Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Daun Tumbuhan Azalea (Rhododendron kamfaeri Planch)
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Azalea (Rhododendron kamfaeri Planch)
Azalea (Rhododendron spp.) banyak ditanam dipegunungan. Azalea pada
dasarnya dapat bertumbuh dalam rumah kaca dan dapat berbunga pada kondisi
apapun. Azalea terlihat sangat indah ketika mekar (Baudendistel, 1982).
Bunga Azalea mempunyai ragam merah yang berbeda-beda , ada juga
yang berwarna kuning dan putih. Memiliki dua jenis kelopak bunga yakni tunggal
dan ganda. Daunnya tunggal berbentuk lonjong dan tumbuh di semua cabang.
Azalea sebaiknya tidak terkena sinar matahari langsung, memerlukan sirkulasi
udara yang sejuk dan tidak lembab. Bila daun-daunnya kekuningan , tandanya
azalea sedang kurang sehat. Tanaman ini tidak memerlukan banyak air (Don,
2006). Azalea dapat ditanam secara soliter atau berkelompok. Bentuk bunganya
menyerupai baling-baling kapal. Tanaman asal India ini akan berbunga sepanjang
tahun terutama jika mendapat pencahayaan yang baik (Ratnasari, 2007).
Berikut ini merupakan sistematika Tumbuhan Azalea berdasarkan hasil
determinasi dari Herbarium Medanense, Universitas Sumatera Utara :
Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Class
: Dicotyledonae
Ordo
: Ericales
Famili
: Ericaceae
Genus
: Rhododendron
Spesies
: Rhododendron kaemferi Planch
Universitas Sumatera Utara
2.1.1
Jenis Tumbuhan Azalea
Bunga Azalea banyak dibudiayakan oleh banyak ahli Hortilkutura. Azalea sering
kali digambarkan berdasarkan bentuk bunga dan berdasarkan waktu mekar. Bunga
azalea memiliki jenis alami (native). Bunga Azalea banyak dilakukan persilangan
sehingga menghasilkan jenis hybrid. Berikut ini merupakan beberapa jenis bunga
azalea berdasarkan bentuk bunga.
1. Azalea alami
Bunga Azalea alami banyak sekali tumbuh di daerah Georgia. Dan
memilki warna bunga dari putih ke pink, kuning, oranye, dengan ujung
bunga berbentuk tajam. Berikut ini merupakan beberapa jenis bunga
azalea alami:
a. Alabama Azalea, R. alabamense
b. Piedmont Azalea, R. canescens
c. Flame Azalea, R. calendulaceum)
2. Azalea Hybrid
Azalea alami disilang sehingga menghasilkan jenis Azalea hybrid. Azalea
ini dihasilkan dengan berbagai warna dan bentuk. Berikut ini beberapa
jenis bunga Azalea Hybrid:
a. Kurume hybrid
b. Glenn Dale hybrid
c. Back Acre hybrid
d. Robin Hill hybrid
Bunga Azalea pada saat ini telah memiliki banyak jenis, sehingga banyak
hybrid bunga Azalea digunakan untuk menciptakan hybrid Azalea yang lainnya
(Wade, 2013)
Universitas Sumatera Utara
2.2 Senyawa Bahan Alam
Bahan alam didefinisikan sebagai senyawa organik dengan bobot molekul antara
100 hingga 2000. Dimana bahan alam ini dapat digunakan dalam bentuk tanaman
mentah, bahan makanan, resin, dan eksudat tanaman atau ekstrak bahan tanaman.
Secara historis bahan alam merupakan inti pengobatan dan masih menjadi sumber
utama obat, istilah yang digunakan untuk menjelaskan senyawa yang dapat
dikembangkan menjadi obat. Bahan alam telah menjadi dasar pengobatan, dan
bahkan sekarang, banyak senyawa yang penting bagi farmasi dan kedokteran yang
diperoleh dari sumber alam. Masyarakat umum telah lama tertarik pada bahan
alam, yang memberikan kesan aman dan nontoksik ( Herbert, 1995).
Senyawa
bahan
alam
yang
beraneka
ragam
pada
umumnya
dikelompokkan berdasarkan kesamaan strukturnya atau jalur biosintesisnya. Zat
essensial untuk hidup digunakan untuk dasar-dasar kehidupan ; tumbuh,
berkembang, dan bereproduksi. Sedangkan zat pendukung kehidupan digunakan
sebagai zat pertahanan dari gangguan mahluk lain, menarik mahluk lain, dan
untuk menetralkan racun. Senyawa alami secara umum adalah molekul kimia
berupa mineral, metabolit primer, dan metabolit sekunder. Bahan alam dibedakan
menjadi dua berdasarkan fungsi terhadap mahluk hidup yakni Metabolit Primer
dan Metabolit Sekunder (Saifudin, 2014).
2.3 Senyawa Metabolit Sekunder
Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh tumbuhan, mikrobia, atau
hewan melalui proses biosintesis yang menunjang kehidupan. Sifat-sifat kimiawi
metabolit sekunder umumnya memiliki berat molekul yang kecil dan umumnya
tidak larut dalam air karena bersifat semi polar, dan struktur kimianya sangat
beragam. Metabolit sekunder sangat banyak dijumpai dialam dan ditemukan hal
baru setiap tahun dikarenakan dilakukan penelitian biosintesis metabolit sekunder
dilaboratorium. Dengan demikian beerdasarkan jalur biosintesis, metabolit
sekunder digolongkan menjadi gologan asetat ( poliketida dan asam lemak),
golongan mevalonat (terpenoid), golongan shikimat ( fenil propanoid), dan
golongan alkaloid ( Saifudin, 2014).
Universitas Sumatera Utara
Pada jaman modern senyawa organik yang diisolasi dari kultur
mikroorganisme, seperti halnya dari tanaman,telah banyak digunakan untuk
mengobati berbagai macam penyakit. Senyawa-senyawa organik yang berasal dari
sumber-sumber alami ini menyusun suatu kelompok besar yang disebut produkproduk alami (natural products), atau yang lebih dikenal sebagai metabolit
sekunder. Metabolit sekunder dapat dibedakan secara akurat dari metabolit primer
berdasarkan kriteria berikut: penyebarannya terbatas, terdapat terutama dalam
tumbuhan dan mikroorganisme. Metabolit sekunder tidaklah bersifat essensial
untuk kehidupan. Hal yang menarik untuk diperhatikan ialah bahwa metabolit
sekunder dibiosintesis terutama dari banyak metabolit-metabolit primer: asam
amino, asetil koenzim A, asam mevalonat, dan zat antara (intermediate) dari alur
shikimat ( Herbert, 1995).
2.4 Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk
daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah, dan biji. Kebanyakan flavonoida
ini berada didalam tumbuh-tumbuhan, kecuali alga. Namun ada juga flavonoida
yang terdapat pada hewan, misalnya dalam kelenjar bau berang-berang dan
sekresi lebah (Markham, 1998).
Menurut Rahmat (2009) yang dikutip dari Peterson dan Dawyer (2000),
antosianin adalah flavonoid bermuatan yang biasanya berikatan dengan gula.
Antosianin memberikan warna merah, biru dan ungu pada buah-buahan dan
sayur-sayuran. Flavonon ditemukan pada famili jeruk. Flavon umumnya
ditemukan pada daun , sedangkan isoflavon seringkali ditemukan dalam kacangkacangan terutama kacang kedelai. Isoflavon berbeda dari flavon dengan
penempatan cincin benzene. Banyak tanaman obat menunjukkan khasiatnya yang
baik seiring dengan tingginya kandungan quercetin. Quercetin memiliki aktivitas
anti peradangan dan anti tumor.
Universitas Sumatera Utara
2.4.1 Struktur senyawa flavonoida
Senyawa flavonoida pada umumnya digambarkan sebagai senyawa bahan alam
yang terdiri dari karbon-karbon yang dihubungkan yaitu �6 -�3 -�6 . Struktur
flavonoida dibagi kedalam tiga kelas berdasarkan pada posisi ikatan terhadap
cincin aromatic dengan benzopiran, pembagian kelas struktur flavonoida tersebut
yakni : Flavonoid (gambar 2.1), isoflavonoid (gambar 2.2), neoflavonoid ( gambar
2,3), Struktur dari pembagian flavonoida dapat dilihat pada gambar berikut :
O
3
O
2
Gambar 2.1 Flavonoid
Gambar 2.2 Isoflavonoid
O
4
Gambar 2.3 Neoflavonoid
Struktur dari Flavonoid diatas dihubungkan secara biogenetik oleh prekursor
yang sama yaitu khalkon (Grotewold, 2006).
2.4.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoid merupakan salah satu kelas dari polifenol yang terdiri dari beberapa
sub kelas seperti flavones, flavonol, flavanonol, flavanon, flavan, dan antosianin.
Flavonoid juga sering dijumpai dalam bentuk aglikon yaitu pada saat hidrogennya
tidak tersubstitusi oleh gula. Namun dialam flavonoida sering dijumpai dalam
membentuk ikatan dengan glikosida (Rahmat, 2009).
Universitas Sumatera Utara
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga
menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan
spektrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat gula yang disebut
dengan glikosida (Harbone, 1996)
Menurut Markham klasifikasi Flavonoida terdiri atas :
1.
Flavonoida O-Glikosida
Flavonoid biasanya terdapat sebagai flavonoid O-Glikosida; pada senyawa
tersebut satu gugus hidroksil flavonoid ( atau lebih) terikat pada satu gula (atau
lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pemutusan gula dari
flavonoid dapat dilakukan dengan menambahakan asam.
2.
Flavonoida C-Glikosida
Gula dapat juga terikat pada atom karbon flavonoid dan dalam hal ini gula
tersebut terikat langsung pada ini benzene dengan suatu ikatan karbon-karbon
yang tahan asam, glikosida yang demikian disebut C-glikosida.
3.
Flavonoida sulfat
Golongan flavonoid lain yang mudah larut dalam air yang mungkin ditemukan
hanya sulfat. Senyawa ini mengandung satu ion sulfat , atau lebih, yang terikat
pada hidroksil fenol atau gula. Secara teknis senyawa ini sebenarnya bisulfat
karena terdapat sebagai garam , yaitu flavon-O-SO3K.
4.
