SCREENING OF BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOME CLONES WITH AFLP-BASED DNA FINGERPRINTING Skrining Klon-Klon BAC Menggunakan DNA-Fingerprinting Berbasis AFLP.

137
Stigma Volume XII No.4, Oktober – Desember 2004

SCREENING OF BACTERIAL ARTIFICIAL CHROMOSOME CLONES
WITH AFLP-BASED DNA FINGERPRINTING
Skrining Klon-Klon BAC Menggunakan DNA-Fingerprinting Berbasis AFLP
Jamsari*), Inke Nitzt**), Stella Marie Reamon Büttner***), Christian Jung****)
ABSTRACT
With the aim of male-determining gene isolation from
asparagus, a Map-based Cloning (MBC) strategy has been
choosen. For that purpose a 6x genome coverage of
asparagus BAC library has been constructed. In order to
get the target BAC clones linking to the M-locus, an
AFLP-based DNA fingreprinting approach has been
applied to screen a total number of 40992 BAC clones
(about 2,6x genome coverage). Using 9 selected AFLPprimer combinations in total 13 different single BAC
clones could be identified. This revealed 1,4 BAC clones
per primer combinations, or lower than expected number
2,6 single BAC clones per primer combination. However
the result indicated the feasibility of AFLP-based DNAfingerprinting to be used in the screening of large insert
library.

Key words: Klon BAC, DNA-Fingerprinting, AFLP

PENDAHULUAN
Mendapatkan klon-klon yang dikehendaki di
antara puluhan atau bahkan ratusan ribu klonklon dari suatu pustaka DNA genomik seperti
BAC=Bacterial Artificial Chromosome, YAC
=Yeast Artificial Chromosome, PAC = Plasmid
Artificial Chromosome, dan lain-lainnya adalah
pekerjaan yang tidak gampang dan membutuhkan
waktu yang lama.
Metode umum yang biasanya dipergunakan
untuk menseleksi klon-klon positif dari suatu
pustaka DNA adalah dengan cara hibridisasi yang
pada umumnya menggunakan metode vi-sualisasi
secara radioaktif. Disisi lain metode hi-bridisasi
secara “konvensional” tersebut akan efektif
dilaksanakan manakala probe-probe single-copy
sudah tersedia. Pada kondisi dimana probe-probe
single-copy tidak tersedia, maka me-tode
hibridisasi tidak akan efektif dilaksanakan, oleh

karena sinyal hibridisasi yang diperoleh tidak
akan memberikan informasi yang tepat ten-tang
posisi dari klon-klon yang sebenarnya dikehendaki. Di samping itu oleh karena sistem pelabelannya menggunakan bahan radioaktif, maka
operasional pelaksanaannya membutuhkan keahlian tinggi dan fasilitas khusus dimana perizin*)
**)

***)

****)

annya tidak pada semua tempat dapat diperoleh.
Persoalan lain adalah problem penanganan limbah sisa bahan radioaktif yang mengharuskan
untuk diperlakuan secara khusus pula.
AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) merupakan salah satu sistem DNAfingerprinting yang bersifat multilokus dan mampu menghasilkan output dengan kapasitas fingerprinting yang besar (high throughput) (Vos, et al,
1995). Aplikasi penggunaan sistem ini telah dilakukan secara luas baik untuk keperluan pengembangan sistem penanda (marker) maupun fingerprinting untuk keperluan analisis kekerabatan dan
asal usul suatu spesies (Hongtrakul, et al., 1997).
Dalam upaya untuk mengisolasi gen pengendali kelamin jantan pada tanaman asparagus,
maka suatu metode kloning berbasis peta (Map
based cloning) telah dipilih sebagai suatu strategi. Untuk keperluan tersebut maka disusun
sebuah pustaka klon BAC asparagus yang akan

akan digunakan sebagai sumber klon-klon berinsersi besar dalam penyusunan petak fisik. Pada
paper ini akan diuraikan aplikasi sistem AFLP
dalam skrining klon-klon pustaka BAC yang
disusun dari tanaman jantan homozigot asparagus
(Asparagus officinalis L.).
BAHAN DAN METODE
Konstruksi Pustaka Klon BAC
Pustaka BAC disusun dengan menggunakan
DNA genomik berberat molekul tinggi
(HMW=High Molecular Weight) yang diisolasi
dari tanaman asparagus jantan berkomposisi
homozigot pada lokus pengendali kelamin (MM).
Isolasi DNA dilakukan dengan menggunakan
protokol yang dikembangkan oleh TAMU
(http://HBZ.TAMUEDU/bacindex2.-html)
dengan sedikit modifikasi berupa penambahan 2%
PVP (polyvinylpyrrolidone) pada buffer isolasi
dan pencucinya. DNA diinkubasi selama 1 jam
dengan 100 µl buffer reaksi yang mengandung
enzim restriksi HindIII atau BamHI.

