Kenansa ANS 22010112130148 Lap.KTI Bab7
DAFTAR PUSTAKA
1. Abbas K A, Lichtmant A H. Basic Immunology Fourth Edition.
Philadelphia: Elsevier; 2012. h.15-20.
2. Kresno S B. Imunologi Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta:
Badan Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2010.
3. Baratawidjaya K G. Imunologi Dasar Edisi ke-10. Jakarta: Badan Penerbit
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2012.
4. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
h.114-18.
5. Dharmana
Edi,
Neni
Susilaningsih,
Noor Wijayahadi.
Pengaruh
Pemberian Tolak Angin Anak Terhadap Proliferasi Limfosit, produksi
Interferon, Fungsi Fagositosis Makrofag Dan Produksi ROI. Semarang:
Universitas Diponegoro dan PT Sido Muncul; 2009.
6. Hariwangsa N T. Pengaruh Pemberian Tolak Angin Anak Cair Terhadap
Kadar Interferon Gamma (IFN-γ) Pada Mencit Swiss. Semarang:
Universitas Diponegoro; 2010.
7. Wahab A S, Madarina Julia. Sistem Imun, Imunisasi, dan Penyakit Imun.
Jakarta: Penerbit Widya Medika; 2002. h.13
8. Abbas K A, Lichtmant A H, Pillai S. Cellular and Molecular Immunologi.
Seventh ed. Philadelphia : W B Saunders Company; 2012.
9. Peakman Mark, Vergani Diego. Basic and Clinical Immunology Second
Edition. USA: Elsevier; 2009. h.77-81.
10. Baratawidjaja K G, Iris Rengganis. Alergi Dasar Edisi ke-1. Jakarta:
Interna Publishing; 2009.
48
49
11. Paul, William. Fundamental Immunology SSeventh Edition. Philadelphia:
Lippincott Williams and Wilkins; 2013. 602-04.
12. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
208-09.
13. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
216.
14. Tolak Angin-Tolak Angin Anak. Obat Herbal Terstandard Tolak Angin.
[Internet].
[cited
2016
Jan
21].
Available
from:
http://xa.yimg.com/kq/groups/78262509/931225350/name/TA-TAASARI.pdf
15. Kohei Kamiya, Toshiko Satake. Chemical constituents of Baeckea
frutescens leaves inhibit copper-induced low-density lipoprotein oxidation.
Fitoterapia [Internet]. 2009. [cited 2015 Nov 12]. Available from:
sciencedirect.com
16. Sunarti, Siti. Jungrahab (Baeckea frustescens L.). Satu-satunya Tumbuhan
Obat dari Marga Baeckea di Indonesia dan Koleksinya di Herbarium
Bogoriense; 2011.
17. Kamiya, Kohei. Chemical Constituents of Baeckea frustescens Leaves
Inhibit Copper-induced low-density Lipoprotein Oxidation [Internet].
2009.
[cited
2015
Nov
14].
8(10):
185-189.
Available
from:
www.elsevier.com/locate/foodchem
18. Jia, Bei-Xi. Baeckeins F-I, Four Novel C-methylated Biflavonoids from
the Roots of Baeckea frutescens and Their Anti-inflamatory Activities
[Internet]. 2014. [cited 2015 Nov 14]. 155(14): 31-37. Available from:
www.ellsevier.com/locate/foodchem
19. Dai, Do N. Chemical Composition of Essential Oil of Baeckea frutuescens
L. [Internet]. 2015. [cited 2015 Nov 14]. 8(1): 26-32. Available from:
www.sciencedomain.org
50
20. Baliga, M. S. Radioprotective potential of mint: A brief review. J Cancer
Res Ther [Internet]. 2010. [cited 2015 Nov 12]. 6(3): pp 255-62.
21. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia. Farmakologi dan Terapeutik. Edisi 5. Jakarta: Balai Penerbit.
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2010.
51
Lampiran 1.
