14756 18765 1 PB
UNESA Journal of Chemistry Vol.5 No.1 January 2016
PENENTUAN pH DAN SUHU OPTIMUM ENZIM PROTEASE DARI ISOLAT
ST-30 YANG DIHASILKAN DARI SINGGAHAN, TUBAN
DETERMINATION OF pH AND TEMPERATURE OPTIMUM PROTEASE
ENZYME OF ST-30 ISOLATE RESULTING FROM HOT SPRING
SINGGAHAN, TUBAN
Nur Chalim Maulidah* dan Nuniek Herdyastuti
Departement of Chemistry, Faculty of Mathematic and Natural Sciences State
University of Surabaya
Jl. Ketintang Surabaya (60231), Telp. 031-8299761
*Corresponding author, email: maulidah.nurchalim@gmail.com
Abstrak.Telah dilakukan penelitian yang bertujuan untuk menentukan pH dan suhu optimum enzim protease
dari isolat ST-30 yang dihasilkan dari sumber air panas Singgahan, Tuban. Penentuan pH dan suhu
optimum berdasarkan aktivitas enzim protease yang dilakukan setelah melalui tahap pemurnian parsial
menggunakan amonium sulfat dengan fraksi 0-35%, 35-65%, dan 65-95%. Aktivitas protease ditentukan
secara kolorimetri menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 748 nm dan penentuan kadar
protein menggunakan metode Lowry. Hasil fraksinasi amonium sulfat pada fraksi 0-35% menunjukkan
aktivitas spesifik tertinggi yaitu 1,2650 U/mg dengan tingkat kemurnian 37,43 kali ekstrak kasarnya dan
memperoleh persentase hasil 97,10%. Enzim protease dari isolat ST-30 menunjukkan kondisi optimum yaitu
pada pH 7 dan suhu 75°C dengan masing-masing aktivitas enzim sebesar 0,3377 U/mL dan 0,2874 U/mL.
Kata kunci: Aktivitas Enzim Protase, pH Optimum, Suhu Optimum
Abstract.Research has been done that aims to determine of pH and temperature optimum protease enzyme of
ST-30 isolate from hot spring Singgahan, Tuban. Determination of pH and temperature optimum based on
protease enzyme activity that is made after partial purification step using ammonium sulfate fractionation
with fraction 0-35%, 35-65%, and 65-95%. Protease activity was determined by colorimetric using
spectrophotometry at a wavelength of 748 nm and protein content determined using Lowry method. The
result of ammonium sulfate fractionation in fraction 0-35% which showed the highest specific activity is
1,2650 U/mg with 37,43 fold purification than the crude extract and obtain a yield of 97,10%. Protease
enzyme of ST-30 isolate shows the optimum condition that is at pH 7 and temperature 75°C with each
enzyme activity are 0,3377 U/mL and 0,2874 U/mL.
Key words: Protease Enzyme Activity, pH Optimum, Temperature Optimum
PENDAHULUAN
8
Enzim adalah biokatalis yang memainkan
peran dalam semua tahap metabolisme dan reaksi
biokimia. Enzim sebagai katalis organik digunakan
dalam berbagai proses pada skala industri [1].
Industri saat ini membutuhkan enzim yang tahan
lingkungan yaitu mempunyai stabilitas tinggi dan
dapat diperoleh dari bakteri yang hidup di
lingkungan ekstrim seperti bakteri termofilik [2].
Enzim protease merupakan enzim proteolitik
yang mengkatalisis pemecahan ikatan peptide pada
protein oleh reaksi hidrolisis [3]. Enzim protease
banyak digunakan dalam industry makanan, farmasi,
kulit, dan tekstil [4]. Enzim ini jumlahnya mencapai
60% dari total produksi enzim di seluruh dunia [5].
Penggunaan protease dari bakteri mesofilik
mempunyai kekurangan yaitu tidak dapat digunakn
pada suhu tinggi karena protease dari bakteri
mesofilik stabil pada suhu rata-rata 37°C, sedangkan
saat ini penggunaan protease dalam industri deterjen
ataupun kulit mensyaratkan stabil pada suhu yang
lebih tinggi [6][7]. Pada industri kulit, protease
digunakan
untuk
proses
dehairing
yang
membutuhkan suhu antara 40-100°C [8]. Enzim
protease yang stabil pada suhu tinggi dikenal
sebagai protease termostabil yang dihasilkan oleh
bakteri termofilik dan efektif digunakan dalam
industry deterjen pada suhu rata-rata 60°C [7]. Salah
satu bakteri yang dapat menghasilkan enzim
protease termostabil adalah isolat ST-30 yang
berhasil diisolasi dari sumber air panas Singgahan,
Tuban yang mempunyai aktivitas protease tertinggi
dibandingan isolat lain yang positif protease yaitu
sebesar 0,2522 U/mL dengan indeks proteolitik
sebesar 9 [9].
Karakter dari suatu enzim dapat ditentukan
tergantung pada kondisi optimum meliputi, pH,
suhu, konsentrasi substrat, dan konsentrasi enzim.
Setiap enzim memiliki pH optimum, dibawah dan
diatas pH optimum aktivitas enzim jauh lebih rendah
dan pada pH yang ekstrim, enzim menjadi benarbenar tidak aktif [10]. Demikian pula dengan
pengaruh suhu terhadap reaksi enzimatik. Laju
reaksi enzimatik akan meningkat seiring dengan
peningkatan suhu sampai suhu optimum. enzim akan
terdenturasi pada suhu yang terlalu tinggi dan
kecepatan reaksi akan menurun, sedangkan pada
suhu rendah reaksi enzimatik berlangsung lambat
[11].
Beberapa penelitian yang telah dilakukan
sebelumnya yaitu berhasil mengkarakterisasi enzim
protease termostabil diantaranya yang dihasilkan
oleh bakteri termofilik isolat EP1001 dari sumber air
panas alkali Zimbabwe mempunyai aktivitas
optimum pada suhu 75°C dengan pH 10 [12].
Protease termostabil dari bakteri termofilik Bacillus
strain HUTBS62 yang diisolasi dari sumber air
panas dekat Laut Mati, Yordania mempunyai kondisi
optimum pada pH 6,8 dan suhu 80°C [13]. B.
pumilus JT3 yang diisolasi dari sumber air panas
Mae’en, Yordania menunjukkan aktivitas protease
termostabil pada suhu optimum 60°C dengan pH 8
[14]. Protease isolat TM2A-2 yang diisolasi dari
sumber air panas Tamalantik, Mamasa bekerja
optimum pada suhu 50°C dan pH 7 [2].
Keperluan karakterisasi akan lebih baik
apabila menggunakan pemurnian yang dilakukan
dimulai dengan cara pengendapan yang meliputi
pengendapan menggunakan garam, pelarut organik,
dan pengendapan berdasarkan titik isoelektriknya
(PI), kemudian dialisis lalu dilanjutkan pemurnian
menggunakan kromatografi seperti kromatografi
penukar ion, gel filtrasi, afinitas, dan teknik
kromatografi lain [15]. Cara pemurnian ini dapat
meningkatkan aktivitas enzim. Fraksi yang
mempunyai aktivitas spesifik paling besar
mempunyai tingkat kemurnian yang paling tinggi
[16].
Beberapa penelitian sebelumnya telah
berhasil melakukan pemurnian enzim protease
secara parsial menggunakan amonium sulfat yaitu
enzim protease dari Bacillus HUTBS62 yang
mempunyai aktivitas spesifik 83 U/mg dengan
tingkat kemurnian 6,5 kali ekstrak kasarnya pada
fraksi pengendapan 55-60% [13]. Protease dari
Bacillus subtilis mempunyai tingkat kemurnian 3,12
kali ekstrak kasarnya pada fraksi pengendapan
amonium sulfat 75% [17]. Protease Termostabil dari
Bacillus subtilis ITBCCB148 mempunyai aktivitas
spesifik tertinggi pada fraksi 50-60% dengan
aktivitas spesifik sebesar 0,55 U/mg [18].
