Uji bioaktivitas fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol daun Annona glabra L. dengan metode brine shrimp lethality test - USD Repository

  Diaj Mem

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Farmasi Oleh:

  Hermanto NIM : 088114136 Diaj Mem

  Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

  Program Studi Farmasi Oleh:

  Hermanto NIM : 088114136

  Kupersembahakan karya kecilku untuk : Yesus Kristus

  Papa, Mama dan Kakakku My Tienci Group (Fredlina, WeA)

  Almamaterku

  Syukur bagi Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat dan rahmat-Nya Penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi Farmasi.

  Penulis telah menerima banyak dukungan selama proses perkuliahan, penelitian, dan penyusunan skripsi. Oleh karena itu, Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada:

  1. Ipang Djunarko, M.Sc., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

  2. Yohanes Dwiatmaka, M.Si., Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan waktu, bimbingan, pengarahan, masukan serta pelajaran tentang hidup kepada Penulis dalam penyusunan skripsi.

  3. Prof. Dr. C.J. Soegihardjo, Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.

  4. Phebe Hendra, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan waktu, masukan, kritik dan saran kepada Penulis.

  5. Segenap dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah mengajar dan membimbing Penulis selama perkuliahan.

  6. Cornelius Brian Alfredo sebagai teman satu tim atas kerjasama, bantuan, dan kebersamaan selama proses penyusunan skripsi.

  7. Teman-teman angkatan 2008 khususnya Kelas C 2008 dan FST 2008 atas

  8. Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andri dan Mas Parlan serta laboran-laboran yang lain yang telah membantu Penulis selama penelitian.

  9. Fredlina Chen, Welly Apriadi, Nancy, Dian Prawita Putri atas dukungan serta Penulis selalu diingatkan untuk menyelesaikan skripsi ini.

  10. Pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh Penulis.

  Penulis menyadari bahwa masih ada kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari seluruh pihak. Semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi kita semua.

  Penulis

  HALAMAN JUDUL .................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... ii HALAMAN PENGESAHAN ...................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ....................................................... v HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI……………………………… vi PRAKATA ................................................................................................... vii DAFTAR ISI ................................................................................................ ix DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiii DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xv

  INTISARI ..................................................................................................... xvi ................................................................................................... xvii BAB I. PENGANTAR .............................................................................

  1 A. Latar Belakang .......................................................................

  1 1. Permasalahan ...................................................................

  4 2. Keaslian penelitian ...........................................................

  4 3. Manfaat penelitian ...........................................................

  5 a. Manfaat teoritis .........................................................

  5 b. Manfaat praktis .........................................................

  5

  BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA .......................................................

  6 A. .......................................................................

  6 1. Keterangan botani ..............................................................

  6 2. Deskripsi tumbuhan ...........................................................

  6 3. Kandungan kimia ..............................................................

  7 B. L. ....................................................................

  7 1. Sistematika ......................................................................

  7 2. Lingkungan hidup ............................................................

  7 3. Tahap perkembangan artemia ..........................................

  8 4. Penggunaan artemia pada BST ........................................

  10 C. (BST) ........................................

  11 D. .................................................................................

  12 E. Penyarian ................................................................................

  13 F. Kromatografi Lapis Tipis .......................................................

  15 G. Landasan Teori .......................................................................

  16 H. Hipotesis ................................................................................

  17 BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ...................................................

  18 A. Jenis Rancangan Penelitian ....................................................

  18 B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ........................

  18 1. Variabel penelitian ...........................................................

  18 2. Definisi operasional .........................................................

  19 C. Bahan Penelitian ....................................................................

  20

  2. Bahan ekstraksi .................................................................

  20 3. Bahan uji BST ...................................................................

  20 4. Bahan air laut buatan (ALB) .............................................

  20 5. Bahan kromatografi lapis tipis (KLT) ...............................

  20 D. Alat Penelitian ........................................................................

  21 E. Tata Cara Penelitian ...............................................................

  21 1. Determinasi tanaman ........................................

  21 2. Pengumpulan bahan .........................................................

  21 3. Pengeringan dan pembuatan serbuk .................................

  21 4. Maserasi ...........................................................................

  22 5. Uji bioaktivitas dengan metode BST ...............................

  23 6. Identifikasi golongan senyawa fraksi ...............................

  25 F. Analisis Data ...........................................................................

  27 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ....................................................

  28 A. Determinasi Tanaman ............................................

  28 B. Pengumpulan Bahan ..............................................................

  28 C. Pengeringan dan Pembuatan Serbuk ......................................

  29 D. Maserasi .................................................................................

  30 E. Uji Bioaktivitas dengan Metode BST ....................................

  34 1. Pembuatan ALB ................................................................

  34 2. Penetasan artemia .....................................................

  35 3. Pembuatan larutan sampel ...............................................

  37

  F. Identifikasi Golongan Senyawa Fraksi ...................................

  48 1. Identifikasi alkaloid .........................................................

  49 2. Identifikasi flavonoid ........................................................

  51 3. Identifikasi asetogenin ......................................................

  53 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN.....................................................

  55 A. Kesimpulan ............................................................................

  55 B. Saran ......................................................................................

  55 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................