Biflavonoida
Seperti yang ditunjukkan oleh namanya, biflavonoid adalah suatu
flavonoid
dimer. Flavonoid yang biasanya terlibat ialah flavon dan flavanon. Ikatan antara
flavonoid dapat berupa ikatan karbon-karbon atau ikatan eter. Biflavonoid jarang
ditemukan dalam bentuk glikosida, dan penyebarannya terbatas.
5.
Aglikon flavonoida yang optis aktif
Sejumlah aglikon flavonoid mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan
demikian menunjukkan keaktifan optik (yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar)
( Markham, 1981).
Universitas Sumatera Utara
Menurut Robinson (1995), flavonoida dapat dikelompokkan berdasarkan
keragaman pada rantai C3 yaitu :
1.
Katekin dan proantosianidin
Katekin dan proantosianidin adalah dua golongan senyawa yang mempunyai
banyak kesamaan. keduanya senyawa tak berwarna, terdapat pada seluruh dunia
tumbuhan terutama pada tumbuhan berkayu. Berikut ini merupakan struktur dari
katekin pada gambar 2.4 berikut :
OH
H
HO
O
OH
H
OH
OH
H
Gambar 2.4 Struktur Katekin
Proantosianidin dipilah kedalam tiga kelompok:
a. Leukoantosianidin
klasik
adalah
flavan
3,4
diol.
Contoh
Leukoantosianidin adalah Melaksidin. Struktur dari Melaksidin dapat
dilihat pada gambar 2.5 berikut:
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
H
OH
Gambar 2.5 Struktur Melaksidin
b. Struktur dimer yang pada pemanasan dengan asam menghasilkan satu
molekul katekin dan satu molekul antosianidin ditambah hasil sekunder
rumit yang lain.
c. Polimer, yang terdiri atas monomer Flavonoid, tetapi yang lainnya
mungkin membentuk ikatan glikosida dengan polisakarida
Universitas Sumatera Utara
2.
Flavanon dan Flavanonol
Flavanon sering terdapat sebagai aglikon dan terdistribusi luas dialam. Terdapat
dalam kayu, daun, dan bunga. Tetapi beberapa flavanon terdapat dalam bentuk
glikosida, contoh nerigenin. Struktur Flavanon dapat dilihat pada gambar 2.6
berikut :
O
O
Gambar 2.6 Struktur Flavanon
Flavanonol barangkali merupakan flavonoid yang paling kurang dikenal. Senyawa
ini berkhasiat sebagai antioksidan. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena
keberadaannya sedikit dan tidak berwarna. Struktur flavanonol dapat dilihat pada
gambar 2.7 berikut :
O
OH
O
Gambar 2.7 Struktur flavanonol
3.
Flavon , flavonol, isoflavon
Flavon dan flavonol merupakan senyawa yang paling tersebar luas dari semua
pigmen tumbuhan kuning, Flavon larut dalam pelarut organik dan berikut struktur
Flavon dalam gambar 2.8 :
O
O
Gambar 2.8 Struktur flavon
Universitas Sumatera Utara
Flavonol lazim sebagai konstituen tanaman yang tinggi dan terdapat dalam
berbagai bentuk terhidroksilasi. Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida,
biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin,
dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiimflamasi. Berikut pada
gambar 2.9 struktur Flavonol :
O
OH
O
Gambar 2.9 Struktur flavonol
Isoflavon adalah 3-fenil kromon tidak begitu menonjol, tetapi senyawa ini penting
sebagai fitoeleksin (senyawa pelindung) dan beberapa isoflavon menujukkan
aktivitas sebagai insektida, dan antifungi. Berikut pada gambar 2.10 struktur
dasar dari Isoflavon :
O
O
Gambar 2.10 Struktur Isoflavon
4.
Antosianin
Antosianin adalah pigmen daun bunga merah sampai biru yang biasa (meski pun
apigenidin kuning). Struktur dasar dari Antosianin dapat dilihat pada gambar 2.11:
O
OH
Gambar 2.11 Struktur Antosianin
Universitas Sumatera Utara
5.
Khalkon dan dihidrokalkon
Khalkon terdapat dalam sejumlah tanaman, namun distribusinya dialam tidak
banyak. Struktur khalkon merupakan struktur dasar dari flavonoid. Berikut
struktur khalkon pada gambar 2.12:
O
Gambar 2.12 Struktur Khalkon
Dihidrokhalkon jarang terdapat di alam. Phlorizin adalah salah satu jenis dari
Dihidrokhalkon.Phlorizin telah lama dikenal dalam bidang farmasi, berikut
struktur phlorizin pada gambar 2.13 :
OH
HO
OH
O
O
Glukosa
Gambar 2.13 Struktur Phlorizin
6.
Auron
Auron berupa pigmen kuning emas terdapat dalam bunga tertentu. Struktur Auron
pada gambar 2.14 berikut :
O
CH
Gambar 2.14 Struktur Auron
Universitas Sumatera Utara
2.5 Hidrolisa
Senyawa bahan alam sering ditemukan berikatan dengan senyawa lain. Salah satu
yang senyawa yang berikatan dengan flavonoida adalah glukosa dan polisakarida.
Flavonoid glikosida biasanya terdiri dari satu atau dua glikosida. Flavonoid yang
terdiri dari dua glikosida disebut dengan diglikosida. Posisi kedua glikosida bisa
berbeda (di- O glikosida dan di-C-O glikosida) ataupun dapat ditemuka dalam
posisi yang sama ( O-glikosida dan C- glikosida) . Pemutusan gula ini berguna
untuk memudahkan pemisahan pada kromatografi. Senyawa yang berikatan
dengan O-, N-, dan S- glukosa dapat dengan mudah dihidrolisa menggunakan
asam. Tetapi C-glukosa sedikit tahan dengan asam ( Dewick, 2002).
2.6 Teknik pemisahan
2.6.1 Ekstraksi
Metode ekstraksi paling sederhana dan menjadi pilihan adalah maserasi
(perendaman). Yakni merendam material didalam pelarut. Maserasi (merendam
dalam pelarut). Tahapan ekstraksi melewati dua mekasnisme dasar yaitu :
1. Disolusi
: proses terendamnya senyawa target oleh solvent.
2. Difusi
: proses terbawanya senyawa oleh solvent keluar dari sel.
Dalam ekstraksi pemilihan pelarut ekstraksi sangat penting. Kegagalan
mengekstraksi biomassa dapat menyebabkan kehilangan zat aktif. Selain itu,
penggunaan metode ekstraksi yang tidak tepat, seperti pemanasan terhadap
biomassa dengan suatu pelarut, dapat menyebabkan penguraian bahan alam yang
berakibat aktivitas biologisnya menjadi hilang. Terdapat juga metode ekstraksi
sederhana yakni ekstraksi dingin. Ekstaksi dingin dilakukan dengan cara
merendam sampel dengan pelarut yang sesuai dalam suhu kamar. Keuntungan
cara ini merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak tidak
dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam menjadi terurai(Heinrich,
2005).
Universitas Sumatera Utara
2.6.2 Kromatografi
Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisaham berdasarkan
partisi cuplikan antara fase bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase
diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita mengetahui bahwa Tswett sebagai
penemu kromatografi dimana pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai
pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen daun. Istilah Kromatografi
dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak
dibagian bawah kolom.
Dalam kromatografi terjadi pemisahan hal ini disebabkan molekulmolekul sampel tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh fase gerak, tergantung
pada afinitas senyawa untuk kedua fase tersebut (Jhonson, 1991). Kromatografi
telah mengalami banyak perkembangan dan berikut merupakan gambar beberapa
cabang dari kromatografi :
Kromatografi
Kromatografi cair
Kromatografi Gas
Gas-Cair
Gas-Padat
Pertukaran
Ion
Eksklusi
Kromatografi
Partisi
Penjerapan
Cair- Padat
Kromatografi
Kertas
Kromatografi
Lapis Tipis
Gambar 2.15 Cabang Kromatografi (Jhonson, 1991).
Universitas Sumatera Utara
2.6.2.1 Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan salah satu metode pemisahan kromatografi
konvensional yang bersejarah karena dari sinilah bermula metode kromatografi.
Kolom gelas dengan kran pada salah satu ujungnya diisi oleh fasa diam berupa
silika atau alumina. Ukuran diameter partikel fasa diam berkisar 100 µm.
campuran yang akan dipisahkan dituangkan pada bagian atas kolom yang berisi
fasa diam. Begitu pula fase gerak berupa pelarut organik seperti heksan atau eter
dialirkan dari bagian atas kolom. Komponen-komponen yang telah terpisah dari
campurannya bergerak terbawa fase gerak ke bawah kolom. Jumlah komponen
penyusun campuran dapat terlihat sebagai cincin-cincin berwarna sepanjang
kolom gelas.
Akhirnya, komponen-komponen dari campuran meninggalkan kolom gelas
satu persatu dan dapat ditampung pada tempat yang berbeda. Untuk melakukan
pemisahan dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang relative
lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil
pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan
secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan yang
lainnya.. Ukuran patikel yang cukup besar membuat luas permukaan fase diam
relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen
dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil
supaya luas permukaan fasa diam bertambah maka menyebabkan semakin
lambatnya aliaran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu
fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan
campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam ( Hendayana, 2006).
Mekanisme pemisahan pada kromatografi pembagian dapat didasarkan
pada perbedaan koefisien partisi komponen-komponen campuran dalam fase
gerak dan fase diam. Kecepatan proses pemisahan dapat dinyatakan dengan harga
Rf komponen campuran.
Laju perambat an komponen sampel
Rf=
Laju perambatan fase gerak
Universitas Sumatera Utara
Adsorben yang digunakan harus memenuhi syarat berikut:
1. Tidak larut dalam pelarut yang digunakan
2. Inert
3. Cukup aktif sehingga memungkinkan permabatan sampel
4. Tidak berwarna agar pemisahan dapat diamati
5. Memungkinkan fase gerak dapat mengalir dengan baik
6. Dapat diproduksi dengan sifat konstan
Serta pemilihan adsorben diharapkan memiliki polaritas yang sama dengan
sampel, sedangkan untuk pelarut digunakan pelarut yang memiliki sifat
berlawanan. Bila digunakan pelarut yang kurang polar, pemisahan sempurna,
tetapi lambat sehingga volume eluen yang diperlukan lebih banyak jika
dibandingkan dengan pelarut yang lebih polar (Harmita, 2009).