Pada penelitian sebelumnya telah berhasil
mengisolasi dan menguji aktivitas enzim protease
dari bakteri proteolitik termofilik yang terpilih yaitu
isolat ST-30 dengan suhu inkubasi 53°C dan pH 7
dari sumber air panas Singgahan, Tuban. Oleh
karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk menentukan kondisi optimum aktivitas enzim
protease dari isolat ST-30 berdasarkan pada variasi
pH dan suhu melalui fraksinasi amonium sulfat.
Tahap fraksinasi amonium sulfat akan dilakukan
untuk memperoleh enzim protease yang murni
sehingga diharapkan dapat meningkatkan aktivitas
enzim protease yang dihasilkan oleh isolat ST-30.
METODE PENELITIAN
Alat
Shaker, mikropipet (Transferpette S),
autoclave (Hirayama), laminar flow (Thermo
scientific), Spektrofotometer UV-Vis (shimadzu
1800), stirrer (dragonlab), digital vortex mixer
(VWR), pH meter (Eutech), sentrifus dingin
(Eppendorf 5810 R), pengaduk magnet dan peralatan
gelas yang umum digunakan.
Bahan
NaCl (Merck), yeast extract (DifcoTM),
MgSO4.7H2O (Merck), K2HPO4 (Merck), kasein
(Oxoid), CuSO4.5H2O (Merck), Na3 sitrat (Merck),
Na2CO3 (Merck), NaOH (Merck), Tirosin (Merck),
Folin-Ciocalteau (Merck), BSA (Sigma), (NH 4)2SO4
(Merck), Na-EDTA (Merck), BaCl 2 (Merck), asam
tricloroasetat (TCA), buffer sitrat pH 3, 4, buffer
asetat pH 5,buffer fosfat pH 6, 7, 8, buffer boratboraks pH 9, buffer karbonat-bikarbonat pH 10,
buffer Na2HPO4-NaOH pH 11, 12.
PROSEDUR PENELITIAN
Pembuatan Inokulum
Kultur isolat ST-30 ditumbuhkan pada media
cair Minimal Synthetic Medium (MSM), kemudian
diinkubasi selama 18 jam pada suhu 53°C dengan
kecepatan 175 rpm.
Produksi Enzim Protease Isolat ST-30
Produksi
enzim
dilakukan
dengan
menambahkan 10% inokulum ke dalam 100 mL
medium produksi (MSM), kemudian diinkubasi
selama 18 jam pada suhu 53°C dengan kecepatan
175 rpm. Selanjutnya, disentrifugasi pada suhu 4°C
dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit.
Supernatan yang diperoleh merupakan crude enzyme
protease dari isolat ST-30 [9].
Fraksinasi Enzim dengan Amonium Sulfat
Protease
difraksinasi
menggunakan
amonium sulfatdengan fraksi 0-35%, 35-65%, dan
65-90% (b/v). Masing-masing fraksi pengendapan
ditentukan aktivitas protease dan kadar protein.
Fraksi terbaik selanjutnya didialisis dengan 0,05 M
buffer fosfat pH 7. Dialisis dihentikan apabila sudah
tidak terbentuk endapan ketika diuji dengan larutan
BaCl2.
Uji Aktivitas Protease
Aktivitas protease ditentukan berdasarkan
jumlah tirosin yang dilepaskan [19]. Larutan enzim
0,5 mL ditambahkan 0,5 mL larutan buffer fosfat pH
7 0,05 M dan dipreinkubasi selama 5 menit.
Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL substrat kasein 2%
dan diinkubasi selama 10 menit, kemudian
ditambkan 1 mL asam trikoloroasetat (TCA) 0,4 M
dan diinkubasi selama 30 menit. Selanjutnya,
disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 5000
rpm selama 15 menit, kemudian diambil 0,5 mL
supernatan lalu ditambahkan 2,5 mL natrium
karbonat 0,5 M dan dipreinkubasi selama 10 menit.
Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL Follin-Ciocalteau
(1:2) dan diinkubasi selama 30 menit [19]. Pada
blanko, penambahan TCA dilakukan setelah larutan
enzim. Selanjutnya, ditentukan absorbansinya
menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 748 nm. Kadar tirosin yang dihasilkan
diperoleh dari persamaan regresi linear larutan
standar tirosin (Gambar 1).
Gambar 1. Kurva Standar Tirosin
Pengukuran aktivitas enzim protease dapat
dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Keterangan :
[Tr] = konsentrasi tirosin dari sampel (μg/mL)
V = volume total sampel (mL)
q = waktu inkubasi (menit)
p = volume enzim (mL)
fp = faktor pengenceran
Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein dapat ditentukan
berdasarkan metode Lowry. Sampel sebanyak 0,5
mL dimasukkan ditambahkan 2,5 mL pereaksi C (50
mL reagen B dan 1 mL reagen A). Selanjutnya,
campuran dikocok dan didiamkan 5-10 menit,
kemudian ditambahkan 0,25 mL reagen D (10 mL
Follin Ciocalteau dan 10 mL air). Selanjutnya,
dikocok dan didiamkan selama 20-30 menit [20],
kemudian
diukur
serapannya
menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang
757 nm.
Penentuan pH Optimum
Larutan
enzim
sebanyak
0,5
mL
ditambahkan dengan 0,5 mL larutan buffer 0,05 M
dengan variasi pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, dan 12.
Selanjutnya, diinkubasi selama 5 menit, kemudian
ditambahkan 0,5 mL substrat kasein 2% lalu
diinkubasi selama 10 menit pada suhu 53°C.
Selanjutnya, dilakukan pengujian aktivitas enzim
protease menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 748 nm.
Penentuan Suhu Optimum
Larutan enzim sebanyak 0,5 mL
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan dengan 0,5 mL larutan buffer pada pH
optimum dan dipreinkubasi selama 5 menit.
Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL substrat kasein
y = 0,01021x + 0,03354
2%, kemudian campuran diinkubasikan pada suhu
R2 = 0,99993
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 dan 100°C selama
10 menit. Selanjutnya, dilakukan pengujian aktivitas
enzim protease menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 748 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi Enzim Protease Isolat ST-30
Bakteri ditumbuhkan pada media padat
kemudian dipindahkan ke media cair yang berfungsi
sebagai media produksi pada kondisi pH 7 dan suhu
53°C dengan kecepatan aerasi 175 rpm. Suhu dan
pH yang digunakan selama proses inkubasi
disesuaikan dengan kondisi lingkungan asal sumber
air panas Singgahan, Tuban.Media cair yang
digunakan adalah Minimal Synthetic Medium
(MSM). Media cair MSM tersebut diperkaya kasein
sebagai inducer agar produksi enzim protease
maksimum.
Produksi enzim dilakukan pada jam ke-18
dimana pada jam tersebut bakteri mencapai fase log
yaitu fase pertumbuhan maksimal bakteri sehingga
diharapkan dapat menghasilkan crude enzyme
(ekstrak kasar) yang optimum [21]. Pada fase log ini,
bakteri sudah dapat beradaptasi secara baik dengan
lingkungan pertumbuhannya sehingga mempunyai
waktu penggandaan (doubling time) yang lebih cepat
[22].
Enzim protease yang dihasilkan oleh isolat
ST-30 bersifat ekstraseluler, sehingga untuk
mendapatkan enzim tersebut dilakukan sentrifugasi
pada suhu 4°C.Ekstrak kasar enzim yang diperoleh,
selanjutnya difraksinasi menggunakan amonium
sulfat.
Fraksinasi menngunakan amonium sulfat
didasarkan atas kelarutannya yang tinggi, sehingga
lebih mudah untuk berinteraksi dengan molekul air.
Oleh sebab itu, molekul amonium sulfat akan
berkompetisi dengan molekul protein untuk
berikatan dengan molekul air. Amonium sulfat
bersifat lebih polar daripada protein sehingga air
yang bersifat polar akan cenderung tertarik ke
molekul amonium sulfat sehingga protein akan
mengendap. Proses tersebut dinamakan salting out
[20].
