Isolasi Senyawa Flavonoida Dari Daun Tumbuhan Benalu Pada Cengkeh (Scurrula Ferruginea (Jack) Danser.)
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Tumbuhan Benalu cengkeh (Scurrula ferruginea (jack) Danser)
Benalu merupakan tumbuhan parasit terhadap inang tumbuhnya, walaupun bersifat parasit
benalu berpotensi sebagai tumbuhan obat. Masyarakat menggunakan untuk bahan obat
tradisional (Semangun, 2004).
2.1.1
Sistematika Tumbuhan benalu pada cengkeh
Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Class
: Dicotyledonae
Ordo
: Santalales
Famili
: Loranthaceae
Genus
: Scurrula
Spesies
: Scurrula ferruginea (jack) Danser.
2.2 Senyawa flavonoida
Flavanoid adalah senyawa polifenol yang banyak terdapat pada sayuran dan buah-buahan.
Flavonoid telah menunjukan perannya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik
dan aktifitas vasodilatator (Miller, 1996).
Senyawa flavonoida terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit,
tepung sari, bunga, buah dan biji. Kebanyakan flavonoida berada dalam tumbuh-tumbuhan
kecuali alga. Ada juga flavonoida terdapat pada hewan. Penyebaran flavonoida pada
tumbuhan yaitu angiospermae, klorofita, fungi briofita (Markham, 1988).
Universitas Sumatera Utara
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan
pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak,
umumnya dalam tumbuhan terikat gula yang disebut dengan glikosida (Harbone, 1996).
Senyawa flavonoid bermanfaat dalam makanan , berupa senyawa fenolik, senyawa
inin yang bersifat antioksidan kuat. Banyak kondisi penyakit yang diketahui bertambah
parah oleh adanya radikal bebas seperti superoksida dan hidroksil, dan flavonoida memiliki
kemampuan untuk menghilangkan dan secara efektif menyapu spesies pengoksida yang
merusak itu. Oleh karena itu, makanan kaya flavonoida dianggap penting untuk mengobati
penyakit-penyakit, seperti kanker dan jantung (Heinrich et al, 2009).
Ada tiga kelompok flavonoida yang amat menarik perhatian dalam fisiologi
tumbuhan, yaitu antosianin, flavonol, dan flavon. Antosianin ( dari bahas yunani Anthos,
bunga dan kyanos, biru tua ) adalah pigmen berwarna yang umumnya terdapat dibunga
berwarna merah, ungu, dan biru. Pigmen juga terdapat di berbagai tumbuhan lain, misalnya
buah tertentu, batang, daun, dan bahkan akar. Sering flavonoida terikat di sel epidermis.
Warna sebagian besar buah dan banyak bunga adalah akibat dari antosianin, walaupun
beberapa warna tumbuhan lainnya, seperti buah tomat dan beberapa bunga kuning, karena
karotenoid. Warna cerah daun musim gugur disebabkan terutama oleh timbunan antosianin
pada hari cerah dan dingin, walaupun karotenoid kuning atau jingga merupakan pigmen
terbesar di daun musim gugur pada beberapa spesies. (salisbury, 1995).
2.2.1 Struktur Dasar Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti
fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat
digambarkan sebagai berikut :
A
C
C
C
B
Gambar 1. Kerangka dasar senyawa flavonoida
(Sastrohamidjojo, 1996).
Universitas Sumatera Utara
2.2.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan
pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak,
umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida (Harborne,
1987).
1. Flavonoida O-glikosida
Pada flavonoida O-glikosida , satu gugus hidroksil flavonoida atau lebih terikat pada
satu gula (lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikolisasi
menyebabkan flavonoida menjadai kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air.
Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga
terdapat adalah galaktosa, ramnosa, xilosa, dan arabinosa.
2. Flavonoida C-glikosida
Gula terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat
langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon tahan asam. Glikosida
yang demikian disebut C-glikosida.
3. Flavonoida Sulfat
Senyawa ini mengandung satu ion sulfat atau lebih yang terikat pada hidroksi fenol
atau gula. Senyawa ini sebenarnya bisulfat karena terdapat sebagai garam, yaitu
flavon-O-SO3K. Banyak yang berupa glikosida bisulfat, bagian bisulfat terikat pada
hidroksil fenol yang mana saja masih bebas atau pada gula.
4. Biflavonoida
Biflavonoid adalah flavonoid dimer, walaupun prosianidin dimer (satuan dasarnya
katekin) biasanya tidak dimasukkan ke dalam golongan ini. Flavonoid yang biasanya
terlibat adalah flavon dan flavanon yang secara biosintesis mempunyai pola
Universitas Sumatera Utara
oksigenasi yang sederhana 5,7,4’ (kadang-kadang 5,7,3’,4’) dan ikatan antar
flavonoid berupa ikatan karbon-karbon atau ikatan eter.
5. Aglikon flavonoid yang aktif-optik
Sejumlah aglikon flavonoid mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan demikian
menunjukkan keaktifan optik ( yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar ). Yang
termasuk dalam golongan flavonoida ini adalah flavanon, dihidroflavonol, katekin,
rotenoid, dan lain-lain.
Robinson (1995), mengelompokkan flavonoid beradasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu
:
1. Flavanon
Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan
konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk, dua glikosida yang
paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.
O
O
2. Flavon
Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi
warnanya. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa
flavonoida
O
O
Universitas Sumatera Utara
3
Flavonol
Flavonol adalah turunan 3-hidroksi flavon dan dihidroflavonol.Daya serap
sinar UV pada struktur flavanol terjadi pada 352-385nm pada pita I dan 240-285 nm
pada pita II.Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida.
O
OH
O
4
Isoflavon
Merupakan isomer flavon, jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin (senyawa
pelindung) yang terbentuk dalam tumbuhan untuk pertahanan terhadap penyakit.
Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi manapun.
O
O
5
Flavanonol
Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika
dibandingkan dengan flavonoida lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena
konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.
O
OH
O
6
Khalkon
Universitas Sumatera Utara
Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat tua dengan sinar UV bila
dikromatografi kertas. Aglikon khalkon dapat dibedakan dari glikosidanya karena
hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas
dalam pengembang air.
O
7
Auron
Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita.
Auron memiliki panjang gelombang maksimum pada band I 340-430 nm. Dalam
larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromarografi kertas
berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet karena kuning kuat berubah menjadi
merah jingga bila diberi uap amonia.
O
CH
O
8
Katekin
Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu.
Katekin dan proantosianidin adalah dua golongan senyawa yang mempunyai banyak
kesamaan dengan semua senyawa tanpa warna (Robinson, 1995).
OH
OH
HO
O
OH
OH
9
Antosianin
Universitas Sumatera Utara
Antosianin adalah pigmen pada daun, bunga dan batang tanaman yang memiliki
banyak warna biru, lembayung, violet, dan semua yang mendekati warna merah.
Antosianin terdapat juga dalam bagian lain tumbuhan tinggi kecuali fungus.
Antosianin selalu terdapat dalam bentuk glikosida. Faktor-faktor yang mempengaruhi
warna dari antosianin yaitu pH, logam dalam bentuk kompleks dan juga tanin
(Robinson, 1995).
O
OH
10 Leukoantosianidin
Merupakan monomer flavan 3,4-diol, leukoantosianidin jarang terdapat sebagai
glikosida, namun beberapa bentuk glikosida yang dikenal adalah apiferol, dan
peltoginol (Robinson, 1995).
OH
OH
O
HO
HO
OH
OH
Universitas Sumatera Utara
Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimana semua
flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dan semuanya
mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni :
Tabel 2.1 Sifat dari golongan-golongan flavonoida menurut Harborne
Golongan
flavonoida
Penyebaran
Ciri khas
Universitas Sumatera Utara
Antosianin
Proantosianidin
Pigmen bunga merah marak, dan
biru juga dalam daun dan jaringan
lain.
Terutama tidak berwarna, dalam
daun tumbuhan yang berkayu.
Larut dalam air, λ maks 515-545 nm,
bergerak dengan BAA pada kertas.
Menghasilkan antosianidin bila jaringan
dipanaskan dalam HCl 2M selama
setengah jam.
Flavonol
Terutama
ko-pigmen
tidak
berwarna dalam bunga sianik dan
asianik tersebar luas dalam daun.