  56 LAMPIRAN .................................................................................................

  59 BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................

  78

  Tabel I. Nilai konstanta dielektrik berbagai zat pelarut ...............................

  14 Tabel II. Seri konsentrasi larutan sampel fraksi n-heksana dan etilasetat .....

  24 Tabel III. Seri konsentrasi larutan sampel fraksi metanol ..............................

  24 Tabel IV. Persen kematian larva artemia ekstrak n-heksana, etilasetat, dan metanol daun ...................................................................

  40 Tabel V. Hasil uji KLT fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol daun untuk pemeriksaan golongan senyawa alkaloid…………...

  50 Tabel VI. Hasil uji KLT fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol daun untuk pemeriksaan golongan senyawa flavonoid………….

  52 Tabel VII. Hasil uji KLT fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol daun untuk pemeriksaan golongan senyawa asetogenin………. ..

  54

  Gambar 1. Daun ...................................................................

  6 Gambar 2. Larva artemia ...............................................................................

  9 Gambar 3. Tahap perubahan bentuk artemia .................................................

  9 Gambar 4. Artemia dewasa ............................................................................

  10 Gambar 5. Skema hasil fraksinasi…………………………………………...

  34 Gambar 6. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi fraksi n- heksana daun ................................................................

  42 Gambar 7. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi fraksi etilasetat daun ..............................................................

  44 Gambar 8. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi fraksi metanol daun .................................................................

  45 Gambar 9. Kromatogram lapis tipis untuk pemeriksaan golongan senyawa alkaloid ..........................................................................................

  50 Gambar 10. Kromatogram lapis tipis untuk pemeriksaan golongan senyawa flavonoid .......................................................................................

  52 Gambar 11. Kromatogram lapis tipis untuk pemeriksaan golongan senyawa asetogenin .....................................................................................

  53

  Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi ..........................

  59 Lampiran 2. Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak n- hekasan yang akan digunakan dalam pengujian .......................

  60 Lampiran 3. Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak etilasetat yang akan digunakan dalam pengujian ......................

  62 Lampiran 4. . Orientasi untuk mendapatkan seri konsentrasi ekstrak metanol yang akan digunakan dalam pengujian .....................................

  64 Lampiran 5. Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak n- heksana daun ..............................................................

  67 Lampiran 6. Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak etil asetat daun ..................................................................

  67 Lampiran 7. Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak metanol daun ..............................................................

  68 Lampiran 8. Perhitungan data statistik SPSS 16.00 dengan menggunakan analisis probit terhadap ekstrak n-heksana daun .......

  69 Lampiran 9. Perhitungan data statistik SPSS 16.00 dengan menggunakan analisis probit terhadap ekstrak etilasetat daun .........

  71 Lampiran 10. Perhitungan data statistik SPSS 16.00 dengan menggunakan analisis probit terhadap ekstrak metanol daun ..........

  73 Lampiran 11. Perhitungan rendemen fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol daun ………………………………………………… .............

  75 Lampiran 12. Kromatogram lapis tipis pada identifikasi golongan senyawa alkaloid, flavonoid, dan asetogenin……………………………

  76

  INTISARI merupakan salah satu tanaman yang telah dimanfaatkan untuk pengobatan kanker. Salah satu pengembangan potensinya sebagai antikanker dilakukan dengan cara mengeksplorasi melalui penyarian dengan cairan yang memiliki tingkat kepolaran yang berbeda serta diuji bioaktivitasnya. Selanjutnya mengidentifikasi golongan senyawa kimia yang diduga memiliki bioaktivitas dengan metode KLT.

  Jenis penelitian ini adalah eksperimental murni dengan menggunakan rancangan penelitian sederhana ( ). Penelitian ini menggunakan tiga jenis pelarut yang memiliki kepolaran yang berbeda yaitu n- heksan, etilasetat, dan metanol. Fraksinasi dilakukan secara bertingkat dengan metode maserasi pada mesin pengaduk ( ) selama 24 jam dengan kecepatan putar 150 rpm. Masing –masing fraksi dibuat 5 seri konsentrasi dan dilakukan replikasi sebanyak 6 kali yang kemudian diuji bioaktivitas nya terhadap

  Leach dengan metode (BST). Bioaktivitas fraksi dinyatakan dengan nilai LC . Fraksi dikatakan memiliki bioaktivitas bila

  50 nilai LC <1000 µg/ml.

  50 Hasil uji bioaktivitas dengan metode BST menunjukkan nilai LC 50 fraksi

  n-heksana, etilasetat dan metanol daun secara berturut-turut sebesar 37,7 µg/ml; 19,6 µg/ml; 179,5 µg/ml. Berdasarkan hasil tersebut maka fraksi yang memiliki bioaktivitas paling besar adalah fraksi etilasetat. Hasil identifikasi dengan KLT menunjukkan golongan senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi etilasetat daun adalah alkaloid dan asetogenin.

  Kata kunci: , Bioaktivitas, , maserasi, Kromatografi Lapis Tipis

  ABSTRACT has been exploited for cancer treatment. One of the development potential of as anticancer done by exploring through fractionation with solvents that have different polarity and tested the bioactivity. Then identify the class of chemical compounds suspected of having the greatest bioactivity by TLC method.

