelombang absorbansi fluoresensinya 370 nm, sedangkan
emisinya 508 nm. Ketepatan kuantifikasi koloni 88.93% menggunakan metode
sampling (mengambil cuplikan) dan/atau tunjuk warna.

ABSTRACT
SUYONO. Design of Selective Colony Counter Based Fluorescein Pigment of
Pseudomonas aeruginosa. Under the direction of AE ZAINAL HASAN, I MADE
ARTIKA, and M. MAMAN R.

The Pseudomonas aeruginosa is phatogen bacteria, easyly grown in simple
media, and included in Standar Nasional Indonesia (SNI) 2006 for packed
drinking water. These bacteria can be identified by using genetical test,
biochemical test, and pigment induction. Genetical and biochemical test need
complicated procedure, differ from pigment induction. This pigment is a
biological signal for bacteria existency. Pseudomonas aeruginosa can produce
both fluorescein pigment which make it different from other bacteria and
pyocyanin which can be distinguished from other species in Pseudomonas genus.
The purpose of this research is to clarify this fast method on local isolate of P.
aeruginosa and design of colony counter for selective quantification for this
fluorescence bacteria. Local bacteria were isolated from packed drinking water
using milipore 0.45 µm, then it was tested using biochemical kit, and pigment
induction. Quantification of colony is supported by colony counter tool, consist
of hardware and program. Program was made from Visual Basic with method of
plotting used 24 bit used pointer and method of quantification used cell
simulation. Biochemical test trust level of P. aeruginosa was 97 % and nitrase
was absent. Fluorescence absorbance wave length was 370 nm and its emission is
508 nm. The precision of colony quantification was 88.93% using sampling
and/or pointing colour.

RANCANG BANGUN PENGHITUNG KOLONI SELEKTIF
BERDASARKAN PIGMEN FLUORESEIN PADA
Pseudomonas aeruginosa

SUYONO

Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biokimia

PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2009

Judul Skripsi : Rancang Bangun Penghitung Koloni Selektif Berdasarkan Pigmen
Fluoresein pada Pseudomonas aeruginosa
Nama

: Suyono
NIM
: G44104023

Disetujui
Komisi Pembimbing

Ir. H.A.E. Zainal Hasan, M.Si
Ketua

Dr. Ir. I Made Artika, M.App.Sc
Anggota

Ir. M. Maman R, M.App.Sc
Anggota

Diketahui

Dr. drh. Hasim, DEA
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala nikmat dan
anugerah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah yang berjudul
Rancang Bangun Penghitung Koloni Selektif Berdasarkan Pigmen Fluoresein
pada Pseudomonas aeruginosa. Penelitian ini telah dilaksanakan dari bulan Maret
sampai Desember 2008 di Laboratorium Biokimia IPB. Penelitian ini terlaksana
berkat bimbingan Ir. H.A.E. Zainal Hasan, M.Si, Dr. Ir. I Made Artika,
M.App.Sc, yang mendukung penelitian bermuatan bioinformatika ini.
Terima kasih penulis ucapkan kepada drh. Sulistiyani, M.Sc., Ph.D yang
telah memberikan kuliah mengenai interaksi sel sehingga mengilhami metode
simulasi sel untuk menghitung koloni bakteri. Terima kasih penulis sampaikan
kepada Ir. M. Maman R, M.App.Sc yang menjembatani penulis dengan Balai
Besar Industri Agro dalam melakukan penelitian. Terima kasih penulis kepada
laboran Biokimia atas semua bantuannya. Ucapan terima kasih juga penulis
sampaikan kepada teman-teman seperjuangan di lab (Dedy, Indra, Fitri, Faridha,
Aswan). Terima kasih kepada teman-teman biokimia 41 atas kebersamaan dan
kekompakannya hingga ke pentas penelitian ini.

Penghargaan tinggi penulis sampaikan kepada orang tua, adik, dan kakak
tercinta atas dorongan semangat, kesabaran, dan bantuan langsungnya. Penulis
merasa banyak kekurangan, baik pada substansi penelitian maupun penulisannya.
Hasil yang didapat lebih banyak karena keberuntungan daripada usaha. Oleh
karena itu, penulis meminta kritikan yang membangun penyempurnaan karya
ilmiah ini. Semoga karya ini bermanfaat bagi para pembaharu bioinformatika,
bioanalisis, dan bioinstrumentasi yang merupakan multidisiplin biokimia.

Bogor, Maret 2009

Suyono

RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Pemangkat, Kalimantan Barat pada tanggal 18 Mei
1984 dari ayahanda Dji Fuk Sin dan ibunda Then Siu Kheng. Penulis merupakan
anak ketiga dari 6 bersaudara. Tahun 2004 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Bogor
dan tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui
jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada Program Studi Biokimia,
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA).
Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti kegiatan Praktik

Lapangan di Laboratorium Mikrobiologi, Balai Besar Industri Agro, Bogor
selama periode Juli sampai Agustus 2007 dengan judul Uji Angka Lempeng,
Coliform, Escherichia coli, Salmonella, dan Staphylococcus aureus pada Sosis.
Penulis pernah menjadi pengurus DKM Al-Hurriyyah staf PSDM dan BEM KM
staf Kebijakkan Daerah pada periode 2006-2007 dan pernah menjadi asisten
praktikum mata kuliah Biokimia Umum dan Metabolisme untuk mahasiswa S1
Budi Daya Perairan dan Biokimia tahun ajaran 2008/2009.

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ viii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... viii
PENDAHULUAN ..............................................................................................

1

TINJAUAN PUSTAKA
Hitungan Cawan ........................................................................................
Bakteri Pseudomonas aeruginosa .............................................................
Media Selektif Pseudomonas ....................................................................

Antibakteri ................................................................................................
Ultraviolet .................................................................................................

1
2
2
4
4

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat ..........................................................................................
Metode Penelitian .....................................................................................

5
5

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Induksi Bakteri ........................................................................ 7
Kontruksi Alat ........................................................................................... 9
Desain Program ......................................................................................... 11

SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................ 15
DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 16
LAMPIRAN ....................................................................................................... 18

DAFTAR GAMBAR

Halaman
1 Isolasi P. aeruginosa pada kertas milipore 0.45 µm ..................................... 7
2 Pigmen fluoresein P. aeruginosa .................................................................. 7
3 Pigmen piosianin ........................................................................................... 7
4 Fluoresein pada koloni .................................................................................. 8
5 Emisi fluoresensi kultur cair bakteri P. aeruginosa ...................................... 9
6 Kotak foto petri ............................................................................................. 9
7 Tampilan program .......................................................................................... 11
8 Ketepatan hitungan program terhadap koloni P. aeruginosa

dengan

metode warna terpasang ................................................................................ 15
9 Ketepatan hitungan program terhadap koloni

P. aeruginosa dengan

metode sampling warna ................................................................................. 15

DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Tahapan penelitian ........................................................................................ 19
2 Isolasi P. aeruginosa dan uji biokimia .......................................................... 20
3 Pengukuran fluoresensi dengan spektrofluorometer ..................................... 21
4 Koloni bakteri dengan metode cawan sebar .................................................. 22
5 Ketepatan dan ketelitian hitungan koloni ....................................................... 24
6 Kalibrasi skala gambar tangkapan kamera .................................................... 27
7 Pengaturan penerangan .................................................................................. 28
8 Tampilan alat dan program ............................................................................ 29
9 Rangkaian komponen elektronik ................................................................... 31
10 Evaluasi biaya kontruksi alat ........................................................................ 32

1

PENDAHULUAN
Teknik konvensional penentuan jumlah
bakteri adalah plate count atau angka
lempeng. Prosedur ini dilakukan dengan
menghitung
koloni
yang
mewakili
pertumbuhan satu sel dari bakteri yang
dibiakkan
dalam
media
pengkayaan.
Hitungan koloni umumnya didapatkan secara
manual. Kerumitan terjadi bila jumlahnya
lebih banyak dari 300 koloni atau berukuran
kecil. Kerumitan bertambah lagi jika koloni
perlu perlakuan khusus seperti induksi
fluoresensi
dengan
ultraviolet
(UV),
contohnya kuantifikasi sekaligus konfirmasi
koloni Pseudomonas aeruginosa. Bakteri P.
aeruginosa mempunyai syarat nutrisi yang
sederhana sehingga dapat tumbuh pada air
destilata. Oleh karena itu, bakteri ini masuk
syarat mutu Standar Nasional Indonesia (SNI)
untuk air minum dalam kemasan tahun 2006.
Paparan UV diperlukan untuk menyeleksi
atau konfirmasi bakteri ini, artinya metode ini
merupakan deteksi cepat. Hitungan selektif
terhadap koloni berfluoresen ini menjadi lebih
sulit karena perlu studio gelap dan sumber
UV. Masalah juga terjadi saat penanda
hitungan/spidol tidak bisa digunakan karena
sulit masuk ke studio tersebut. Kesulitan ini
karena studio berukuran kecil, sehingga
cahaya dapat masuk jika tangan atau spidol
dimasukkan. Selain itu, paparan UV yang
mungkin berbahaya jika terpapar dalam waktu
lama.
Galat laboran atau manusia menjadi sulit
dihindari dan akan membesar jika tidak ada
hitungan ulang. Oleh karena itu, diperlukan
alat bantu yang dapat menjadi referensi
perhitungan atau mempermudah dengan cara
memperbesar atau memberikan tanda. Alat
tersebut adalah colony counter (penghitung
koloni), tetapi dioperasikan secara manual,
artinya masih tergantung pada manusia.
Sejalan
dengan
perkembangan
dunia
elektronik, lahirlah komputer yang menjadi
alat bantu dan otomatisasi rutinitas manusia.
Otomatisasi utama yang berasal dari komputer
sarat keakuratan, ketelitian, dan kecepatan
sehingga memperbaiki analisis. Selain itu,
komputer juga memberikan kemudahan dalam
penyimpanan informasi dan akses database
Sisi keunggulan dari komputer bila dipadukan
dalam kehidupan kerja manusia dapat
mengurangi aspek human error.
Sekarang, komputer memainkan peranan
penting dalam desain, eksekusi, dan analisis
penelitian. Komputer tidak mengubah pikiran
peneliti atau metodenya, formulasi hipotesis,

falsifikasi
teori
dan
model,
tetapi
mempengaruhi
dinamika
perkembangan
laboratorium modern. Komputer dapat
menghitung jumlah sel dalam petri,
menghitung besar inti sel tumor ginjal melalui
mikroskop, merekam aktivitas listrik isolat sel
syaraf terduga pada penyakit sakit kepala
kronik, dan membaca sekuen informasi dari
elektroforesis gel yang telah dilabel dengan
radioaktif (Buehler dan Rashidi 2005).
Tujuan penelitian ini untuk deteksi cepat
koloni selektif-fluoresensi P. aeruginosa
dengan kontruksi perangkat keras dan lunak
yang menghubungkan analisis laboratorium
dengan komputer. Deteksi cepat ini juga akan
diklarifikasi dengan memakai isolat lokal pada
media referensi, media modifikasi, dan
penginduksinya lainnya. Media referensi
adalah Pseudomonas base penginduksi
piosianin yang ditambahkan suplemen CN
(Cetrimide-Nalidixic). Media modifikasinya
adalah King’s B. Faktor penginduksi yang
akan ditinjau adalah panjang gelombang
absorbansi fluoresensi dan emisi, suplemen
antibakteri, dan bahan tambahan lain di luar
referensi.
Hipotesis penelitian adalah otomatisasi
hitung koloni dengan komputer dapat menjadi
alat bantu yang meningkatkan ketelitian,
ketepatan, dan kemudahan
perhitungan
bakteri selektif-fluoresen P. aeruginosa.
Manfaat penelitian ini secara khusus untuk
memberikan kemudahan bagi laboran dalam
menghitung koloni yang perlu paparan
ultraviolet dan secara umum untuk merintis
pengembangan instrumentasi laboratorium di
Indonesia.

TINJAUAN PUSTAKA
Hitungan Cawan
Metode hitungan cawan merupakan cara
yang akurat untuk menentukan jumlah mikrob
karena hanya sel yang masih hidup yang
dihitung. Selain itu, beberapa jenis mikrob
dapat dihitung sekaligus dan dapat digunakan
untuk isolasi dan identifikasi mikrob. Bakteri
harus dapat tumbuh dalam medium padat dan
membentuk koloni yang kompak dan jelas
(tidak menyebar) dan memerlukan persiapan
waktu inkubasi relatif lama sehingga
pertumbuhan
koloni
dapat
dihitung
(Adiprabowo 2008).
Menurut Fardiaz (1989), prinsip dari
metode hitungan cawan adalah jika sel jasad
renik yang masih hidup ditumbuhkan pada
medium agar maka sel jasad renik tersebut