Tabel 1. Data Hasil Fraksinasi Enzim Protease Isolat ST-30 Pada Berbagai Konsentrasi Amonium
Sulfat
Fraksi Pengendapan
0-35%
35-65%
65-95%
Aktivitas Enzim
(U/mL)
0,2440
0,2052
0,2618
Kadar Protein
(mg/mL)
0,1931
0,4951
0,4831
Aktivitas Spesifik
(U/mg)
1,2650
0,4150
0,5425
Tabel 2. Tahapan Pemurnian Enzim Protease dari Isolat ST-30
Tahap
Ekstrak kasar
Pengendapan
(NH4)2SO4 0-35%
Total
protein
(mg)
3,7184
Total
Aktivitas
Enzim (U)
0,1257
Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
0,0338
0,0966
0,1220
1,2650
Pada Tabel 1 menunjukkan bahwa aktivitas
spesifik tertinggi diperoleh pada fraksi pengendapan
1
Hasil (%
total
aktivitas)
100
37,43
97,10
Kemurnian
(kali)
0-35% dengan aktivitas spesifik sebesar 1,2650
U/mg.
Pada proses penambahan amonium sulfat
dengan konsentrasi 0-35% mempunyai aktivitas
spesifik tertinggi disebabkan jumlah protein yang
terendapkan merupakan enzim protease dari isolat
ST-30. Hal ini didukung dengan besarnya aktivitas
enzim yang diperoleh pada fraksi pengendapan
tersebut. Berbeda dengan fraksi lain yaitu 65-95%
meskipun mempunyai aktivitas enzim protease
besar, namun aktivitas spesifik yang diperoleh
rendah. Hal ini disebabkan keseluruhan protein yang
terendapkan, ada sebagian protein yang bukan
merupakan enzim protease dari isolat ST-30 ikut
terendapkan. Besarnya aktivitas spesifik ditentukan
oleh dua faktor yaitu aktivitas protease dan kadar
protein. Fraksi dengan aktivitas protease besar
belum tentu memiliki aktivitas spesifik besar,
tergantung pada kadar protein proteinnya. Enzim
merupakan protein, sehingga dengan mengetahui
kadar protein keseluruhan maka dapat diketahui
besarnya protein yang berfungsi sebagai enzim
melalui kemampuannya dalam mengubah substrat
menjadi produk yang diinginkan.
Pada Tabel 2 menunjukan perbandingan
persentase hasil pemurnian dan tingkat kemurnian
dengan ekstrak kasar protease. Pada fraksi
pengendapan 0-35% menunjukkan persentase hasil
sebesar 97,10% dengan tingkat kemurnian 37,43 kali
ekstrak kasarnya. Pemurnian yang baik dapat
ditentukan berdasarkan pada tingkat kemurnian dan
persentase hasil. Tingkat kemurnian yang tinggi dan
persentase hasil yang rendah, menunjukkan
kandungan proteinnya sedikit, dan sebaliknya
persentase hasil yang tinggi dengan
tingkat
kemurnian yang rendah menunjukkan adanya
protein lain selain protein target dalam jumlah
banyak [23]. Perolehan persentase hasil yang tinggi
pada penelitian ini menunjukkan masih adanya
protein lain selain protein target.
Tingkat kemurnian enzim juga didasarkan
pada aktivitas spesifik dimana semakin besar
aktivitas spesifiknya, maka semakin tinggi tingkat
kemurnian enzim. Hal ini disebabkan total protein
pada proses pemurnian mengalami penurunan akibat
penambahan
amonium
sulfat
yang
dapat
mengendapkan protein target, sehingga diharapkan
dapat memperoleh total aktivitas enzim yang tinggi.
Akan tetapi, pada fraksi pengendapan 0-35%
memperoleh
total
aktivitas
lebih
rendah
dibandingkan ekstrak kasar protease (Tabel 2). Hal
ini diduga protein yang terendapkan ada yang
mengalami kerusakan enzim dimana kerusakan
tersebut dapat disebabkan oleh adanya penambahan
amonium sulfat yang mungkin mengganggu sisi
aktif enzim sehingga aktivitas enzim menurun.
Meskipun aktivitas enzim pada tahap pemurnian
lebih rendah, namun tingkat kemurniannya tinggi
dikarenakan aktivitas spesifiknya yang tinggi.
Hasil pengendapan yang optimum pada
fraksi 0-35% selanjutnya didialisis. Tujuan dialisis
adalah untuk menghilangkan residu garam amonium
sulfat yang bercampur dengan protein karena dapat
mengganggu sisi aktif enzim dalam mengikat
substrat, sehingga dapat mempengaruhi aktivitas
enzim. Pada proses dialisis garam amonium sulfat
akan
berdifusi
keluar
melalui
membran
semipermeable ke dalam pelarut buffer sehingga
molekul enzim dapat terbebas dari molekul garam
tersebut. Dialisis akan dihentikan apabila semua
garam amonium sulfat telah keluar dari membran
dengan mengujinya menggunakan larutan BaCl 2
dimana ion sulfat (SO42-) akan membentuk endapan
putih BaSO4 dengan reaksi sebagai berikut:
NH4(SO4)(aq) + BaCl2(aq) → BaSO4(s) + 2NH4Cl(aq)
Penentuan pH Optimum
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim
protease dari isolat ST-30 dapat dilihat pada Gambar
2. Enzim protease dari isolat ST-30 optimum pada
pH 7 dengan aktivitas sebesar 0,3377 U/mL.
Gambar 2. Grafik Aktivitas Enzim Protease Isolat
ST-30 Pada Berbagai Variasi pH
Pada saat pH optimum, enzim mempunyai
konformasi sisi aktif yang sesuai dengan substrat,
sehingga terbentuknya kompleks enzim-substrat
menjadi maksimal dan produk yang dihasilkan juga
maksimal. Hal ini disebabkan adanya gugus pemberi
dan gugus penerima yang penting berada pada sisi
katalitik berada pada tingkat ionisasi yang
diinginkan [24]. Perubahan pH di sekitar pH
optimum akan menyebabkan berubahnya muatan
residu asam amino yang menyusun pusat aktif
enzim, dan muatan residu asam amino penyusun
substrat (kasein), sehingga menyebabkan turunnya
efektivitas pengikatan enzim dengan substrat [11].
Dengan demikian, struktur tiga dimensi enzim akan
mengalami perubahan konformasi dimana substrat
tidak dapat lagi berikatan dengan tepat di bagian
molekul enzim. Hal ini menyebabkan enzim
mengalami denaturasi sehingga aktivitas enzim yang
diperoleh rendah.
Setiap enzim protease memiliki pH optimum
bervariasi tergantung dari jenis protease serta
sumbernya. Jenis protease dapat dibedakan
berdasarkan pH optimum yaitu protease asam,
netral, dan basa [5]. Berdasarkan pH optimum yang
diperoleh, maka protease isolat ST-30 adalah
protease netral. Beberapa protease termostabil yang
telah diteliti rata-rata mendapatkan pH optimum 7
diantaranya adalah enzim protease yang diproduksi
bakteri termofilik dari sumber air panas Tamalantik,
Mamasa mempunyai pH optimum 7 [2].
Karakteristik protease bakteri E. agglomerans LAS2b yang diisolasi dari sumber air panas Lejja
Kabupaten Soppeng Sulawesi Selatan bekerja
optimum pada pH 7 [25]. Protease termostabil dari
bakteri Bacillus strain HUTBS26 yang diisolasi dari
sumber air panas dekat Laut Mati, Yordania
mempunyai pH optimum 6,8 [13].
Penentuan Suhu Optimum
Hasil aktivitas enzim protease dari isolat ST30 pada berbagai variasi suhu pada Gambar 3.
Enzim protease dari isolat ST-30 optimum pada suhu
75°C dengan aktivitas sebesar 0,2874 U/mL.
kompleks enzim-substrat yang terbentuk sedikit. Hal
ini mengakibatkan berkurangnya kemampuan
kompleks enzim-susbtrat dalam mengubah substrat
menjadi produk, sehingga produk yang dihasilkan
sedikit.
Kenaikan suhu akan meningkatkan gerak
termodinamik dimana benturan antara molekul
enzim dengan substrat meningkat. Hal ini
menyebabkan enzim mengalami denaturasi dimana
struktur tiga dimensinya berubah. Semakin jauh
suhu diatas suhu optimum, semakin besar deformasi
struktur tiga dimensi sehingga makin sukar substrat
berikatan tepat
dengan
enzim.
Hal
ini
mengakibatkan kompleks enzim-substrat akan sukar
terbentuk sehingga produk yang dihasilkan semakin
sedikit [26].