PROSEDUR ISOLASI MAKROFAG PERITONEAL MENCIT
(dikutip dari Lewis JG, 1995)
Untuk mendapatkan 1-3 x 106 sel/ml
Alat :
1. Gunting dan pinset
2. Semprit 10 ml steril dengan jarum ukuran 18 atau 20 gauge
3. Tabung sentrifus 50 ml steril
4. Pipet Pasteur steril
5. Tabung berlapis silikon
6. Hemacytometer
7. Laminar flow hood
8. Refrigerated centrifuge
Bahan / reagen :
1. Sodium pentobarbitol, 50 mg/ml
2. Ethanol, 70% (v/v)
3. Free Hank’s balanced salt solution (CMF-HBSS), mengandung Ca2+ dan
Mg2+ (GIBCO)
4. Asam acetat 3 % (v/v) + crystal violet 1 mg/100 ml
5. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (GIBCO)
52
6. Fetal Bovine Serum, FBS
7. Glutamin (GIBCO)
8. Penicillin-Streptomycin (GIBCO)
Prosedur :
1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher atau inhalasi dengan sodium
pentobarbitol atau CO2, dibaringkan telentang dan seluruh permukaan
ventral disiram ethanol 70%
2. Buat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen.
Robek kulit menggunakan 2 pinset kearah kepala dan ekor mencit, sehingga
kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Basahi peritoneum dengan ethanol
70% untuk menyingkirkan bulu- bulu yang rontok
3. Injeksikan 2-3 ml CMF-HBSS dalam rongga peritoneum menggunakan
semprit 10ml dengan jarum no. 18 atau 20 (lebih baik pakai no 26). Injeksi
dilakukan di bagian perut bawah dimana lemak berada di sekitar kandung
kemih. Lokasi ini dipilih karena setelah penyuntikan jarum akan ditarik dan
abdomen/peritoneum dipijat, lemak akan melekat pada lubang jarum
sehingga cairan tidak keluar selama pemijatan. Peritoneum dipijat pelan
kemudian disemprot lagi dengan ethanol 70%
4. Injeksikan 7-8 ml HBSS. Sedot kembali cairan dalam rongga peritoneum
sampai habis (dengan jarum 18/ 20 ujung jarum menghadap ke atas/ventral),
bila masih ada sisa cairan dihisap menggunakan pipet Pasteur steril.
Masukkan cairan ke dalam tabung sentrifuse steril
5. Cairan disentrifus 800 xg pada suhu 20o C selama 5 menit. Bila cairan
terkontaminasi darah, maka cuci sel- sel tersebut 2 kali menggunakan CMFHBSS
53
6. Tambahkan medium komplit yang terdiri dari RPMI 1640 mengandung
penicillin (50 U/ml), streptomycin (50μg/ml), glutamine (20mM) dan 10%
FBS
7. Setelah itu cairan peritonium diambil sebagian dimasukkan ke dalam
tolliven blue. Hitung sel- sel dengan Hemacytometer setelah dilarutkan
dalam 3% asam acetat untuk melisiskan sel darah merah
8. Kultur sel dalam medium komplit dengan kepadatan 5 x 105 sel/ml selama 2
jam dalam CO2 inkubator pada suhu 37o C
9. Cuci sel- sel tersebut dengan HBSS sebanyak 3 kali, kemudian tambahkan 1
ml medium komplit untuk selanjutnya dikultur dalam CO2 inkubator pada
suhu 37o C selama 24 jam
Modifikasi dari Lewis JG. Isolation of Alveolar Macrophages, Peritoneal
Macrophages, and Kupffer cells. In : Methods in Immunotoxicology vol 2, editor
: Burleson GR, Dean JH, Munson AE. New York: A John Wilye Liss & sons Inc
Publ, 1995;15-26
54
Lampiran 2. Prosedur Isolasi Splenosit
PROSEDUR ISOLASI SPLENOSIT
(Metode Mishell (1980) dan Ding (1994)
Untuk mendapatkan 5 x 107 – 2 x 108 sel/ mencit
Alat :
1. Pemanas alkohol
2. Beaker glass volume 50 – 75 ml
3. Gunting
4. Pinset
5. Petri dishes plastik
6. Refrigerated centrifuge
7. Pipet Pasteur
8. Laminar flow hood
9. Spuit disposable 5 cc
Bahan :
1. Sodium pentobarbitol, 50 mg/ml
2. Ethanol, 70% (v/v)
3. Free Hank’s balanced salt solution (CMF-HBSS), mengandung Ca2+ dan
Mg2+ (GIBCO)
4. Lysing buffer (NH4Cl 0,17 M)
5. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (GIBCO)
55
6. Fetal Bovine Serum, FBS
7. Glutamin (GIBCO)
8. Penicillin-Streptomycin (GIBCO)
Prosedur :
1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher atau inhalasi dengan sodium
pentobarbital, dibaringkan telentang dan seluruh permukaan ventral
disiram ethanol 70%.