Setelah hidrolisis, berupa bercak kuning
murup pada kromatogram Forestal bila
disinari sinar UV, maksimal spektrum
pada 330 – 350 nm.
Flavon
Seperti flavonol
Setelah hidrolisis, berupa bercak coklat
redup pada kromatogram Forestal maksimal spektrum pada 330-350 nm.
Glikoflavon
Seperti flavonol
Mengandung gula yang terikat melalui
ikatan C-C, bergerak dengan pengembang
air, tidak seperti flavon biasa.
Biflavonil
Tidak berwarna dan
seluruhnya
terbatas
gimnospermae
hampir
pada
Pada kromatogram BAA berupa bercak
redup dengan RF tinggi .
Khalkon dan
Auron
Pigmen bunga kuning, kadangkadang terdapat juga dalam
jaringan lain
Dengan amonia
berwarna merah
(perubahan warna dapat diamati in situ),
maksimal spektrum 370-410 nm.
Flavanon
Tidak berwarna, dalam daun dan
buah (terutama dalam Citrus)
Berwarna merah kuat dengan Mg/HCl,
kadang – kadang sangat pahit .
Isoflavon
Tidak berwarna, sering kali dalam
akar, hanya terdapat dalam suku
Leguminosae
Bergerak pada kertas dengan pengembang
air, tidak ada uji warna yang khas.
2.2.3 Biosintesis Flavonoid
Senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom
karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linear
Universitas Sumatera Utara
yang terdiri dari tiga atom karbon. Kerangka ini dapat ditullis sebagai C6-C3-C6. Jadi
senyawa flavonoida adalah senyawa 1,3 diarilpropana, senyawa isoflavonoida adalah
senyawa 1,2 diarilpropana, sedang senyawa-senyawa neoflavonoida adalah senyawa 1,1
diarilpropana.
Senyawa flavonoida diturunkan dari unit C6-C3 (fenil propana) yang bersumber dari
asam sikimat (via fenilalanin) dan unit C6 yang diturunkan dari jalur poliketida. Fragmen
poliketida ini disusun dari tiga molekul malonil-KoA yang bergabung dengan unit C6-C3
(sebagai KoA tioester) untuk membentuk unit awal triketida. Oleh karena itu, flavonoid yang
berasal dari biosintesis gabungan terdiri atas unit-unit yang diturunkan dari asam sikimat dan
jalur poliketida (Heinrich et al 2009).
Semua varian flavonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama yang
melalui alur sikimat dan alur asetat-malonat. Flavonoida yang pertama kali terbentuk pada
biosintesis adalah khalkon dan semua bentuk diturunkan darinya melalui berbagai alur.
Modifikasi flavonoida lebih lanjut mungkin terjadi pada berbagai tahap dan menghasilkan:
penambahan (atau pengurangan) hidroksilasi, metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida,
metilenasi gugus orto-dihidroksil, dimerisasi (pembentukan biflavonoida), dan glikosilasi
gugus hidroksil (pembentukan flavonoida O-glikosida) atau inti flavonoida (pembentukan
flavonoida C-glikosida).
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.1 Biosintesa hubungan antara jenis monomer flavonoida dari alur asetat-malonat
dan alur sikimat (Markham, 1988).
Universitas Sumatera Utara
2.2.4 Sifat Kelarutan Flavonoida
Senyawa flavonoid termasuk senyawa polar, karena mempunyai sejumlah gugus
hidroksil ataupun suatu gugus gula. Hal ini memungkinkan flavonoid dapat larut dalam
pelarut polar seperti etanol (EtOH), metanol (MeOH), butanol, aseton, dimetilsulfoksida
(DMSO), dimetilformamida (DMF), air dan lain-lain. Flavonoid yang berupa aglikon
merupakan golongan polifenol yang memiliki sifat senyawa fenol yaitu bersifat agak asam,
Keberadaan gugus gula yang terikat pada flavonoid (glikosida) cenderung menyebabkan
flavonoid lebih mudah terlarut dalam air. Namun hal sebaliknya tidak berlaku pada aglikon
yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi
cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).
2.3 Skrining Fitokimia
Banyak reagen yang dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan dari flavonoid,
meskipun beberapa juga akan bereaksi positif dengan senyawa polifenol. Reagen yang biasa
digunakan adalah :
1. Shinoda Test, yaitu dengan menambahkan serbuk magnesium pada ekstrak sampel
dan beberapa tetes HCl pekat, warna orange, pink, merah sampai ungu akan terjadi
pada senyawa flavon, flavonol, turunan 2,3-dihidro dan xanton. Penggunaan zinc
sebagai pengganti magnesium dapat dilakukan, dimana hanya flavanonol yang
memberikan perubahan warna merah pekat sampai magenta, flavanon dan flavonol
akan memberi warna merah muda yang lemah sampai magenta (Sarker, et al 2006).
2. H2SO4(p), flavon dan flavonol akan memberikan perubahan larutan kuning pekat.
Kalkon dan auron menghasilkan larutan berwarna merah atau merah kebiru-biruan.
Flavanon memberikan warna orange (Sarker, et al 2006).
3. NaOH 10% , menghasilkan larutan biru violet
4. FeCl3 5% telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol, tetapi
tidak dapat digunakan untuk membedakan macam-macam golongan flavonoid.
Universitas Sumatera Utara
Pereaksi ini memberi warna kehijauan, warna biru, dan warna hitam-biru (Robinson,
1995).
2.4 Teknik Pemisahan
Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan
ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen
lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan
yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaanperbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam
satu golongan (Muldja, 1995).
2.4.1
Ekstraksi
Terdapat sejumlah metode ekstraksi, yang paling sederhana adalah ekstraksi dingin
(dalam labu besar berisi biomassa), dengan cara ini bahan kering hasil gilingan diekstraksi
pada suhu kamar secara berturut-turut dengan pelarut yang kepolarannya makin tinggi.
Keuntungan utama cara ini adalah merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak
tidak dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam terurai. Penggunaan pelarut
dengan peningkatan kepolaran secara berurutan memungkinkan pemisahan bahan alam
berdasarkan kelarutannya (dan polaritasnya) dalam ektraksi. Hal ini sangat mempermudah
proses isolasi (Heinrich et al, 2009).
Beberapa metode ekstraksi dapat digunakan untuk mengekstrak suatu konstituen
dalam suatu bahan tanaman, yang diantaranya adalah maserasi, perkolasi, ekstraksi sokletasi,
ekstraksi pelarut bertekanan, ekstraksi dengan refluks, dan destilasi uap. Dalam ekstraksi
padat-cair, bahan tanaman ditempatkan dalam sebuah wadah, dan dibiarkan terjadi kontak
dengan pelarut. Proses yang terjadi dari seluruh proses dinamis tersebut dapat diuraikan
menjadi beberapa tahap, yaitu tahap pertama pelarut akan berdifusi ke dalam sel, kemudian
Universitas Sumatera Utara
pelarut akan melarutkan metabolit, dan pada proses akhir pelarut akan berdifusi keluat dari
sel bersama dengan metabolit (Sarker, 2007).
Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap
senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak pekat, biasanya pelarut
ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harborne, 1996).
2.4.2
Partisi
Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak
digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak. Partisi menggunakan dua pelarut tak
bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus
menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya
meningkat.
Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap:
1. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan
organik
2. Air/diklorometan atau air/kloroform atau air/etil asetat untuk membuat fraksi agak polar
di lapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengandalkan
kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain (Heinrich et al,
2009).
2.4.3
Hidrolisa
Prosedur yang digunakan untuk hidrolisis asam dari flavonoid glikosida adalah,
sebanyak 2 mg sampel flavonoid glikosida dicampur dengan asam klorida 6% sebanyak 5 ml
dengan jumlah metanol yang sangat sedikit pada sampel untuk membuat proses hidrolisis
menjadi sempurna. Larutan dipanaskan selama 45 menit lalu didinginkan, kemudian ekstrak
sepenuhnya dilarutkan dengan eter. Penguapan dari larutan akan mengendapkan ramnosa
dan glukosa. Lapisan eter, setelah dikeringkan dengan menggunakan natrium sulfat akan
didapatkan aglikon flavonoid setelah diuapkan (Mabry et al, 1970).