2.6.2.2 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis metode yang paling banyak digunakan untuk
memurnikan sejumlah komponen. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau
aluminium yang telah dilapisi dengan penyerap (misalnya silika gel) dengan
ketebalan tertentu tergantung pada jumlah bahan yang akan dimuat kedalam
lempeng. Lempeng lapis penyerap sering menggunakan indicator fluoresensi
(�254 ) sehingga bahan alam yang mengabsorpsi sinar UV gelombang-pendek (254
nm) akan tampak sebagai bercak hitam pada latar hijau. Pada sinar UV
gelombang-panjang, senyawa tertentu dapat menampakkan fluoresensi biru atau
kuning terang (Heinrich, 2005).Kelebihan dari KLT pada penelitian Flavonoid
ialah sebagai cara analisis cepat yang memerlukan bahan yang sangat sedikit.
KLT berguna untuk tujuan berikut:
a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom
b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom
c. Identifikasi flavonoid secara ko-kromatografi
d. Isolasi flavonoid murni skala kecil
Universitas Sumatera Utara
Plat Kromatografi Lapis Tipis dapat dibuat sendiri dengan adsorben yang
telah disediakan dan sampel yang merupakan campuran senyawa yang akan
dipisahkan, sampel dilarutkan dalam pelarut yang mudah menguap kemudian
sampel tersebut ditotolkaan pada plat dengan menggunakan pipet mikro atau juga
dapat menggunakan pipa kapiler. Tetesan sampel harus diusahakan sekecil
mungkin dilakukan berulang kali dan dikeringkan. Plat Kromatografi Lapis Tipis
yang telah diteteskan sampel dalam system pelarut untuk pengembangan.
Pemilihan system pelarut dipakai berdasarkan atas prinsip like dissolve like, yang
berarti pemilihan system pelarut berdasarkan kepolaran dari sampel dimana
sampel yang bersifat nonpolar digunakan system pelarut yang non polar juga.
berikut menurut Markham (1988) senyawa Flavonoida akan menunjukkan warna
bercak khas yang dihasilkan pada penyerap kromatografi ( bisa digunakan
kromatografi kertas dan lapis tipis) berdasarkan golongan flavonoid yang
dikandung oleh ekstraksi sampel. Tabel 2.1 berikut warna bercak khas jenis
flavonoida dengan menggunakan sinar UV:
Tabel 2.1 Warna Khas Jenis Flavonoida dengan Sinar UV
Warna bercak Dengan sinar UV
Sinar UV
Sinar UV
Jenis Flavonoid yang mungkin
Tanpa NH3
Dengan NH3
Tak Nampak
Fluorosensi biru Isoflavon tanpa 5-OH bebas
muda
Kuning redup dan Perubahan warna Flavonol yang mengandung 3-OH bebas
kuning atau
sedikit atau tanpa dan dihidroflavonol
fluorosensi jingga perubahan
Fluorosensi
Jingga atau merah Auron yang mengandung 4’OH bebas
kuning
dan 2-4 OH khalkon
Hijau-kuning
Perubahan warna a. Auron yang tak mengandung 4’OH
Hijau-biru atau sedikit atau tanpa bebas dan flavanon tanpa 5-OH bebas
hijau
perubahan
b. Flavonol yang mengandung 3-OH
bebas dan disertai atau tanpa 5-OH bebas
Merah jingga
Biru
Antosianidin 3-Glikosida
redup atau merah
senduduk
Merah jambu
Biru
Sebagian
besar
antosianidin
3,5
atau fluorosensi
diglikosida
kuning
Universitas Sumatera Utara
Kromatografi sering digunakan untuk uji pendahuluan kandungan flavonoida
suatu ekstrak, dengan menggunakan pelarut alcohol dan bejana sebagai
penyangga serta menggunakan sinar UV untuk mengidentifikasi golongan
senyawa flavonoid dalam suatu ektraksi sampel.
Proses pengembangan akan lebih baik bila ruangan pengembangan dalam
kondisi tertutup. Dan visualisasi kromatogram dapat dilakukan dengan
menggunakan sinar UV (Adnan, 1997)
2.6.2.3 Komatografi Lapis Tipis Preparatif
KLT berskala preparatif memiliki kelebihan dibandingkan dengan KLT biasa,
dimana dapat menghasilkan bahan yang cukup murni untuk uji biologis dan
elusidasi struktur.
KLT Preparatif digunakan sebagai prosedur pembersih akhir
untuk pemisahan 2-4 senyawa (Heinrich, 2005). Pada KLT preparative, cuplikan
yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi plat dan
dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan
terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan menggunakan sinar UV
dan penyerap yang mengandung pita dikerok dari plat kaca (Gritter, 1991 ).
Penjerap Kromatografi Lapis Tipis mengandung pengikat dan indikator
fluorosensi yang susunan kimianya biasanya tidak ketahui. Ketika senyawa yang
dipisahkan dengan KLTP diekstraks, pengikat, indicator, dan pencemar lain
kemungkinan besar terekstraksi pula. Makin polar pelarut pengekstraksi makin
banyak bahan yang tidak diinginkan yang terekstraksi. Fase gerak biner sangat
sering dipakai pada pemisahan secara KLTP : n-heksana : etilasetat, n-heksana :
aseton. Serta pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca
yang dapat menampung beberapa plat. Keefesienan pemisahan dapat ditingkatkan
dengan cara pengembangan berulang (Hostettman, 1995)
Universitas Sumatera Utara
2.7 Adsorben
Adsorben dapat bersifat polar atau non polar. Silika gel dan alumina, adsorben
yang paling banyak digunakan dalam kromatografi, kedua-duanya bersifat polar.
Kedua adsorben tersebut lebih mudah mengadsorbi solute yang bersifat lebih
polar dari pada solute yang bersifat nonpolar. Dengan demikian alkohol akan
teradsorbsi lebih kuat daripada eter dan selanjutnya dari pada senyawa- senyawa
hidrokarbon. Sebagai contoh adsorben yang nonpolar adalah charcoal (Adnan,
1997 ). Silika dan Alumina mempunyai gugus hidroksil antaraksi yang
menentukan sifat penjerapan. Jumlah dan tatasusun gugus hidroksil ini
menentukan keaktifan. Makin besar jumlah gugus hidroksil pada senyawa, makin
kuat senyawa itu ditahan. Begitu juga dengan tatasusun isomer dari senyawa maka
urutan elusi dari yang paling lemah adalah orto, meta dan para ( Johnson, 1991).
Berikut ini merupakan beberapa jenis adsorben yang sering digunakan
pada kromatografi untuk pemisahan senyawa bahan alam khususnya Flavonoida :
1. Selulosa
Selulosa ideal digunakan untuk memisahkan glikosida yang satu dengan yang
lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon, serta unuk memisahkan aglikon
yang kurang polar.
2. Silika
Silika paling banyak digunakan untuk memisahkan aglikon yang kurang
polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon , dan flavonol.
3. Poliamida
Poliamida cocok untuk memisahkan semua flavonoid. Tetapi dapat
mencemari fraksi-fraksi.
4. Gel sephadex
Bahan ini dirancang untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan pada
ukuran molekul (bila digunakan pelarut air); molekul besar terelusi lebih
dahulu. Pada cara ini sephadex berguna untuk memisahkan poliglikosida
yang berbeda bobot molekulnya, bila sebagai pengelusi dipakai pelarut
organik (Markham, 1988).
Universitas Sumatera Utara
2.8 Teknik Spektroskopi
Spektroskopi adalah studi mengenai interaksi energy elektromagnetik dengan
materi. Dalam Kimia Organik lebih dikenal dengan spektroskopi molecular (Field
et al. 2008). Teknik spektroskopi merupakan cara yang terbaik saat ini untuk
penentuan struktur senyawa organik karena dapat dilakukan dalam waktu singkat
dan jumlah sampel yang sedikit (mg atau µg ). Pada saat ini teknik-teknik
spektroskopi sangat berkembang, bahkan stereokimia dan posisi gugus-gugus
fungsi pembentuknya dapat ditentukan. Penentuan struktur kimia senyawa
organik secara spektroskopi dapat dilakukan jika senyawa organik tersebut dalam
keadaan murni, adanya pengotor akan dihasilkan spektra yang lebih kompleks
sehingga menyulitkan dalam interpretasi spektra. Setiap senyawa organik akan
menyerap energy gelombang elektromagnetik yang berbeda-beda, oleh karena itu
teknik-teknik spektroskopi dapat digunakan untuyk menentukan struktur senyawa
organik yang tak diketahui atau untuk mempelajari karakteristik ikatan dari
senyawa-senyawa organik yang diketahui (Supratman, 2010).
2.8.1 Spektrofotometri Ultra Violet dan Visibel (UV-VIS)
Kegunaan spektrometri UV-VIS ini terletak pada kemampuannya mengukur
jumlah ikatan rangkap atau konjugasi aromatik didalam suatu molekul. Letak
serapan dapat dipengaruhi oleh substituent (ausokrom) yang menimbulkan
pergeseran dalam diena terkonjugasi, senyawa aromatic dan karbonil terkonjugasi.
Satuan yang digunakan utuk panjang gelombang ini adalah nanometer (nm =
109 m). spektrum tampak terentang dari 400 nm (ungu) ke 750 nm (merah),
sedangkan ultraviolet berjangka dari 200 nm ke 400 nm (Supratman, 2010).
Karena penyerapan radiasi ultraviolet atau tampak oleh molekul mengarah transisi
antara tingkat energi elektronik molekul , maka spektroskopi ini sering disebut
sebagai spektroskopi elektronik. Spektrum UV – Vis biasanya diukur dalam
larutan yang sangat encer dan kriteria yang paling penting dalam pilihan pelarut.
Biasanya digunakan pelarut yang tidak memiliki ikatan rangkap (Kumar, 2006).
Universitas Sumatera Utara
Spekrofotometer UV-VIS pada umumnya digunakan untuk :
1. Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonjugasi dan
ausokrom dari suatu senyawa organik.
2. Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang
maksimum suatu senyawa
3. Mampu menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan
menggunakan hukum Lambert-Beer.
Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan
sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm (Dachriyanus, 2004)
Spektrum flavonoid biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut metanol
(MeOH, ) atau etanol (EtOH), meski perlu diingat bahwa spektrum yang
dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan sehingga pada umumnya pelarut
metanol yang digunakan untuk menentukan serapan pita yang dihasilkan.
Perubahan penyulihan pada cincin A cenderung tercerminkan pada serapan pita II,
sedangkan perubahan penyulihan pada cincin B dan C cenderung lebih jelas
tercermin pada serapan pita I (Markham, 1988).
Tabel 2.2 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visible golongan Flavonoida
No
Pita II (nm)
Pita I (nm)
Jenis Flavonoida
1
250-280
310-350
Flavon
2
250-280
330-360
Flavonol (3-OH tersubstitusi)
3
250-280
350-385
Flavonol (3-OH bebas)
4
245-274
310-330 bahu
Isoflavon
5
275-295
300-330 bahu
Flavanon dan dihidroflavonol
340-390
Khalkon
380-430
Auron
465-560
Antosianidin dan antosianin
6
7
8
230-270
(kekuatan rendah)
230-270
(kekuatan rendah)
270-280
Universitas Sumatera Utara
2.8.2 Spektrofotometer Inframerah (IR)
Spektroskopi inframerah tentunya merupakan salah satu teknik analisis yang
paling penting untuk para ilmuwan saat ini . Salah satu keuntungan besar dari
inframerah spektroskopi adalah hampir semua sampel di hampir semua negara
dapat dipelajari .Cairan, pasta , bubuk , film , serat , gas dan permukaan semua
bisa diperiksa dengan pilihan teknik sampling . Akhirnya dilakukanlah berbagai
pengembangan instrumentasi , dengan berbagai teknik sensitive dikembangkan
dalam rangka untuk memeriksa sampel. Spektrometer inframerah telah tersedia
secara komersial sejak tahun 1940-an.
Spektroskopi inframerah adalah suatu teknik yang didasarkan pada
getaran dari atom molekul . Spektrum inframerah umumnya diperoleh dengan
melewatkan sinar radiasi inframerah melalui sampel dan radiasi akan diserap
pada energi tertentu . energi di mana setiap puncak dalam penyerapan spektrum
muncul bersesuaian dengan frekuensi getaran dari bagian dari sampel molekul .
Getaran molekul akan dilihat di sini , karena ini penting untuk interpretasi
spektrum inframerah.
Suatu molekul akan memberikan suatu ciri khusus pada penyerapan
Inframerah, karena momen dipole listrik pada molekul tersebut akan berubah
ketika bergetar. Ini adalah aturan batasan untuk spektroskopi inframerah. Getaran
melibatkan perubahan panjang ikatan stretching ( peregangan ) atau bending (
menekuk ). Beberapa
stretching biasanya berbentuk simetris dan bending
biasanya berbentuk asimetris.molekul memiliki atom-atom yang berbeda seperti
HCN , ClCN atau ONCl , maka panjang ikatan tidak lagi simetris dan getaran
asimetris yang sama (Stuart, 2004). Dua molekul senyawa yang memiliki struktur
kimia yang berbeda akan memiliki spektrum inframerah yang berbeda pula. Hal
ini dapat dimengerti karena kedua molekul tersebut memiliki jenis ikatan dan
frekuensi vibrasi yang berbeda. Walaupun memilki jenis ikatan yang sama,
ikatan-ikatan tersebut berada dalam dua senyawa yang berbeda sehingga
mempunyai frekuensi vibrasi yang berbeda (karena kedua ikatan yang sama
tersebut berada dalm lingkungan yang berbeda).
Universitas Sumatera Utara
Dengan demikian , spektrum inframerah dapat dikatakan sebagai sidik jari
suatu molekul, seperti yang dimiliki oleh setiap orang ( Harmita, 2002).
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul.
Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul:
Stretching (vibrasi regang/ulur) : vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi
perpanjangan atau pemendekan ikatan.
Bending (vibrasi lentur/tekuk) : vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan
sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan. Gerakan vibrasi yang
teramati dengan spektrum inframerah jika menghasilkan perubahan momen dipole
(µ≠0) sedangkan jika (µ=0) akan teramati dalam spektrum raman.
Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energy lebih dari satu
panjang gelombang. Contohnya ikatan O-H menyerap energy pada frekuensi 3330
cm-1 ; energy pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang
ikatan O-H itu. Suatu ikatan O-H itu juga menyerap pada kira-kira 1250-1 ; energy
pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi
yang berlain-lainan ini disebut dengan vibrasi fundamental.
Berikut ini merupakan beberapa serapan karakteristik gugus fungsi molekul
organik:
1. Karbon-Karbon dan Karbon-Hidrogen
Ikatan antara atom sp3 (ikatan tunggal C-C) mengakibatkan adanya pita
serapan yang lemah dalam spektrum inframerah. Ikatan antara karbon sp2
(C=C) seringkali menunjukkan absorpsi karakteristik sekitar 1600-1700
cm-1. Ikatan karbon-karbon aril menunjukkan serapan pada frekuensi
sedikit lebih rendah (lebih kekanan dalam spektrum itu), hal ini
diakibatkan
adanya
delokalisasi
electron
� sehingga orde ikatan
berkurang. Ikatan antara karbon sp ≡C)
(C menunjukkan serapan yang
lemah, tetapi sangat karakteristik, pada 2100-2250 cm-1, suatu daerah
spektrum dimana kebanyakan gugus-gugus lain tidak menunjukkan
absorpsi.
Universitas Sumatera Utara
Hampir semua senyawa organik mengandung ikaatan C-H. serapan yang
disebabkan oleh vibrasi regang C-H seringkali berguna dalam menetapkan
hibridisas atom karbonnya.berbagai jenis ikatan C-H menunjukkan
serapan dibagian tertentu dari daerah regang C-H (3300-2700 cm-1 dan
tergantung juga dengan posisi relative C-H dari gugus fungsi.
2. Senyawa karbonil
Salah satu pita dalam spektrum inframerah yang paling berbeda ialah pita
yang disebabkan oleh modus vibrasi regang karbonil. Pita ini merupakan
pita kuat dijumpai pada daerah 1640-1820 cm-1. Gugus karbonil
merupakan bagian dari sejumlah gugus fungsional.
3. Eter
Eter mempunyai suatu pita yang berasal dari vibrasi regang C-O yang
terletak dalam daerah sidik jari pada 1050-1260 cm-1 karena oksigen
bersifat elektronegatif, regang akan menyebabkan perubahan besar dalam
momen ikatan.
4. Alkohol
Alkohol menunjukkan serapan regang O-H yang jelas pada 3000-3700
cm-1, disebelah kiri serapan C-H. Ikatan hydrogen mengubah posisi pada
penampilan pita serapan inframerah. Bila ikatan hydrogen kurang
ekstensif akan Nampak pita O-H yang lebih runcing dan kurang intensif
(Supratman,2010)
Spektrofotometer inframerah pada umumnya digunakan untuk:
1. Menentukan gugus fungsi suatu senyawa organik
2. Mengetahui
informasi
struktur
suatu
senyawa
organik
dengan
membandingkan daerah sidik jarinya.
Universitas Sumatera Utara
2.8.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton
Spektroskopi resonansi magnet proton dapat digunakan untuk menentukan jenis
lingkungan atom yang berbeda yang ada didalam molekul; jumlah atom hydrogen
pada atom karbon tetangga. Sinyal-sinyal resonansi muncul karena proton-proton
dalam molekul berada dalam molekul berada dalam lingkungan kimia yang
berlainan. Sinyal-sinyal resonansi tersebut letaknya terpisah karena adanya
geseran kimia (chemical shift). beberapa sinyal tidak berupa garis tunggal tetapi
mengikuti pola pemecahan (splitting) yang karakteristik, seperti doublet, triplet,
dan kuartet. Pemecahan disebabkan oleh pengandengan spin-spin (spin-spin
coupling), yaitu interaksi magnetic suatu inti dengan inti yang lain
(Harmita,2009).
Chemical shift dan spin-spin coupling berhubungan dengan lingkungan
kimia pada inti. Sebuah spektrum 1H NMR adalah grafik antara frekuensi
resonansi (chemical shift) vs. intensitas absorpsi Rf oleh sampel. Spektrum
biasanya dikalibrasikan kedalam ppm (parts per million) (Field et al, 2008).
Pergeseran kimia (chemical shift) dapat diukur dalam Hz tapi sering
digambarkan dalam ppm.
pergeseran kimia dari TMS dalam Hz
Chemical shift (δ) dalam ppm =
frekuensi spektrometer dalam MHz
Dalam
1
H NMR, yang diukur adalah perbedaan antara frekuensi
resonansi suatu jenis proton dan frekuensi resonansi proton senyawa pembanding,
misalnya Tetrametilsilan (TMS). Dan pelarut yang tidak memiliki proton.TMS
juga dapat digunakan untuk 13C-NMR karna alasan berikut :
1. Stabil secara kimia, simetris dan beresonansi.
2. Proton pada gugus metil senyawa ini lebih terperisai dibandingkan proton
senyawa lain.
3. TMS memberikan signal yang tajam (singlet)
4. Bersifat inert dan titik didih rendah (26,5 oC)
5. Larut dalam sebagian besar pelarut organik (Harmita, 2009
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Tumbuhan Azalea (Rhododendron kamfaeri Planch)
Azalea (Rhododendron spp.) banyak ditanam dipegunungan. Azalea pada
dasarnya dapat bertumbuh dalam rumah kaca dan dapat berbunga pada kondisi
apapun. Azalea terlihat sangat indah ketika mekar (Baudendistel, 1982).
Bunga Azalea mempunyai ragam merah yang berbeda-beda , ada juga
yang berwarna kuning dan putih. Memiliki dua jenis kelopak bunga yakni tunggal
dan ganda. Daunnya tunggal berbentuk lonjong dan tumbuh di semua cabang.
Azalea sebaiknya tidak terkena sinar matahari langsung, memerlukan sirkulasi
udara yang sejuk dan tidak lembab. Bila daun-daunnya kekuningan , tandanya
azalea sedang kurang sehat. Tanaman ini tidak memerlukan banyak air (Don,
2006). Azalea dapat ditanam secara soliter atau berkelompok. Bentuk bunganya
menyerupai baling-baling kapal. Tanaman asal India ini akan berbunga sepanjang
tahun terutama jika mendapat pencahayaan yang baik (Ratnasari, 2007).