2. Buat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen.
Robek kulit menggunakan 2 pinset kearah kepala dan ekor mencit,
sehingga kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Basahi peritoneum
dengan ethanol 70% untuk menyingkirkan bulu- bulu yang rontok.
3. Rendam gunting dan pinset dalam ethanol 95%. Gunting peritoneum
dengan irisan berbentuk huruf U mengelilingi limpa. Peritoneum dilipat ke
atas, angkat limpa dengan menggunakan pinset. Pisahkan limpa dari
pembuluh darah dan jaringan sekitarnya menggunakan gunting. Letakkan
limpa pada petri dish berisi 1,5 ml HBSS.
4. Semprotkan media menggunakan spuit ke dalam limpa sampai semua sel
keluar.
5. Dengan menggunakan pipet Pasteur, pindahkan suspense sel tabung
pemusing. Biarkan sel- sel yang menggumpal mengendap selama 5 atau 6
menit.
56
6. Pindahkan suspense sel ke tabung yang lain dan pusingkan sel pada
kecepatan 200 xg selama 10 menit pada suhu 4oC. Pellet yang didapat
diresuspensikan dalam 2 ml lysing buffer pada suhu ruang (25oC) dikocokkocok untuk melisiskan eritrosit, lalu pusingkan pada kecepatan 200 xg
selama 10 menit pada suhu 4oC.
7. Buang supernatant dan pellet dicuci 2x dengan RPMI dengan cara dipipet
berulang- ulang dan dipusingkan pada kecepatan 200 xg selama 10 menit
pada suhu 4oC.
8. Hitung sel- sel menggunakan hematocytometer.
9. Untuk keperluan pemeriksaan sitokin (mis : IFN–γ), kultur sel dengan
kepadatan 3 x 106 sel/ml dalam medium komplit yang terdiri dari RPMI
1640 mengandung penisilin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml),
glutamine (1 mM) dan 10 % FBS selama 72 jam dalam CO2 inkubator
pada suhu 37oC.
57
Lampiran 4. Prosedur Pemeriksaan TNF-
PROSEDUR PEMERIKSAAN TNF-
Reagen (kit) yang tersedia :
1. Microwell plate berlapis Ab monoklonal spesifik terhadap TNF- mencit
2. Biotin-Conjugate
3. Streptavidin-HRP
4. Mouse TNF- standard lyophilized
5. Calibrator diluent
6. Sample diluent
7. Assay buffer
8. Wash buffer
9. Substrate Solution
10. Stop Solution
11. Adhesive films
Alat dan bahan tambahan yang dibutuhkan :
1. Micropipet
2. Distilled water
3. ELISA reader
4. Tube eppendorf
Persipan reagen :
1. Pembuatan standard dilution :
58
-
Siapkan tube 7 buah (S1-S7).
-
Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam masing-masing tube.
-
Tambahkan 100 μl mouse TNF- standard ke dalam tube S1.
-
Lakukan pengenceran bertingkat.
2. Pengenceran wash buffer : 50 ml wash buffer diencerkan dalam 950 ml
distilled water.
3. Pengenceran Assay buffer : 5 ml assay buffer diencerkan dalam 95 ml
distilled water.