Program Studi Pemuliaan Tanaman Fakultas Pertanian Universitas Andalas, Padang.
Federal Dairy Research Centre Kiel, Institute of Physiology and Biochemistry of Nutrition, Hermann-WeigmannStrasse 1, 24103 Kiel, Germany
Drug Research and Medical Biotechnology, Fraunhofer Institute for Aerosol Research and Toxicology, Nikolai-FuchsStrasse 1, 30621 Hanover, Germany
Plant Breeding Institute, Christian-Albrechts-University of Kiel, Olshausenstrasse 40, 24098 Kiel, Germany

ISSN 0853-3776

AKREDITASI DIKTI No. 52/DIKTI/KEP/1999 tgl. 12 Nopember 2002

138
Stigma Volume XII No.4, Oktober – Desember 2004
Seleksi ukuran tahap awal dilakukan pada
suatu PFGE (Pulse field Gel Electrophoresis) dengan menggunakan kondisi tegangan 5.8 V/cm,
sudut 120°, dan dengan interval pulsa dari 12
sampai 45 detik selama 16 jam pada suhu 14°C.
Fragmen DNA berukuran 100-350 kb (kilobasa)
digunakan untuk material pada seleksi ukuran
tahap II. Dengan menggunakan peralatan dan
kondisi yang sama pada seleksi ukuran tahap I,

terkecuali interval pulsa yang hanya 5 detik,
fragmen DNA berukuran 100 kb diseleksi sebagai materi dasar untuk kloning pada saat penyusunan pustaka BAC.
Untuk pengklonan fragmen-fragmen DNA
terseleksi digunakan plasmid pBeloBAC11
(Shizuya et al. 1992) dan pBeloBACkan (Mozo
et al. 1998). Sebanyak 10 µg DNA vektor dicerna
secara komplet dengan enzim restriksi HindIII
untuk pBeloBAC11 atau BamHI untuk
pBeloBACkan. Preparasi, ligasi dan transfomasi
vektor dilaksanakan berdasarkan protokol TAMU
(http://HBZ.TAMU.EDU/bacindex-.html). Klonklon tunggal dipanen dari cawan petri dan disimpan pada piring mikrotiter berkapasitas 96 sumur
yang dilengkapi dengan 150 µl media pembeku
(media LB yang dilengkapi dengan 36,0 mM
K2HPO4, 13,2 mM KH2PO4, 1,7 mM sodium
citrate, 0,4 mM MgSO4, 6,8 mM (NH4)SO4, 4,4%
(v/v) glycerol dan 12,5 µg/ml chloramphenicol).
Setelah pertumbuhan satu malam pada suhu
37°C, piring mikrotiter disimpan pada suhu
-20°C. Untuk melihat kwalitas pustaka klon BAC
maka dilakukan analisis hibridisasi terhadap 4608

koloni (± 5%) yang dipilih secara acak yang
dihibridisasi dengan probe spesifik DNA kloroplas tembakau pXX1.6 and mitokondria DNA
spesifik dari Oenothera coxI (diperoleh atas
kebaikan K. Krupinska, Universitas Kiel).
Pengepoolan Klon-klon BAC
Untuk mempersingkat proses skrining, maka
dilakukan
pengepoolan
klon-klon
BAC.
Pengepoolan tahap I dilakukan terhadap 4 buah
piring mikrotiter berformat 96 klon (8 baris dan
12 kolom), sehingga didalam satu pool akan terdapat sebanyak 384 klon tunggal BAC. Selanjutnya pengepoolan dilakukan pada posisi baris dan
kolom dari ke empat buah piring mikrotiter, sehingga untuk setiap pool baris akan terdapat 4 x
12 klon = 48 klon BAC, sedangkan pool kolom
terdiri dari 4 x 8 klon = 32 klon BAC. Dengan
demikian dari setiap 384 klon BAC akan terdapat
8 pool baris dan 12 pool kolom. Selanjutnya isolasi DNA dari klon-klon BAC yang telah dipool
dilakukan dengan metode lisis-alkalin dengan
menggunakan kit isolasi untuk plasmid dengan

insersi besar yang disupply oleh Qiagen (QiagenHeidelberg Jerman). Sedangkan isolasi sub pool