Beberapa penelitian protease termostabil
mendapatkan suhu optimum yang berbeda-beda
diantaranya adalah suhu optimum enzim protease
bakteri EP1001 yang diisolasi dari sumber air panas
di Zimbabwe adalah 75°C [12]. Protease yang
dihasilkan oleh isolat BII-6, BII-4 dan LII yang
diisolasi dari dua tempat sumber air panas Padang
Cermin, di Lampung, dan Banyuwedang, di Bali
berturut-turut mempunyai suhu optimum 65, 60 dan
85°C [27]. Bakteri termofilik B. pumilus JT3 yang
diisolasi dari sumber air panas Mae’en, Jordan
memiliki aktivitas protease termostabil dengan suhu
optimum 60°C [14].
PENUTUP
Simpulan
Enzim protease
dari isolat ST-30
memperoleh tingkat mempunyai aktivitas spesifik
tertinggi pada fraksi amonium sulfat 0-35% yaitu
sebesar 1,2650 U/mg. Hasil optimasi enzim protease
dari isolat ST-30 mempunyai pH dan suhu optimum
yaitu pada pH 7 dan suhu 75°C dengan masingmasing aktivitas sebesar 0,3377 U/mL dan 0,2874
U/mL.
Saran
Gambar 3. Grafik Aktivitas Enzim Protease Isolat
ST-30 Pada Berbagai Variasi Suhu
Pada suhu optimum, tumbukan antara enzim
dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan
kompleks enzim-substrat semakin mudah terbentuk
dan produk yang dihasilkan meningkat. Pada suhu
yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas
enzim rendah. Hal ini disebabkan tumbukan antara
molekul enzim dengan substrat berkurang, sehingga
Perlu dilanjutkan untuk mengetahui kondisi
optimum lainnya seperti konsentrasi enzim dan
substrat, pengaruh ion logam, serta stabilitas termal
terhadap aktivitas enzim protease dari isolat ST-30.
DAFTAR PUSTAKA
1. Nigam, Poonam Singh. 2013. Microbial
Enzymes with Special Characteristics for
Biotechnological Applications. Biomolecules. 3:
597-611
2. Rahayu, S. 2014. Isolasi dan Karakterisasi
Protease dari Bakteri Sumber Air Panas
Tamalantik Mamasa Sulawesi Barat. Skripsi.
Makassar: Jurusan Kimia, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Hasanuddin.
3. Sinha, Pallavi, Rahul Kunwar Singh, Rishi
Srivastva, Rajesh Sharma, dan Shree Prakash
Tiwari.
2013.
Characterization
and
Optimization of Alkaline Protease Enzyme
Produced By Soil Borne Bacteria. Trends in
Life Sciences. 2 (2): 38–46.
4. Rakshit, S.K., dan Haki, G.D. 2003.
Developments in Industrially Important
Thermostable Enzymes: A Review. Bioresource
Technolog. 89: 17-34.
5. Rao, Mala B., Aparna M. Tanksale, Mohini S.
Ghatge, and Vasanti V. Deshpande. 1998.
Molecular and Biotechnological Aspects of
Microbial Proteases. Microbiology and
Molecularbiology. 62 (3): 597–635.
6. Jin Jang, Hyeung, Chang-Hun Lee, Woentae
Lee, dan Yu Sam Kim. 2002. Two Flexible
Loops in Subtilisin-like, Thermophilic Protease,
Thermicin,
from
Thermoanaerobacter
yonseiensis. Biochemistry and Molecular
Biology. 35 (2): 498-507.
7. Chenel, J. P., R. D. Tyagi, dan R. Y. Surampalli.
2008. Production of Thermostable Protease
Enzyme in Wastewater Sludge Using
Thermophilic Bacterial Strains Isolated From
Sludge. Institut National de la Recherche
Scientifique,
Centre
Eau,
Terre
et
Environnement, Université du Québec.
8. Madhavi, Jatavathu, Jatavathu Srilakshmi, dan
M. V. Raghavendra Rao. 2011. Efficient
Leather Dehairing by Bacterial Thermostable
Protease. International Journal of Bio-Science
and Bio-Technology. 3 (4): 11-26.
9. Rusdwitasari, Yeni Nur. 2014. Aktivitas Bakteri
Proteolitik yang Diisolasi dari Sumber Air
Panas Singgahan, Tuban. UNESA Journal of
Chemistry. 3 (3): 183-188.
10. Satyanarayana, U., dan Chakrapani, U. 2006.
Biochemistry. Third Edition. Chintamoni Das
Lane, Kolkata: Arunaba Sen Books and Allied
(P) Ltd.
11. Kusumadjaja,
Aline
Puspita.
2005.
Determination of Optimum Condition of Papain
Enzyme FromPapaya Var Java (Carica
Papaya). Indonesian Journal of Chemistry. 5
(2): 147-151.
12. Wilson, Parawira, dan Remigio, Zvauya. 2012.
Production and Characterisation of Protease
Enzyme Produced By A Novel Moderate
Thermophilic Bacterium (EP1001) Isolated
From An Alkaline Hot Spring, Zimbabwe.
African Journal of Microbiology Research. 6
(27): 5542-5551.
13. Aqel, Hazem, Farouk Al-Quadan, Tahani K.
Yousef. 2012. A novel neutral protease from
thermophilic Bacillus strain HUTBS62.
Journal of Bioscience and Biotechnology. 1 (2):
117-123.
14. Al-Qodah, Zakaria, Hala Dagishtani, dan
Kholoud Alananbeh. 2013. Isolation and
characterization of thermostable protease
producing Bacillus pumilus from thermal spring
in Jordan. Academic Journals. 7 (29): 37113719.
15. Voet, Donald, dan Voet, Judith G. 2011.
Biochemistry. Four Edition. United States of
America: John Wiley & Sons, Inc.
16. Monica, Athitya Diah. 2007. Studi Aktivitas
Spesifik Selulase dari Lactobacillus collinoides
yang Dimurnikan dengan Pengendapan
Bertingkat Amonium Sulfat. Skripsi. Malang:
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya.
17. Padmapriya, Muthu, dan Williams, Christudhas.
2012. Purification and characterization of
neutral protease enzyme from Bacillus Subtilis.
Journal of Microbiology and Biotechnology
Research. 2 (4): 612-618.
18. Yandri A.S, Dian Herasari, dan Tati Suhartati.
2007. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi
Enzim Protease Termostabil dari Bakteri Isolat
Lokal Bacillus subtilis ITBCCB148. Jurnal
Sains MIPA. 13 (2): 100-106.
19. Cupp-Enyard, Carrie. 2008. Sigma's Nonspecific Protease Activity Assay-Casein as a
Substrate. Journal of Visualized Experiments.
20. Scope, Robert K. 1994. Protein Purification
Principles and Practice. New York: SpringerVerlag New York, Inc.
21. Yuanita, Dian Novalia. 2014. Screening Bakteri
Proteolitik Termofilik Dari Sumber Air Panas
Singgahan, Tuban. UNESA Journal of
Chemistry. 3 (3): 49-54.
22. Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekular.
Jakarta: Erlangga.
23. Berg, Jeremy M., John L. Tymoczko, dan
Lubert Stryer. 2002. Biochemistry. Fifth
Edition. New York: W. H. Freeman.
24. Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar
Biokimia.
Terjemahan
oleh
Maggy
Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga.
25. Fitriani. 2014. Eksplorasi Mikroba Penghasil
Enzim Protease Dari Sumber Air Panas Lejja
Kabupaten
Soppeng
Sulawesi
Selatan.
Indonesia Chimica Acta. Makassar: Universitas
Hasanuddin.
26. Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim.
Jakarta: Widya Medika.
27. Zilda, Dewi Seswita, Eni Harmayan, Jaka
Widada, Widya Asmara, Hari Eko Irianto,
Gintung Patantis1, dan Yusro Nuri Fawzy.