  The research was simple pure experimental with posttest only control group design. This study used three kinds of solvents such as n-hexane, ethylacetate, and methanol that have different polarity. Fractionation is done stratified by maceration method on a shaker for 24 hours with rotational speed 150 rpm. Each concentration of fraction made 5 series and replicated 6 times and then tested its bioactivity against Leach with Brine Shrimp Lethality Test method (BST). Bioactivity of fraction expressed as LC

  50 values. Fractions

  have the bioactivity if the LC

50 values < 1000 µg/ml.

  The result of bioactivity test with BST method showed LC

  50 of n-

  hexane, ethylacetate and methanol leaf fraction of , respectively 37.7 µg/ml, 19.6 µg/ml, 179.5 µg/ml. Based on the results, the greatest bioactivity is ethylacetate fraction. The results of identification by TLC showed class of chemical compounds contained in ethylacetate leaf fraction of are alkaloid and acetogenin.

  Key words: , Bioactivity, Brine Shirmp Lethality Test, maceration, Thin Layer Chromatography

   ! " #$

  Kanker merupakan penyebab utama kematian pada negara-negara maju dan berkembang. ! " # (WHO) melaporkan bahwa pada tahun 2007 terjadi 7,9 juta kematian di dunia akibat kanker. Jika tidak dikendalikan, diperkirakan 26 juta orang akan menderita kanker dan 17 juta meninggal karena kanker pada tahun 2030. Ironisnya, kejadian ini akan terjadi lebih cepat di negara miskin dan berkembang. Di Indonesia sendiri prevalensi tumor/kanker adalah 4,3 per 1000 penduduk yang merupakan penyebab kematian nomor 7 (5,7%) setelah , (TB), hipertensi, cedera, perinatal, dan (DM) (Anonim, 2011).

  Pengobatan kanker yang telah dilakukan seperti: pembedahan, radioterapi, dan kemoterapi dapat menimbulkan efek samping serta belum menunjukkan hasil yang memuaskan (King, 2000). Oleh karena itu, diperlukan alternatif pengobatan salah satunya adalah dengan penggunaan bahan alam. merupakan salah satu tanaman yang telah dimanfaatkan untuk pengobatan kanker. Daun mengandung dua senyawa bioaktif asetogenin $ , yaitu dan . Kedua senyawa tersebut diisolasi dari ekstrak etanol daun yang diketahui dapat menghambat (MCF-7) dan

  a a

  Berdasarkan penelitian Liu (1999 ), memiliki potensi yang sangat besar untuk dikembangkan sebagai antikanker sehingga perlu dilakukan eksplorasi lagi untuk mengetahui potensi dari jenis cairan penyari yang digunakan dengan melihat bioaktivitasnya. Oleh karena itu pada penelitian ini, penyarian akan dilakukan secara bertingkat dengan metode maserasi. Penggunaan penyarian bertingkat memiliki keuntungan karena dapat memisahkan senyawa dengan tingkat kepolaran yang berbeda-beda sesuai dengan tingkat kepolaran pelarutnya. Tiga jenis pelarut yang memiliki tingkatan kepolaran yang berbeda untuk menyari senyawa yang terdapat dalam daun , yaitu n-heksana, etilasetat, dan metanol.

  Penggunaan n-heksana dan etilasetat dipilih karena keduanya menunjukkan konstanta dielektrik yang berada pada tingkatan kepolaran yang berbeda, begitu pula dengan metanol. Nilai konstanta dielektrik n-heksana sebesar 1,89 yang menunjukkan bahwa pelarut ini bersifat non-polar, sedangkan etilasetat sebesar 6,020 yang menunjukkan bahwa pelarut ini memiliki polaritas yang lebih rendah dari metanol namun memiliki polaritas yang lebih besar dibanding n- heksana. Metanol sendiri memiliki nilai konstanta dielektrik sebesar 33,620 yang menunjukkan pelarut ini memiliki polaritas yang paling tinggi diantara ketiga

  a

  pelarut tersebut. Berbeda dengan penelitian Liu (1999 ) yang menggunakan pelarut etanol, Pada penelitian ini pelarut yang dipilih adalah metanol. Hal ini dikarenakan metanol memiliki penetrasi yang lebih baik dibanding etanol dalam penyarian, yang ditunjukkan dengan nilai viskositas metanol sebesar 0.59 mPa·s

ke dalam sel dan penyarian senyawa lebih maksimal. Selain itu, metanol memiliki polaritas yang lebih besar dibandingkan etanol. % & adalah kapasitas pelarut untuk melarutkan . Metanol memiliki parameter (E )

  T sebesar 55,4 sedangkan nilai E etanol sebesar 51,9 (Buchori, 2007). T

  Fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun yang diperoleh kemudian diuji bioaktivitasnya dengan metode (BST). Prinsip metode ini adalah uji toksisitas akut terhadap larva Leach (artemia) dengan penentuan nilai LC

  50 setelah perlakuan 24 jam (Meyer,

  Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nichols, and Laughlin, 1982). Artemia digunakan sebagai hewan uji karena memiliki kesamaan tanggapan dengan mamalia, misalnya tipe DNA- RNA artemia serupa yang terdapat

  dalam mamalia, dan organisme ini memiliki $ & Na dan K ATP , sehingga senyawa maupun fraksi yang memiliki aktivitas pada sistem tersebut dapat terdeteksi (Solis, Wright, Anderson, Gupta and

  Phillipson, 1993).