ISSN 0853-3776

(pool baris dan kolom) dilakukan dengan maxiprep yang dimodifikasi untuk keperluan itu.
Skrining Klon BAC dengan AFLP
Prosedur kerja AFLP dilakukan menurut protokol yang dikembangkan oleh Vos et al (1995)
dengan melakukan modifikasi seperlunya. Untuk
skrining fingerprinting dengan AFLP, sebanyak
75 ng DNA pool digunakan sebagai templet.
DNA tersebut direstriksi secara komplet dengan
menggunakan enzim EcoRI dan MseI atau PstI
dan MseI sekaligus di dalam 25 µl volume reaksi
restriksi. Inkubasi restriksi dilakukan selama 1
jam pada suhu 37°C. Selanjutnya DNA yang
telah direstriksi tersebut diligasi dengan adaptor
EcoRI dan MseI ataupun PstI dan MseI. Sekuens
adaptor dapat dilihat pada lampiran 1. Hasil
restriksi-ligasi diencerken dengan buffer TA 0,1x.
Lima mikroliter dari larutan restriksi-ligasi

digunakan untuk preamplifikasi dengan menggunakan satu nukleotid selektif (lampiran 1). Reaksi
preamplifikasi dilakukan pada volume 25 µl,
dengan siklus reaksi pada tabel 1. Produk PCR
hasil preamplifikasi diencerkan dengan 75 µl TA
0,1x. dan digunakan sebanyak 5 µl sebagai templet untuk reaksi amplifikasi dengan 3 selektif
nukleotid, yang salah satu primernya dilabel dengan senyawa berfluorescen IRD800. Sebanyak
11 kombinasi primer AFLP digunakan untuk
menyeleksi 107 pool (40992 klon tunggal) klon
BAC. PCR dilaksanakan dengan siklus seperti
tertera pada tabel 1. Hasil amplifikasi selanjutnya
dijalankan pada 8% Polyakrilamid Gel yang diinstalasikan dengan Licor DNA sequencer (LicorGermany) dimana data analisis ditransfer dalam
format TIFF, dan diedit dengan menggunakan
software Adobe-Photoshop.
Tabel 1.

Program PCR yang digunakan selama preamplifikasi dan amplifikasi dalam skrining
klon-klon BAC.

Program PCR untuk pre-amplikasi
Temperatur (oC)

Waktu (detik)
94
30
94
30
56
30
72
60
72
300
4

Program PCR untuk amplikasi
Temperatur (oC)
Waktu (detik)
94
30
94
30

65
56
30
72
60
94
30
56
30
72
60
72
300
4


AKREDITASI DIKTI No. 52/DIKTI/KEP/1999 tgl. 12 Nopember 2002

Jumlah siklus
1

23
1
1
Jumlah siklus
1
13

23
1
1

139
Stigma Volume XII No.4, Oktober – Desember 2004

HASIL DAN PEMBAHASAN
Karakteristik Pustaka Klon BAC
Sebanyak 143.522 klon BAC tanaman asparagus telah selesai disusun sebagai materi prasyarat dalam isolasi gen pengendali kelamin jantan (M) dengan menggunakan strategi kloning
berbasis peta (MBC = Map Based Cloning).
Keseluruhan pustaka klon BAC tersebut terdiri
dari tiga sub pustaka yang dikelompokkan berdasarkan perbedaan sisi kloning dan vektor yang
digunakan. Untuk mendapatkan gambaran kwalitas dari pustaka tersebut, maka dilakukan analisis
terhadap rata-rata insersi, proporsi klon tanpa
insersi, klon yang tidak tumbuh, serta fraksi klon
yang mengandung insersi organel DNA (kloroplast dan mitokondria).
Hasil analisis terhadap 604 sampel klon BAC
tunggal yang dipilih secara acak menunjukkan
bahwa, pustaka BamHI dengan vektor
pBeloBAC-Kan, pustaka BamHI- dengan vektor

Gambar 1.