2012. Squalen. 7 (3): 105-114.
PENENTUAN pH DAN SUHU OPTIMUM ENZIM PROTEASE DARI ISOLAT
ST-30 YANG DIHASILKAN DARI SINGGAHAN, TUBAN
DETERMINATION OF pH AND TEMPERATURE OPTIMUM PROTEASE
ENZYME OF ST-30 ISOLATE RESULTING FROM HOT SPRING
SINGGAHAN, TUBAN
Nur Chalim Maulidah* dan Nuniek Herdyastuti
Departement of Chemistry, Faculty of Mathematic and Natural Sciences State
University of Surabaya
Jl. Ketintang Surabaya (60231), Telp. 031-8299761
*Corresponding author, email: maulidah.nurchalim@gmail.com
Abstrak.Telah dilakukan penelitian yang bertujuan untuk menentukan pH dan suhu optimum enzim protease
dari isolat ST-30 yang dihasilkan dari sumber air panas Singgahan, Tuban. Penentuan pH dan suhu
optimum berdasarkan aktivitas enzim protease yang dilakukan setelah melalui tahap pemurnian parsial
menggunakan amonium sulfat dengan fraksi 0-35%, 35-65%, dan 65-95%. Aktivitas protease ditentukan
secara kolorimetri menggunakan spektrofotometri pada panjang gelombang 748 nm dan penentuan kadar
protein menggunakan metode Lowry. Hasil fraksinasi amonium sulfat pada fraksi 0-35% menunjukkan
aktivitas spesifik tertinggi yaitu 1,2650 U/mg dengan tingkat kemurnian 37,43 kali ekstrak kasarnya dan
memperoleh persentase hasil 97,10%. Enzim protease dari isolat ST-30 menunjukkan kondisi optimum yaitu
pada pH 7 dan suhu 75°C dengan masing-masing aktivitas enzim sebesar 0,3377 U/mL dan 0,2874 U/mL.
Kata kunci: Aktivitas Enzim Protase, pH Optimum, Suhu Optimum
Abstract.Research has been done that aims to determine of pH and temperature optimum protease enzyme of
ST-30 isolate from hot spring Singgahan, Tuban. Determination of pH and temperature optimum based on
protease enzyme activity that is made after partial purification step using ammonium sulfate fractionation
with fraction 0-35%, 35-65%, and 65-95%. Protease activity was determined by colorimetric using
spectrophotometry at a wavelength of 748 nm and protein content determined using Lowry method. The
result of ammonium sulfate fractionation in fraction 0-35% which showed the highest specific activity is
1,2650 U/mg with 37,43 fold purification than the crude extract and obtain a yield of 97,10%. Protease
enzyme of ST-30 isolate shows the optimum condition that is at pH 7 and temperature 75°C with each
enzyme activity are 0,3377 U/mL and 0,2874 U/mL.
Key words: Protease Enzyme Activity, pH Optimum, Temperature Optimum
PENDAHULUAN
8
Enzim adalah biokatalis yang memainkan
peran dalam semua tahap metabolisme dan reaksi
biokimia. Enzim sebagai katalis organik digunakan
dalam berbagai proses pada skala industri [1].
Industri saat ini membutuhkan enzim yang tahan
lingkungan yaitu mempunyai stabilitas tinggi dan
dapat diperoleh dari bakteri yang hidup di
lingkungan ekstrim seperti bakteri termofilik [2].
Enzim protease merupakan enzim proteolitik
yang mengkatalisis pemecahan ikatan peptide pada
protein oleh reaksi hidrolisis [3]. Enzim protease
banyak digunakan dalam industry makanan, farmasi,
kulit, dan tekstil [4]. Enzim ini jumlahnya mencapai
60% dari total produksi enzim di seluruh dunia [5].
Penggunaan protease dari bakteri mesofilik
mempunyai kekurangan yaitu tidak dapat digunakn
pada suhu tinggi karena protease dari bakteri
mesofilik stabil pada suhu rata-rata 37°C, sedangkan
saat ini penggunaan protease dalam industri deterjen
ataupun kulit mensyaratkan stabil pada suhu yang
lebih tinggi [6][7]. Pada industri kulit, protease
digunakan
untuk
proses
dehairing
yang
membutuhkan suhu antara 40-100°C [8]. Enzim
protease yang stabil pada suhu tinggi dikenal
sebagai protease termostabil yang dihasilkan oleh
bakteri termofilik dan efektif digunakan dalam
industry deterjen pada suhu rata-rata 60°C [7]. Salah
satu bakteri yang dapat menghasilkan enzim
protease termostabil adalah isolat ST-30 yang
berhasil diisolasi dari sumber air panas Singgahan,
Tuban yang mempunyai aktivitas protease tertinggi
dibandingan isolat lain yang positif protease yaitu
sebesar 0,2522 U/mL dengan indeks proteolitik
sebesar 9 [9].
Karakter dari suatu enzim dapat ditentukan
tergantung pada kondisi optimum meliputi, pH,
suhu, konsentrasi substrat, dan konsentrasi enzim.
Setiap enzim memiliki pH optimum, dibawah dan
diatas pH optimum aktivitas enzim jauh lebih rendah
dan pada pH yang ekstrim, enzim menjadi benarbenar tidak aktif [10]. Demikian pula dengan
pengaruh suhu terhadap reaksi enzimatik. Laju
reaksi enzimatik akan meningkat seiring dengan
peningkatan suhu sampai suhu optimum. enzim akan
terdenturasi pada suhu yang terlalu tinggi dan
kecepatan reaksi akan menurun, sedangkan pada
suhu rendah reaksi enzimatik berlangsung lambat
[11].
Beberapa penelitian yang telah dilakukan
sebelumnya yaitu berhasil mengkarakterisasi enzim
protease termostabil diantaranya yang dihasilkan
oleh bakteri termofilik isolat EP1001 dari sumber air
panas alkali Zimbabwe mempunyai aktivitas
optimum pada suhu 75°C dengan pH 10 [12].
Protease termostabil dari bakteri termofilik Bacillus
strain HUTBS62 yang diisolasi dari sumber air
panas dekat Laut Mati, Yordania mempunyai kondisi
optimum pada pH 6,8 dan suhu 80°C [13]. B.
pumilus JT3 yang diisolasi dari sumber air panas
Mae’en, Yordania menunjukkan aktivitas protease
termostabil pada suhu optimum 60°C dengan pH 8
[14]. Protease isolat TM2A-2 yang diisolasi dari
sumber air panas Tamalantik, Mamasa bekerja
optimum pada suhu 50°C dan pH 7 [2].
Keperluan karakterisasi akan lebih baik
apabila menggunakan pemurnian yang dilakukan
dimulai dengan cara pengendapan yang meliputi
pengendapan menggunakan garam, pelarut organik,
dan pengendapan berdasarkan titik isoelektriknya
(PI), kemudian dialisis lalu dilanjutkan pemurnian
menggunakan kromatografi seperti kromatografi
penukar ion, gel filtrasi, afinitas, dan teknik
kromatografi lain [15]. Cara pemurnian ini dapat
meningkatkan aktivitas enzim. Fraksi yang
mempunyai aktivitas spesifik paling besar
mempunyai tingkat kemurnian yang paling tinggi
[16].
Beberapa penelitian sebelumnya telah
berhasil melakukan pemurnian enzim protease
secara parsial menggunakan amonium sulfat yaitu
enzim protease dari Bacillus HUTBS62 yang
mempunyai aktivitas spesifik 83 U/mg dengan
tingkat kemurnian 6,5 kali ekstrak kasarnya pada
fraksi pengendapan 55-60% [13]. Protease dari
Bacillus subtilis mempunyai tingkat kemurnian 3,12
kali ekstrak kasarnya pada fraksi pengendapan
amonium sulfat 75% [17]. Protease Termostabil dari
Bacillus subtilis ITBCCB148 mempunyai aktivitas
spesifik tertinggi pada fraksi 50-60% dengan
aktivitas spesifik sebesar 0,55 U/mg [18].
Pada penelitian sebelumnya telah berhasil
mengisolasi dan menguji aktivitas enzim protease
dari bakteri proteolitik termofilik yang terpilih yaitu
isolat ST-30 dengan suhu inkubasi 53°C dan pH 7
dari sumber air panas Singgahan, Tuban. Oleh
karena itu, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut
untuk menentukan kondisi optimum aktivitas enzim
protease dari isolat ST-30 berdasarkan pada variasi
pH dan suhu melalui fraksinasi amonium sulfat.