  Bioaktivitas senyawa ditentukan berdasarkan nilai LC

  50 . LC

  50

  merupakan kadar konsentrasi yang mampu menyebabkan kematian 50% pada hewan uji pada pejanan selama waktu tertentu (Lu, 1995). Suatu senyawa dikatakan bioaktif apabila nilai LC

  50 kurang dari 1000 µg/ml, maka senyawa

  tersebut dapat diduga memiliki efek sitotoksik. Senyawa yang bersifat bioaktif pada BST belum tentu bersifat sitotoksik, sehingga perlu dilakukan uji tingkat lanjut dengan menggunakan sel kanker. Namun, suatu senyawa yang bersifat sitotoksik akan bersifat bioaktif bila diuji dengan metode BST (Meyer , 1982).

  Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai nilai LC

  50 tiap fraksi yang menunjukkan bioaktivitasnya sehingga dapat diketahui

  potensi dari tiap fraksi yang diperoleh dengan maserasi bertingkat. Selain itu, dilakukan penentuan golongan senyawa yang tersari ke dalam tiap fraksi menggunakan metode kromatografi lapis tipis dengan melihat perubahan warna bercak setelah disemprot pereaksi tertentu serta dilihat dibawah sinar ultraviolet.

   % & ! ' #

  a. Apakah fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun memiliki bioaktivitas terhadap larva artemia dengan metode BST? b. Fraksi manakah yang memiliki bioaktivitas paling besar terhadap larva artemia? c. Golongan senyawa kimia apakah yang terdapat dalam fraksi daun yang paling aktif dengan melihat profil kromatogram lapis tipis?

   &!( # ) # !( ( #

  Sejauh penelusuran peneliti, beberapa penelitian terkait dengan toksisitas antara lain pengujian antikanker ekstrak etanol biji, daun, daging buah pada oleh Cochrane, Nair, Melnick, Resek, dan Ramachandran (2008); pengujian dua senyawa hasil fraksi etanol ,

  a

  dan , dengan metode BST oleh Liu (1999 ); pengujian dua senyawa hasil fraksi etanol , ' dan ()$ ' ,

  b penelusuran pustaka untuk uji bioaktivitas fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol daun dengan metode belum pernah dilakukan.

• * #+ ) # !( ( # #+ , ( (&

  Penelitian ini diharapkan memberikan informasi yang berguna bagi ilmu pengetahuan khususnya bidang farmasi mengenai bioaktivitas fraksi n- heksana, etilasetat, dan metanol terhadap larva artemia serta golongan senyawa yang terdapat dalam fraksi yang paling aktif.

• - #+ ) " (&

  Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi kepada masyarakat terkait potensi fraksi daun dalam pengembangannya sebagai senyawa sitotoksik.

  ./. # # !( ( #

  1. Mengetahui bioaktivitas fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun terhadap larva artemia pada BST

  2. Mengetahui nilai LC

  50 fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun

  pada BST

  3. Mengetahui golongan senyawa kimia yang terdapat dalam fraksi daun paling aktif dengan melihat profil kromatogram lapis tipis

  #$ # -, #( Tanaman L. termasuk dalam familia Annonaceae.

  Tanaman ini dikenal juga dengan nama asingnya yaitu, (Unites States Department of Agriculture, 2001).

  0 1 0 1

%- # % # 0 1 .# 0 1 .#$

0 ,2 ', # 3 -! #4 .! &

  1 &" ()&( .%-.' #

  dikenal sebagai tanaman yang umumnya tumbuh di daerah pesisir dengan tinggi pohon mencapai 12 meter. Daunnya selang seling, lonjong dengan panjang sampai 15 cm (Gambar 1A), dan bunga berwarna krem dengan bercak merah didekat bagian dasar (Gambar 1B). Panjang buah sampai 10 cm, berwarna kuning dan daging buah berwana merah muda dengan banyak biji berwarna hitam (Cambie, 1994).

• * #4.#$ # "(%(

  Kandungan toksik adalah alkaloid liriodenine. Batang, kayu, dan kulit batang mengandung alkaloid ' $ , , , , *$ , , , , .

  ,$-$ $./$ + $.0$ juga telah diisolasi. Alkaloid pada daun

  adalah *$ dan . Ekstrak daun yang terhidrolisis menghasilkan flavonoid 1 dan . Daun, akar dan kulit batang menunjukkan hasil positif adanya alkaloid, dan ekstrak biji mempunyai sifat insektisidal (Cambie, 1994). Daun juga mengandung asetogenin $

  a

  yaitu dan B (Liu , 1999 ), serta asetogenin

  b lainnya yaitu ' dan ()$ ' (Liu ., 1999 ).