2

akan berkembang biak dan membentuk koloni
yang dapat langsung dihitung menggunakan
mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode
hitungan cawan dapat dibedakan atas dua cara
yaitu metode tuang (pour plate) dan metode
permukaan (surface/spread plate).
Dalam metode hitungan cawan, sampel
yang diperkirakan mengandung lebih dari 300
sel/ml memerlukan pengenceran sebelum
ditumbuhkan di dalam cawan petri. Setelah
inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan
tersebut dalam jumlah yang masih dapat
dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah
diantara 30-300 koloni. Pengenceran biasanya
dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100,
1:1000 dan seterusnya, atau 1:100, 1:10000,
1:1000000 dan seterusnya. Larutan yang
digunakan untuk pengenceran dapat berupa
larutan NaCl 0.9% dan bufer fosfat. Jumlah
koloni dalam contoh yang dihitung atau
koloni/ml yaitu jumlah koloni per cawan
dikali faktor pengenceran (Adiprabowo 2008).
Metode ini umum dilakukan untuk
berbagai bakteri, dan lebih condong ke angka
lempeng total (ALT). Angka total ini
menyatakan kuantitas berbagai jenis bakteri
mesofil aerob. Metode ALT untuk
menumbuhkan bakteri mesofil aerob pada
media yang mendukung pertumbuhan
mikroorganisme secara luas. Hal ini karena
media yang digunakan mengandung nutrisi
standar yang tidak selektif dan dapat
dimetabolisme banyak bakteri, sesuai dengan
SNI yaitu Plate Count Agar (PCA) . Media ini
diadaptasikan untuk bakteri yang hidup
membutuhkan/tahan oksigen dan berada
sekitar suhu kamar.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa
Bakteri Pseudomonas aeruginosa adalah
bakteri gram negatif, aerob, berbentuk bulat
dengan diameter 0.5-0.8 µm, dan banyak
ditemukan pada air, tanah, daerah lembab.
Nama bakteri ini dapat ditelaah, yaitu
“pseudo” artinya semu, “monas” artinya unit
tunggal, “ae” artinya tua, dan “ruginosa”
artinya berkerut atau tidak rata. Bakteri ini
adalah patogen manusia. Hampir semua strain
motil dengan satu flagel. Bakteri ini
ditemukan di alam berada di biofilm terikat
dengan beberapa permukaan atau berbentuk
plangton, sebagai organisme uniseluler, dan
aktif berenang, bahkan merupakan perenang
tercepat (Kenneth 2008).
Isolat bakteri dapat membentuk tiga tipe
koloni. Isolat dari tanah dan air membentuk
koloni kecil dan kasar. Contoh klinik
membentuk satu atau dua bentuk halus, yaitu

tampak seperti telur goreng, besar, tepi yang
rata, dan terelevasi. Bentuk lainnya sering
didapat dari sistem respirasi dan ekskresi urin
membentuk lendir, yang merupakan produksi
alginat. Bentuk halus dan mucoid memainkan
peranan dalam virulensi (Kenneth 2008).
Medium sederhana yang biasa digunakan
untuk kultur P. aeruginosa di laboratorium
adalah asetat sebagai sumber karbon dan
amonium sulfat sebagai sumber nitrogen.
Faktor pertumbuhan organik tidak diperlukan
dan bakteri ini dapat menggunakan lebih dari
75 bahan organik untuk tumbuh. Bakteri ini
tahan pada kadar garam dan pewarna yang
tinggi, antiseptik lemah, dan antibiotik umum.
Antibiotik yang efektif melawan bakteri ini
adalah aminoglikosida (gentamisin, amikasin,
tobramisin), kuinolon (siprofloksasin and
levofloksasin, tetapi tidak moksifloksasin),
cephalosporins
(seftazidim,
sefepim,
sefpirom, tetapi tidak cefuroksim, ceftriakson,
cefotaksim), dan lain-lain. Semua antibiotik
tersebut semuanya harus diinjeksikan kecuali
fluorokuinolon. Sebaliknya, bakteri ini tahan
terhadap nalidiksat hingga 15 µg/ml asam
nalidiksat. jumlah ini sudah mampu
menghambat sebagian besar flora mikrob
(Goto dan Enomoto 1970).
Strain bakteri ini memproduksi tiga
macam pigmen solubel, yaitu pigmen
fluoresen, piorubin, dan piosianin. Produksi
pigmen ini terutama bila ditumbuhkan pada
media kurang besi. Piosianin referensi dari
nanah biru yang merupakan karakteristik
infeksi yang diakibatkan bakteri ini. Bakteri
ini menyebabkan infeksi pada sistem urin,
respirasi,
dermatitis,
gastrointestinal,
komplikasi AIDS, dan menjangkiti luka bakar
parah dan kanker . Waktu inkubasi bakteri ini
biasanya 24-72 jam dan tumbuh optimum
pada suhu 37oC. Bakteri ini mampu tumbuh
pada
suhu
42oC,
berbeda
dengan
Pseudomonas fluorecent (Atlas 1984).
Media Selektif Pseudomonas
Media Pseudomonas Agar merupakan
media awal yang diusulkan oleh King, Ward,
dan Raney (1954) untuk mengisolasi dan
membedakan Pseudomonas berdasarkan
pembentukkan piosianin dan/atau piorubin
atau materi fluoresein. Media ini juga
diusulkan sesuai rekomendasi United States
Pharmacopeia XXVI (2003) dan spesifikasi
media ini di dalam DIN Norm 38411
(pemeriksaan air). Media Pseudomonas Agar
Base ada dua macam yaitu tipe P
(menginduksi piosianin atau piorubin) dan F
(menginduksi pigmen fluoresein, menghambat

3

pigmen piosianin).
Komposisi media menurut buku manual
perusahaan Merck KGaA 2002 untuk
menginduksi piosianin (tipe P) dalam satu
liter air adalah pepton 20 g, MgCl2 1.4 g,
K2SO4 10.0 g, agar-agar 12.6 g , dan gliserol
10 ml. Komposisi tipe F adalah adalah pepton
dari kasein 10.0 g, pepton dari daging 10.0 g,
MgSO4 1.5 g, K2HPO4 1.5 g, agar-agar 12.0
g, dan gliserol 10 ml. Pepton mendukung
pertumbuhan spesies Pseudomonas dalam
spektrum luas. Media tipe P ini mengandung
nutrisi untuk pembentukan piosianin dan/atau
piorubin mereduksi fluoresein. Tipe F untuk
pembentukan fluoresein dan menghambat
pembentukan piosianin dan/atau piorubin.
Kedua media ini dapat digunakan secara
simultan sehingga mempercepat deteksi
Pseudomonas
dan
membedakannya
berdasarkan kemampuan yang berbeda dari
beberapa strain. Strain ini ada yang dapat
hanya membentuk piosianin, beberapa yang
lain hanya materi fluoresein, dan yang lain
lagi kedua zat warna, piosianin dan piorubin.
Bakteri Pseudomonas aeruginosa tumbuh
pada agar tipe P membentuk koloni yang
dikelilingi warna kuning hingga kehijauan
karena menghasilkan fluoresein, warna biru
hingga kehijauan saat piosianin dihasilkan dan
merah hingga kehitaman saat piorubin
dihasilkan. Fluoresein yang dihasilkan akan
terlihat hijau terang (berfluoresensi) saat
dipapari UV. Blazefick et al. (1973)
mengatakan P. aeruginosa atipikal negatif
piosianin tetapi positif fluoresein dapat
dibedakan dari P. fluorecens dan P. putida.
Brodsky dan Nixon (1973) melaporkan
fluoresensi koloni P. aeruginosa dalam
cahaya ultraviolet mengikuti pertumbuhan
pada agar MacCONKEY sehingga dapat
dieksploitasi untuk menyediakan tes cepat P.
fluorecens dan P. putida yang tidak
berfluoresensi dan hanya sedikit tumbuh pada
media ini.
Media ini mengalami perkembangan dan
modifikasi oleh Brown dan Lowbury (1965)
sehingga sekarang digunakan untuk isolasi
dan diferensiasi P. aeruginosa dari berbagai
material (bakteri lain). Nama media ini
menjadi Pseudomonas Selective Agar Base.
Medium ini direkomendasikan oleh States
Pharmacopeia XXIII (1995) dan European
Pharmacopeia II dan ini ekuivalen dengan
spesifikasi medium di dalam DIN Norm
38411. Modifikasi medium ini dengan
penambahan agen aktif permukaan atau
surfaktan cetrimide (cetyltrimethylammonium
bromide). Senyawa ini adalah antibakteri yang