Tahap fraksinasi amonium sulfat akan dilakukan
untuk memperoleh enzim protease yang murni
sehingga diharapkan dapat meningkatkan aktivitas
enzim protease yang dihasilkan oleh isolat ST-30.
METODE PENELITIAN
Alat
Shaker, mikropipet (Transferpette S),
autoclave (Hirayama), laminar flow (Thermo
scientific), Spektrofotometer UV-Vis (shimadzu
1800), stirrer (dragonlab), digital vortex mixer
(VWR), pH meter (Eutech), sentrifus dingin
(Eppendorf 5810 R), pengaduk magnet dan peralatan
gelas yang umum digunakan.
Bahan
NaCl (Merck), yeast extract (DifcoTM),
MgSO4.7H2O (Merck), K2HPO4 (Merck), kasein
(Oxoid), CuSO4.5H2O (Merck), Na3 sitrat (Merck),
Na2CO3 (Merck), NaOH (Merck), Tirosin (Merck),
Folin-Ciocalteau (Merck), BSA (Sigma), (NH 4)2SO4
(Merck), Na-EDTA (Merck), BaCl 2 (Merck), asam
tricloroasetat (TCA), buffer sitrat pH 3, 4, buffer
asetat pH 5,buffer fosfat pH 6, 7, 8, buffer boratboraks pH 9, buffer karbonat-bikarbonat pH 10,
buffer Na2HPO4-NaOH pH 11, 12.
PROSEDUR PENELITIAN
Pembuatan Inokulum
Kultur isolat ST-30 ditumbuhkan pada media
cair Minimal Synthetic Medium (MSM), kemudian
diinkubasi selama 18 jam pada suhu 53°C dengan
kecepatan 175 rpm.
Produksi Enzim Protease Isolat ST-30
Produksi
enzim
dilakukan
dengan
menambahkan 10% inokulum ke dalam 100 mL
medium produksi (MSM), kemudian diinkubasi
selama 18 jam pada suhu 53°C dengan kecepatan
175 rpm. Selanjutnya, disentrifugasi pada suhu 4°C
dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit.
Supernatan yang diperoleh merupakan crude enzyme
protease dari isolat ST-30 [9].
Fraksinasi Enzim dengan Amonium Sulfat
Protease
difraksinasi
menggunakan
amonium sulfatdengan fraksi 0-35%, 35-65%, dan
65-90% (b/v). Masing-masing fraksi pengendapan
ditentukan aktivitas protease dan kadar protein.
Fraksi terbaik selanjutnya didialisis dengan 0,05 M
buffer fosfat pH 7. Dialisis dihentikan apabila sudah
tidak terbentuk endapan ketika diuji dengan larutan
BaCl2.
Uji Aktivitas Protease
Aktivitas protease ditentukan berdasarkan
jumlah tirosin yang dilepaskan [19]. Larutan enzim
0,5 mL ditambahkan 0,5 mL larutan buffer fosfat pH
7 0,05 M dan dipreinkubasi selama 5 menit.
Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL substrat kasein 2%
dan diinkubasi selama 10 menit, kemudian
ditambkan 1 mL asam trikoloroasetat (TCA) 0,4 M
dan diinkubasi selama 30 menit. Selanjutnya,
disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 5000
rpm selama 15 menit, kemudian diambil 0,5 mL
supernatan lalu ditambahkan 2,5 mL natrium
karbonat 0,5 M dan dipreinkubasi selama 10 menit.
Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL Follin-Ciocalteau
(1:2) dan diinkubasi selama 30 menit [19]. Pada
blanko, penambahan TCA dilakukan setelah larutan
enzim. Selanjutnya, ditentukan absorbansinya
menggunakan spektrofotometer pada panjang
gelombang 748 nm. Kadar tirosin yang dihasilkan
diperoleh dari persamaan regresi linear larutan
standar tirosin (Gambar 1).
Gambar 1. Kurva Standar Tirosin
Pengukuran aktivitas enzim protease dapat
dihitung dengan persamaan sebagai berikut:
Keterangan :
[Tr] = konsentrasi tirosin dari sampel (μg/mL)
V = volume total sampel (mL)
q = waktu inkubasi (menit)
p = volume enzim (mL)
fp = faktor pengenceran
Penentuan Kadar Protein
Penentuan kadar protein dapat ditentukan
berdasarkan metode Lowry. Sampel sebanyak 0,5
mL dimasukkan ditambahkan 2,5 mL pereaksi C (50
mL reagen B dan 1 mL reagen A). Selanjutnya,
campuran dikocok dan didiamkan 5-10 menit,
kemudian ditambahkan 0,25 mL reagen D (10 mL
Follin Ciocalteau dan 10 mL air). Selanjutnya,
dikocok dan didiamkan selama 20-30 menit [20],
kemudian
diukur
serapannya
menggunakan
spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang
757 nm.
Penentuan pH Optimum
Larutan
enzim
sebanyak
0,5
mL
ditambahkan dengan 0,5 mL larutan buffer 0,05 M
dengan variasi pH 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, dan 12.
Selanjutnya, diinkubasi selama 5 menit, kemudian
ditambahkan 0,5 mL substrat kasein 2% lalu
diinkubasi selama 10 menit pada suhu 53°C.
Selanjutnya, dilakukan pengujian aktivitas enzim
protease menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 748 nm.
Penentuan Suhu Optimum
Larutan enzim sebanyak 0,5 mL
dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian
ditambahkan dengan 0,5 mL larutan buffer pada pH
optimum dan dipreinkubasi selama 5 menit.
Selanjutnya, ditambahkan 0,5 mL substrat kasein
y = 0,01021x + 0,03354
2%, kemudian campuran diinkubasikan pada suhu
R2 = 0,99993
55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 dan 100°C selama
10 menit. Selanjutnya, dilakukan pengujian aktivitas
enzim protease menggunakan spektrofotometer pada
panjang gelombang 748 nm.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Produksi Enzim Protease Isolat ST-30
Bakteri ditumbuhkan pada media padat
kemudian dipindahkan ke media cair yang berfungsi
sebagai media produksi pada kondisi pH 7 dan suhu
53°C dengan kecepatan aerasi 175 rpm. Suhu dan
pH yang digunakan selama proses inkubasi
disesuaikan dengan kondisi lingkungan asal sumber
air panas Singgahan, Tuban.Media cair yang
digunakan adalah Minimal Synthetic Medium
(MSM). Media cair MSM tersebut diperkaya kasein
sebagai inducer agar produksi enzim protease
maksimum.
Produksi enzim dilakukan pada jam ke-18
dimana pada jam tersebut bakteri mencapai fase log
yaitu fase pertumbuhan maksimal bakteri sehingga
diharapkan dapat menghasilkan crude enzyme
(ekstrak kasar) yang optimum [21]. Pada fase log ini,
bakteri sudah dapat beradaptasi secara baik dengan
lingkungan pertumbuhannya sehingga mempunyai
waktu penggandaan (doubling time) yang lebih cepat
[22].
Enzim protease yang dihasilkan oleh isolat
ST-30 bersifat ekstraseluler, sehingga untuk
mendapatkan enzim tersebut dilakukan sentrifugasi
pada suhu 4°C.Ekstrak kasar enzim yang diperoleh,
selanjutnya difraksinasi menggunakan amonium
sulfat.
Fraksinasi menngunakan amonium sulfat
didasarkan atas kelarutannya yang tinggi, sehingga
lebih mudah untuk berinteraksi dengan molekul air.
Oleh sebab itu, molekul amonium sulfat akan
berkompetisi dengan molekul protein untuk
berikatan dengan molekul air. Amonium sulfat
bersifat lebih polar daripada protein sehingga air
yang bersifat polar akan cenderung tertarik ke
molekul amonium sulfat sehingga protein akan
mengendap. Proses tersebut dinamakan salting out
[20].