  (& % ("

  Artemia dikenal dengan nama asing termasuk familia artemiidae, genus , dan spesies Leach (Mudjiman, 1989).

  (#$".#$ # '(4.) o

  Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6 C atau lebih

  o

  dari 35

  C, tetapi hal ini sangat bergantung pada ras dan kebiasaan tempat hidup mereka. Maka dari itu, pertumbuhan artemia yang baik berkisar pada suhu antara

  o

  25-30

  C. Daya tahan artemia terhadap perubahan kandungan ion-ion kimia dalam air tenyata juga sangat tinggi. Apabila kandungan ion natrium dibandingkan dengan ion kalium di dalam air laut alami adalah 28, maka Artemia masih dapat bertahan pada perbandingan antara 8-173 (Mudjiman, 1989).

  Artemia dapat berkembang dengan baik pada kadar garam yang tinggi. Pada kadar garam yang tinggi, artemia terhindar dari musuh-musuh yang tidak dapat hidup pada kadar garam yang tinggi. Artemia dapat hidup di perairan dengan kadar garam antara 1-300 per mil (Mudjiman,1989).

  Artemia juga dapat hidup dan menyesuaikan diri pada tempat yang kadar oksigennya rendah maupun yang mengalami kejenuhan oksigen. Pengaruh pH terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa belum jelas namun berpengaruh terhadap penetasan . Apabila pH untuk penetasan kurang dari 8, maka efisiensi penetasan akan menurun. banyak yang tidak menetas atau waktu penetasan lebih panjang (Mudjiman, 1989).

• * ' ) ) " %- #$ # %(

  Istilah untuk telur artemia adalah , yaitu telur yang telah berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian diselubungi oleh cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultraviolet dan mempermudah pengapungan. Oleh karena itu, ia sangat tahan menghadapi keadaan lingkungan yang buruk (Mudjiman, 1989).

  Apabila siste artemia direndam dalam air laut bersuhu 25ºC, maka akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkangnya keluarlah larva yang juga dikenal dengan istilah . Dalam perkembangan selanjutnya, larva mengalami perubahan bentuk merupakan satu tingkatan. Larva tingkat I dinamakan instar I, tingkat II dinamakan instar II, tingkat III dinamakan instar III, demikian seterusnya sampai instar XV. Setelah itu berubahlah menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989).

  %- 5 %( 0 .4/(% # 6761

  Larva yang baru saja menetas masih dalam tingkatan instar I. Warnanya kemerah-merahan karena masih banyak mengandung makanan cadangan. Oleh karena itu mereka masih belum perlu makan. (Mudjiman, 1989).

• * %- ' ) ) .- ' # - # ." %( 0 .4/(% # 6761 Sekitar 24 jam setelah menetas, larva akan berubah menjadi instar II.

  Pada tingkatan instar II, larva udah mulai mempunyai mulut, saluran pencernaan itu, cadangan makanannya juga sudah mulai habis. Pada tingkatan selanjutnya mulai terbentuk sepasang mata majemuk, selain itu berangsur-angsur tumbuh tunas-tunus kakinya. Setelah menjadi instar XV, kakinya sudah lengkap sebanyak 11 pasang, maka berakhirlah masa larva, dan berubah menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989).

  %- 8 %( 4 2 & 0 .4/(% # 6761 8 #$$.# # %( ) 4

  1 Uji BST dengan hewan uji artemia dapat digunakan untuk skrining awal

  terhadap senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor karena uji ini mempunyai kolerasi yang positif dengan potensinya sebagai antitumor maupun fisiologis aktif tertentu (Anderson, Goets, dan McLaughlin, 1991).

  Artemia digunakan sebagai hewan uji karena memiliki kesamaan tanggapan dengan mamalia, misalnya tipe DNA- RNA

  juga memiliki $ & Na dan K ATP Na dan K ATP merupakan enzim yang mengkatalisis hidrolisis ATP menjadi

• ADP serta menggunakan energi untuk mengeluarkan 3Na dari sel

  mengambil 2K ke dalam, tiap sel bagi tiap mol ATP dihidrolisis. Na K ATP ditemukan dalam semua bagian tubuh. Aktivitas enzim ini dihambat oleh . Adanya menyebabkan keseimbangan ion Na+ dan K+ tetap terjaga (Ganong,1995). Jika suatu senyawa bekerja mengganggu kerja salah satu enzim ini pada artemia dan menyebabkan kematian artemia, maka senyawa tersebut bersifat toksik dan dapat menyebabkan kematian sel mamalia (Solis , 1993).

  3

  1

  (BST) merupakan salah satu metode uji toksisitas yang banyak digunakan dalam penelusuran senyawa bioaktif yang bersifat toksik dari bahan alam. Metode ini dapat digunakan sebagai $ dari bahan alam karena mudah, cepat, murah, dan cukup reprodusibel. Beberapa senyawa bioaktif yang telah berhasil diisolasi dan aktivitasnya dimonitor dengan BST menunjukkan adanya korelasi terhadap suatu uji spesifik antikanker (Harmita, and Radji, 2006).