menghambat sebagian besar pertumbuhan
flora mikrob bersama/terintegrasi. Lowburry
dan Collins (1955) menyatakan 0.3 g/l zat ini
menghambat organisme terintegrasi secara
memuaskan dan mengurangi interferensi
dengan pertumbuhan P. aeruginosa. Produksi
pigmen tidak dihambat bila ditumbuhkan
dengan medium ini.
Hal lain yang perlu diketahui adalah
komposisi media. Komposisi media agak
berbeda dengan komposisi sebelumnya, yaitu
pepton dari gelatin 20.0 g, MgCl2 1.4 g,
K2SO4
10.0
g,
N-cetyl-N,N,Ntrimethylammoniumbromida (cetrimide) 0.3,
dan agar-agar 13.0. Preparasi media ini
dengan membentuk suspensi campuran 44.5 g
dalam 1 liter (pH: 7.0 ± 0.2 pada 25 °C) air
lalu ditambah 10 ml gliserol dan diautoklaf.
Koloni P. aeruginosa akan memproduksi
pigmen kuning kehijauan (piosianin) dan
berfluoresensi di bawah sinar UV. Tes lebih
lanjut sebaiknya dilakukan untuk identifikasi
lanjut (Hugh dan Leifson 1953).
Media
ini
kembali
ditingkatkan
selektifitasnya sehingga tidak perlu tes lanjut
dalam menentukan jumlah bakteri yang
terkandung dalam contoh. Media ini bernama
agar Pseudomonas C-N. Huruf C menyatakan
cetrimide dan N menyatakan nalidixic acid
(nalidiksat). Perubahan ini tampak dari
penambahan senyawa nalidiksat sebagai
antibakteri. Goto dan Enomoto (1970)
merekomendasikan
penambahan
asam
nalidiksat 15 µg /ml untuk menambah inhibisi
flora
terintegrasi.
Medium
ini
direkomendasikan oleh DIN/EN 12780 untuk
deteksi dan penentuan jumlah P. aeruginosa
dalam air dengan menggunakan membran
filtrasi. Metode ini juga dapat dipakai pada
contoh padat yang telah diencerkan.
Preparasi lain yang perlu diperhatikan
adalah formulasi media, penyimpanan, respon
positif, dan konfirmasi. Komposisi media ini
adalah pepton dari gelatin 16.0 g, hidrolisat
kasein 10.0 g, K2SO4 10.0 g, MgCl2 1.4 g,
agar-agar 11.0 g. Semuanya dalam 1 liter air,
ditambah 10 ml gliserol dan suplemen CN (50
mg setrimida dan 3.75 mg nalidiksat). K2SO4
dan MgCl2 mendukung pembentukan pigmen
koloni. Setelah dituangkan dalam petri media
ini akan tampak bersih dan bening dan dapat
disimpan 4 minggu 2-8 oC, tetapi jangan
sampai menjadi cair (saat suhunya 45-50oC
selama 4 jam. Waktu inkubasi contoh adalah
44 ± 4 jam pada 36 ± 2°C. Semua koloni yang
berwarna
biru-hijau
dapat
dipastikan
Pseudomonas aeruginosa sehingga dapat
langsung dihitung. Semua koloni yang tidak

4

berwarna biru-hijau tetapi berfluoresensi
dengan cahaya UV adalah bakteri yang diduga
sebagai P. aeruginosa, oleh karena itu perlu
dikonfirmasi dengan larutan asetamid. Semua
koloni merah-coklat yang tidak berfluoresensi
juga terduga P. aeruginosa, konfirmasi
dengan tes oksidase, larutan asetamid, dan
media King’s B.
Metode identifikasi dengan induksi
ultraviolet ini juga diterapkan pada deteksi
cepat E. coli tetapi dengan senyawa aktif yang
berasal dari luar, yaitu MUG. Paparan sinar
ultraviolet yang digunakan juga 365 nm.
Metode ini adalah metode lembaga AOAC
yang diadaptasikan ke dalam FDA. Metode ini
didasarkan pada bakteri E. coli yang
mempunyai enzim spesifik -glukuronidase
(GUD) yang tidak dimiliki bakteri enterik
lainnya. Enzim ini dapat memecah 4metilumbeliferil
-D-glukuronida (MUG).
Reaksi ini membebaskan 4-metilumbeliferil
(MU) yang menyebabkan berfluoresensi bila
dipapari cahaya ultraviolet. Penelitian Moberg
et al. menunjukkan pembacaan fluoresensi
setelah 24 jam inkubasi memberikan
keakuratan dalam memprediksi E. coli dan
dapat mengidentifikasi tube positif E. coli
sekitar 83-95%. Setelah 48 jam inkubasi, 96100% tube positif E. coli dapat diidentifikasi
(Szabo et al. 1986).
Antibakteri
Antibakteri adalah zat yang dapat
mengganggu pertumbuhan atau metabolisme
bakteri. Antibakteri disebut juga antibiotik.
Antibakteri dapat dibedakan menjadi dua jenis
berdasarkan aktivitasnya, yaitu antibakteri
yang menghambat pertumbuhan bakteri
(bakteriostatik) dan membunuh bakteri
(bakterisidal).
Beberapa
bahan
yang
mengandung aktivitas antibakteri diantaranya
adalah fenol, alkohol, halogen, logam berat,
deterjen, aldehida, dan kemosterilisator gas
(Pelczar dan Chan 1988).
Mekanisme
antibakteri
dalam
mengendalikan bakteri ada beberapa macam,
yaitu memecah dinding sel, mengubah
permeabilitas sel, mendenaturasi protein sel,
menghambat kerja enzim, dan menghambat
sintesis asam nukleat protein (Pelczar dan
Chan 1988). Mekanisme tersebut sesuai
kelompok bahan antibakteri yang digunakan.
Kelompok
alkohol
bekerja
dengan
mendenaturasi protein dan merusak membran
sel. Kelompok halogen (fluor, iodium, dan
klor) bekerja dengan cara menginaktifkan
enzim dan protein.