Universitas Sumatera Utara
2.4.4 Kromatografi
Kromatografi adalah berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fase
yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam, dapat berupa zat cair atau zat
padat. Pemisahan secara kromatografi yang berhasil baik berkaitan dengan mengkompromi
daya pisah kromatografi, beban cuplikan, dan waktu analisis (Gritter, 1991)
Pemisahan pada kromatografi planar pada umumnya dihentikan sebelum semua fase
gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua kromatografi ini
dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung fase geraknya. Nilai faktor
retardasi solut (Rf) dapat dihitung dengan menggunakan perbandingan dalam persamaan:
Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai perbandingan
distribusi (D) dan faktor retensi sama dengan 0 yang berarti solut bermigrasi dengan
kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika
solut tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam.
Proses sorpsi
Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam, sementara
itu proses sebaliknya (pemindahan solut dari fase diam ke fase gerak) disebut dengan
desorpsi. Kedua proses ini (sorpsi dan desorpsi) terjadi secara terus menerus selama
pemisahan
kromatografi
karenanya
sistem
kromatografi
berada
dalam
keadaan
kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fase yang bersesuaian dengan
perbandingan distribusinya (D) untuk menjaga keadaan kesetimbangan ini. Ada 4 jenis
Universitas Sumatera Utara
mekanisme sorpsi dasar dan umumnya 2 atau lebih mekanisme ini terlibat dalam satu jenis
kromatografi. Keempat jenis tersebut adalah adsorpsi, partisi, pertukaran ion, dan eksklusi
ukuran.
Adsorben
Silika gel merupakan jenis adsorben (fase diam) yang penggunaannya paling luas.
Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol
bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan hidrogen
dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar.
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan
permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel. Hal seperti ini dapat
diatasi dengan memanaskan pada suhu 105 0C, meskipun demikian reproduksibilitasnya sulit
dicapai kecuali jika suhu dan kelembapan benar-benar dijaga secara hati-hati. Beberapa
adsoben yang sering digunakan adalah :
Alumina
(paling polar)
Karbon aktif (charcoal)
Silika gel
Magnesium silikat
Selulosa
Resin-resin polimerik (stiren/difenil
(paling non-polar)
benzen)
Tabel 2.2 Daftar adsorben pada kromatografi (Gandjar dkk, 2007).
2.4.4.1
Kromatografi lapis tipis
Kromatografi Lapis Tipis pada plat berlapis yang berukuran lebih besar, biasanya
5x20 cm, 10x20 cm, atau 20x20 cm. Biasanya memerlukan waktu pengembangan 30 menit
sampai satu jam. Pada hakikatnya KLT melibatkan dua fase yaitu fase diam atau sifat
lapisan, dan fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk
halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap atau penyangga untuk lapisan zat cair.
Universitas Sumatera Utara
Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut (Sudjadi,
1986).
Pemisahan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis seperti senyawa organik alam
dan senyawa organik sintetik dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan alat yang
harganya tidak terlalu mahal. Jumlah cuplikan beberapa mikrogram atau sebanyak 5 g dapat
ditangani. Kelebihan KLT yang lain ialah pemakaian jumlah pelarut dan jumlah cuplikan
yang sedikit. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode pemisahan yang
cukup sederhana yaitu dengan menggunakan plat kaca yang dilapisi silika gel dengan
menggunakan pelarut tertentu (Gritter, 1991).
Lempeng lapis penyerap sering menggunanakan indikator flueresensi sehingga bahan
alam yang mengabsobsi sinar uv gelombang pendek 245 nm akan tampak sebagai bercak
hitam pada latar hijau
2.4.4.2 Kromatografi Kolom
Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi)
atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu
pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Ukuran keseluruhan kolom sungguh
beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan
mungkin saja sampai 100 kalinya. Ukuran kolom dan banyaknya penjerap yang dipakai
ditentukan oleh bobot campuran sampel yang akan dipisahkan.
Untuk pemisahan normal, bobot sampel biasanya 30:1 ternyata memadai jika
pemisahan tidak terlalu sukar. Ukuran partikel penjerap pada kolom biasanya lebih besar
daripada untuk KLT. Walau pun banyak jenis penjerap telah dipakai untuk kolom, alumina
dan silika gel adalah penjerap yang paling berguna dan mudah didapat.
Fraksi kolom yang mengandung senyawa yang sama (diperiksa dengan KLT) atau
tampaknya berasal dari satru puncak (memakai pendeteksian sinambung) digabungkan, dan
Universitas Sumatera Utara
pelarutnya diuapkan, lebih baik dengan tekanan rendah. Jika pelarut dan penjerap murni.
Maka fraksi-fraksi pun murni (Gritter dkk, 1991).
2.4.4.3 Kromatografi lapis tipis preparatif
Sebagian besar pemakaian kromatografi lapis tipis preparatif hanya dalam jumlah
miligram. Kromatografi lapis tipis preparatif bersama-sama dengan kromatografi kolom
terbuka, dijumpai sebagian besar dalam isolasi bahan alam. Penjerap yang paling umum
digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun
campuran senyawa hidrofil. Ukuran partikel dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran
tingkat KLT.
Cuplikan sebanyak 10-100 mg dapat dipisahkan pada lapisan silika gel atau
aluminium oksida 20 x 20 cm yang tebalnya 1 mm. Pengembangan plat KLTP biasanya
dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap
jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan sehelai kertas saring yang tercelup ke
dalam pengembang.
Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluorosensi yang membantu
mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap
sinar UV. Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat dengan spatula atau
pengerok berbentuk tabung. Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan pelarut yang
paling kurang polar yang mungkin (sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap). Harus
diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penjerap makin besar
kemungkinan penguraian (Hostettmann dkk, 1995).
2.4.5
Kristalisasi
Kristalisai adalah pengendapan kristal dari larutan yang terbuat dari bahan tertentu.
Selama proses pembentukan kristal, molekul akan cenderung menjadi melekat kristal
tumbuh terdiri dari jenis yang sama molekul karena cocok dalam kisi kristal untuk molekul
Universitas Sumatera Utara
struktur yang sama daripada molekul yang lain. Jika proses kristalisasi diperbolehkan untuk
terjadi dalam mendekati – kondisi kesetimbangan, preferensi molekul untuk deposit pada
permukaan terdiri dari molekul seperti akan menyebabkan peningkatan dalam kemurnian
bahan kristal. Sehingga proses rekristalisasi adalah salah satu metode yang paling penting
tersedia bagi ahli kimia untuk pemurnian padatan. ( Pasto, 1992 ).
2.4.6
Rekristalisasi
Amorf yang diperoleh dari hasil isolasi dilarutkan kembali dengan EtOAc, diaduk
hingga semua amorf larut sempurna. Kemudian ditambahkan n – heksana secara perlahan –
lahan hingga pembentukan kembali senyawa yang lebih murni dari sebelumnya dan jatuh di
dasar wadah. Didekantasi larutan bagian atas wadah. Lalu diuapkan sisa pelarut dari amorf
hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut (Jacobs, 1974).
2.5
Teknik Spektroskopi
Spektrofotometer merupakan alat untuk mempelajari interaksi sinar elektromagnetik
dengan materi. Gelombang elekromagnetik yang digunakan adalah sekitar 180-800nm.
Energi elektromagnetik akan diubah menjadi besaran listrik dan melalui amplifier akan
diubah menjadi besaran yang dapat diamati. Radiasi elektromagnetik adalah energi yang
digunakan untuk penyerapan dan emisi radiasi magnetik yang diteruskan melalui ruang
dengan kecepatan luar biasa. Dikenal dua kelompok utama spektroskopi, yaitu spektroskopi
atom dan spektroskopi molekul. Dasar dari spektroskopi atom adalah tingkat energi elektron
terluar suatu atom atau unsur, sedangkan dasar dari spektroskopi molekul adalah tingkat
energi molekul yang melibatkan energi elektronik, energi vibrasi, dan energi rotasi. Energi
elektronik yaitu energi yang melibatkan tingkat energi yang ditempati orbit elektron suatu
atom dari molekul- molekul. Energi vibrasi yaitu energi yang melibatkan vibrasional antar
Universitas Sumatera Utara
atom dalam molekul. Energi rotasi yaitu energi yang melibatkan rotasi dari molekul
(Bintang, 2011).