Berikut ini merupakan sistematika Tumbuhan Azalea berdasarkan hasil
determinasi dari Herbarium Medanense, Universitas Sumatera Utara :
Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Class
: Dicotyledonae
Ordo
: Ericales
Famili
: Ericaceae
Genus
: Rhododendron
Spesies
: Rhododendron kaemferi Planch
Universitas Sumatera Utara
2.1.1
Jenis Tumbuhan Azalea
Bunga Azalea banyak dibudiayakan oleh banyak ahli Hortilkutura. Azalea sering
kali digambarkan berdasarkan bentuk bunga dan berdasarkan waktu mekar. Bunga
azalea memiliki jenis alami (native). Bunga Azalea banyak dilakukan persilangan
sehingga menghasilkan jenis hybrid. Berikut ini merupakan beberapa jenis bunga
azalea berdasarkan bentuk bunga.
1. Azalea alami
Bunga Azalea alami banyak sekali tumbuh di daerah Georgia. Dan
memilki warna bunga dari putih ke pink, kuning, oranye, dengan ujung
bunga berbentuk tajam. Berikut ini merupakan beberapa jenis bunga
azalea alami:
a. Alabama Azalea, R. alabamense
b. Piedmont Azalea, R. canescens
c. Flame Azalea, R. calendulaceum)
2. Azalea Hybrid
Azalea alami disilang sehingga menghasilkan jenis Azalea hybrid. Azalea
ini dihasilkan dengan berbagai warna dan bentuk. Berikut ini beberapa
jenis bunga Azalea Hybrid:
a. Kurume hybrid
b. Glenn Dale hybrid
c. Back Acre hybrid
d. Robin Hill hybrid
Bunga Azalea pada saat ini telah memiliki banyak jenis, sehingga banyak
hybrid bunga Azalea digunakan untuk menciptakan hybrid Azalea yang lainnya
(Wade, 2013)
Universitas Sumatera Utara
2.2 Senyawa Bahan Alam
Bahan alam didefinisikan sebagai senyawa organik dengan bobot molekul antara
100 hingga 2000. Dimana bahan alam ini dapat digunakan dalam bentuk tanaman
mentah, bahan makanan, resin, dan eksudat tanaman atau ekstrak bahan tanaman.
Secara historis bahan alam merupakan inti pengobatan dan masih menjadi sumber
utama obat, istilah yang digunakan untuk menjelaskan senyawa yang dapat
dikembangkan menjadi obat. Bahan alam telah menjadi dasar pengobatan, dan
bahkan sekarang, banyak senyawa yang penting bagi farmasi dan kedokteran yang
diperoleh dari sumber alam. Masyarakat umum telah lama tertarik pada bahan
alam, yang memberikan kesan aman dan nontoksik ( Herbert, 1995).
Senyawa
bahan
alam
yang
beraneka
ragam
pada
umumnya
dikelompokkan berdasarkan kesamaan strukturnya atau jalur biosintesisnya. Zat
essensial untuk hidup digunakan untuk dasar-dasar kehidupan ; tumbuh,
berkembang, dan bereproduksi. Sedangkan zat pendukung kehidupan digunakan
sebagai zat pertahanan dari gangguan mahluk lain, menarik mahluk lain, dan
untuk menetralkan racun. Senyawa alami secara umum adalah molekul kimia
berupa mineral, metabolit primer, dan metabolit sekunder. Bahan alam dibedakan
menjadi dua berdasarkan fungsi terhadap mahluk hidup yakni Metabolit Primer
dan Metabolit Sekunder (Saifudin, 2014).
2.3 Senyawa Metabolit Sekunder
Metabolit sekunder adalah senyawa yang disintesis oleh tumbuhan, mikrobia, atau
hewan melalui proses biosintesis yang menunjang kehidupan. Sifat-sifat kimiawi
metabolit sekunder umumnya memiliki berat molekul yang kecil dan umumnya
tidak larut dalam air karena bersifat semi polar, dan struktur kimianya sangat
beragam. Metabolit sekunder sangat banyak dijumpai dialam dan ditemukan hal
baru setiap tahun dikarenakan dilakukan penelitian biosintesis metabolit sekunder
dilaboratorium. Dengan demikian beerdasarkan jalur biosintesis, metabolit
sekunder digolongkan menjadi gologan asetat ( poliketida dan asam lemak),
golongan mevalonat (terpenoid), golongan shikimat ( fenil propanoid), dan
golongan alkaloid ( Saifudin, 2014).
Universitas Sumatera Utara
Pada jaman modern senyawa organik yang diisolasi dari kultur
mikroorganisme, seperti halnya dari tanaman,telah banyak digunakan untuk
mengobati berbagai macam penyakit. Senyawa-senyawa organik yang berasal dari
sumber-sumber alami ini menyusun suatu kelompok besar yang disebut produkproduk alami (natural products), atau yang lebih dikenal sebagai metabolit
sekunder. Metabolit sekunder dapat dibedakan secara akurat dari metabolit primer
berdasarkan kriteria berikut: penyebarannya terbatas, terdapat terutama dalam
tumbuhan dan mikroorganisme. Metabolit sekunder tidaklah bersifat essensial
untuk kehidupan. Hal yang menarik untuk diperhatikan ialah bahwa metabolit
sekunder dibiosintesis terutama dari banyak metabolit-metabolit primer: asam
amino, asetil koenzim A, asam mevalonat, dan zat antara (intermediate) dari alur
shikimat ( Herbert, 1995).
2.4 Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida sebenarnya terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk
daun, akar, kayu, kulit, tepung sari, bunga, buah, dan biji. Kebanyakan flavonoida
ini berada didalam tumbuh-tumbuhan, kecuali alga. Namun ada juga flavonoida
yang terdapat pada hewan, misalnya dalam kelenjar bau berang-berang dan
sekresi lebah (Markham, 1998).
Menurut Rahmat (2009) yang dikutip dari Peterson dan Dawyer (2000),
antosianin adalah flavonoid bermuatan yang biasanya berikatan dengan gula.
Antosianin memberikan warna merah, biru dan ungu pada buah-buahan dan
sayur-sayuran. Flavonon ditemukan pada famili jeruk. Flavon umumnya
ditemukan pada daun , sedangkan isoflavon seringkali ditemukan dalam kacangkacangan terutama kacang kedelai. Isoflavon berbeda dari flavon dengan
penempatan cincin benzene. Banyak tanaman obat menunjukkan khasiatnya yang
baik seiring dengan tingginya kandungan quercetin. Quercetin memiliki aktivitas
anti peradangan dan anti tumor.
Universitas Sumatera Utara
2.4.1 Struktur senyawa flavonoida
Senyawa flavonoida pada umumnya digambarkan sebagai senyawa bahan alam
yang terdiri dari karbon-karbon yang dihubungkan yaitu �6 -�3 -�6 . Struktur
flavonoida dibagi kedalam tiga kelas berdasarkan pada posisi ikatan terhadap
cincin aromatic dengan benzopiran, pembagian kelas struktur flavonoida tersebut
yakni : Flavonoid (gambar 2.1), isoflavonoid (gambar 2.2), neoflavonoid ( gambar
2,3), Struktur dari pembagian flavonoida dapat dilihat pada gambar berikut :
O
3
O
2
Gambar 2.1 Flavonoid
Gambar 2.2 Isoflavonoid
O
4
Gambar 2.3 Neoflavonoid
Struktur dari Flavonoid diatas dihubungkan secara biogenetik oleh prekursor
yang sama yaitu khalkon (Grotewold, 2006).
2.4.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoid merupakan salah satu kelas dari polifenol yang terdiri dari beberapa
sub kelas seperti flavones, flavonol, flavanonol, flavanon, flavan, dan antosianin.
Flavonoid juga sering dijumpai dalam bentuk aglikon yaitu pada saat hidrogennya
tidak tersubstitusi oleh gula. Namun dialam flavonoida sering dijumpai dalam
membentuk ikatan dengan glikosida (Rahmat, 2009).
Universitas Sumatera Utara
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga
menunjukkan pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan
spektrum sinar tampak, umumnya dalam tumbuhan terikat gula yang disebut
dengan glikosida (Harbone, 1996)
Menurut Markham klasifikasi Flavonoida terdiri atas :
1.
Flavonoida O-Glikosida
Flavonoid biasanya terdapat sebagai flavonoid O-Glikosida; pada senyawa
tersebut satu gugus hidroksil flavonoid ( atau lebih) terikat pada satu gula (atau
lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pemutusan gula dari
flavonoid dapat dilakukan dengan menambahakan asam.
2.
Flavonoida C-Glikosida
Gula dapat juga terikat pada atom karbon flavonoid dan dalam hal ini gula
tersebut terikat langsung pada ini benzene dengan suatu ikatan karbon-karbon
yang tahan asam, glikosida yang demikian disebut C-glikosida.
3.
Flavonoida sulfat
Golongan flavonoid lain yang mudah larut dalam air yang mungkin ditemukan
hanya sulfat. Senyawa ini mengandung satu ion sulfat , atau lebih, yang terikat
pada hidroksil fenol atau gula. Secara teknis senyawa ini sebenarnya bisulfat
karena terdapat sebagai garam , yaitu flavon-O-SO3K.
4.
Biflavonoida
Seperti yang ditunjukkan oleh namanya, biflavonoid adalah suatu
flavonoid
dimer. Flavonoid yang biasanya terlibat ialah flavon dan flavanon. Ikatan antara
flavonoid dapat berupa ikatan karbon-karbon atau ikatan eter. Biflavonoid jarang
ditemukan dalam bentuk glikosida, dan penyebarannya terbatas.
5.
Aglikon flavonoida yang optis aktif
Sejumlah aglikon flavonoid mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan
demikian menunjukkan keaktifan optik (yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar)
( Markham, 1981).
Universitas Sumatera Utara
Menurut Robinson (1995), flavonoida dapat dikelompokkan berdasarkan
keragaman pada rantai C3 yaitu :
1.