Selektifitas media Pseudomonas didukung
oleh inhibitor pertumbuhan bakteri lain. Ada
yang bersifat desinfektan atau antibiotik.
Salah satunya adalah cetrimide/setrimida.
Setrimida adalah senyawa yang umum
digunakan sebagai desinfektan untuk isolasi
selektif Pseudomonas aeruginosa dari
campuran flora mikrob (Harper dan Cawston
1945). Senyawa ini berbentuk kristal putih,
titik leleh 235oC, dan disebut juga
alkiltrimetilamonium bromida, HTAB, atau
CTAB. Nitrogen pusatnya bergabung dengan
empat radikal organik dan satu radikal asam.
Radikal
tersebut
dipersiapkan
untuk
membentuk agen alkilasi. Senyawa ini telah
diuji dosis toksisnya pada tikus secara oral
dengan nilai LD50 410 mg/kg. Senyawa ini
juga bersifat
antifungi, bersama 1hidroksifenazin telah diteliti dapat digunakan
untuk melawan pulmonary candidiasis oleh
Kerr et al. (1999). Campuran senyawa ini
pada media agar dengan konsentrasi rendah
dari 0.1%-0.03% untuk pertumbuhan optimal
P. aeruginosa.
Selain setrimida, selektifitas isolasi bakteri
P. aeruginosa juga ditingkatkan dengan
antibiotik
nalidixic/nalidiksat.
Asam
nalidiksat merupakan antibiotik kuinolon.
Senyawa ini mempunyai merek dagang
Neggram dan Wintomylon. Asam ini efektif
melawan bakteri gram positif dan negatif.
Konsentrasi rendah zat ini menyebabkan
bakteriostatik,
saat
konsentrasi
tinggi
menyebabkan
bakterisidal.
Nalidiksat
terutama digunakan untuk infeksi sistem urin
yang disebabkan oleh Escherichia coli,
Proteus,
Shigella,
Enterobacter,
dan
Klebsiella. Zat ini digunakan juga untuk
regulasi divisi bakteri. Senyawa ini selektif
dan reversibel memblokir replikasi DNA pada
bakteri tertentu. Asam nalidiksat ini
menghambat subunit girase DNA dan
menginduksi
pembentukkan
relaksasi
kompleks analog (Anonim 2008).
Ultraviolet
Ultraviolet
adalah
cahaya
yang
mempunyai rentang panjang gelombang
hingga 400 nm. Nama ini mengandung arti
“melebihi ungu”, dinamakan demikian karena
panjang gelombang ini melebihi warna ungu
merupakan panjang gelombang cahaya paling
pendek dari cahaya tampak. Radiasi
elektromagnetis ini mempunyai panjang
gelombang yang lebih pendek dari daerah
dengan sinar tampak dan sinar inframerah (di
atas 700 nm), namun lebih panjang dari sinarX yang kecil. Radiasi UV dapat dibagi

5

menjadi hampir UV (panjang gelombang:
380–200 nm) dan UV vakum (200–10 nm).
Ketika mempertimbangkan pengaruh radiasi
UV terhadap kesehatan manusia dan
lingkungan, jarak panjang gelombang sering
dibagi lagi kepada UV A (400–315 nm) yang
juga disebut long wave; UV B (315–280 nm)
yang juga disebut "Gelombang Medium"
(Medium Wave), dan UV C (280-200 nm)
juga disebut short wave (Webb 2000).
Materi yang menyerap warna lebih dari
cukup menyebabkan disosiasi molekul. Energi
yang cukup atau panjang gelombang cahaya
yang diserap sesuai, menyebabkan terjadi
transisi elektron dari satu orbital ke orbital
energi yang lebih tinggi, atau dinamakan
eksitasi. Elektron yang tereksitasi akan
kembali ke orbital dasar melalui empat
mekanisme,
yaitu
konversi
internal,
fluoresensi, sistem silang fosforesensi atau
konversi internal, dan interaksi dengan
molekul lain. Emisi fluoresensi mempunyai
panjang gelombang yang lebih panjang dari
absorbsi (Lowry dan Richardson 1987).
Aplikasi utama UV adalah sterilisasi
karena sifat utama yang destruktif terhadap
materi biologis. Sifat ini diperoleh dari
energinya yang tinggi sesuai dengan panjang
gelombangnya yang pendek. Panjang
gelombang yang biasa digunakan bersifat
germicidal (untuk sterilisasi) berada pada
rentang 280 dan 100, yang sering digunakan
adalah 254 nm. Aplikasi lainnya untuk lampu
fluorensen/neon, sistem keamanan, astronomi,
spektrofotometri,
marker
kimia,
fotokemoterapi, deteksi api, dan lain-lain.
Ultraviolet umumnya dihasilkan dari
eksitasi atom raksa. Prinsip ini umum untuk
semua lampu neon atau tube lamp alias lampu
fluoresen. Tabung lampu berisi uap raksa dan
gas inert (tidak reaktif) argon pada tekanan
yang rendah, ada pula yang ditambahkan
kripton. Ujung lampu dihubungkan oleh dua
elektroda. Elektroda yang disebut katoda ini
akan mengeksitasikan atom raksa jika diberi
tegangan tinggi melalui mekanisme plasma
argon. Reaksi dari eksitasi ini menghasilkan
energi radiasi gelombang elektromagnetik
dalam kisaran ultraviolet.
Sumber UV yang umum digunakan untuk
mikrobiologi mempunyai gelombang panjang
254 untuk sterilisasi/germisidal dan 366 nm
untuk induksi fluoresensi. Lampu ini bisa
berupa lampu neon atau Light Emitting Diode
(LED). Lampu neon, permukaan kacanya
dilapisi fosfor europium yang didoping
stronsium
fluoroborat
(SrB4O7F:Eu2+)
sehingga dapat melepaskan radiasi pada

panjang gelombang 368-371. Lampu UV yang
digunakan 6 watt sudah cukup dan aman, bila
lebih dari itu misalnya 15 watt diperlukan
kaca pelindung.

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam penelitian
ini adalah media Pseudomonas Agar Base
Pyocyanin (PABP), King’s B agar dan cair,
setrimida 0.03 %, nalidiksat 1.5 %, HNO3
pekat, gliserol, NaCl 0.9 %, alkohol 70%, dan
akuades steril. Bahan yang dibutuhkan untuk
kontruksi alat adalah lampu ultraviolet 366
nm portabel 4 watt, Light Emitting Diode
(LED) putih, kamera digital atau webcam
(resolusi minimal 1.3 megapiksel), kaca hitam
5 mm, kaca es 3 mm, aluminium (holo got,
holo kotak, daun rolling door, lis, dll), karet
penyangga kaca, kabel, baterai Ni-MH 8.4 V,
Integrated Circuit LM317, transformator step
down 500 mA, potensiometer 5 K , trimpot
50 K , dioda IN4002, kapasitor, resistor,
heatsink (lempeng aluminium penurun panas),
rangkaian inverter DC-AC tegangan tinggi,
dan Printed Circuit Board (PCB), sakelar
tekan on-off, microswitch, skrup, paku rivet 3
mm, timah, dan lem plastik-panas.
Alat-alat yang digunakan, diantaranya
neraca analitik, pipet mikro, jarum ose,
penyedot air untuk kertas milipore, petri, kit
uji biokimia, vortex, spektrofotometer,
spektrofluorometer, laminar air flow cabinet,
inkubator, autoklaf, dan lemari pendingin.
Alat-alat yang digunakan dalam kontruksi alat
adalah komputer, multitester, solder, penyedot
timah, bor listrik (mata bor 3 mm dan 1 mm),
pistol rivet, cutter, pinset, gergaji, gunting
kawat, obeng, dan tang.
Metode Penelitian
Isolasi Bakteri dan Induksi Pigmen
Air minum dalam kemasan disaring
dengan kertas milipore 0.45 µm dan
menggunakan alat penyedot/vakum air. Kertas
milipore ditaruh pada permukaan media
Pseudomonas Agar Base Pyocyanin (dalam
petri) lalu dituangkan suplemen CetrimideNalidixic (CN). Setelah itu, petri diinkubasi
35 oC selama 24 jam atau lebih hingga hari ke
tujuh. Koloni yang tumbuh diamati warnanya
tanpa UV dan dengan UV 366 nm
(longwave). Koloni positif P. aeruginosa
mempunyai zona berwarna biru atau biru