2.5.1
Spektroskopi Ultra Violet
Serapan molekul di dalam derah ultra violet dan terlihat dari spektrum bergantung
pada struktur ultra elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan
percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi di
dalam keadaan tereskitasi (Silverstein, 1986).
Fenol menyerap didaerah UV pendek dan dapat dideteksi pada pelat silika gel yang
mengandung indikator fluoresensi gelombang 253 nm, terlihat sebagai bercak gelap dengan
latar belakang berfluoresensi. Akan tetapi, biasanya lebih baik mendeteksinya dengan
pereaksi yang lebih khas.Semua senyawa fenol berupa senyawa aromatik sehingga
semuanya menunjukan serapan kuat didaerah spektrum UV. Selain itu secara khas senyawa
fenol menunjukan geseran batokrom pada spektrumnya bila ditambahkan basa (Markham,
1988).
2.5.2 Spektroskopi Inframerah (FT-IR)
Spektrum inframerah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran
(vibrasi) yang berlainan. Inti-inti atom yang terikat oleh ikatan kovalen mengalami getaran
(vibrasi) atau osilasi (iscillation) dengan cara serupa dengan dua bola yang terikat oleh suatu
pegas.
Bila molekul menyerap radiasi inframerah, energi yang diserap menyebabkan
kenaikan dalam amplitudo getaran atom-atom yang terikat itu. Jadi molekul ini berada dalam
keadaan vibrasi tereksitasi , energi yang diserap ini akan dibuang dalam bentuk panas bila
molekul itu kembali ke keadaan dasar. Panjang gelombang eksak dari absorpsi oleh suatu
tipe ikatan, bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut. Oleh karena itu, tipe ikatan
yang berlainan (C-H, C-C, C=O, C=C, O-H, dan sebagainya) menyerap radiasi inframerah
Universitas Sumatera Utara
pada panjang gelombang yang berlainan. Dengan demikian spektrometri inframerah dapat
digunakan untuk mengidentifikasi adanya gugus fungsi dalam suatu molekul. Banyaknya
energi yang diserap juga beraneka ragam dari ikatan ke ikatan. Ini disebabkan sebagian oleh
perubahan dalam momen dipol (μ≠0) pada saat energi diserap. Ikatan nonpolar (seperti C -H
atau C-C) menyebabkan absorpsi lemah, sedangkan ikatan polar (seperti misalnya O-H, NH, dan C=O) menunjukkan absorpsi yang lebih kuat.
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul.
Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul:
1. Streching (vibrasi regang/ulur): vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan
atau pemendekan ikatan.
2.
Bending (vibrasi lentur/tekuk): vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga
terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan.
Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang
gelombang. Contohnya, ikatan O-H menyerap energi pada frekuensi 3330 cm-1, energi pada
panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang ikatan O-H itu. Suatu ikatan
O-H itu juga menyerap pada kira-kira 1250 cm-1, energi pada panjang gelombang ini
menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi yang berlain-lainan ini disebut cara
vibrasi fundamental (Supratman, 2010).
2.5.2
Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Setelah spektroskopi inframerah, spektroskopi resonansi magnetik inti (NMR) adalah
yang metode yang paling penting digunakan dalam kimia organik. Dalam spektroskopi
inframerah mengandung infromasi mengenai adanya gugus fungsi pada molekul, sedangkan
spektroskopi NMR memberikan informasi mengenai jumlah dari masing-masing hidrogen.
Universitas Sumatera Utara
Kemampuan terhebat resonansi inti magnetik timbul karena tidak semua proton
dalam molekul memiliki resonansi yang identik pada frekuensi yang sama. Hal ini sesuai
dengan fakta bahwa berbagai macam proton dalam molekul dikelilingi oleh elektron dan
memiliki sedikit perbedaan dalam lingkungan elektronik dari satu dan yang lainnya. Proton
akan terlindungi oleh elektron yang mengelilingi mereka. Dalam daerah magnetik, peredaran
elektron valensi dari daerah penghasil proton yang bertentangan dengan daerah magnetik
yang berlaku. Pergeseran kimia dalam unit δ ditunjukkan dalam jumlah resonansi proton
yang bergeser dari TMS dalam bagian per juta (ppm) dari frekuensi dasar spektroskopi.
Unsur dasar dari spektrometer NMR adalah ilustrasi skematis. Sampel dilarutkan
dalam pelarut yang tidak memiliki proton (biasanya CCl4) dan dalam jumlah yang kecil dari
TMS yang ditambahkan sebagai pusat referensi internal.
Semua proton dalam molekul yang identik dalam lingkungan kimia akan memiliki
pergerseran kimia yang sama. Dengan demikian, semua proton dari TMS atau semua proton
dalam benzen , siklopentana, atau aseton memiliki nilai resonansi yang berdekatan pada nilai
δ. Masing-masing komponen akan memiliki penyerapan yang tunggal dalam spektrum nmr.
Proton ini dikatakan sama secara kimia. Pada kenyataannya, spektrum tidak dapat hanya
dibedakan dari berapa banyak tipe proton yang berbeda pada molekul tersebut, tetapi dapat
memperlihatkan berapa banyak jenis perbedaan yang ada dalam molekul tersebut. Dalam
spektrum NMR, daerah dibawah masing-masing peak adalah proporsional dengan jumlah
dari hidrogen yang ada pada peak tersebut (Pavia, 1979).
Universitas Sumatera Utara
TINJAUAN PUSTAKA
2.1
Tumbuhan Benalu cengkeh (Scurrula ferruginea (jack) Danser)
Benalu merupakan tumbuhan parasit terhadap inang tumbuhnya, walaupun bersifat parasit
benalu berpotensi sebagai tumbuhan obat. Masyarakat menggunakan untuk bahan obat
tradisional (Semangun, 2004).
2.1.1
Sistematika Tumbuhan benalu pada cengkeh
Kingdom
: Plantae
Divisi
: Spermatophyta
Class
: Dicotyledonae
Ordo
: Santalales
Famili
: Loranthaceae
Genus
: Scurrula
Spesies
: Scurrula ferruginea (jack) Danser.
2.2 Senyawa flavonoida
Flavanoid adalah senyawa polifenol yang banyak terdapat pada sayuran dan buah-buahan.
Flavonoid telah menunjukan perannya sebagai antioksidan, antimutagenik, antineoplastik
dan aktifitas vasodilatator (Miller, 1996).
Senyawa flavonoida terdapat pada semua bagian tumbuhan termasuk daun, akar, kayu, kulit,
tepung sari, bunga, buah dan biji. Kebanyakan flavonoida berada dalam tumbuh-tumbuhan
kecuali alga. Ada juga flavonoida terdapat pada hewan. Penyebaran flavonoida pada
tumbuhan yaitu angiospermae, klorofita, fungi briofita (Markham, 1988).
Universitas Sumatera Utara
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan
pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak,
umumnya dalam tumbuhan terikat gula yang disebut dengan glikosida (Harbone, 1996).
Senyawa flavonoid bermanfaat dalam makanan , berupa senyawa fenolik, senyawa
inin yang bersifat antioksidan kuat. Banyak kondisi penyakit yang diketahui bertambah
parah oleh adanya radikal bebas seperti superoksida dan hidroksil, dan flavonoida memiliki
kemampuan untuk menghilangkan dan secara efektif menyapu spesies pengoksida yang
merusak itu. Oleh karena itu, makanan kaya flavonoida dianggap penting untuk mengobati
penyakit-penyakit, seperti kanker dan jantung (Heinrich et al, 2009).
Ada tiga kelompok flavonoida yang amat menarik perhatian dalam fisiologi
tumbuhan, yaitu antosianin, flavonol, dan flavon. Antosianin ( dari bahas yunani Anthos,
bunga dan kyanos, biru tua ) adalah pigmen berwarna yang umumnya terdapat dibunga
berwarna merah, ungu, dan biru. Pigmen juga terdapat di berbagai tumbuhan lain, misalnya
buah tertentu, batang, daun, dan bahkan akar. Sering flavonoida terikat di sel epidermis.