  Penggunaan BST sebagai pertama kali dilaporkan oleh Tarpley untuk menentukan keberadaan residu insektisida, menentukan senyawa anestetik, serta menentukan tingkat toksisitas air laut. Selanjutnya, Meyer dan kawan-kawan ekstrak tanaman yang ditunjukkan sebagai toksisitas terhadap larva artemia. Toksisitas ditentukan dengan melihat harga LC yang dihitung berdasarkan

  50

  analisis probit. (Harmita, and Radji, 2006). Apabila harga LC

  50 <1000 µg/ml maka

  senyawa dapat dikatakan toksik. Apabila pengujian dengan larva artemia menghasilkan harga LC <1000 µg/ml maka dapat dilanjutkan dengan pengujian

  50

  antikanker menggunakan biakan sel kanker. Cara ini akan menghemat waktu dan biaya penelitian (Meyer , 1982).

  Metode untuk mendeteksi adanya aktivitas biologi suatu ekstrak tanaman dalam skrining dapat dibagi menjadi dua kelompok besar: dan # . dibagi menjadi dua kelompok lagi yaitu dan

  (Bohlin, and Bruhn, 1999). BST merupakan metode kelompok yang merupakan & & pada larva artemia. Sejak dikenalkan pada tahun 1982, metode ini telah digunakan untuk isolasi & & agen antitumor dan pestisida yang dihasilkan oleh tanaman (Bohlin, and Bruhn, 1999). Metode ini melihat kematian larva artemia dalam waktu pengamatan 24 jam yang merupakan suatu pengujian toksisitas akut. Uji toksisitas akut adalah uji tunggal yang dilakukan kepada hewan uji menggunakan senyawa-senyawa/zat-zat kimia yang berkaitan dengan kepentingan biologi dalam jangka waktu tertentu. Pengamatannya dilakukan selama 24 jam dan bertujuan untuk menentukan tingkat letalitasnya (Donatus, 2001).

  Pengamatan aktivitas biologi yang dilakukan pada uji toksisitas akut dapat berupa pengamatan gejala-gejala klinis, kematian hewan uji, atau pengamatan hispatologi organ. Data yang dapat diperoleh pada uji toksisitas akut

• + dapat berupa data kuantitatif yang dinyatakan dengan harga 2

  34 (LD ) dan 2 34 (LC ). LD merupakan dosis

  50

  50

  50

  senyawa uji yang dapat menimbulkan kematian 50% jumlah hewan uji sedangkan LC

  50 merupakan kadar (konsentrasi) senyawa uji yang mampu menimbulkan

  kematian 50% hewan uji. Harga LD dan LC suatu senyawa harus dilaporkan

  50

  50

  sesuai dengan lamanya hewan uji yang diamati. Apabila lama pengamatan tidak ditunjukkan dianggap bahwa pengamatan dilakukan selama 24 jam (Donatus, 2001).

   #9 ( #

  Penyarian adalah proses pemisahan suatu zat berdasarkan perbedaan kelarutannya terhadap dua cairan tidak saling larut yang berbeda. Prinsip penyarian adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non polar dalam senyawa non polar (Harborne, 1987).

  Cairan penyari untuk ekstrak sebaiknya sesuai dengan zat aktif yang berkhasiat, dalam arti dapat memisahkan zat aktif tersebut dari senyawa lainnya dalam bahan sehingga ekstrak mengandung sebagian besar senyawa aktif Republik Indonesia, 1985). Ada dua pertimbangan dalam memilih pelarut yang akan digunakan dalam penyarian, yaitu memiliki daya melarutkan yang tinggi dan pelarut tersebut tidak berbahaya atau tidak beracun (Somaatmadja, 1981). Daya melarutkan suatu pelarut bergantung terhadap kepolaran pelarut dan senyawa yang terlarut. Suatu senyawa akan terlarut dalam suatu pelarut yang sesuai dengan prinsip “like dissolve like” yang artinya suatu senyawa akan terlarut pada pelarut yang memiliki kepolaran yang hampir sama. Indikator kelarutan pelarut dapat ditentukan dari nilai konstanta dielektrik dan nilai polaritas pelarut (Stahl, 1985).

• - ! (! ( ",#& # 4( ! " (" - - $ ( : ) ! . 0 '! 67;1 ,#& # ( ! " (" ! . ,! ( &

  Non-polar 1,890 Petroleum eter 2,023 Sikloheksana 2,238 Karbon tetraklorida

  Toluene 2,284 Benzene Diklorometan 4,806 Kloroform

  4,340 Etileter 6,020 Etilasetat 20,700 Aseton n-propanol 24,300 etanol 33,620 metanol 80,370 air Polar

  Maserasi merupakan cara penyarian yang sederhana. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia ke dalam penyari. Penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Zat aktif akan larut karena adanya beda konsentrasi antara larutan di dalam dan di luar sel. Larutan yang lebih pekat akan terdesak keluar. Peristiwa ini berulang sehingga terjadi keseimbangan konsentrasi antara larutan di dalam dan di maksimal biasanya dilakukan dengan maserasi menggunakan sederetan pelarut atau metode Charauxs- Paris yaitu metode penyarian dengan menggunakan pelarut yang berbeda kepolaran, dimana ekstrak pekat pelarut polar diekstraksi kembali dengan pelarut semipolar dan pelarut non polar (Harborne, 1987).