pBeloBAC11 dan pustaka HindIII dengan vector
pBeloBAC11 memiliki rata-rata insersi sebesar
36 kb, 50 kb dan 82 kb secara berturut-turut.
Oleh karena itu untuk skrining dengan menggunakan AFLP, materi yang digunakan hanya
pustaka klon BAC HindIII. Rata-rata insersi yang
dimiliki pustaka ini (82 kb) memang lebih rendah
dibandingkan dengan rata-rata insersi yang dimiliki oleh pustaka-pustaka BAC lainnya seperti
100 kb pada pustaka BAC tanaman tomat
(Folkertsma et al., 1999), 106 kb pada pustaka
BAC barley (Yu et al., 2000), 132 kb pada
pustaka BAC padi (Wang et al., 2001), 118 kb
pada melon (Luo et al., 2001), 125 kb dari beet
gula (Gindullis et al., 2001) dan 157 kb dari
pustaka BAC sorghum (Woo et al., 1994).
Sebaliknya ada juga pustaka klon BAC yang memiliki insersi lebih rendah daripada yang dicapai
dari hasil penelitian ini, seperti 80 kb pada pustaka BAC tanaman bunga matahari (Gentzbittel et
al., 2002), dan 80 kb pada tanaman jeruk (Yang
et al., 2001).

Penampilan sebuah image hasil fingerprinting DNA klon-klon BAC dengan sistem AFLP. Tiga buah jalur
pertama setelah standar (M) adalah DNA genomik dari asparagus yang masing-masing adalah jantan
heterozygot (1), jantan homozygot (2), dan betina homozygot (3), kemudian diikuti dengan DNA dari bakteri
E. coli dan vektor pBeloBAC11. Blok setelah itu adalah blok DNA dari pool 384 klon, kemudian diikuti
dengan blok pool baris dan kolom, serta blok DNA dari klon tunggal. Posisi sinyal positif diberi tanda dengan
anak panah, setelah membandingkannya dengan sinyal yang terdapat pada DNA genomik asparagus. Tanda
bintang memperlihatkan posisi DNA genomik darí bakteri (E. coli).

ISSN 0853-3776

AKREDITASI DIKTI No. 52/DIKTI/KEP/1999 tgl. 12 Nopember 2002

140
Stigma Volume XII No.4, Oktober – Desember 2004
Secara teoritis sebenarnya kemampuan daya
tampung insersi dengan menggunakan sistem
BAC dapat mencapai sampai 350 kb (Shizuya et
al., 1992). Yang berarti besarnya insersi rata-rata
yang dicapai dari hasil penelitian ini baru sekitar
23% dari kapasitas maksimalnya. Namun demikian dengan total 86,784 klon dari pustaka
HindIII, pustaka tersebut ekuivalen dengan 6x
besar total genome asparagus yang sebesar 1308
Mb (Arumuganathan and Earle, 1991). Dengan
demikian jumlah tersebut lebih tinggi dari yang
dihasilkan oleh pustaka BAC tomat (Folkertsma
et al., 1999) meskipun beberapa pustaka BAC
tertentu ada yang mencapai jumlah 10x kali besar
dari total genomnya seperti pada padi (14x)
(Wang et al., 2001) dan melon (18.7x) (Luo et
al., 2001).
Dengan menggunakan rumus dari Clark dan
Carbon (1976):
ln (1 - P)
N
ln (1 - L/M)
Dimana N adalah jumlah klon, L adalah besarnya insersi rata-rata, P adalah peluang, dan M
adalah besarnya ukuran genom, maka peluang
untuk mendapatkan klon-klon yang dikehendaki
dari pustaka HindIII adalah 98.6%. Hasil tersebut
diperoleh setelah melakukan koreksi terhadap

ekuivalensi pustaka BAC yang dimiliki dengan
mempertimbangkan keberadaan jumlah klon
yang tidak memiliki insersi 0.57%, klon yang
tidak dapat tumbuh 0.07%, serta proporsi DNA
kloroplas dan mitokondria (0.61% dan 2.00%
secara berturut-turut).
Skrining Klon-Klon BAC dengan AFLP
Sejumlah 9 kombinasi primer AFLP (7
EcoRI-MseI dan 2 PstI-MseI) telah digunakan
untuk menseleksi 107 buah pool (40992 klon)
klon BAC asparagus. Kesembilan kombinasi
primer AFLP tersebut memiliki jarak genetik terhadap lokus gen target (M) kurang dari 5 cM
(centi Morgan) berdasarkan hasil analisis tautan
dengan menggunakan 206 individu tanaman F2
(data tidak diperlihatkan).
Tujuhpuluh lima nanogram DNA dari pool
klon-klon BAC digunakan sebagai templet untuk
restriksi dan ligasi, dan terbukti mampu menghasilkan suatu pola fingerprinting yang jelas untuk dianalisis (gambar 1). Dari setiap kombinasi
primer AFLP rata-rata dapat diamati 14 fragmen
AFLP dengan kisaran antara 4 sampai 18 fragmen. Jumlah tertinggi diperlihatkan oleh kombinasi primer E46M54, sedangkan E44M47 memperlihatkan jumlah fragmen yang paling sedikit.