Warna sebagian besar buah dan banyak bunga adalah akibat dari antosianin, walaupun
beberapa warna tumbuhan lainnya, seperti buah tomat dan beberapa bunga kuning, karena
karotenoid. Warna cerah daun musim gugur disebabkan terutama oleh timbunan antosianin
pada hari cerah dan dingin, walaupun karotenoid kuning atau jingga merupakan pigmen
terbesar di daun musim gugur pada beberapa spesies. (salisbury, 1995).
2.2.1 Struktur Dasar Senyawa Flavonoida
Senyawa flavonoida adalah senyawa yang mengandung C15 terdiri atas dua inti
fenolat yang dihubungkan dengan tiga satuan karbon. Struktur dasar flavonoida dapat
digambarkan sebagai berikut :
A
C
C
C
B
Gambar 1. Kerangka dasar senyawa flavonoida
(Sastrohamidjojo, 1996).
Universitas Sumatera Utara
2.2.2 Klasifikasi Senyawa Flavonoida
Flavonoida mengandung sistem aromatik yang terkonjugasi sehingga menunjukkan
pita serapan kuat pada daerah spektrum sinar ultraviolet dan spektrum sinar tampak,
umumnya dalam tumbuhan terikat pada gula yang disebut dengan glikosida (Harborne,
1987).
1. Flavonoida O-glikosida
Pada flavonoida O-glikosida , satu gugus hidroksil flavonoida atau lebih terikat pada
satu gula (lebih) dengan ikatan hemiasetal yang tak tahan asam. Pengaruh glikolisasi
menyebabkan flavonoida menjadai kurang reaktif dan lebih mudah larut dalam air.
Glukosa merupakan gula yang paling umum terlibat dan gula lain yang sering juga
terdapat adalah galaktosa, ramnosa, xilosa, dan arabinosa.
2. Flavonoida C-glikosida
Gula terikat pada atom karbon flavonoida dan dalam hal ini gula tersebut terikat
langsung pada inti benzena dengan suatu ikatan karbon-karbon tahan asam. Glikosida
yang demikian disebut C-glikosida.
3. Flavonoida Sulfat
Senyawa ini mengandung satu ion sulfat atau lebih yang terikat pada hidroksi fenol
atau gula. Senyawa ini sebenarnya bisulfat karena terdapat sebagai garam, yaitu
flavon-O-SO3K. Banyak yang berupa glikosida bisulfat, bagian bisulfat terikat pada
hidroksil fenol yang mana saja masih bebas atau pada gula.
4. Biflavonoida
Biflavonoid adalah flavonoid dimer, walaupun prosianidin dimer (satuan dasarnya
katekin) biasanya tidak dimasukkan ke dalam golongan ini. Flavonoid yang biasanya
terlibat adalah flavon dan flavanon yang secara biosintesis mempunyai pola
Universitas Sumatera Utara
oksigenasi yang sederhana 5,7,4’ (kadang-kadang 5,7,3’,4’) dan ikatan antar
flavonoid berupa ikatan karbon-karbon atau ikatan eter.
5. Aglikon flavonoid yang aktif-optik
Sejumlah aglikon flavonoid mempunyai atom karbon asimetrik dan dengan demikian
menunjukkan keaktifan optik ( yaitu memutar cahaya terpolarisasi-datar ). Yang
termasuk dalam golongan flavonoida ini adalah flavanon, dihidroflavonol, katekin,
rotenoid, dan lain-lain.
Robinson (1995), mengelompokkan flavonoid beradasarkan keragaman pada rantai C3 yaitu
:
1. Flavanon
Flavanon terdapat di dalam kayu, daun dan bunga. Flavanon glikosida merupakan
konstituen utama dari tanaman genus prenus dan buah jeruk, dua glikosida yang
paling lazim adalah neringenin dan hesperitin, terdapat dalam buah anggur dan jeruk.
O
O
2. Flavon
Flavon berbeda dengan flavonol dimana pada flavon tidak terdapat gugusan 3hidroksi. Hal ini mempunyai serapan UV-nya, gerakan kromatografi, serta reaksi
warnanya. Flavon dianggap sebagai induk dalam nomenklatur kelompok senyawa
flavonoida
O
O
Universitas Sumatera Utara
3
Flavonol
Flavonol adalah turunan 3-hidroksi flavon dan dihidroflavonol.Daya serap
sinar UV pada struktur flavanol terjadi pada 352-385nm pada pita I dan 240-285 nm
pada pita II.Flavonol paling sering terdapat sebagai glikosida, biasanya 3-glikosida.
O
OH
O
4
Isoflavon
Merupakan isomer flavon, jumlahnya sangat sedikit dan sebagai fitoaleksin (senyawa
pelindung) yang terbentuk dalam tumbuhan untuk pertahanan terhadap penyakit.
Isoflavon sukar dicirikan karena reaksinya tidak khas dengan pereaksi manapun.
O
O
5
Flavanonol
Senyawa ini berkhasiat sebagai antioksidan dan hanya terdapat sedikit sekali jika
dibandingkan dengan flavonoida lain. Sebagian besar senyawa ini diabaikan karena
konsentrasinya rendah dan tidak berwarna.
O
OH
O
6
Khalkon
Universitas Sumatera Utara
Khalkon adalah pigmen fenol kuning yang berwarna coklat tua dengan sinar UV bila
dikromatografi kertas. Aglikon khalkon dapat dibedakan dari glikosidanya karena
hanya pigmen dalam bentuk glikosida yang dapat bergerak pada kromatografi kertas
dalam pengembang air.
O
7
Auron
Auron berupa pigmen kuning emas yang terdapat dalam bunga tertentu dan briofita.
Auron memiliki panjang gelombang maksimum pada band I 340-430 nm. Dalam
larutan basa senyawa ini berwarna merah ros dan tampak pada kromarografi kertas
berupa bercak kuning, dengan sinar ultraviolet karena kuning kuat berubah menjadi
merah jingga bila diberi uap amonia.
O
CH
O
8
Katekin
Katekin terdapat pada seluruh dunia tumbuhan, terutama pada tumbuhan berkayu.
Katekin dan proantosianidin adalah dua golongan senyawa yang mempunyai banyak
kesamaan dengan semua senyawa tanpa warna (Robinson, 1995).
OH
OH
HO
O
OH
OH
9
Antosianin
Universitas Sumatera Utara
Antosianin adalah pigmen pada daun, bunga dan batang tanaman yang memiliki
banyak warna biru, lembayung, violet, dan semua yang mendekati warna merah.
Antosianin terdapat juga dalam bagian lain tumbuhan tinggi kecuali fungus.
Antosianin selalu terdapat dalam bentuk glikosida. Faktor-faktor yang mempengaruhi
warna dari antosianin yaitu pH, logam dalam bentuk kompleks dan juga tanin
(Robinson, 1995).
O
OH
10 Leukoantosianidin
Merupakan monomer flavan 3,4-diol, leukoantosianidin jarang terdapat sebagai
glikosida, namun beberapa bentuk glikosida yang dikenal adalah apiferol, dan
peltoginol (Robinson, 1995).
OH
OH
O
HO
HO
OH
OH
Universitas Sumatera Utara
Menurut Harborne (1996), dikenal sekitar sepuluh kelas flavonoida dimana semua
flavonoida, menurut strukturnya, merupakan turunan senyawa induk flavon dan semuanya
mempunyai sejumlah sifat yang sama yakni :
Tabel 2.1 Sifat dari golongan-golongan flavonoida menurut Harborne
Golongan
flavonoida
Penyebaran
Ciri khas
Universitas Sumatera Utara
Antosianin
Proantosianidin
Pigmen bunga merah marak, dan
biru juga dalam daun dan jaringan
lain.
Terutama tidak berwarna, dalam
daun tumbuhan yang berkayu.
Larut dalam air, λ maks 515-545 nm,
bergerak dengan BAA pada kertas.
Menghasilkan antosianidin bila jaringan
dipanaskan dalam HCl 2M selama
setengah jam.
Flavonol
Terutama
ko-pigmen
tidak
berwarna dalam bunga sianik dan
asianik tersebar luas dalam daun.
Setelah hidrolisis, berupa bercak kuning
murup pada kromatogram Forestal bila
disinari sinar UV, maksimal spektrum
pada 330 – 350 nm.
Flavon
Seperti flavonol
Setelah hidrolisis, berupa bercak coklat
redup pada kromatogram Forestal maksimal spektrum pada 330-350 nm.