Tabel 1. Data Hasil Fraksinasi Enzim Protease Isolat ST-30 Pada Berbagai Konsentrasi Amonium
Sulfat
Fraksi Pengendapan
0-35%
35-65%
65-95%
Aktivitas Enzim
(U/mL)
0,2440
0,2052
0,2618
Kadar Protein
(mg/mL)
0,1931
0,4951
0,4831
Aktivitas Spesifik
(U/mg)
1,2650
0,4150
0,5425
Tabel 2. Tahapan Pemurnian Enzim Protease dari Isolat ST-30
Tahap
Ekstrak kasar
Pengendapan
(NH4)2SO4 0-35%
Total
protein
(mg)
3,7184
Total
Aktivitas
Enzim (U)
0,1257
Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
0,0338
0,0966
0,1220
1,2650
Pada Tabel 1 menunjukkan bahwa aktivitas
spesifik tertinggi diperoleh pada fraksi pengendapan
1
Hasil (%
total
aktivitas)
100
37,43
97,10
Kemurnian
(kali)
0-35% dengan aktivitas spesifik sebesar 1,2650
U/mg.
Pada proses penambahan amonium sulfat
dengan konsentrasi 0-35% mempunyai aktivitas
spesifik tertinggi disebabkan jumlah protein yang
terendapkan merupakan enzim protease dari isolat
ST-30. Hal ini didukung dengan besarnya aktivitas
enzim yang diperoleh pada fraksi pengendapan
tersebut. Berbeda dengan fraksi lain yaitu 65-95%
meskipun mempunyai aktivitas enzim protease
besar, namun aktivitas spesifik yang diperoleh
rendah. Hal ini disebabkan keseluruhan protein yang
terendapkan, ada sebagian protein yang bukan
merupakan enzim protease dari isolat ST-30 ikut
terendapkan. Besarnya aktivitas spesifik ditentukan
oleh dua faktor yaitu aktivitas protease dan kadar
protein. Fraksi dengan aktivitas protease besar
belum tentu memiliki aktivitas spesifik besar,
tergantung pada kadar protein proteinnya. Enzim
merupakan protein, sehingga dengan mengetahui
kadar protein keseluruhan maka dapat diketahui
besarnya protein yang berfungsi sebagai enzim
melalui kemampuannya dalam mengubah substrat
menjadi produk yang diinginkan.
Pada Tabel 2 menunjukan perbandingan
persentase hasil pemurnian dan tingkat kemurnian
dengan ekstrak kasar protease. Pada fraksi
pengendapan 0-35% menunjukkan persentase hasil
sebesar 97,10% dengan tingkat kemurnian 37,43 kali
ekstrak kasarnya. Pemurnian yang baik dapat
ditentukan berdasarkan pada tingkat kemurnian dan
persentase hasil. Tingkat kemurnian yang tinggi dan
persentase hasil yang rendah, menunjukkan
kandungan proteinnya sedikit, dan sebaliknya
persentase hasil yang tinggi dengan
tingkat
kemurnian yang rendah menunjukkan adanya
protein lain selain protein target dalam jumlah
banyak [23]. Perolehan persentase hasil yang tinggi
pada penelitian ini menunjukkan masih adanya
protein lain selain protein target.
Tingkat kemurnian enzim juga didasarkan
pada aktivitas spesifik dimana semakin besar
aktivitas spesifiknya, maka semakin tinggi tingkat
kemurnian enzim. Hal ini disebabkan total protein
pada proses pemurnian mengalami penurunan akibat
penambahan
amonium
sulfat
yang
dapat
mengendapkan protein target, sehingga diharapkan
dapat memperoleh total aktivitas enzim yang tinggi.
Akan tetapi, pada fraksi pengendapan 0-35%
memperoleh
total
aktivitas
lebih
rendah
dibandingkan ekstrak kasar protease (Tabel 2). Hal
ini diduga protein yang terendapkan ada yang
mengalami kerusakan enzim dimana kerusakan
tersebut dapat disebabkan oleh adanya penambahan
amonium sulfat yang mungkin mengganggu sisi
aktif enzim sehingga aktivitas enzim menurun.
Meskipun aktivitas enzim pada tahap pemurnian
lebih rendah, namun tingkat kemurniannya tinggi
dikarenakan aktivitas spesifiknya yang tinggi.
Hasil pengendapan yang optimum pada
fraksi 0-35% selanjutnya didialisis. Tujuan dialisis
adalah untuk menghilangkan residu garam amonium
sulfat yang bercampur dengan protein karena dapat
mengganggu sisi aktif enzim dalam mengikat
substrat, sehingga dapat mempengaruhi aktivitas
enzim. Pada proses dialisis garam amonium sulfat
akan
berdifusi
keluar
melalui
membran
semipermeable ke dalam pelarut buffer sehingga
molekul enzim dapat terbebas dari molekul garam
tersebut. Dialisis akan dihentikan apabila semua
garam amonium sulfat telah keluar dari membran
dengan mengujinya menggunakan larutan BaCl 2
dimana ion sulfat (SO42-) akan membentuk endapan
putih BaSO4 dengan reaksi sebagai berikut:
NH4(SO4)(aq) + BaCl2(aq) → BaSO4(s) + 2NH4Cl(aq)
Penentuan pH Optimum
Pengaruh pH terhadap aktivitas enzim
protease dari isolat ST-30 dapat dilihat pada Gambar
2. Enzim protease dari isolat ST-30 optimum pada
pH 7 dengan aktivitas sebesar 0,3377 U/mL.
Gambar 2. Grafik Aktivitas Enzim Protease Isolat
ST-30 Pada Berbagai Variasi pH
Pada saat pH optimum, enzim mempunyai
konformasi sisi aktif yang sesuai dengan substrat,
sehingga terbentuknya kompleks enzim-substrat
menjadi maksimal dan produk yang dihasilkan juga
maksimal. Hal ini disebabkan adanya gugus pemberi
dan gugus penerima yang penting berada pada sisi
katalitik berada pada tingkat ionisasi yang
diinginkan [24]. Perubahan pH di sekitar pH
optimum akan menyebabkan berubahnya muatan
residu asam amino yang menyusun pusat aktif
enzim, dan muatan residu asam amino penyusun
substrat (kasein), sehingga menyebabkan turunnya
efektivitas pengikatan enzim dengan substrat [11].
Dengan demikian, struktur tiga dimensi enzim akan
mengalami perubahan konformasi dimana substrat
tidak dapat lagi berikatan dengan tepat di bagian
molekul enzim. Hal ini menyebabkan enzim
mengalami denaturasi sehingga aktivitas enzim yang
diperoleh rendah.
Setiap enzim protease memiliki pH optimum
bervariasi tergantung dari jenis protease serta
sumbernya. Jenis protease dapat dibedakan
berdasarkan pH optimum yaitu protease asam,
netral, dan basa [5]. Berdasarkan pH optimum yang
diperoleh, maka protease isolat ST-30 adalah
protease netral. Beberapa protease termostabil yang
telah diteliti rata-rata mendapatkan pH optimum 7
diantaranya adalah enzim protease yang diproduksi
bakteri termofilik dari sumber air panas Tamalantik,
Mamasa mempunyai pH optimum 7 [2].
Karakteristik protease bakteri E. agglomerans LAS2b yang diisolasi dari sumber air panas Lejja
Kabupaten Soppeng Sulawesi Selatan bekerja
optimum pada pH 7 [25]. Protease termostabil dari
bakteri Bacillus strain HUTBS26 yang diisolasi dari
sumber air panas dekat Laut Mati, Yordania
mempunyai pH optimum 6,8 [13].
Penentuan Suhu Optimum
Hasil aktivitas enzim protease dari isolat ST30 pada berbagai variasi suhu pada Gambar 3.
Enzim protease dari isolat ST-30 optimum pada suhu
75°C dengan aktivitas sebesar 0,2874 U/mL.
kompleks enzim-substrat yang terbentuk sedikit. Hal
ini mengakibatkan berkurangnya kemampuan
kompleks enzim-susbtrat dalam mengubah substrat
menjadi produk, sehingga produk yang dihasilkan
sedikit.
Kenaikan suhu akan meningkatkan gerak
termodinamik dimana benturan antara molekul
enzim dengan substrat meningkat. Hal ini
menyebabkan enzim mengalami denaturasi dimana
struktur tiga dimensinya berubah. Semakin jauh
suhu diatas suhu optimum, semakin besar deformasi
struktur tiga dimensi sehingga makin sukar substrat
berikatan tepat
dengan
enzim.
Hal
ini
mengakibatkan kompleks enzim-substrat akan sukar
terbentuk sehingga produk yang dihasilkan semakin
sedikit [26].