4. Pengenceran Biotin-conjugate : 0,06 ml biotin-conjugate diencerkan dalam
5,94 ml assay buffer.
5. Pengenceran Streptavidin-HRP : 0,06 ml Streptavidin-HRP dalam 5,94 ml
Assay buffer.
Persiapan sampel :
Sampel berupa supernatant yang berasal dari kultur splenosit selama 72 jam.
Prosedur pemeriksaan :
1. Tentukan jumlah microwell strips yang dibutuhkan.
2. Cuci microwell strips 2 kali dengan wash buffer.
3. Tambahkan 100 μl standard dilution ke dalam standard well.
4. Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam blank well.
5. Tambahkan 50 μl sample diluent ke dalam sample well.
6. Tambahkan 50 μl sample A, B, C ke dalam sample well.
7. Siapkan biotin-conjugate.
59
8. Tambahkan 50 μl biotin-conjugate ke semua well.
9. Tutup microwell strips dan inkubasi 2 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
10. Siapkan Streptavidin-HRP.
11. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
12. Tambahkan 100 μl streptavidin-HRP ke semua well.
13. Tutup microwell strips dan inkubasi 1 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
14. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
15. Tambahkan 100 μl substrate solution ke semua well.
16. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan (18-25o C).
17. Tambahkan 100 μl stop solution ke semua well.
18. Baca dengan ELISA reader pada 450 nm.
60
Lampiran 4. Prosedur Pemeriksaan IFN-γ
PROSEDUR PEMERIKSAAN IFN-γ
Reagen (kit) yang tersedia :
12. Microwell plate berlapis Ab monoklonal spesifik terhadap IFN- γ mencit
13. Biotin-Conjugate
14. Streptavidin-HRP
15. Mouse IFN- γ standard lyophilized
16. Sample diluent
17. Assay buffer
18. Wash buffer
19. Substrate Solution
20. Stop Solution
21. Pewarna (blue-dye, green-dye, red-dye)
22. Adhesive films
Alat dan bahan tambahan yang dibutuhkan :
5. Micropipet
6. Distilled water
7. ELISA reader
8. Tube eppendorf
Persipan reagen :
6. Pembuatan standard dilution :
61
-
Siapkan tube 7 buah (S1-S7).
-
Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam masing-masing tube.
-
Tambahkan 100 μl mouse IFN- γ standard ke dalam tube S1.
-
Lakukan pengenceran bertingkat.
7. Pengenceran wash buffer : 50 ml wash buffer diencerkan dalam 950 ml
distilled water.
8. Pengenceran Assay buffer : 5 ml assay buffer diencerkan dalam 95 ml
distilled water.
9. Pengenceran Biotin-conjugate : 0,06 ml biotin-conjugate diencerkan dalam
5,94 ml assay buffer.
10. Pengenceran Streptavidin-HRP : 0,06 ml Streptavidin-HRP dalam 5,94 ml
Assay buffer.
Persiapan sampel :
Sampel berupa supernatant yang berasal dari kultur splenosit selama 72 jam.
Prosedur pemeriksaan :
19. Tentukan jumlah microwell strips yang dibutuhkan.
20. Cuci microwell strips 2 kali dengan wash buffer.
21. Tambahkan 100 μl standard dilution ke dalam standard well.
22. Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam blank well.
23. Tambahkan 50 μl sample diluent ke dalam sample well.
24. Tambahkan 50 μl sample A, B, C ke dalam sample well.
25. Siapkan biotin-conjugate.
62
26. Tambahkan 50 μl biotin-conjugate ke semua well.
27. Tutup microwell strips dan inkubasi 2 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
28. Siapkan Streptavidin-HRP.
29. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
30. Tambahkan 100 μl streptavidin-HRP ke semua well.
31. Tutup microwell strips dan inkubasi 1 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
32. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
33. Tambahkan 100 μl substrate solution ke semua well.
34. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan (18-25o C).