Tabel 2. Hasil skrining Klon-klon pustaka BAC dengan menggunakan metode DNA fingerprinting berbasis AFLP
Kombinasi
Primer AFLP
EM4150
EM3156
EM3353
EM4447.1
EM3950
EM4654
PM3159
PM3551
EM4447.2
Total

Klon-klon BAC yang teridentifikasi pada setiap tahap
Pool 384 klon
P35; P36; P65; P73; P91
P19; P20
P33; P57; P62; P68; P102
P12; P28; P62; P73; P87
P97
P29; P94
P61; P97
P12; P65; P96
P27;P38
25

Pool Baris
P91/C
P19/F;P20/E
P102/A
P12/B; P28/A;P87D
P97/C
P29/G; P94/B
P97/C
P12/C; P96/C/D
P38/F
14

Sejumlah 25 pool klon BAC pada tahap awal
skrining memperlihatkan sinyal positif setelah
fragmen AFLP-nya dibandingkan dengan kontrol
yang menggunakan DNA genomik dari tiga
genotipe asparagus (jantan heterozygot (Mm),
jantan homozygot (MM) dan betina (mm)).
Setelah tahap verifikasi pada tingkat pool baris
dan kolom dan selanjutnya tingkat klon tunggal
akhirnya diperoleh 13 klon BAC berbeda yang
dianggap positif.
Dengan demikian setiap kombinasi primer
AFLP yang digunakan dapat mengidentifikasi antara 1 sampai 3 klon BAC. Satu klon BAC dengan nomor 385C3 dideteksi oleh dua kombinasi
primer AFLP yang berbeda, yang masing-

ISSN 0853-3776

Pool Kolom
P91/6
P19/6;P20/7
P102/8
P12/2;P87/2
P97/3
P29/11;P94/5
P97/3
P12/7;P96/6
P38/5
12

Klon BAC tunggal
364C6
73F6; 77E7
407A8
45B2;347D2
385C3
115G11;373B5
385C3
46C7; 381C6;383B6
151F5
13

masingnya berjarak genetis 0,5 cM. Dalam hal ini
jumlah total klon-klon BAC tunggal positif yang
diidentifikasi lebih rendah dari jumlah yang diharapkan. Jika total klon BAC yang diseleksi berjumlah 40992 klon BAC atau sekitar 2,6 kali dari
besarnya genom haploid asparagus, maka secara
teoritis seharusnya setiap kombinasi primer
AFLP akan menghasilkan rata-rata 2,6 klon BAC
atau sekitar 2 sampai 3 klon BAC. Sehingga total
klon BAC tunggal yang diperoleh sekitar 23-24
klon BAC. Sementara hasil yang diperoleh dalam
penelitian ini hanya 13 klon BAC tungal, yang
berarti efisiensi skriningnya hanya 56% dari
jumlah yang diharapkan

AKREDITASI DIKTI No. 52/DIKTI/KEP/1999 tgl. 12 Nopember 2002

141
Stigma Volume XII No.4, Oktober – Desember 2004
Jika dibandingkan antara dua kombinasi enzim restriksi, maka kombinasi EcoRI/MseI memperlihatkan rata-rata jumlah fragmen yang lebih
tinggi (14 fragmen) dibandingkan dengan kombinasi PstI/MseI (11 fragmen). Jika menggunakan
DNA genomik langsung sebagai template maka
rata-rata jumlah fragment yang diperoleh dari
kombinasi EcoRI/MseI untuk tanaman asparagus
sekitar 76 buah, sebaliknya jika menggunakan

kombinasi PstI/MseI akan diperoleh jumlah ratarata fragmen sekitar 52 buah. Fenomena yang
hampir sama juga diamati oleh El-Mezawy
(2002) dan Setiawan (1999) pada tanaman beet
gula. Penjelasan hal tersebut diduga berkaitan
dengan sensitifitas enzim restriksi PstI yang secara umum sangat sensitif dengan proses inaktifasi
metilasi.