Katekin dan proantosianidin
Katekin dan proantosianidin adalah dua golongan senyawa yang mempunyai
banyak kesamaan. keduanya senyawa tak berwarna, terdapat pada seluruh dunia
tumbuhan terutama pada tumbuhan berkayu. Berikut ini merupakan struktur dari
katekin pada gambar 2.4 berikut :
OH
H
HO
O
OH
H
OH
OH
H
Gambar 2.4 Struktur Katekin
Proantosianidin dipilah kedalam tiga kelompok:
a. Leukoantosianidin
klasik
adalah
flavan
3,4
diol.
Contoh
Leukoantosianidin adalah Melaksidin. Struktur dari Melaksidin dapat
dilihat pada gambar 2.5 berikut:
OH
OH
HO
O
OH
OH
OH
H
OH
Gambar 2.5 Struktur Melaksidin
b. Struktur dimer yang pada pemanasan dengan asam menghasilkan satu
molekul katekin dan satu molekul antosianidin ditambah hasil sekunder
rumit yang lain.
c. Polimer, yang terdiri atas monomer Flavonoid, tetapi yang lainnya
mungkin membentuk ikatan glikosida dengan polisakarida
Universitas Sumatera Utara
2.
Flavanon dan Flavanonol
Flavanon sering terdapat sebagai aglikon dan terdistribusi luas dialam. Terdapat
dalam kayu, daun, dan bunga. Tetapi beberapa flavanon terdapat dalam bentuk
glikosida, contoh nerigenin. Struktur Flavanon dapat dilihat pada gambar 2.6
berikut :
O
O
Gambar 2.6 Struktur Flavanon
Flavanonol barangkali merupakan flavonoid yang paling kurang dikenal. Senyawa
ini berkhasiat sebagai antioksidan. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena
keberadaannya sedikit dan tidak berwarna. Struktur flavanonol dapat dilihat pada
gambar 2.7 berikut :
O
OH
O
Gambar 2.7 Struktur flavanonol
3.
Flavon , flavonol, isoflavon
Flavon dan flavonol merupakan senyawa yang paling tersebar luas dari semua
pigmen tumbuhan kuning, Flavon larut dalam pelarut organik dan berikut struktur
Flavon dalam gambar 2.8 :
O
O
Gambar 2.8 Struktur flavon
Universitas Sumatera Utara
Flavonol lazim sebagai konstituen tanaman yang tinggi dan terdapat dalam
berbagai bentuk terhidroksilasi. Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida,
biasanya 3-glikosida, dan aglikon flavonol yang umum yaitu kamferol, kuersetin,
dan mirisetin yang berkhasiat sebagai antioksidan dan antiimflamasi. Berikut pada
gambar 2.9 struktur Flavonol :
O
OH
O
Gambar 2.9 Struktur flavonol
Isoflavon adalah 3-fenil kromon tidak begitu menonjol, tetapi senyawa ini penting
sebagai fitoeleksin (senyawa pelindung) dan beberapa isoflavon menujukkan
aktivitas sebagai insektida, dan antifungi. Berikut pada gambar 2.10 struktur
dasar dari Isoflavon :
O
O
Gambar 2.10 Struktur Isoflavon
4.
Antosianin
Antosianin adalah pigmen daun bunga merah sampai biru yang biasa (meski pun
apigenidin kuning). Struktur dasar dari Antosianin dapat dilihat pada gambar 2.11:
O
OH
Gambar 2.11 Struktur Antosianin
Universitas Sumatera Utara
5.
Khalkon dan dihidrokalkon
Khalkon terdapat dalam sejumlah tanaman, namun distribusinya dialam tidak
banyak. Struktur khalkon merupakan struktur dasar dari flavonoid. Berikut
struktur khalkon pada gambar 2.12:
O
Gambar 2.12 Struktur Khalkon
Dihidrokhalkon jarang terdapat di alam. Phlorizin adalah salah satu jenis dari
Dihidrokhalkon.Phlorizin telah lama dikenal dalam bidang farmasi, berikut
struktur phlorizin pada gambar 2.13 :
OH
HO
OH
O
O
Glukosa
Gambar 2.13 Struktur Phlorizin
6.
Auron
Auron berupa pigmen kuning emas terdapat dalam bunga tertentu. Struktur Auron
pada gambar 2.14 berikut :
O
CH
Gambar 2.14 Struktur Auron
Universitas Sumatera Utara
2.5 Hidrolisa
Senyawa bahan alam sering ditemukan berikatan dengan senyawa lain. Salah satu
yang senyawa yang berikatan dengan flavonoida adalah glukosa dan polisakarida.
Flavonoid glikosida biasanya terdiri dari satu atau dua glikosida. Flavonoid yang
terdiri dari dua glikosida disebut dengan diglikosida. Posisi kedua glikosida bisa
berbeda (di- O glikosida dan di-C-O glikosida) ataupun dapat ditemuka dalam
posisi yang sama ( O-glikosida dan C- glikosida) . Pemutusan gula ini berguna
untuk memudahkan pemisahan pada kromatografi. Senyawa yang berikatan
dengan O-, N-, dan S- glukosa dapat dengan mudah dihidrolisa menggunakan
asam. Tetapi C-glukosa sedikit tahan dengan asam ( Dewick, 2002).
2.6 Teknik pemisahan
2.6.1 Ekstraksi
Metode ekstraksi paling sederhana dan menjadi pilihan adalah maserasi
(perendaman). Yakni merendam material didalam pelarut. Maserasi (merendam
dalam pelarut). Tahapan ekstraksi melewati dua mekasnisme dasar yaitu :
1. Disolusi
: proses terendamnya senyawa target oleh solvent.
2. Difusi
: proses terbawanya senyawa oleh solvent keluar dari sel.
Dalam ekstraksi pemilihan pelarut ekstraksi sangat penting. Kegagalan
mengekstraksi biomassa dapat menyebabkan kehilangan zat aktif. Selain itu,
penggunaan metode ekstraksi yang tidak tepat, seperti pemanasan terhadap
biomassa dengan suatu pelarut, dapat menyebabkan penguraian bahan alam yang
berakibat aktivitas biologisnya menjadi hilang. Terdapat juga metode ekstraksi
sederhana yakni ekstraksi dingin. Ekstaksi dingin dilakukan dengan cara
merendam sampel dengan pelarut yang sesuai dalam suhu kamar. Keuntungan
cara ini merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak tidak
dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam menjadi terurai(Heinrich,
2005).
Universitas Sumatera Utara
2.6.2 Kromatografi
Kromatografi adalah istilah umum untuk berbagai cara pemisaham berdasarkan
partisi cuplikan antara fase bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase
diam, dapat berupa zat cair atau zat padat. Kita mengetahui bahwa Tswett sebagai
penemu kromatografi dimana pada tahun 1903 menguraikan karyanya mengenai
pemakaian kolom kapur untuk memisahkan pigmen daun. Istilah Kromatografi
dipakai oleh Tswett untuk menggambarkan daerah berwarna yang bergerak
dibagian bawah kolom.
Dalam kromatografi terjadi pemisahan hal ini disebabkan molekulmolekul sampel tertahan oleh fase diam atau dibawa oleh fase gerak, tergantung
pada afinitas senyawa untuk kedua fase tersebut (Jhonson, 1991). Kromatografi
telah mengalami banyak perkembangan dan berikut merupakan gambar beberapa
cabang dari kromatografi :
Kromatografi
Kromatografi cair
Kromatografi Gas
Gas-Cair
Gas-Padat
Pertukaran
Ion
Eksklusi
Kromatografi
Partisi
Penjerapan
Cair- Padat
Kromatografi
Kertas
Kromatografi
Lapis Tipis
Gambar 2.15 Cabang Kromatografi (Jhonson, 1991).
Universitas Sumatera Utara
2.6.2.1 Kromatografi Kolom
Kromatografi kolom merupakan salah satu metode pemisahan kromatografi
konvensional yang bersejarah karena dari sinilah bermula metode kromatografi.
Kolom gelas dengan kran pada salah satu ujungnya diisi oleh fasa diam berupa
silika atau alumina. Ukuran diameter partikel fasa diam berkisar 100 µm.
campuran yang akan dipisahkan dituangkan pada bagian atas kolom yang berisi
fasa diam. Begitu pula fase gerak berupa pelarut organik seperti heksan atau eter
dialirkan dari bagian atas kolom. Komponen-komponen yang telah terpisah dari
campurannya bergerak terbawa fase gerak ke bawah kolom. Jumlah komponen
penyusun campuran dapat terlihat sebagai cincin-cincin berwarna sepanjang
kolom gelas.
Akhirnya, komponen-komponen dari campuran meninggalkan kolom gelas
satu persatu dan dapat ditampung pada tempat yang berbeda. Untuk melakukan
pemisahan dengan metode kromatografi kolom diperlukan waktu yang relative
lama, bisa berjam-jam hanya untuk memisahkan satu campuran. Selain itu, hasil
pemisahan kurang jelas artinya kadang-kadang sukar mendapatkan pemisahan
secara sempurna karena pita komponen yang satu bertumpang tindih dengan yang
lainnya.. Ukuran patikel yang cukup besar membuat luas permukaan fase diam
relative kecil sehingga tempat untuk berinteraksi antara komponen-komponen
dengan fasa diam menjadi terbatas. Apabila ukuran diameter partikel diperkecil
supaya luas permukaan fasa diam bertambah maka menyebabkan semakin
lambatnya aliaran fasa gerak atau fasa gerak tidak mengalir sama sekali. Selain itu
fasa diam yang sudah terpakai tidak dapat digunakan lagi untuk pemisahan
campuran yang lain karena sukar meregenerasi fasa diam ( Hendayana, 2006).
Mekanisme pemisahan pada kromatografi pembagian dapat didasarkan
pada perbedaan koefisien partisi komponen-komponen campuran dalam fase
gerak dan fase diam. Kecepatan proses pemisahan dapat dinyatakan dengan harga
Rf komponen campuran.
Laju perambat an komponen sampel
Rf=
Laju perambatan fase gerak
Universitas Sumatera Utara
Adsorben yang digunakan harus memenuhi syarat berikut:
1. Tidak larut dalam pelarut yang digunakan
2. Inert
3. Cukup aktif sehingga memungkinkan permabatan sampel
4. Tidak berwarna agar pemisahan dapat diamati
5. Memungkinkan fase gerak dapat mengalir dengan baik
6. Dapat diproduksi dengan sifat konstan
Serta pemilihan adsorben diharapkan memiliki polaritas yang sama dengan
sampel, sedangkan untuk pelarut digunakan pelarut yang memiliki sifat
berlawanan. Bila digunakan pelarut yang kurang polar, pemisahan sempurna,
tetapi lambat sehingga volume eluen yang diperlukan lebih banyak jika
dibandingkan dengan pelarut yang lebih polar (Harmita, 2009).