6

kehijauan. Induksi dengan UV menyebabkan
fluoresensi hijau pada koloni.
Koloni
positif
tersebut
disubkultur/diremajakan ke agar King’s B,
diinkubasi 35 oC selama 48 jam. Koloni yang
tumbuh, kemudian diuji biokimia dengan
menggunakan kit biokimia. Koloni digores
dengan jarum ose, lalu dicelupkan ke dalam
10 ml NaCl 0.9 % , larutan dikocok, kemudian
diulangi hingga larutan menjadi keruh
(suspensi). Sebanyak 100 µl suspensi bakteri
diinjekkan ke masing-masing sumur kit, lalu
diinkubasi 37 oC selama 24 jam.
Sebanyak 5 ml kultur cair bakteri P.
aeriginosa ditempatkan di kuvet, lalu
dianalisis panjang gelombang absorbansi dan
emisinya
dengan
menggunakan
spektrofluorometer. Absorbansinya diukur
dengan memberikan radiasi cahaya putih,
sedangkan emisi dengan menempatkan radiasi
laser 410 nm berhadapan dengan detektor.
Setting jenis pengukuran dilakukan dengan
perangkat lunak pada komputer, hasilnya
berupa grafik dengan puncak panjang
gelombang. Panjang gelombang emisi lampu
ultraviolet juga diukur spektrofluorometer
dengan menempatkan detektor berhadapan
dengan lampu.
Kultur yang telah diidentifikasi diinduksi
pada berbagai induser dugaan. Sebanyak 5 ml
larutan disiapkan, larutan tersebut adalah
King’s B, King’s B mengandung setrimida
0.03 %, King’s B mengandung nalidiksat 1.5
%, King’s B + 1 tetes HNO3, King’s B + 0.5
ml gliserol, King’s B + selulosa, dan lain-lain.
Semua larutan diberi 1 inokulan bakteri, lalu
diinkubasi 35 oC 24 jam. Konsentrasi daya
induksi atau daya hambat ditentukan pada
induser dugaan atau inhibitor yang teramati
mempengaruhi produksi pigmen.
Kontruksi Alat dan Desain Program
Kontruksi Alat. Sketsa alat dibuat pada
kertas. Sketsa ini dimasukkan dalam komputer
untuk dikontruksi ulang. Alat dikontruksi
awal/prototipe dengan kardus, kemudian
dikontruksi menggunakan rangka aluminium
dan sekat dari papan melamin dan kaca.
Komponen elektronik disketsa di atas kertas,
kemudian dirakit pada Printed Circuit Board
(PCB) dan disolder menggunakan timah.
Komponen tersebut adalah regulator tegangan
12 volt, regulator intensitas cahaya, inverter
DC ke AC tegangan tinggi, sistem detektor
panas, baterai, dan sinyal kelap-kelip
(pembuang arus). Fungsi rangkaian tersebut
diuji dan diperbaiki hingga berfungsi.
Selanjutnya semua rangkaian elektronik

termasuk kamera diintegrasikan dalam
kompartemen elektronik. Komponen tersebut
diset sedemikian rupa hingga didapatkan
tegangan, penerangan, dan tangkapan kamera
yang sesuai.
Desain Program. Program dibuat dengan
Visual Basic 6 dan menggunakan program
rutin Application Programming Inferface
(API) milik Windows. Tampilan program
dibuat, lalu diberikan fungsi (kalkulasi dan
perintah) dan pemicu kontrol. Fungsi dipecah
dalam bentuk modul, lalu program modul
dijalankan dan diujikan pada model koloni
(gambar lingkaran). Kode diperbaiki dan
diefektifkan, kemudian program dijalankan
dan diujikan pada koloni sebenarnya.
Tangkapan gambar petri dikalibrasi, setelah
itu koloni pada berbagai petri dihitung dan
ditentukan ketelitian dan ketepatannya.
Kalibrasi
Kalibrasi Alat. Gambar (input) bulatan
kecil pada berbagai ukuran dan jarak,
penggaris, dan lingkaran dibuat dan dicetak
dengan
printer.
Sistem
penerangan
dihidupkan, kemudian gambar ditangkap oleh
kamera dan disimpan dalam harddisk.
Simpanan (output) dibandingkan dengan
gambar inputnya, dalam hal keterpisahan,
skala, dan distorsi.
Kalibrasi Program. Sebanyak 20 petri
berisi koloni bakteri untuk pemeriksaan angka
lempeng total dihitung secara manual dan
dengan
program
penghitung
koloni.
Pembacaan oleh alat dilakukan dengan
menaruh petri pada posisi tengah tangkapan
kamera dengan posisi terbalik kemudian
sistem penerangan yang terdiri atas lampu
(LED) putih bawah dan atas diaktifkan.
Setelah itu, gambar petri ditangkap oleh
kamera, dihitung dengan program pada setting
yang sesuai. Bakteri P. aeruginosa
teridentifikasi disebar pada 6 petri berisi agar
King’s B yang kemudian diinkubasi 35 oC
selama 48 jam. Kultur Pseudomonas
aeruginosa disebar masing-masing. Warna
koloni diambil 5 kali dari salah satu petri
dengan
menggunakan
pointer
mouse
(penunjuk tetikus). Rentang warna baik
merah, hijau, dan biru (jangkauan 0-255
satuan Red Green Blue (RGB)) dicatat oleh
software dan disimpan sebagai setting untuk
seleksi koloni berdasarkan warna. Koloni dari
tiap petri dihitung secara manual dan
menggunakan program penghitung koloni.
Penangkapan gambar dilakukan dengan
menaruh petri pada posisi tengah tangkapan
kamera dengan posisi terbalik kemudian

7

sistem penerangan UV dan lampu (LED)
putih bawah diaktifkan.

HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi dan Induksi Bakteri
Bakteri lokal yang diisolasi dari air minum
dalam kemasan yang beredar lokal. Isolasi
menggunakan prosedur penyaringan dengan
kertas milipore karena kuantitas bakteri yang
kecil pada air minum, terutama yang dalam
kemasan. Ukuran pori kertas milipore yang
digunakan adalah 0.45 µm sesuai dengan
prosedur SNI 1992 yang masih berlaku
sampai sekarang. Kertas milipore ditaruh pada
agar Pseudomonas Base Pyocyanin (PBP).
Koloni P. aeruginosa berwarna biru kehijauan
dan akan berfluoresensi kehijauan bila
dipapari ultraviolet 366 nm (Gambar 1).
Selektifitas media didukung pula oleh
penambahan suplemen antibiotik Cetrimide
Nalidixic (CN). Bakteri yang didapat lalu diuji
biokimia dengan menggunakan kit yang
terdiri atas uji oksidase, nitrat, lisin, ornitin,
H2S, glukosa, manitol, silosa, Orto-Nitro
Phenol Galaktosidase (ONPG), indol, urease,
Voges Proskauer, sitrat, gelatin, malonat,
inositol, sorbitol, ramnosa, sukrosa, laktosa,
arabinosa, adonitol, rafinosa, salisin, dan
arginin.
Hasil kombinasi uji biokimia
menunjukkan bakteri lokal ini menunjukkan
tingkat kepercayaan P. aeruginosa sebesar
97%, tetapi ada hasil uji yang tidak biasa,
yaitu negatif nitrase. Spesies ini umumnya
positif nitrase.
Pigmen fluoresein berwarna hijau dan
berfluoresensi jika dipapari ultraviolet
(Gambar 2), sedangkan piosianin berwarna
biru. Oleh karena itu, koloni P. aeruginosa
berwarna biru kehijauan dan berfluoresensi
kehijauan saat dipapari ultraviolet (UV)
longwave. Koloni positif tersebut kemudian
dimurnikan dengan subkultur ke media King’s
B. Media ini merupakan media referensi untuk
pertumbuhan bakteri genus Pseudomonas dan
mendukung pembentukkan pigmen.

Gambar 1 Isolat P. aeruginosa pada kertas
milipore 0.45 µm.

(a)

(b)

Gambar 2 Pigmen fluoresein P. aeruginosa:
(a) tidak dipapari UV dan (b)
dipapari UV.
Modifikasi media tersebut dimaksudkan
untuk melihat induksi pigmen dengan media
selain Pseudomonas Base Pyocyanin (PBP)
dan memudahkan analisis faktor penginduksi.
Faktor penginduksi lebih mudah diamati
dengan mengeliminasi perkursor atau induser
yang telah ada dalam paket referensi (PBP dan
suplemen CN). Walaupun induksi warna
gagal, tetapi pemurnian bakteri dengan media
King’s B masih tetap dapat dilakukan. Hal ini
karena bakteri murninya sudah diperoleh dari
koloni tunggal yang terbentuk di media agar
PBP dan bakteri dapat tumbuh pada media
agar King’s B disertai produksi pigmen hijau.
Pertumbuhan bakteri di media ini sudah
terlihat pada inkubasi selama 24 jam.
Piosianin adalah marker/penanda yang
dapat membedakan P. aeruginosa dengan
bakteri berfluoresen lain, misalnya P.
fluorecens. Pigmen fluoresein berhasil
terinduksi pada King’s B (cair), sedangkan
piosianin hanya terinduksi (positif) pada
subkultur
pertama.
Pigmen
piosianin
mewarnai suspensi bakteri sehingga berwarna
biru, sedangkan pigmen fluoresein mewarnai
suspensi dengan warna hijau (Gambar 3).
Piosianin dihasilkan saat bakteri yang
dibiakkan pada King’s B berasal dari isolat
paling awal dalam isolasi, yaitu dari media
agar PBP. Kelarutan piosianin pada kultur
cair ini tidak stabil, berbeda dengan
fluoresein. Piosianin akan terpisah dan berada
di permukaan bila didiamkan cukup lama.

Gambar 3 Pigmen
piosianin:
positif
dihasilkan (a) dan negatif (b).

8

Piosianin tidak dihasilkan oleh bakteri saat
subkultur kedua pada media King’s B. Hal ini
menunjukkan
ada
bahan
penginduksi
piosianin pada media PBP, tetapi tidak
dimiliki media King’s B. Hal ini diduga dari
ion keberadaan ion tertentu, sesuai dengan
pernyataan Frank dan DeMoss (1959), bahwa
produksi piosianin dapat terjadi selama media
tumbuh mengandung konsentrasi ion fosfat
yang rendah dan cukup ion sulfat . Komposisi
media PBP mengandung garam sulfat, tetapi
tidak mengandung senyawa atau garam fosfat.
Hal ini berbeda dengan King’s B yang
mengandung
komposisi
garam
fosfat
(K2HPO4).
Fluoresein juga akan hilang jika kultur
didinginkan atau disimpan dalam lemari
pendingin (-4 oC) dan tidak dihasilkan bila
kultur tersebut disubkultur lagi dari kultur
yang lama. Peristiwa ini terlihat pada Gambar
4, satu koloni P. aeruginosa pada sebelah
kanan petri tidak menghasilkan pigmen
fluoresein
atau
tidak
berfluoresensi.
Fluoresein akan muncul lagi bila disegarkan
terlebih dahulu dalam media cair yang
mengandung bufer. Media cair yang
digunakan adalah King’s B cair, karena
komposisinya sederhana dan memiliki bufer
untuk spesifikasi pertumbuhan Pseudomonas.
Media
ini
juga
digunakan
untuk
mengencerkan bakteri, bukan dengan NaCl
0.9
%
karena
dapat
menghambat
pembentukkan fluoresein. Hal ini diduga
karena inhibisi oleh ion Cl-.
Induksi piosianin tidak berhasil dilakukan
hanya dengan media King’s B saja. Oleh
karena itu, induksi dilanjutkan dengan
menambahkan bahan tertentu bersama media
King’s B. Penambahan bahan ini diharapkan
dapat menjadi induser atau mencekam bakteri.
Induksi piosianin dengan penambahan
setrimida 0.03% (300 ppm) dan kelipatannya,
nalidiksat 1.5%, campuran keduanya, HNO3,
media berselulosa, gliserol berlebih.

Gambar 4 Fluoresein pada koloni: terinduksi
(kiri) dan tidak (kanan).