Beberapa penelitian protease termostabil
mendapatkan suhu optimum yang berbeda-beda
diantaranya adalah suhu optimum enzim protease
bakteri EP1001 yang diisolasi dari sumber air panas
di Zimbabwe adalah 75°C [12]. Protease yang
dihasilkan oleh isolat BII-6, BII-4 dan LII yang
diisolasi dari dua tempat sumber air panas Padang
Cermin, di Lampung, dan Banyuwedang, di Bali
berturut-turut mempunyai suhu optimum 65, 60 dan
85°C [27]. Bakteri termofilik B. pumilus JT3 yang
diisolasi dari sumber air panas Mae’en, Jordan
memiliki aktivitas protease termostabil dengan suhu
optimum 60°C [14].
PENUTUP
Simpulan
Enzim protease
dari isolat ST-30
memperoleh tingkat mempunyai aktivitas spesifik
tertinggi pada fraksi amonium sulfat 0-35% yaitu
sebesar 1,2650 U/mg. Hasil optimasi enzim protease
dari isolat ST-30 mempunyai pH dan suhu optimum
yaitu pada pH 7 dan suhu 75°C dengan masingmasing aktivitas sebesar 0,3377 U/mL dan 0,2874
U/mL.
Saran
Gambar 3. Grafik Aktivitas Enzim Protease Isolat
ST-30 Pada Berbagai Variasi Suhu
Pada suhu optimum, tumbukan antara enzim
dan substrat sangat efektif, sehingga pembentukan
kompleks enzim-substrat semakin mudah terbentuk
dan produk yang dihasilkan meningkat. Pada suhu
yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas
enzim rendah. Hal ini disebabkan tumbukan antara
molekul enzim dengan substrat berkurang, sehingga
Perlu dilanjutkan untuk mengetahui kondisi
optimum lainnya seperti konsentrasi enzim dan
substrat, pengaruh ion logam, serta stabilitas termal
terhadap aktivitas enzim protease dari isolat ST-30.
DAFTAR PUSTAKA
1. Nigam, Poonam Singh. 2013. Microbial
Enzymes with Special Characteristics for
Biotechnological Applications. Biomolecules. 3:
597-611
2. Rahayu, S. 2014. Isolasi dan Karakterisasi
Protease dari Bakteri Sumber Air Panas
Tamalantik Mamasa Sulawesi Barat. Skripsi.
Makassar: Jurusan Kimia, Fakultas Matematika
dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas
Hasanuddin.
3. Sinha, Pallavi, Rahul Kunwar Singh, Rishi
Srivastva, Rajesh Sharma, dan Shree Prakash
Tiwari.
2013.
Characterization
and
Optimization of Alkaline Protease Enzyme
Produced By Soil Borne Bacteria. Trends in
Life Sciences. 2 (2): 38–46.
4. Rakshit, S.K., dan Haki, G.D. 2003.
Developments in Industrially Important
Thermostable Enzymes: A Review. Bioresource
Technolog. 89: 17-34.
5. Rao, Mala B., Aparna M. Tanksale, Mohini S.
Ghatge, and Vasanti V. Deshpande. 1998.
Molecular and Biotechnological Aspects of
Microbial Proteases. Microbiology and
Molecularbiology. 62 (3): 597–635.
6. Jin Jang, Hyeung, Chang-Hun Lee, Woentae
Lee, dan Yu Sam Kim. 2002. Two Flexible
Loops in Subtilisin-like, Thermophilic Protease,
Thermicin,
from
Thermoanaerobacter
yonseiensis. Biochemistry and Molecular
Biology. 35 (2): 498-507.
7. Chenel, J. P., R. D. Tyagi, dan R. Y. Surampalli.
2008. Production of Thermostable Protease
Enzyme in Wastewater Sludge Using
Thermophilic Bacterial Strains Isolated From
Sludge. Institut National de la Recherche
Scientifique,
Centre
Eau,
Terre
et
Environnement, Université du Québec.
8. Madhavi, Jatavathu, Jatavathu Srilakshmi, dan
M. V. Raghavendra Rao. 2011. Efficient
Leather Dehairing by Bacterial Thermostable
Protease. International Journal of Bio-Science
and Bio-Technology. 3 (4): 11-26.
9. Rusdwitasari, Yeni Nur. 2014. Aktivitas Bakteri
Proteolitik yang Diisolasi dari Sumber Air
Panas Singgahan, Tuban. UNESA Journal of
Chemistry. 3 (3): 183-188.
10. Satyanarayana, U., dan Chakrapani, U. 2006.
Biochemistry. Third Edition. Chintamoni Das
Lane, Kolkata: Arunaba Sen Books and Allied
(P) Ltd.
11. Kusumadjaja,
Aline
Puspita.
2005.
Determination of Optimum Condition of Papain
Enzyme FromPapaya Var Java (Carica
Papaya). Indonesian Journal of Chemistry. 5
(2): 147-151.
12. Wilson, Parawira, dan Remigio, Zvauya. 2012.
Production and Characterisation of Protease
Enzyme Produced By A Novel Moderate
Thermophilic Bacterium (EP1001) Isolated
From An Alkaline Hot Spring, Zimbabwe.
African Journal of Microbiology Research. 6
(27): 5542-5551.
13. Aqel, Hazem, Farouk Al-Quadan, Tahani K.
Yousef. 2012. A novel neutral protease from
thermophilic Bacillus strain HUTBS62.
Journal of Bioscience and Biotechnology. 1 (2):
117-123.
14. Al-Qodah, Zakaria, Hala Dagishtani, dan
Kholoud Alananbeh. 2013. Isolation and
characterization of thermostable protease
producing Bacillus pumilus from thermal spring
in Jordan. Academic Journals. 7 (29): 37113719.
15. Voet, Donald, dan Voet, Judith G. 2011.
Biochemistry. Four Edition. United States of
America: John Wiley & Sons, Inc.
16. Monica, Athitya Diah. 2007. Studi Aktivitas
Spesifik Selulase dari Lactobacillus collinoides
yang Dimurnikan dengan Pengendapan
Bertingkat Amonium Sulfat. Skripsi. Malang:
Jurusan Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya.
17. Padmapriya, Muthu, dan Williams, Christudhas.
2012. Purification and characterization of
neutral protease enzyme from Bacillus Subtilis.
Journal of Microbiology and Biotechnology
Research. 2 (4): 612-618.
18. Yandri A.S, Dian Herasari, dan Tati Suhartati.
2007. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi
Enzim Protease Termostabil dari Bakteri Isolat
Lokal Bacillus subtilis ITBCCB148. Jurnal
Sains MIPA. 13 (2): 100-106.
19. Cupp-Enyard, Carrie. 2008. Sigma's Nonspecific Protease Activity Assay-Casein as a
Substrate. Journal of Visualized Experiments.
20. Scope, Robert K. 1994. Protein Purification
Principles and Practice. New York: SpringerVerlag New York, Inc.
21. Yuanita, Dian Novalia. 2014. Screening Bakteri
Proteolitik Termofilik Dari Sumber Air Panas
Singgahan, Tuban. UNESA Journal of
Chemistry. 3 (3): 49-54.
22. Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekular.
Jakarta: Erlangga.
23. Berg, Jeremy M., John L. Tymoczko, dan
Lubert Stryer. 2002. Biochemistry. Fifth
Edition. New York: W. H. Freeman.
24. Lehninger, Albert L. 1982. Dasar-dasar
Biokimia.
Terjemahan
oleh
Maggy
Thenawidjaja. Jakarta: Erlangga.
25. Fitriani. 2014. Eksplorasi Mikroba Penghasil
Enzim Protease Dari Sumber Air Panas Lejja
Kabupaten
Soppeng
Sulawesi
Selatan.
Indonesia Chimica Acta. Makassar: Universitas
Hasanuddin.
26. Sadikin, Mohamad. 2002. Biokimia Enzim.
Jakarta: Widya Medika.
27. Zilda, Dewi Seswita, Eni Harmayan, Jaka
Widada, Widya Asmara, Hari Eko Irianto,
Gintung Patantis1, dan Yusro Nuri Fawzy.
2012. Squalen. 7 (3): 105-114.