Glikoflavon
Seperti flavonol
Mengandung gula yang terikat melalui
ikatan C-C, bergerak dengan pengembang
air, tidak seperti flavon biasa.
Biflavonil
Tidak berwarna dan
seluruhnya
terbatas
gimnospermae
hampir
pada
Pada kromatogram BAA berupa bercak
redup dengan RF tinggi .
Khalkon dan
Auron
Pigmen bunga kuning, kadangkadang terdapat juga dalam
jaringan lain
Dengan amonia
berwarna merah
(perubahan warna dapat diamati in situ),
maksimal spektrum 370-410 nm.
Flavanon
Tidak berwarna, dalam daun dan
buah (terutama dalam Citrus)
Berwarna merah kuat dengan Mg/HCl,
kadang – kadang sangat pahit .
Isoflavon
Tidak berwarna, sering kali dalam
akar, hanya terdapat dalam suku
Leguminosae
Bergerak pada kertas dengan pengembang
air, tidak ada uji warna yang khas.
2.2.3 Biosintesis Flavonoid
Senyawa flavonoida adalah senyawa-senyawa polifenol yang mempunyai 15 atom
karbon, terdiri dari dua cincin benzena yang dihubungkan menjadi satu oleh rantai linear
Universitas Sumatera Utara
yang terdiri dari tiga atom karbon. Kerangka ini dapat ditullis sebagai C6-C3-C6. Jadi
senyawa flavonoida adalah senyawa 1,3 diarilpropana, senyawa isoflavonoida adalah
senyawa 1,2 diarilpropana, sedang senyawa-senyawa neoflavonoida adalah senyawa 1,1
diarilpropana.
Senyawa flavonoida diturunkan dari unit C6-C3 (fenil propana) yang bersumber dari
asam sikimat (via fenilalanin) dan unit C6 yang diturunkan dari jalur poliketida. Fragmen
poliketida ini disusun dari tiga molekul malonil-KoA yang bergabung dengan unit C6-C3
(sebagai KoA tioester) untuk membentuk unit awal triketida. Oleh karena itu, flavonoid yang
berasal dari biosintesis gabungan terdiri atas unit-unit yang diturunkan dari asam sikimat dan
jalur poliketida (Heinrich et al 2009).
Semua varian flavonoida saling berkaitan karena alur biosintesis yang sama yang
melalui alur sikimat dan alur asetat-malonat. Flavonoida yang pertama kali terbentuk pada
biosintesis adalah khalkon dan semua bentuk diturunkan darinya melalui berbagai alur.
Modifikasi flavonoida lebih lanjut mungkin terjadi pada berbagai tahap dan menghasilkan:
penambahan (atau pengurangan) hidroksilasi, metilasi gugus hidroksil atau inti flavonoida,
metilenasi gugus orto-dihidroksil, dimerisasi (pembentukan biflavonoida), dan glikosilasi
gugus hidroksil (pembentukan flavonoida O-glikosida) atau inti flavonoida (pembentukan
flavonoida C-glikosida).
Universitas Sumatera Utara
Gambar 2.1 Biosintesa hubungan antara jenis monomer flavonoida dari alur asetat-malonat
dan alur sikimat (Markham, 1988).
Universitas Sumatera Utara
2.2.4 Sifat Kelarutan Flavonoida
Senyawa flavonoid termasuk senyawa polar, karena mempunyai sejumlah gugus
hidroksil ataupun suatu gugus gula. Hal ini memungkinkan flavonoid dapat larut dalam
pelarut polar seperti etanol (EtOH), metanol (MeOH), butanol, aseton, dimetilsulfoksida
(DMSO), dimetilformamida (DMF), air dan lain-lain. Flavonoid yang berupa aglikon
merupakan golongan polifenol yang memiliki sifat senyawa fenol yaitu bersifat agak asam,
Keberadaan gugus gula yang terikat pada flavonoid (glikosida) cenderung menyebabkan
flavonoid lebih mudah terlarut dalam air. Namun hal sebaliknya tidak berlaku pada aglikon
yang kurang polar seperti isoflavon, flavanon, dan flavon serta flavonol yang termetoksilasi
cenderung lebih mudah larut dalam pelarut seperti eter dan kloroform (Markham, 1988).
2.3 Skrining Fitokimia
Banyak reagen yang dapat digunakan untuk mengetahui keberadaan dari flavonoid,
meskipun beberapa juga akan bereaksi positif dengan senyawa polifenol. Reagen yang biasa
digunakan adalah :
1. Shinoda Test, yaitu dengan menambahkan serbuk magnesium pada ekstrak sampel
dan beberapa tetes HCl pekat, warna orange, pink, merah sampai ungu akan terjadi
pada senyawa flavon, flavonol, turunan 2,3-dihidro dan xanton. Penggunaan zinc
sebagai pengganti magnesium dapat dilakukan, dimana hanya flavanonol yang
memberikan perubahan warna merah pekat sampai magenta, flavanon dan flavonol
akan memberi warna merah muda yang lemah sampai magenta (Sarker, et al 2006).
2. H2SO4(p), flavon dan flavonol akan memberikan perubahan larutan kuning pekat.
Kalkon dan auron menghasilkan larutan berwarna merah atau merah kebiru-biruan.
Flavanon memberikan warna orange (Sarker, et al 2006).
3. NaOH 10% , menghasilkan larutan biru violet
4. FeCl3 5% telah digunakan secara luas untuk mengidentifikasi senyawa fenol, tetapi
tidak dapat digunakan untuk membedakan macam-macam golongan flavonoid.
Universitas Sumatera Utara
Pereaksi ini memberi warna kehijauan, warna biru, dan warna hitam-biru (Robinson,
1995).
2.4 Teknik Pemisahan
Teknik pemisahan memiliki tujuan untuk memisahkan komponen yang akan
ditentukan berada dalam keadaan murni, tidak tercampur dengan komponen-komponen
lainnya. Ada 2 jenis teknik pemisahan:
1. Pemisahan kimia adalah suatu teknik pemisahan yang berdasarkan adanya perbedaan
yang besar dari sifat-sifat fisika komponen dalam campuran yang akan dipisahkan.
2. Pemisahan fisika adalah suatu teknik pemisahan yang didasarkan pada perbedaanperbedaan kecil dari sifat-sifat fisik antara senyawa-senyawa yang termasuk dalam
satu golongan (Muldja, 1995).
2.4.1
Ekstraksi
Terdapat sejumlah metode ekstraksi, yang paling sederhana adalah ekstraksi dingin
(dalam labu besar berisi biomassa), dengan cara ini bahan kering hasil gilingan diekstraksi
pada suhu kamar secara berturut-turut dengan pelarut yang kepolarannya makin tinggi.
Keuntungan utama cara ini adalah merupakan metode ekstraksi yang mudah karena ekstrak
tidak dipanaskan sehingga kemungkinan kecil bahan alam terurai. Penggunaan pelarut
dengan peningkatan kepolaran secara berurutan memungkinkan pemisahan bahan alam
berdasarkan kelarutannya (dan polaritasnya) dalam ektraksi. Hal ini sangat mempermudah
proses isolasi (Heinrich et al, 2009).
Beberapa metode ekstraksi dapat digunakan untuk mengekstrak suatu konstituen
dalam suatu bahan tanaman, yang diantaranya adalah maserasi, perkolasi, ekstraksi sokletasi,
ekstraksi pelarut bertekanan, ekstraksi dengan refluks, dan destilasi uap. Dalam ekstraksi
padat-cair, bahan tanaman ditempatkan dalam sebuah wadah, dan dibiarkan terjadi kontak
dengan pelarut. Proses yang terjadi dari seluruh proses dinamis tersebut dapat diuraikan
menjadi beberapa tahap, yaitu tahap pertama pelarut akan berdifusi ke dalam sel, kemudian
Universitas Sumatera Utara
pelarut akan melarutkan metabolit, dan pada proses akhir pelarut akan berdifusi keluat dari
sel bersama dengan metabolit (Sarker, 2007).
Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap
senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak pekat, biasanya pelarut
ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator (Harborne, 1996).
2.4.2
Partisi
Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak
digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak. Partisi menggunakan dua pelarut tak
bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus
menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya
meningkat.
Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap:
1. Air/petroleum eter ringan (heksana) untuk menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan
organik
2. Air/diklorometan atau air/kloroform atau air/etil asetat untuk membuat fraksi agak polar
di lapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengandalkan
kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain (Heinrich et al,
2009).
2.4.3
Hidrolisa
Prosedur yang digunakan untuk hidrolisis asam dari flavonoid glikosida adalah,
sebanyak 2 mg sampel flavonoid glikosida dicampur dengan asam klorida 6% sebanyak 5 ml
dengan jumlah metanol yang sangat sedikit pada sampel untuk membuat proses hidrolisis
menjadi sempurna. Larutan dipanaskan selama 45 menit lalu didinginkan, kemudian ekstrak
sepenuhnya dilarutkan dengan eter. Penguapan dari larutan akan mengendapkan ramnosa
dan glukosa. Lapisan eter, setelah dikeringkan dengan menggunakan natrium sulfat akan
didapatkan aglikon flavonoid setelah diuapkan (Mabry et al, 1970).
Universitas Sumatera Utara
2.4.4 Kromatografi
Kromatografi adalah berbagai cara pemisahan berdasarkan partisi cuplikan antara fase
yang bergerak, dapat berupa gas atau zat cair, dan fase diam, dapat berupa zat cair atau zat
padat. Pemisahan secara kromatografi yang berhasil baik berkaitan dengan mengkompromi
daya pisah kromatografi, beban cuplikan, dan waktu analisis (Gritter, 1991)
Pemisahan pada kromatografi planar pada umumnya dihentikan sebelum semua fase
gerak melewati seluruh permukaan fase diam. Solut pada kedua kromatografi ini
dikarakterisasi dengan jarak migrasi solut terhadap jarak ujung fase geraknya. Nilai faktor
retardasi solut (Rf) dapat dihitung dengan menggunakan perbandingan dalam persamaan:
Nilai maksimum Rf adalah 1 dan ini dicapai ketika solut mempunyai perbandingan
distribusi (D) dan faktor retensi sama dengan 0 yang berarti solut bermigrasi dengan
kecepatan yang sama dengan fase gerak. Nilai minimum Rf adalah 0 dan ini teramati jika
solut tertahan pada posisi titik awal di permukaan fase diam.
Proses sorpsi
Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fase gerak ke fase diam, sementara
itu proses sebaliknya (pemindahan solut dari fase diam ke fase gerak) disebut dengan
desorpsi. Kedua proses ini (sorpsi dan desorpsi) terjadi secara terus menerus selama
pemisahan
kromatografi
karenanya
sistem
kromatografi
berada
dalam
keadaan
kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fase yang bersesuaian dengan
perbandingan distribusinya (D) untuk menjaga keadaan kesetimbangan ini. Ada 4 jenis
Universitas Sumatera Utara
mekanisme sorpsi dasar dan umumnya 2 atau lebih mekanisme ini terlibat dalam satu jenis
kromatografi. Keempat jenis tersebut adalah adsorpsi, partisi, pertukaran ion, dan eksklusi
ukuran.
Adsorben
Silika gel merupakan jenis adsorben (fase diam) yang penggunaannya paling luas.
Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol (Si-OH). Gugus silanol
bersifat sedikit asam dan polar karenanya gugus ini mampu membentuk ikatan hidrogen
dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar.
Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan
permukaan silika gel karena air akan menutup sisi aktif silika gel. Hal seperti ini dapat
diatasi dengan memanaskan pada suhu 105 0C, meskipun demikian reproduksibilitasnya sulit
dicapai kecuali jika suhu dan kelembapan benar-benar dijaga secara hati-hati. Beberapa
adsoben yang sering digunakan adalah :
Alumina
(paling polar)
Karbon aktif (charcoal)
Silika gel
Magnesium silikat
Selulosa
Resin-resin polimerik (stiren/difenil
(paling non-polar)
benzen)
Tabel 2.2 Daftar adsorben pada kromatografi (Gandjar dkk, 2007).
2.4.4.1
Kromatografi lapis tipis
Kromatografi Lapis Tipis pada plat berlapis yang berukuran lebih besar, biasanya
5x20 cm, 10x20 cm, atau 20x20 cm. Biasanya memerlukan waktu pengembangan 30 menit
sampai satu jam. Pada hakikatnya KLT melibatkan dua fase yaitu fase diam atau sifat
lapisan, dan fase gerak atau campuran pelarut pengembang. Fase diam dapat berupa serbuk
halus yang berfungsi sebagai permukaan penyerap atau penyangga untuk lapisan zat cair.
Universitas Sumatera Utara
Fase gerak dapat berupa hampir segala macam pelarut atau campuran pelarut (Sudjadi,
1986).
Pemisahan senyawa dengan Kromatografi Lapis Tipis seperti senyawa organik alam
dan senyawa organik sintetik dapat dilakukan dalam beberapa menit dengan alat yang
harganya tidak terlalu mahal. Jumlah cuplikan beberapa mikrogram atau sebanyak 5 g dapat
ditangani. Kelebihan KLT yang lain ialah pemakaian jumlah pelarut dan jumlah cuplikan
yang sedikit. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan salah satu metode pemisahan yang
cukup sederhana yaitu dengan menggunakan plat kaca yang dilapisi silika gel dengan
menggunakan pelarut tertentu (Gritter, 1991).
Lempeng lapis penyerap sering menggunanakan indikator flueresensi sehingga bahan
alam yang mengabsobsi sinar uv gelombang pendek 245 nm akan tampak sebagai bercak
hitam pada latar hijau
2.4.4.2 Kromatografi Kolom
Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi (gravitasi)
atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran jenis tertentu
pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut. Ukuran keseluruhan kolom sungguh
beragam, tetapi biasanya panjangnya sekurang-kurangnya 10 kali garis tengah dalamnya dan
mungkin saja sampai 100 kalinya. Ukuran kolom dan banyaknya penjerap yang dipakai
ditentukan oleh bobot campuran sampel yang akan dipisahkan.
Untuk pemisahan normal, bobot sampel biasanya 30:1 ternyata memadai jika
pemisahan tidak terlalu sukar. Ukuran partikel penjerap pada kolom biasanya lebih besar
daripada untuk KLT. Walau pun banyak jenis penjerap telah dipakai untuk kolom, alumina
dan silika gel adalah penjerap yang paling berguna dan mudah didapat.
Fraksi kolom yang mengandung senyawa yang sama (diperiksa dengan KLT) atau
tampaknya berasal dari satru puncak (memakai pendeteksian sinambung) digabungkan, dan
Universitas Sumatera Utara
pelarutnya diuapkan, lebih baik dengan tekanan rendah. Jika pelarut dan penjerap murni.
Maka fraksi-fraksi pun murni (Gritter dkk, 1991).
2.4.4.3 Kromatografi lapis tipis preparatif
Sebagian besar pemakaian kromatografi lapis tipis preparatif hanya dalam jumlah
miligram. Kromatografi lapis tipis preparatif bersama-sama dengan kromatografi kolom
terbuka, dijumpai sebagian besar dalam isolasi bahan alam. Penjerap yang paling umum
digunakan adalah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun
campuran senyawa hidrofil. Ukuran partikel dan porinya kurang lebih sama dengan ukuran
tingkat KLT.
Cuplikan sebanyak 10-100 mg dapat dipisahkan pada lapisan silika gel atau
aluminium oksida 20 x 20 cm yang tebalnya 1 mm. Pengembangan plat KLTP biasanya
dilakukan dalam bejana kaca yang dapat menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap
jenuh dengan pelarut pengembang dengan bantuan sehelai kertas saring yang tercelup ke
dalam pengembang.
Kebanyakan penjerap KLTP mengandung indikator fluorosensi yang membantu
mendeteksi kedudukan pita yang terpisah sepanjang senyawa yang dipisahkan menyerap
sinar UV. Pita yang kedudukannya telah diketahui dikerok dari plat dengan spatula atau
pengerok berbentuk tabung. Senyawa harus diekstraksi dari penjerap dengan pelarut yang
paling kurang polar yang mungkin (sekitar 5 ml pelarut untuk 1 g penjerap). Harus
diperhatikan bahwa semakin lama senyawa berkontak dengan penjerap makin besar
kemungkinan penguraian (Hostettmann dkk, 1995).