Tabel 3. Daftar sekuens adaptor, primer untuk preamplifikasi dan primer amplifikasi yang digunakan.
Sekuens adaptor
Jenis adaptor
EcoRI-adaptor

Sekuens 1)
5'-CTCGTAGACTGCGTACC- 3'
3' -CATCTGACGCATGGTTAA-5'
MseI-adaptor
5'-GACGATGAGTCCTGAG- 3'
3' -TACTCAGGACTCAT- 5'
PstI-adaptor
5'-CTCGTAGACTGCGTACATGCA-3'
3' CATCTGACGCATGT- 5'
1 )Sisi restriksi digarisbawahi dan dicetak tebal Primer untuk preamplifikasi (satu nukleotid selektif)
Kode Primer
Nama Nomenklatur nukleotida
Sekuens 2)
E 01
EcoRI-A
5'–GACTGCGTACCAATTCA-3'
M 02
MseI-C
5'–GATGAGTCCTGAGTAAC-3'
P 01
PstI-A
5'–GACTGCGTACATGCAGA-3'
Primer untuk amplifikasi (tiga nukleotid selektif)
Kode Primer
Nomenklatur nukleotida
Sekuens 2)
E 31
EcoRI-AAA
5'-GACTGCGTACCAATTCAAA-3'
E 33
EcoRI-AAG
5'-GACTGCGTACCAATTCAAG-3'
E 39
EcoRI-AGA
5'-GACTGCGTACCAATTCAGA-3'
E 41
EcoRI-AGG
5'-GACTGCGTACCAATTCAGG-3'
E 44
EcoRI-ATC
5'-GACTGCGTACCAATTCATC-3'
E 46
EcoRI-ATT
5'-GACTGCGTACCAATTCATT-3'
M 47
MseI-CAA
5'-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3'
M 50
MseI-CAT
5'-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3'
M 51
MseI-CCA
5'-GATGAGTCCTGAGTAACCA-3'
M 53
MseI-CCG
5'-GATGAGTCCTGAGTAACCG-3'
M 54
MseI-CCT
5'-GATGAGTCCTGAGTAACCT-3'
M 56
MseI-CGC
5'-GATGAGTCCTGAGTAACGC-3'
M 59
MseI-CTA
5'-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3'
P 31
PstI-AAA
5'-GACTGCGTACATGCAGAAA-3'
P 35
PstI-ACA
5'-GACTGCGTACATGCAGACA-3'
2) Nukleotid selektif dicetak tebal

Penyimpangan antara jumlah yang diharapkan dengan jumlah yang diperoleh dalam skrining klon-klon dari pustaka BAC juga dilaporkan
dari hasil skrining klon BAC tanaman padi oleh
Tao et al, (2001). Beberapa alasan penyimpangan
antara hasil yang diperoleh dengan jumlah hasil
yang diharapkan bisa disebabkan oleh salah satu
atau beberapa hal berikut:
1. Adanya overestimasi dari rata-rata ukuran
insersi yang disebabkan oleh rendahnya
ukuran sample dalam pengujian kwalitas
pustaka klon BAC. Hal ini akan menyebabkan bahwa cakupan 2,6 x dari ukuran genom
asparagus yang diperkirakan dari sampling
yang dilakukan pada kenyataannya lebih
besar dari yang sebenarnya. Disamping itu
keberadaan fraksi klon-klon tanpa insersi dan

ISSN 0853-3776

2.

adanya koloni yang tidak tumbuh diduga
juga menjadi penyebab adanya overestimasi.
Distribusi non acak sekuens repetitif diduga
juga menjadi penyebab penyimpangan tersebut. Fraksi sekuens repetitif pada tanaman
asparagus menurut Galli et al, (1988) adalah
sebesar 68%, sementara itu Reamon-Büttner
et al., (1999) melaporkan bahwa fragmenfragmen spesifik AFLP terpaut kelamin yang
diisolasi dan dihibridisasikan secara in-situ
memperlihatkan pola hibridisasi yang dispersif pada seluruh kromosom asparagus. Hal
ini mencerminkan karakteristik sekuenssekuens tersebut bersifat middle repetitif
ataupun high-copy. Kehadiran sekuens repetitive dapat menyebabkan distribusi non acak
dari titik-titik potok di sepanjang kromosom