  ,% ,$ +( )(& ()(&

  Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode kromatografi untuk fitokimia yang berdasarkan pada proses adsorpsi. Suatu senyawa dilewatkan pada lapisan yang disebut fase diam dengan bantuan suatu pelarut sebagai fase gerak. Fase diam yang biasa digunakan adalah silica atau alumina yang dilapiskan pada lempeng kaca atau alumunium, dan fase gerak berupa pelarut organik (Gritter, 1991).

  Jarak pengembangan senyawa pada kromatografi biasanya dinyatakan dalam angka Rf atau hRf, dimana angka tersebut dapat digunakan untuk identifikasi senyawa yang dianalisis. Harga Rf merupakan karakteristik KLT. Perkiraan identifikasi diperoleh dengan pengamatan dua bercak dengan harga Rf dan ukuran yang hampir sama. Harga Rf untuk suatu senyawa dapat dibandingkan dengan harga standar (Stahl, 1985).

  Deteksi bercak pada lempeng kromatografi yang telah dikembangkan dapat menggunakan sinar UV 254 nm dan UV 365 nm dan pereaksi semprot.

  Deteksi paling sederhana adalah dengan sinar UV pada lapisan yang mengandung indikator fluoresensi, terbatas pada senyawa yang mempunyai cincin aromatik dan ikatan rangkap terkonjugasi (Stahl, 1985).

  #4 & # , (

  merupakan salah satu tanaman yang telah diketahui memiliki aktivitas antikanker karena memiliki beberapa senyawa yang dapat menghambat maupun menyebabkan kematian pada sel kanker. Senyawa-senyawa yang terkandung di dalamnya antara lain alkaloid , ,$-$

  $./$ $.0$ , flavonoid 1 dan , asetogenin $ .

  Penyarian bertingkat bertujuan untuk menyari senyawa-senyawa yang terdapat dalam daun . Senyawa yang terkandung memiliki polaritas yang berbeda-beda sehingga digunakan 3 macam pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda yaitu metanol, etilasetat, dan heksana. Metanol merupakan pelarut organik yang bersifat polar sehingga akan melarutkan senyawa-senyawa yang memiliki sifat kepolaran sama dengan metanol, seperti flavonoid quercetin.

  Begitupula dengan n-heksana akan melarutkan senyawa yang larut dalam pelarut organik non-polar seperti alkaloid bebas dan asetogenin, namun pada asetogenin sendiri masih memiliki gugus hidroksi yang bersifat polar meskipun terdiri dari rantai karbon yang panjang sehingga tidak semua asetogenin dapat larut dalam pelarut non-polar seperti n-heksana. Oleh karena itu etilasetat yang memiliki tingkat kepolaran diantara metanol dan n-heksana digunakan untuk melarutkan

  Pengujian bioaktivitas fraksi digunakan metode (BST) yang merupakan pengujian bioaktivitas suatu bahan terhadap hewan uji larva artemia. Bioaktivitas suatu senyawa ditunjukkan dengan nilai LC

  50 ,

  apabila harga LC 50 <1000 µg/ml maka senyawa dapat dikatakan bioaktif.

  (), &(&

  Fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun memiliki bioaktivitas terhadap larva artemia pada metode BST. Fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana memiliki nilai LC

  50 yang berbeda. Fraksi n-heksana mengandung

  golongan senyawa kimia berupa alkaloid dan asetogenin, fraksi etilasetat berupa asetogenin, serta fraksi metanol berupa flavonoid.

   #(& 4 # #< #$ # # !( ( #

  Penelitian tentang uji bioaktivitas fraksi n-heksana, etilasetat, dan metanol daun dengan metode BST merupakan jenis eksperimental murni dengan

• + rancangan % "

  ( - ! 4 # +(#(&( ) &(,# ! ( - ! # !( ( #

  Variabel-variabel dalam penelitian ini adalah:

  a. Variabel bebas Konsentrasi fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun .

  b. Variabel tergantung Jumlah kematian larva artemia akibat pemberian fraksi metanol, etilasetat, dan n-heksana daun .

  c. Variabel pengacau terkendali

  o o

  1) Lingkungan tempat percobaan: suhu penetasan artemia 25 -30

  C, cahaya dengan sinar lampu 5 watt, air laut buatan dengan kadar garam 3,8 permil. 2) Subyek uji: Umur larva artemia 48 jam. 3) Tanaman: spesies atau varietas tanaman d. Variabel pengacau tak terkendali 1) Umur tanaman 2) Kondisi patologis larva artemia

• +(#(&( ) &(,# !

  a. Fraksi n-heksana daun adalah fraksi kental yang diperoleh dengan maserasi serbuk kering daun menggunakan pelarut n- heksana.

  b. Fraksi etilasetat daun adalah fraksi kental yang diperoleh dengan maserasi serbuk kering daun menggunakan pelarut etilasetat, sebelumnya telah dimaserasi dengan n-heksana terlebih dahulu.

  c. Fraksi metanol daun adalah fraksi kental yang diperoleh dengan maserasi serbuk kering daun menggunakan pelarut metanol, sebelumnya telah dimaserasi dengan heksana dahulu kemudian maserasi dilanjutkan dengan etilasetat.

  d. LC adalah konsentrasi fraksi metanol, etilasetat, dan heksana daun

  50

  yang menyebabkan kematian 50% pada populasi hewan uji dalam waktu 24 jam dan merupakan data kuantitatif yang diperoleh dari pengujian toksisitas akut, dinyatakan dalam µg/ml.