2.4.5
Kristalisasi
Kristalisai adalah pengendapan kristal dari larutan yang terbuat dari bahan tertentu.
Selama proses pembentukan kristal, molekul akan cenderung menjadi melekat kristal
tumbuh terdiri dari jenis yang sama molekul karena cocok dalam kisi kristal untuk molekul
Universitas Sumatera Utara
struktur yang sama daripada molekul yang lain. Jika proses kristalisasi diperbolehkan untuk
terjadi dalam mendekati – kondisi kesetimbangan, preferensi molekul untuk deposit pada
permukaan terdiri dari molekul seperti akan menyebabkan peningkatan dalam kemurnian
bahan kristal. Sehingga proses rekristalisasi adalah salah satu metode yang paling penting
tersedia bagi ahli kimia untuk pemurnian padatan. ( Pasto, 1992 ).
2.4.6
Rekristalisasi
Amorf yang diperoleh dari hasil isolasi dilarutkan kembali dengan EtOAc, diaduk
hingga semua amorf larut sempurna. Kemudian ditambahkan n – heksana secara perlahan –
lahan hingga pembentukan kembali senyawa yang lebih murni dari sebelumnya dan jatuh di
dasar wadah. Didekantasi larutan bagian atas wadah. Lalu diuapkan sisa pelarut dari amorf
hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut (Jacobs, 1974).
2.5
Teknik Spektroskopi
Spektrofotometer merupakan alat untuk mempelajari interaksi sinar elektromagnetik
dengan materi. Gelombang elekromagnetik yang digunakan adalah sekitar 180-800nm.
Energi elektromagnetik akan diubah menjadi besaran listrik dan melalui amplifier akan
diubah menjadi besaran yang dapat diamati. Radiasi elektromagnetik adalah energi yang
digunakan untuk penyerapan dan emisi radiasi magnetik yang diteruskan melalui ruang
dengan kecepatan luar biasa. Dikenal dua kelompok utama spektroskopi, yaitu spektroskopi
atom dan spektroskopi molekul. Dasar dari spektroskopi atom adalah tingkat energi elektron
terluar suatu atom atau unsur, sedangkan dasar dari spektroskopi molekul adalah tingkat
energi molekul yang melibatkan energi elektronik, energi vibrasi, dan energi rotasi. Energi
elektronik yaitu energi yang melibatkan tingkat energi yang ditempati orbit elektron suatu
atom dari molekul- molekul. Energi vibrasi yaitu energi yang melibatkan vibrasional antar
Universitas Sumatera Utara
atom dalam molekul. Energi rotasi yaitu energi yang melibatkan rotasi dari molekul
(Bintang, 2011).
2.5.1
Spektroskopi Ultra Violet
Serapan molekul di dalam derah ultra violet dan terlihat dari spektrum bergantung
pada struktur ultra elektronik dari molekul. Penyerapan sejumlah energi, menghasilkan
percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi lebih tinggi di
dalam keadaan tereskitasi (Silverstein, 1986).
Fenol menyerap didaerah UV pendek dan dapat dideteksi pada pelat silika gel yang
mengandung indikator fluoresensi gelombang 253 nm, terlihat sebagai bercak gelap dengan
latar belakang berfluoresensi. Akan tetapi, biasanya lebih baik mendeteksinya dengan
pereaksi yang lebih khas.Semua senyawa fenol berupa senyawa aromatik sehingga
semuanya menunjukan serapan kuat didaerah spektrum UV. Selain itu secara khas senyawa
fenol menunjukan geseran batokrom pada spektrumnya bila ditambahkan basa (Markham,
1988).
2.5.2 Spektroskopi Inframerah (FT-IR)
Spektrum inframerah suatu molekul adalah hasil transisi antara tingkat energi getaran
(vibrasi) yang berlainan. Inti-inti atom yang terikat oleh ikatan kovalen mengalami getaran
(vibrasi) atau osilasi (iscillation) dengan cara serupa dengan dua bola yang terikat oleh suatu
pegas.
Bila molekul menyerap radiasi inframerah, energi yang diserap menyebabkan
kenaikan dalam amplitudo getaran atom-atom yang terikat itu. Jadi molekul ini berada dalam
keadaan vibrasi tereksitasi , energi yang diserap ini akan dibuang dalam bentuk panas bila
molekul itu kembali ke keadaan dasar. Panjang gelombang eksak dari absorpsi oleh suatu
tipe ikatan, bergantung pada macam getaran dari ikatan tersebut. Oleh karena itu, tipe ikatan
yang berlainan (C-H, C-C, C=O, C=C, O-H, dan sebagainya) menyerap radiasi inframerah
Universitas Sumatera Utara
pada panjang gelombang yang berlainan. Dengan demikian spektrometri inframerah dapat
digunakan untuk mengidentifikasi adanya gugus fungsi dalam suatu molekul. Banyaknya
energi yang diserap juga beraneka ragam dari ikatan ke ikatan. Ini disebabkan sebagian oleh
perubahan dalam momen dipol (μ≠0) pada saat energi diserap. Ikatan nonpolar (seperti C -H
atau C-C) menyebabkan absorpsi lemah, sedangkan ikatan polar (seperti misalnya O-H, NH, dan C=O) menunjukkan absorpsi yang lebih kuat.
Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul.
Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul:
1. Streching (vibrasi regang/ulur): vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan
atau pemendekan ikatan.
2.
Bending (vibrasi lentur/tekuk): vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga
terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan.
Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang
gelombang. Contohnya, ikatan O-H menyerap energi pada frekuensi 3330 cm-1, energi pada
panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang ikatan O-H itu. Suatu ikatan
O-H itu juga menyerap pada kira-kira 1250 cm-1, energi pada panjang gelombang ini
menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi yang berlain-lainan ini disebut cara
vibrasi fundamental (Supratman, 2010).
2.5.2
Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)
Setelah spektroskopi inframerah, spektroskopi resonansi magnetik inti (NMR) adalah
yang metode yang paling penting digunakan dalam kimia organik. Dalam spektroskopi
inframerah mengandung infromasi mengenai adanya gugus fungsi pada molekul, sedangkan
spektroskopi NMR memberikan informasi mengenai jumlah dari masing-masing hidrogen.
Universitas Sumatera Utara
Kemampuan terhebat resonansi inti magnetik timbul karena tidak semua proton
dalam molekul memiliki resonansi yang identik pada frekuensi yang sama. Hal ini sesuai
dengan fakta bahwa berbagai macam proton dalam molekul dikelilingi oleh elektron dan
memiliki sedikit perbedaan dalam lingkungan elektronik dari satu dan yang lainnya. Proton
akan terlindungi oleh elektron yang mengelilingi mereka. Dalam daerah magnetik, peredaran
elektron valensi dari daerah penghasil proton yang bertentangan dengan daerah magnetik
yang berlaku. Pergeseran kimia dalam unit δ ditunjukkan dalam jumlah resonansi proton
yang bergeser dari TMS dalam bagian per juta (ppm) dari frekuensi dasar spektroskopi.
Unsur dasar dari spektrometer NMR adalah ilustrasi skematis. Sampel dilarutkan
dalam pelarut yang tidak memiliki proton (biasanya CCl4) dan dalam jumlah yang kecil dari
TMS yang ditambahkan sebagai pusat referensi internal.
Semua proton dalam molekul yang identik dalam lingkungan kimia akan memiliki
pergerseran kimia yang sama. Dengan demikian, semua proton dari TMS atau semua proton
dalam benzen , siklopentana, atau aseton memiliki nilai resonansi yang berdekatan pada nilai
δ. Masing-masing komponen akan memiliki penyerapan yang tunggal dalam spektrum nmr.
Proton ini dikatakan sama secara kimia. Pada kenyataannya, spektrum tidak dapat hanya
dibedakan dari berapa banyak tipe proton yang berbeda pada molekul tersebut, tetapi dapat
memperlihatkan berapa banyak jenis perbedaan yang ada dalam molekul tersebut. Dalam
spektrum NMR, daerah dibawah masing-masing peak adalah proporsional dengan jumlah
dari hidrogen yang ada pada peak tersebut (Pavia, 1979).
Universitas Sumatera Utara