AKREDITASI DIKTI No. 52/DIKTI/KEP/1999 tgl. 12 Nopember 2002

142
Stigma Volume XII No.4, Oktober – Desember 2004
asparagus. Konsekuensinya akan banyak
sekuens penting yang hilang pada saat seleksi
ukuran fragmen tahap 1 ataupun 2 selama
proses penyusunan pustaka BAC. Akan tetapi asumsi tersebut kontradiktif dengan kenyataan ukuran insersi yang diperoleh. Hal
ini ditunjukkan oleh adanya klon yang hanya
memiliki ukuran 5,75 kb, yakni klon BAC
373B5, meskipun dua tahap seleksi telah
diberlakukan selama proses penyusunan pustaka klon BAC asparagus.
3. Jika dua buah lokus dari kombinasi primer
AFLP secara fisik berdekatan satu dengan
lainnya, maka kedua kombinasi primer tersebut cenderung akan menghasilkan klon BAC
yang sama, sebagaimana ditunjukkan oleh
klon BAC 385C3 yang diidentifikasi oleh
kombinasi primer E39M50 dan P31M59.
Data tersebut merupakan salah satu contoh
yang paling tepat, dimana secara statistik
akan mereduksi jumlah klon BAC yang
diharapkan dengan jumlah klon BAC yang
secara nyata diperoleh.
Penggunaan AFLP untuk menseleksi klonklon positif dari suatu pustaka BAC telah dilaporkan oleh penulis lain seperti Klein et al.,
(2000). Akan tetapi kebanyakan pustaka insersi
berukuran besar seperti BAC maupun YAC diseleksi dengan cara hibridisasi biasa (Druka et al.,
2000; Meksem et al., 2000; Wang et al., 2001)
dengan menggunakan probe yang diperoleh dari
fragmen-fragmen RFLP atau probe-probe yang
telah dipurifikasi yang dikembangkan dari proses
PCR.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penelitian ini didanai oleh perkumpulan
peneliti
Jerman
(DFG=Deutsche
Forschungsgemeinschaft), serta didukung oleh
Dinas Pertukaran Akademik Jerman (DAAD).
Ucapan terimakasih disampaikan kepada B.
Neidhard, J. Grimm serta T. Keil atas bantuannya
dalam penyusunan dan skrining klon-klon

pustaka BAC
DAFTAR PUSTAKA
Arumuganathan, K., Earle, E. D. (1991). Nuclear DNA
content of some important plant species. Plant Mol Biol
Rep 9: 211-215.
Clark, L., Carbon, J. (1976). A colony bank containing
synthetic ColE1 hybrids representative of the entire E.
coli genome. Cell 9: 91-99.
Druka, A., Kudrna, D., Han, F., Kilian, A., Steffenson, B.,
Frisch, D., Tomkins, J., Wing, R., Kleinhofs, A. (2000).