35. Tambahkan 100 μl stop solution ke semua well.
36. Baca dengan ELISA reader pada 450 nm.
63
64
HASIL OUTPUT ANALISIS DATA
Explore
IFN-
Kelompok
Case Summaries
IFN-gamma
Kelompok
P1
P2
P3
Total
N
6
6
6
18
Mean
368.9276
214.3011
46.9091
210.0460
Std. Deviation
399.11185
141.75122
53.66405
268.17118
Median
202.6730
196.2375
25.2300
95.0863
Tests of Normality
IFN-gamm a
Kelompok
P1
P2
P3
Statistic
.845
.912
.781
a. Lilliefors Significance Correction
Shapiro-Wilk
df
6
6
6
Sig.
.144
.450
.040
Minimum
7.46
52.10
8.14
7.46
Maximum
948.92
389.74
148.51
948.92
65
IFN-gamma
Tests of Normality
Log10IFN_gamma
Kelompok
P1
P2
P3
Statistic
.923
.925
.958
Shapiro-Wilk
df
6
6
6
a. Lilliefors Significance Correction
Test of Homogeneity of Variances
IFN-gamma
Levene
Statistic
12.074
df1
df2
2
15
Sig.
.001
Test of Homogeneity of Variances
Log10IFN_gamma
Levene
Statistic
1.781
df1
df2
2
15
Sig.
.202
Sig.
.528
.541
.807
66
Oneway
ANOVA
Log10IFN_gamma
Sum of
Squares
2.294
4.813
7.108
Between Groups
Within Groups
Total
df
2
15
17
Mean Square
1.147
.321
F
3.575
Sig.
.054
Explore
TNF-
Kelompok
Case Summaries
TNF-alfa
Kelompok
P1
P2
P3
Total
N
5
5
5
15
Mean
17.2586
258.9940
1828.8900
701.7142
Std. Deviation
11.37048
90.72331
213.13784
840.50073
Median
16.3340
230.1100
1864.2000
230.1100
Tests of Normality
TNF-alfa
Kelompok
P1
P2
P3
Statistic
.915
.766
.825
a. Lilliefors Significance Correction
Shapiro-Wilk
df
5
5
5
Sig.
.501
.041
.127
Minimum
.62
186.65
1467.00
.62
Maximum
28.33
417.01
2007.60
2007.60
67
TNF-alfa
Tests of Normality
Log10TNF_alfa
Kelompok
P1
P2
P3
Statistic
.722
.838
.798
Shapiro-Wilk
df
5
5
5
a. Lilliefors Significance Correction
Test of Homogeneity of Variances
TNF-alfa
Levene
Statistic
3.133
df1
df2
2
12
Sig.
.080
Sig.
.016
.160
.078
68
NPar Tests
Kruskal-Wallis Test
Ranks
TNF-alfa
Kelompok
P1
P2
P3
Total
N
5
5
5
15
Test Statisticsa,b
Chi-Square
df
Asymp. Sig.
TNF-alfa
12.500
2
.002
a. Kruskal Wallis Test
b. Grouping Variable: Kelompok
Mean Rank
3.00
8.00
13.00
69
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
TNF-alfa
Kelompok
P1
P2
Total
N
5
5
10
Mean Rank
3.00
8.00
Sum of Ranks
15.00
40.00
Mean Rank
3.00
8.00
Sum of Ranks
15.00
40.00
Test Statisticsb
Mann-Whitney U
Wilcoxon W
Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
Exact Sig. [2*(1-tailed
Sig.)]
TNF-alfa
.000
15.000
-2.611
.009
a
.008
a. Not corrected for ties.
b. Grouping Variable: Kelompok
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
TNF-alfa
Kelompok
P1
P3
Total
N
5
5
10
70
Test Statisticsb
Mann-Whitney U
Wilcoxon W
Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
Exact Sig. [2*(1-tailed
Sig.)]
TNF-alfa
.000
15.000
-2.611
.009
a
.008
a. Not corrected for ties.
b. Grouping Variable: Kelompok
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
TNF-alfa
Kelompok
P2
P3
Total
N
5
5
10
Test Statisticsb
Mann-Whitney U
Wilcoxon W
Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
Exact Sig. [2*(1-tailed
Sig.)]