2.6.2.2 Kromatografi Lapis Tipis
Kromatografi Lapis Tipis metode yang paling banyak digunakan untuk
memurnikan sejumlah komponen. Metode ini menggunakan lempeng kaca atau
aluminium yang telah dilapisi dengan penyerap (misalnya silika gel) dengan
ketebalan tertentu tergantung pada jumlah bahan yang akan dimuat kedalam
lempeng. Lempeng lapis penyerap sering menggunakan indicator fluoresensi
(�254 ) sehingga bahan alam yang mengabsorpsi sinar UV gelombang-pendek (254
nm) akan tampak sebagai bercak hitam pada latar hijau. Pada sinar UV
gelombang-panjang, senyawa tertentu dapat menampakkan fluoresensi biru atau
kuning terang (Heinrich, 2005).Kelebihan dari KLT pada penelitian Flavonoid
ialah sebagai cara analisis cepat yang memerlukan bahan yang sangat sedikit.
KLT berguna untuk tujuan berikut:
a. Mencari pelarut untuk kromatografi kolom
b. Analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom
c. Identifikasi flavonoid secara ko-kromatografi
d. Isolasi flavonoid murni skala kecil
Universitas Sumatera Utara
Plat Kromatografi Lapis Tipis dapat dibuat sendiri dengan adsorben yang
telah disediakan dan sampel yang merupakan campuran senyawa yang akan
dipisahkan, sampel dilarutkan dalam pelarut yang mudah menguap kemudian
sampel tersebut ditotolkaan pada plat dengan menggunakan pipet mikro atau juga
dapat menggunakan pipa kapiler. Tetesan sampel harus diusahakan sekecil
mungkin dilakukan berulang kali dan dikeringkan. Plat Kromatografi Lapis Tipis
yang telah diteteskan sampel dalam system pelarut untuk pengembangan.
Pemilihan system pelarut dipakai berdasarkan atas prinsip like dissolve like, yang
berarti pemilihan system pelarut berdasarkan kepolaran dari sampel dimana
sampel yang bersifat nonpolar digunakan system pelarut yang non polar juga.
berikut menurut Markham (1988) senyawa Flavonoida akan menunjukkan warna
bercak khas yang dihasilkan pada penyerap kromatografi ( bisa digunakan
kromatografi kertas dan lapis tipis) berdasarkan golongan flavonoid yang
dikandung oleh ekstraksi sampel. Tabel 2.1 berikut warna bercak khas jenis
flavonoida dengan menggunakan sinar UV:
Tabel 2.1 Warna Khas Jenis Flavonoida dengan Sinar UV
Warna bercak Dengan sinar UV
Sinar UV
Sinar UV
Jenis Flavonoid yang mungkin
Tanpa NH3
Dengan NH3
Tak Nampak
Fluorosensi biru Isoflavon tanpa 5-OH bebas
muda
Kuning redup dan Perubahan warna Flavonol yang mengandung 3-OH bebas
kuning atau
sedikit atau tanpa dan dihidroflavonol
fluorosensi jingga perubahan
Fluorosensi
Jingga atau merah Auron yang mengandung 4’OH bebas
kuning
dan 2-4 OH khalkon
Hijau-kuning
Perubahan warna a. Auron yang tak mengandung 4’OH
Hijau-biru atau sedikit atau tanpa bebas dan flavanon tanpa 5-OH bebas
hijau
perubahan
b. Flavonol yang mengandung 3-OH
bebas dan disertai atau tanpa 5-OH bebas
Merah jingga
Biru
Antosianidin 3-Glikosida
redup atau merah
senduduk
Merah jambu
Biru
Sebagian
besar
antosianidin
3,5
atau fluorosensi
diglikosida
kuning
Universitas Sumatera Utara
Kromatografi sering digunakan untuk uji pendahuluan kandungan flavonoida
suatu ekstrak, dengan menggunakan pelarut alcohol dan bejana sebagai
penyangga serta menggunakan sinar UV untuk mengidentifikasi golongan
senyawa flavonoid dalam suatu ektraksi sampel.
Proses pengembangan akan lebih baik bila ruangan pengembangan dalam
kondisi tertutup. Dan visualisasi kromatogram dapat dilakukan dengan
menggunakan sinar UV (Adnan, 1997)
2.6.2.3 Komatografi Lapis Tipis Preparatif
KLT berskala preparatif memiliki kelebihan dibandingkan dengan KLT biasa,
dimana dapat menghasilkan bahan yang cukup murni untuk uji biologis dan
elusidasi struktur.
KLT Preparatif digunakan sebagai prosedur pembersih akhir
untuk pemisahan 2-4 senyawa (Heinrich, 2005). Pada KLT preparative, cuplikan
yang akan dipisahkan ditotolkan berupa garis pada salah satu sisi plat dan
dikembangkan secara tegak lurus pada garis cuplikan sehingga campuran akan
terpisah menjadi beberapa pita. Pita ditampakkan dengan menggunakan sinar UV
dan penyerap yang mengandung pita dikerok dari plat kaca (Gritter, 1991 ).
Penjerap Kromatografi Lapis Tipis mengandung pengikat dan indikator
fluorosensi yang susunan kimianya biasanya tidak ketahui. Ketika senyawa yang
dipisahkan dengan KLTP diekstraks, pengikat, indicator, dan pencemar lain
kemungkinan besar terekstraksi pula. Makin polar pelarut pengekstraksi makin
banyak bahan yang tidak diinginkan yang terekstraksi. Fase gerak biner sangat
sering dipakai pada pemisahan secara KLTP : n-heksana : etilasetat, n-heksana :
aseton. Serta pengembangan plat KLTP biasanya dilakukan dalam bejana kaca
yang dapat menampung beberapa plat. Keefesienan pemisahan dapat ditingkatkan
dengan cara pengembangan berulang (Hostettman, 1995)
Universitas Sumatera Utara
2.7 Adsorben
Adsorben dapat bersifat polar atau non polar. Silika gel dan alumina, adsorben
yang paling banyak digunakan dalam kromatografi, kedua-duanya bersifat polar.
Kedua adsorben tersebut lebih mudah mengadsorbi solute yang bersifat lebih
polar dari pada solute yang bersifat nonpolar. Dengan demikian alkohol akan
teradsorbsi lebih kuat daripada eter dan selanjutnya dari pada senyawa- senyawa
hidrokarbon. Sebagai contoh adsorben yang nonpolar adalah charcoal (Adnan,
1997 ). Silika dan Alumina mempunyai gugus hidroksil antaraksi yang
menentukan sifat penjerapan. Jumlah dan tatasusun gugus hidroksil ini
menentukan keaktifan. Makin besar jumlah gugus hidroksil pada senyawa, makin
kuat senyawa itu ditahan. Begitu juga dengan tatasusun isomer dari senyawa maka
urutan elusi dari yang paling lemah adalah orto, meta dan para ( Johnson, 1991).
Berikut ini merupakan beberapa jenis adsorben yang sering digunakan
pada kromatografi untuk pemisahan senyawa bahan alam khususnya Flavonoida :
1. Selulosa
Selulosa ideal digunakan untuk memisahkan glikosida yang satu dengan yang
lain, atau memisahkan glikosida dari aglikon, serta unuk memisahkan aglikon
yang kurang polar.
2. Silika
Silika paling banyak digunakan untuk memisahkan aglikon yang kurang
polar, misalnya isoflavon, flavanon, metil flavon , dan flavonol.
3. Poliamida
Poliamida cocok untuk memisahkan semua flavonoid. Tetapi dapat
mencemari fraksi-fraksi.
4. Gel sephadex
Bahan ini dirancang untuk memisahkan campuran, terutama berdasarkan pada
ukuran molekul (bila digunakan pelarut air); molekul besar terelusi lebih
dahulu. Pada cara ini sephadex berguna untuk memisahkan poliglikosida
yang berbeda bobot molekulnya, bila sebagai pengelusi dipakai pelarut
organik (Markham, 1988).
Universitas Sumatera Utara
2.8 Teknik Spektroskopi
Spektroskopi adalah studi mengenai interaksi energy elektromagnetik dengan
materi. Dalam Kimia Organik lebih dikenal dengan spektroskopi molecular (Field
et al. 2008). Teknik spektroskopi merupakan cara yang terbaik saat ini untuk
penentuan struktur senyawa organik karena dapat dilakukan dalam waktu singkat
dan jumlah sampel yang sedikit (mg atau µg ). Pada saat ini teknik-teknik
spektroskopi sangat berkembang, bahkan stereokimia dan posisi gugus-gugus
fungsi pembentuknya dapat ditentukan. Penentuan struktur kimia senyawa
organik secara spektroskopi dapat dilakukan jika senyawa organik tersebut dalam
keadaan murni, adanya pengotor akan dihasilkan spektra yang lebih kompleks
sehingga menyulitkan dalam interpretasi spektra. Setiap senyawa organik akan
menyerap energy gelombang elektromagnetik yang berbeda-beda, oleh karena itu
teknik-teknik spektroskopi dapat digunakan untuyk menentukan struktur senyawa
organik yang tak diketahui atau untuk mempelajari karakteristik ikatan dari
senyawa-senyawa organik yang diketahui (Supratman, 2010).
2.8.1 Spektrofotometri Ultra Violet dan Visibel (UV-VIS)
Kegunaan spektrometri UV-VIS ini terletak pada kemampuannya mengukur
jumlah ikatan rangkap atau konjugasi aromatik didalam suatu molekul. Letak
serapan dapat dipengaruhi oleh substituent (ausokrom) yang menimbulkan
pergeseran dalam diena terkonjugasi, senyawa aromatic dan karbonil terkonjugasi.
Satuan yang digunakan utuk panjang gelombang ini adalah nanometer (nm =
109 m). spektrum tampak terentang dari 400 nm (ungu) ke 750 nm (merah),
sedangkan ultraviolet berjangka dari 200 nm ke 400 nm (Supratman, 2010).