ISSN 0853-3776

Physical mapping of the barley stem rust resistance gene
rpg4. Mol Gen Genet 264:283-290.
El-Mezawy, A., Dreyer, F., Jacobs, G., Jung, C. (2002). Highresolution mapping of the bolting gene B of sugar beet.
Theor Appl Genet 105: 100-105.
Folkertsma, R. T., Spassova, M. I., Prins, M., Stevens, M. R.,
Hille, J., Goldbach, R. W. (1999). Construction of a
bacterial artificial chromosome (BAC) library of
Lycopersicon esculentum cv. Stevens and its application
to physically map the Sw-5 locus. Molecular Breeding 5:
197-207.
Galli, M. G., Bracale, M., Falavigna, A., Soave, C. (1988).
Sexual differentiation in Asparagus officinalis L. I. DNA
characterization and mRNA activities in male and
female flowers. Sex Plant Reprod 1: 202-207.
Gentzbittel, L., Abbott, A., Galaud, J. P., Georgi, L., Fabre, F.,
Liboz, T., Alibert, G. (2002). A bacterial artificial
chromosome (BAC) library for sunflower, and
identification of clones containing genes for putative
transmembrane receptors. Mol Genet Genomics 266:
979-987.
Gindulis, F., Dechyeva, D., Schmidt, T. (2001). Construction
and characterization of a BAC library for the molecular
dissection of a single wild beet centromere and sugar
beet (Beta vulgaris) genome analysis. Genome 44 : 846855.
Hongtrakul, V. G.H., Huestis, S.J. Knapp. (1997). Amplified
fragment length polymorphisms as a tool for DNA
fingerprinting sunflower germplasm: genetic diversity
among oilseed inbred lines. Theor Appl. Genet. 95: 400407.
Klein, P. E., Klein, R. R., Cartinhour, S. W., Ulanch, P. E.,
Dong, J., Obert, J. A., Morishige, D. T., Schlueter, S. D.,
Childs, K. L., Ale, M., Mullet, J. E. (2000). A highthroughput AFLP-based method for constructing
integrated genetic and physical maps: Progress toward a
shorgum genome map. Genome Research 10: 789-807.
Luo, M., Wang, Y.-H., Frisch, D., Joobeur, T., Wing, R. A.,
Dean, R. A. (2001). Melon bacterial artificial
chromosome (BAC) library construction using improved
methods and identification of clones linked to the locus
conferring resistance to melon Fusarium wilt (Fom-2).
Genome 44: 154-162.
Meksem, K., Zobrist, K., Ruben, E., Hyten, D., Quanzhou, T.,
Zhang, H.B., Lightfoot, D.A. (2000). Two large-insert
soybean genomic libraries constructed in a binary
vector: applications in chromosome walking and
genome physical mapping. Theor Appl Genet 101: 747755.
Mozo, T.; Fischer, S.; Meier-Ewert, S.; Lehrach, H.; Altmann,
T. (1998). Use of the IGF BAC library for physical
mapping of the Arabidopsis thaliana genome. Plant J
16: 377-384
Reamon-Büttner, S. M., Jung, C. (2000). AFLP-derived STS
markers for the identification of sex in Asparagus
officinalis L. Theor Appl Genet 100: 432-438.
Reamon-Büttner, S. M., Schmidt, T., Jung, C. (1999). AFLPs
represent highly repetitive sequences in Asparagus
officinalis L. Chromosome Research 7: 297-304.
Setiawan, A. (1999). Mapping quantitative trait loci (QTL) for
resistance to leaf spot disease (Cercospora beticola
Sacc.) in sugar beet (Beta vulgaris L.). Dissertation.
Christian-Albrechts-Universität, Kiel.
Shizuya, H., Birren, B., Kim, U. –J., Mancino, V., Slepak, T.,
Tachiiri, Y., Simon, M. (1992). Cloning and stable
maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human
DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.
Proc Natl Acad Sci USA 89: 8794-8797
Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T.,
Hornes, M., Fritjters, A., Pot., J., Peleman, J., Kuiper,
M., Zabeau, M. (1995). AFLP: a new technique for DNA
fingerprinting. Nucl Acids Res 23: 4407-4414.

AKREDITASI DIKTI No. 52/DIKTI/KEP/1999 tgl. 12 Nopember 2002

143
Stigma Volume XII No.4, Oktober – Desember 2004
Wang, W., Zhai, W., Luo, M., Jiang, G., Chen, X., Li, X.,
Wing, R.A., Zhu, L., (2001a). Chromosome landing at
the bacterial blight resistance gene Xa4 locus using a
deep coverage rice BAC library. Mol Genet Genomics
265: 118-125.
S. –S., Jiang, J., Gill, B. S., Paterson, A. H., Wing, R. A.,
(1994). Construction and characterization of bacterial
artificial chromosome library of Sorghum bicolor. Nucl
Acids Res 22: 4922-4931.
Yang, D., Parco., Nandi, S., Subudhi, P., Zhu, Y., Wang, G.,
Huang, N. (1997). Construction of a bacterial artificial

chromosome (BAC) library and identification of
overlapping BAC clones with chromosome 4-specific
RFLP markers in rice. Theor Appl Genet 95: 1147-1154.
Yu, Y., Tomkins, J. P., Waugh, R., Frisch, D. A., Kudrna, D.,
Kleinhofs, A., Brueggeman, R. S., Muehlbauer, G. J.,
Wise, R. P. Wing, R. A., (2000). A bacterial artificial
chromosome library for barley (Hordeum vulgare L.)
and the identification of clones containing putative
resistance genes. Theor Appl Genet 101:1093-1099.

------------------------------oo0oo------------------------------

ISSN 0853-3776

AKREDITASI DIKTI No. 52/DIKTI/KEP/1999 tgl. 12 Nopember 2002