Alasan penggunaan bahan-bahan tersebut,
yaitu setrimida telah dilaporkan dapat
menginduksi piosianin, sedangkan nalidiksat
bersama setrimida diberikan sebagai suplemen
penginduksi piosianin pada isolasi pertama
(positif piosianin). Senyawa HNO3 menjadi
pertimbangan karena isolat lokal ini negatif
nitrase dan piosianin dihasilkan dari isolat
pertama setelah dikultur beberapa hari. Hal ini
juga
sesuai
dengan
prinsip
adanya
penggunaan oksigen terlarut dalam air untuk
proses nitrasi (BOD tingkat 2, menghasilkan
NO-3). Selulosa menjadi pertimbangan karena
digunakan pada isolasi air minum, yaitu pada
kertas milipore. Penambahan bahan-bahan
tersebut gagal menginduksi piosianin, tetapi
fluoresein berhasil terinduksi.
Setrimida tidak menginduksi fluoresein
pada isolat lokal ini. Hasil percobaan
menunjukkan bahwa fluoresein belum tentu
terbentuk pada King’s B cair pada beberapa
kali ulangan. Walaupun demikian, sudah jelas
setrimida tidak menginduksi piosianin pada
isolat lokal ini. Setrimida dan nalidiksat juga
dapat menginhibisi pertumbuhan bakteri ini
bila kadar berlebih. Dua kali lipat kadar
referensi setrimida atau 2 x 0.03 % ternyata
mampu menghambat bakteri ini hingga kultur
cair tidak terlihat keruh.
Induksi dengan menggunakan bahan
tambahan tidak berhasil, lalu muncul dugaan
induksi berupa cekaman atau interaksi dari
atau bersama bakteri asing. Penelitian
akhirnya dilanjutkan dengan memberikan
cekaman bakteri asing. Bakteri tersebut adalah
kontaminan yang tumbuh pada kultur petri P.
aeruginosa
sebelumnya
dan
bakteri
Escherichia coli. Selain itu, ketahanan bakteri
ini dikecilkan dengan memberikan perlakuan
setrimida dan mengecilkan jumlah bakteri
dengan pengenceran sampai 10-3. Semua
perlakuan tersebut dilakukan terhadap bakteri
P. aeruginosa (lokal) dalam lima ml King’s B
cair. Hasil yang diperoleh menunjukkan
piosianin tidak terinduksi pada semua
perlakuan, berbeda dengan fluoresein. Tahap
induksi ini tidak dilanjutkan lagi hingga
pengujian pengaruh ion fosfat dan sulfat
terhadap produksi pigmen piosianin dan
fluoresein.
Radiasi ultraviolet (UV) diperlukan untuk
menginduksi pigmen fluoresein agar dapat
berfluoresensi. Panjang gelombang ultraviolet
(UV) untuk menginduksinya adalah 366 nm
(longwave)
sesuai
dengan
prosedur
perusahaan Merck. Panjang gelombang UV
untuk
menginduksi
fluoresensi
perlu
diklarifikasi dengan mengukur kembali

9

absorbansi kultur terinduksi (menghasilkan
pigmen fluoresein) dengan menggunakan
spektrufluorometer. Pengukuran dilakukan
pada berbagai panjang gelombang, artinya
energi eksitasi berupa radiasi cahaya putih.
Hasilnya berupa tampilan puncak yang
menunjukkan nilai absorbansi pada panjang
gelombang tertentu. Panjang gelombang
absorbansi ditentukan dari proyeksi titik
puncak ke sumbu horizontal. Hasil pembacaan
menunjukkan ada banyak puncak antara
panjang gelombang 359 dan 371 nm. Ada
juga puncak di atas rentang panjang
gelombang ultraviolet, yaitu 409 nm.
Energi utama dari fluoresensi berasal dari
absorbansi cahaya panjang gelombang
pendek. Cahaya panjang gelombang pendek
mempunyai energi yang tinggi dan rentang ini
masuk ultraviolet. Hal inilah yang mendasari
induksi fluoresensi dengan ultraviolet. Induksi
utama diyakini berada pada panjang
gelombang daerah ultraviolet, yaitu 370 nm.
Panjang gelombang yang direferensikan
berada pada panjang gelombang 366 nm. Hal
ini menjelaskan panjang gelombang 366 nm
mungkin sudah menjadi standar di pasaran.
Selain itu, mungkin juga sulit menemukan
atau memodifikasi lapisan pendar (biasanya
senyawa fosfor) yang dapat menghasilkan
panjang gelombang pada panjang gelombang
selain 366 nm atau sesuai spesifikasi tertentu.
Sumber cahaya UV adalah lampu tube
lamp/neon empat watt dan terdapat di pasaran
sebagai
pendeteksi
marker-fluoresen
perangko.
Walaupun demikian, perlu
dilakukan klarifikasi terhadap dugaan panjang
gelombang lampu UV yang akan dipakai pada
alat karena tidak ada spesifikasi panjang
gelombang yang tertera pada kemasan.
Panjang gelombang lampu ini diperiksa
dengan spektrofluorometer dengan hasil
berupa tampilan puncak emisi pada berbagai
panjang gelombang secara kontinyu. Puncak
tertinggi merupakan panjang gelombang
sumber cahaya. Adanya getaran harmonik
menyebabkan interferensi sehingga terjadi
rentang panjang gelombang yang lebar.
Rentang panjang gelombang emisi lampu ini
antara 364-367 nm. Nilai 366 nm masuk
dalam rentang nilai tersebut sehingga sudah
sesuai referensi. Panjang gelombang tersebut
tidak bersifat germisidal karena masuk UV
longwave yang energinya yang kecil.
Emisi fluoresensi juga dibaca dengan
spektrofluorometer, tetapi menggunakan
radiasi penginduksi fluoresensi pada satu
panjang gelombang. Sumber radiasi berupa
laser, namun yang tersedia di laboratorium

hanya panjang gelombang 410 nm. Panjang
gelombang ini masih dekat rentang ultraviolet
atau masuk ultraviolet longwave sehingga
masih dapat menginduksi fluoresensi.
Hasilnya berupa grafik (Gambar 5) dengan
sumbu vertikal menunjukkan kuat emisi
cahaya (satuan counts/hitungan), sedangkan
sumbu horizontal menyatakan panjang
gelombang (satuan nanometer). Panjang
gelombang emisi didapatkan dari proyeksi
titik puncak dengan sumbu horizontal. Puncak
tertinggi menunjukkan panjang gelombang
emisi 508 nm.

Gambar 5 Emisi fluoresensi kultur
bakteri P. aeruginosa.

cair

Kontruksi Alat
Petri yang akan diproses dengan komputer,
memerlukan alat untuk menangkap gambar.
Alat ini adalah kotak foto-petri yang memiliki
kamera dan sistem pencahayaan (Gambar 6).
Alat dikontruksi dengan rangka dari
aluminium. Bahan ini dipilih karena tahan
karat dan ringan. Selain itu, juga karena sudah
mempunyai bentuk sehingga tidak perlu diberi
bentuk estetis dan tidak perlu diberikan rel
penyangga sekat (kaca atau papan). Rangka
ini ditutupi dengan papan melamin untuk
mengisolasi kamera dari cahaya luar dan
memantulkan kembali cahaya yang berasal
dari dalam. Bagian pintu dan beberapa bagian
ditutupi kaca hitam agar bagian dalam tampak
dari luar, terutama untuk memantau
penerangan ultraviolet.

Gambar 6 Kotak foto petri.

10

Alat ini tersusun atas lima kompartemen,
dari atas ke bawah yaitu kompartemen
penyimpan barang tambahan (seperti compact
disc program, kertas kalibrasi, terminal listrik
dan lain-lain), penyimpan kabel, sistem
elektronik, ruang foto, dan kompartemen
pembaur cahaya. Kompartemen pembaur
cahaya berfungsi untuk mendapatkan cahaya
yang merata di belakang gambar petri.
Sistem elekteronik, terdiri atas regulator
tegangan 12 volt (V), regulator intensitas
cahaya, inverter DC ke AC tegangan tinggi,
sistem detektor panas, baterai, dan sinyal
kelap-kelip (pembuang arus). Sistem ini
berdiri sendiri, tidak berhubungan dengan
komponen elektronik komputer kecuali
kamera.
Sistem
regulator
tegangan
mempunyai komponen utama satu Integrated
Circuit (IC) LM317 dan dua kondensator.
Keduany