Karena penyerapan radiasi ultraviolet atau tampak oleh molekul mengarah transisi
antara tingkat energi elektronik molekul , maka spektroskopi ini sering disebut
sebagai spektroskopi elektronik. Spektrum UV – Vis biasanya diukur dalam
larutan yang sangat encer dan kriteria yang paling penting dalam pilihan pelarut.
Biasanya digunakan pelarut yang tidak memiliki ikatan rangkap (Kumar, 2006).
Universitas Sumatera Utara
Spekrofotometer UV-VIS pada umumnya digunakan untuk :
1. Menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap yang terkonjugasi dan
ausokrom dari suatu senyawa organik.
2. Menjelaskan informasi dari struktur berdasarkan panjang gelombang
maksimum suatu senyawa
3. Mampu menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan
menggunakan hukum Lambert-Beer.
Sinar ultraviolet berada pada panjang gelombang 200-400 nm sedangkan
sinar tampak berada pada panjang gelombang 400-800 nm (Dachriyanus, 2004)
Spektrum flavonoid biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut metanol
(MeOH, ) atau etanol (EtOH), meski perlu diingat bahwa spektrum yang
dihasilkan dalam etanol kurang memuaskan sehingga pada umumnya pelarut
metanol yang digunakan untuk menentukan serapan pita yang dihasilkan.
Perubahan penyulihan pada cincin A cenderung tercerminkan pada serapan pita II,
sedangkan perubahan penyulihan pada cincin B dan C cenderung lebih jelas
tercermin pada serapan pita I (Markham, 1988).
Tabel 2.2 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visible golongan Flavonoida
No
Pita II (nm)
Pita I (nm)
Jenis Flavonoida
1
250-280
310-350
Flavon
2
250-280
330-360
Flavonol (3-OH tersubstitusi)
3
250-280
350-385
Flavonol (3-OH bebas)
4
245-274
310-330 bahu
Isoflavon
5
275-295
300-330 bahu
Flavanon dan dihidroflavonol
340-390
Khalkon
380-430
Auron
465-560
Antosianidin dan antosianin
6
7
8
230-270
(kekuatan rendah)
230-270
(kekuatan rendah)
270-280
Universitas Sumatera Utara
2.8.2 Spektrofotometer Inframerah (IR)
Spektroskopi inframerah tentunya merupakan salah satu teknik analisis yang
paling penting untuk para ilmuwan saat ini . Salah satu keuntungan besar dari
inframerah spektroskopi adalah hampir semua sampel di hampir semua negara
dapat dipelajari .Cairan, pasta , bubuk , film , serat , gas dan permukaan semua
bisa diperiksa dengan pilihan teknik sampling . Akhirnya dilakukanlah berbagai
pengembangan instrumentasi , dengan berbagai teknik sensitive dikembangkan
dalam rangka untuk memeriksa sampel. Spektrometer inframerah telah tersedia
secara komersial sejak tahun 1940-an.
Spektroskopi inframerah adalah suatu teknik yang didasarkan pada
getaran dari atom molekul . Spektrum inframerah umumnya diperoleh dengan
melewatkan sinar radiasi inframerah melalui sampel dan radiasi akan diserap
pada energi tertentu . energi di mana setiap puncak dalam penyerapan spektrum
muncul bersesuaian dengan frekuensi getaran dari bagian dari sampel molekul .
Getaran molekul akan dilihat di sini , karena ini penting untuk interpretasi
spektrum inframerah.
Suatu molekul akan memberikan suatu ciri khusus pada penyerapan
Inframerah, karena momen dipole listrik pada molekul tersebut akan berubah
ketika bergetar. Ini adalah aturan batasan untuk spektroskopi inframerah. Getaran
melibatkan perubahan panjang ikatan stretching ( peregangan ) atau bending (
menekuk ). Beberapa
stretching biasanya berbentuk simetris dan bending
biasanya berbentuk asimetris.molekul memiliki atom-atom yang berbeda seperti
HCN , ClCN atau ONCl , maka panjang ikatan tidak lagi simetris dan getaran
asimetris yang sama (Stuart, 2004). Dua molekul senyawa yang memiliki struktur
kimia yang berbeda akan memiliki spektrum inframerah yang berbeda pula. Hal
ini dapat dimengerti karena kedua molekul tersebut memiliki jenis ikatan dan
frekuensi vibrasi yang berbeda. Walaupun memilki jenis ikatan yang sama,
ikatan-ikatan tersebut berada dalam dua senyawa yang berbeda sehingga
mempunyai frekuensi vibrasi yang berbeda (karena kedua ikatan yang sama
tersebut berada dalm lingkungan yang berbeda).
Universitas Sumatera Utara
Dengan demikian , spektrum inframerah dapat dikatakan sebagai sidik jari
suatu molekul, seperti yang dimiliki oleh setiap orang ( Harmita, 2002).
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul.
Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul:
Stretching (vibrasi regang/ulur) : vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi
perpanjangan atau pemendekan ikatan.
Bending (vibrasi lentur/tekuk) : vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan
sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan. Gerakan vibrasi yang
teramati dengan spektrum inframerah jika menghasilkan perubahan momen dipole
(µ≠0) sedangkan jika (µ=0) akan teramati dalam spektrum raman.
Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energy lebih dari satu
panjang gelombang. Contohnya ikatan O-H menyerap energy pada frekuensi 3330
cm-1 ; energy pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang
ikatan O-H itu. Suatu ikatan O-H itu juga menyerap pada kira-kira 1250-1 ; energy
pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi
yang berlain-lainan ini disebut dengan vibrasi fundamental.
Berikut ini merupakan beberapa serapan karakteristik gugus fungsi molekul
organik:
1. Karbon-Karbon dan Karbon-Hidrogen
Ikatan antara atom sp3 (ikatan tunggal C-C) mengakibatkan adanya pita
serapan yang lemah dalam spektrum inframerah. Ikatan antara karbon sp2
(C=C) seringkali menunjukkan absorpsi karakteristik sekitar 1600-1700
cm-1. Ikatan karbon-karbon aril menunjukkan serapan pada frekuensi
sedikit lebih rendah (lebih kekanan dalam spektrum itu), hal ini
diakibatkan
adanya
delokalisasi
electron
� sehingga orde ikatan
berkurang. Ikatan antara karbon sp ≡C)
(C menunjukkan serapan yang
lemah, tetapi sangat karakteristik, pada 2100-2250 cm-1, suatu daerah
spektrum dimana kebanyakan gugus-gugus lain tidak menunjukkan
absorpsi.
Universitas Sumatera Utara
Hampir semua senyawa organik mengandung ikaatan C-H. serapan yang
disebabkan oleh vibrasi regang C-H seringkali berguna dalam menetapkan
hibridisas atom karbonnya.berbagai jenis ikatan C-H menunjukkan
serapan dibagian tertentu dari daerah regang C-H (3300-2700 cm-1 dan
tergantung juga dengan posisi relative C-H dari gugus fungsi.
2. Senyawa karbonil
Salah satu pita dalam spektrum inframerah yang paling berbeda ialah pita
yang disebabkan oleh modus vibrasi regang karbonil. Pita ini merupakan
pita kuat dijumpai pada daerah 1640-1820 cm-1. Gugus karbonil
merupakan bagian dari sejumlah gugus fungsional.
3. Eter
Eter mempunyai suatu pita yang berasal dari vibrasi regang C-O yang
terletak dalam daerah sidik jari pada 1050-1260 cm-1 karena oksigen
bersifat elektronegatif, regang akan menyebabkan perubahan besar dalam
momen ikatan.
4. Alkohol
Alkohol menunjukkan serapan regang O-H yang jelas pada 3000-3700
cm-1, disebelah kiri serapan C-H. Ikatan hydrogen mengubah posisi pada
penampilan pita serapan inframerah. Bila ikatan hydrogen kurang
ekstensif akan Nampak pita O-H yang lebih runcing dan kurang intensif
(Supratman,2010)
Spektrofotometer inframerah pada umumnya digunakan untuk:
1. Menentukan gugus fungsi suatu senyawa organik
2. Mengetahui
informasi
struktur
suatu
senyawa
organik
dengan
membandingkan daerah sidik jarinya.
Universitas Sumatera Utara
2.8.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton
Spektroskopi resonansi magnet proton dapat digunakan untuk menentukan jenis
lingkungan atom yang berbeda yang ada didalam molekul; jumlah atom hydrogen
pada atom karbon tetangga. Sinyal-sinyal resonansi muncul karena proton-proton
dalam molekul berada dalam molekul berada dalam lingkungan kimia yang
berlainan. Sinyal-sinyal resonansi tersebut letaknya terpisah karena adanya
geseran kimia (chemical shift). beberapa sinyal tidak berupa garis tunggal tetapi
mengikuti pola pemecahan (splitting) yang karakteristik, seperti doublet, triplet,
dan kuartet. Pemecahan disebabkan oleh pengandengan spin-spin (spin-spin
coupling), yaitu interaksi magnetic suatu inti dengan inti yang lain
(Harmita,2009).
Chemical shift dan spin-spin coupling berhubungan dengan lingkungan
kimia pada inti. Sebuah spektrum 1H NMR adalah grafik antara frekuensi
resonansi (chemical shift) vs. intensitas absorpsi Rf oleh sampel. Spektrum
biasanya dikalibrasikan kedalam ppm (parts per million) (Field et al, 2008).
Pergeseran kimia (chemical shift) dapat diukur dalam Hz tapi sering
digambarkan dalam ppm.
pergeseran kimia dari TMS dalam Hz
Chemical shift (δ) dalam ppm =
frekuensi spektrometer dalam MHz
Dalam
1
H NMR, yang diukur adalah perbedaan antara frekuensi
resonansi suatu jenis proton dan frekuensi resonansi proton senyawa pembanding,
misalnya Tetrametilsilan (TMS). Dan pelarut yang tidak memiliki proton.TMS
juga dapat digunakan untuk 13C-NMR karna alasan berikut :
1. Stabil secara kimia, simetris dan beresonansi.
2. Proton pada gugus metil senyawa ini lebih terperisai dibandingkan proton
senyawa lain.
3. TMS memberikan signal yang tajam (singlet)
4. Bersifat inert dan titik didih rendah (26,5 oC)
5. Larut dalam sebagian besar pelarut organik (Harmita, 2009
Universitas Sumatera Utara