  3 ' # # !( ( # ' # # % #

  Daun yang digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Kebun Tanaman Obat Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman, Yogyakarta.

  ' # ) #9 ( #

  Pelarut yang digunakan dalam penyarian adalah metanol teknis, etil asetat teknis, dan n-heksana teknis.

  ' # ./( *

  Bahan yang digunakan dalam uji BST adalah artemia ("

  

5 , 5 ), air laut buatan berkadar garam 3,8 permil, ragi

& (fermipan), fraksi metanol, etilasetat, dan heksana daun

  .

  8 ' # ( ! . -. # 0

  1 Kecuali aquadest, bahan untuk KLT yang digunakan sebagai fase gerak

  dengan derajat kualitas pro analisis berupa : kloroform, aseton, dietilamin, , , asam formiat, dietileter, petroleum eter. Reagen yang digunakan, yaitu pereaksi Dragendorff, pereaksi aluminium klorida, kalium permanganat 0,32%. Plat KLT dengan Silica gel 60 F 254 (Merck, Darmstadt) sebagai fase diam.

  ! # !( ( #

  Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas (Pyrex), kain hitam, (National), ayakan no 40, (2100), &

  & (Janke & Kunkel), neraca analitik (Mettler Tolendo AB 204),

  aquarium penetasan artemia., lampu 5 watt (Dop), aerator, pipet tetes, flakon,

  

& ' ' (Djikstra), micropipette (SOCOREX), lempeng kaca, alat-alat gelas

  (Pyrex), bejana kromatografi, kertas saring, oven (Memmert), lampu UV 254 nm, alat semprot, pipa kapiler 5 µl.

  3 # !( ( # %(# &( # % #

  Determinasi dilakukan di Laboratorium Farmokognosi Fitokimia Universitas Sanata Dharma Yogyakarta dengan cara membandingkan habitus tanaman dengan pustaka acuan (Backer, and Bakhuizen van den Brink, 1963).

   #$.%).! # - ' #

  Daun diperoleh pada bulan September tahun 2011 di Kebun Tanaman Obat Kampus III Universitas Sanata Dharma, Paingan, Maguwoharjo, Depok, Sleman, Yogyakarta. Daun yang diambil adalah daun ke-4 sampai ke-5 dari ujung tangkai.

   #$ (#$ # 4 # ) %-. # & -." *

  Daun dicuci dengan air bersih mengalir, kemudian diangin- anginkan, setelah daun bersih kemudian dikeringkan di bawah sinar matahari

  

o

  dipindahkan ke oven dengan suhu 40-45 C untuk dikeringkan, daun dinyatakan kering apabila daun hancur ketika diremas. Selanjutnya dipotong kecil-kecil dan diserbuk dengan . Serbuk kering daun kemudian diayak dengan ayakan no mesh 40.

  8 & &(

  Penyarian yang dilakukan adalah penyarian bertingkat dengan metode maserasi. Serbuk kering daun ditimbang sebanyak 60 g dan dibagi menjadi dua masing-masing 30 g kemudian dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dengan ditambah pelarut n-heksana sebanyak 250 mL. Erlenmeyer ditutup dengan aluminium foil, lalu diletakkan pada dengan laju konstan 150 rpm selama 24 jam kemudian larutan disaring dengan corong Buchner. Ampas yang diperoleh pada penyaringan kembali dimaserasi dengan 250 mL n-heksana hingga diperoleh filtrat yang berwarna pucat. Selanjutnya, disaring kembali dengan corong Buchner dan ampas dikeringkan pada suhu ruangan hingga terbebas dari pelarut heksana.

  Ampas yang telah bebas dari pelarut heksana kembali di maserasi dengan 250 mL pelarut etilasetat selama 24 jam pada dengan laju konstan 150 rpm kemudian disaring dengan corong Buchner. Ampas yang diperoleh kembali dimaserasi dengan 250 mL etilasetat hingga diperoleh filtrat yang berwarna pucat. Selanjutnya, disaring dengan corong Buchner dan ampas yang diperoleh dikeringkan kembali sampai terbebas etilasetat.

  Ampas kembali diberi perlakuan seperti prosedur sebelumnya, namun pada selama 24 jam dengan laju konstan 150 rpm. Saring kembali dengan corong Buchner dan ampas yang diperoleh kembali ditambah dengan 250 mL metanol. Maserasi kembali dengan sampai memperoleh filtrat yang berwarna pucat.

  Ketiga fraksi yang dihasilkan masing-masing dipekatkan dengan & & hingga diperoleh fraksi pekat metanol, etilasetat, dan heksana.

  Fraksi pekat kemudian dimasukkan dalam oven dengan suhu 50

  o