TNF-alfa
.000
15.000
-2.611
.009
a
.008
a. Not corrected for ties.
b. Grouping Variable: Kelompok
Mean Rank
3.00
8.00
Sum of Ranks
15.00
40.00
71
Foto Hasil Penelitian
72
73
Foto Kegiatan Penelitian
74
1. Abbas K A, Lichtmant A H. Basic Immunology Fourth Edition.
Philadelphia: Elsevier; 2012. h.15-20.
2. Kresno S B. Imunologi Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta:
Badan Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2010.
3. Baratawidjaya K G. Imunologi Dasar Edisi ke-10. Jakarta: Badan Penerbit
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2012.
4. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
h.114-18.
5. Dharmana
Edi,
Neni
Susilaningsih,
Noor Wijayahadi.
Pengaruh
Pemberian Tolak Angin Anak Terhadap Proliferasi Limfosit, produksi
Interferon, Fungsi Fagositosis Makrofag Dan Produksi ROI. Semarang:
Universitas Diponegoro dan PT Sido Muncul; 2009.
6. Hariwangsa N T. Pengaruh Pemberian Tolak Angin Anak Cair Terhadap
Kadar Interferon Gamma (IFN-γ) Pada Mencit Swiss. Semarang:
Universitas Diponegoro; 2010.
7. Wahab A S, Madarina Julia. Sistem Imun, Imunisasi, dan Penyakit Imun.
Jakarta: Penerbit Widya Medika; 2002. h.13
8. Abbas K A, Lichtmant A H, Pillai S. Cellular and Molecular Immunologi.
Seventh ed. Philadelphia : W B Saunders Company; 2012.
9. Peakman Mark, Vergani Diego. Basic and Clinical Immunology Second
Edition. USA: Elsevier; 2009. h.77-81.
10. Baratawidjaja K G, Iris Rengganis. Alergi Dasar Edisi ke-1. Jakarta:
Interna Publishing; 2009.
48
49
11. Paul, William. Fundamental Immunology SSeventh Edition. Philadelphia:
Lippincott Williams and Wilkins; 2013. 602-04.
12. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
208-09.
13. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
216.
14. Tolak Angin-Tolak Angin Anak. Obat Herbal Terstandard Tolak Angin.
[Internet].
[cited
2016
Jan
21].
Available
from:
http://xa.yimg.com/kq/groups/78262509/931225350/name/TA-TAASARI.pdf
15. Kohei Kamiya, Toshiko Satake. Chemical constituents of Baeckea
frutescens leaves inhibit copper-induced low-density lipoprotein oxidation.
Fitoterapia [Internet]. 2009. [cited 2015 Nov 12]. Available from:
sciencedirect.com
16. Sunarti, Siti. Jungrahab (Baeckea frustescens L.). Satu-satunya Tumbuhan
Obat dari Marga Baeckea di Indonesia dan Koleksinya di Herbarium
Bogoriense; 2011.
17. Kamiya, Kohei. Chemical Constituents of Baeckea frustescens Leaves
Inhibit Copper-induced low-density Lipoprotein Oxidation [Internet].
2009.
[cited
2015
Nov
14].
8(10):
185-189.
Available
from:
www.elsevier.com/locate/foodchem
18. Jia, Bei-Xi. Baeckeins F-I, Four Novel C-methylated Biflavonoids from
the Roots of Baeckea frutescens and Their Anti-inflamatory Activities
[Internet]. 2014. [cited 2015 Nov 14]. 155(14): 31-37. Available from:
www.ellsevier.com/locate/foodchem
19. Dai, Do N. Chemical Composition of Essential Oil of Baeckea frutuescens
L. [Internet]. 2015. [cited 2015 Nov 14]. 8(1): 26-32. Available from:
www.sciencedomain.org
50
20. Baliga, M. S. Radioprotective potential of mint: A brief review. J Cancer
Res Ther [Internet]. 2010. [cited 2015 Nov 12]. 6(3): pp 255-62.
21. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia. Farmakologi dan Terapeutik. Edisi 5. Jakarta: Balai Penerbit.
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2010.
51
Lampiran 1.
PROSEDUR ISOLASI MAKROFAG PERITONEAL MENCIT
(dikutip dari Lewis JG, 1995)
Untuk mendapatkan 1-3 x 106 sel/ml
Alat :
1. Gunting dan pinset
2. Semprit 10 ml steril dengan jarum ukuran 18 atau 20 gauge
3. Tabung sentrifus 50 ml steril
4. Pipet Pasteur steril
5. Tabung berlapis silikon
6. Hemacytometer
7. Laminar flow hood
8. Refrigerated centrifuge
Bahan / reagen :
1. Sodium pentobarbitol, 50 mg/ml
2. Ethanol, 70% (v/v)
3. Free Hank’s balanced salt solution (CMF-HBSS), mengandung Ca2+ dan
Mg2+ (GIBCO)
4. Asam acetat 3 % (v/v) + crystal violet 1 mg/100 ml
5. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (GIBCO)
52
6. Fetal Bovine Serum, FBS
7. Glutamin (GIBCO)
8. Penicillin-Streptomycin (GIBCO)
Prosedur :
1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher atau inhalasi dengan sodium
pentobarbitol atau CO2, dibaringkan telentang dan seluruh permukaan
ventral disiram ethanol 70%
2. Buat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen.
Robek kulit menggunakan 2 pinset kearah kepala dan ekor mencit, sehingga
kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Basahi peritoneum dengan ethanol
70% untuk menyingkirkan bulu- bulu yang rontok
3. Injeksikan 2-3 ml CMF-HBSS dalam rongga peritoneum menggunakan
semprit 10ml dengan jarum no. 18 atau 20 (lebih baik pakai no 26). Injeksi
dilakukan di bagian perut bawah dimana lemak berada di sekitar kandung
kemih. Lokasi ini dipilih karena setelah penyuntikan jarum akan ditarik dan
abdomen/peritoneum dipijat, lemak akan melekat pada lubang jarum
sehingga cairan tidak keluar selama pemijatan. Peritoneum dipijat pelan
kemudian disemprot lagi dengan ethanol 70%
4. Injeksikan 7-8 ml HBSS. Sedot kembali cairan dalam rongga peritoneum
sampai habis (dengan jarum 18/ 20 ujung jarum menghadap ke atas/ventral),
bila masih ada sisa cairan dihisap menggunakan pipet Pasteur steril.
Masukkan cairan ke dalam tabung sentrifuse steril
5. Cairan disentrifus 800 xg pada suhu 20o C selama 5 menit. Bila cairan
terkontaminasi darah, maka cuci sel- sel tersebut 2 kali menggunakan CMFHBSS
53
6. Tambahkan medium komplit yang terdiri dari RPMI 1640 mengandung
penicillin (50 U/ml), streptomycin (50μg/ml), glutamine (20mM) dan 10%
FBS
7. Setelah itu cairan peritonium diambil sebagian dimasukkan ke dalam
tolliven blue. Hitung sel- sel dengan Hemacytometer setelah dilarutkan
dalam 3% asam acetat untuk melisiskan sel darah merah
8. Kultur sel dalam medium komplit dengan kepadatan 5 x 105 sel/ml selama 2
jam dalam CO2 inkubator pada suhu 37o C
9. Cuci sel- sel tersebut dengan HBSS sebanyak 3 kali, kemudian tambahkan 1
ml medium komplit untuk selanjutnya dikultur dalam CO2 inkubator pada
suhu 37o C selama 24 jam
Modifikasi dari Lewis JG. Isolation of Alveolar Macrophages, Peritoneal
Macrophages, and Kupffer cells. In : Methods in Immunotoxicology vol 2, editor
: Burleson GR, Dean JH, Munson AE. New York: A John Wilye Liss & sons Inc
Publ, 1995;15-26
54
Lampiran 2. Prosedur Isolasi Splenosit
PROSEDUR ISOLASI SPLENOSIT
(Metode Mishell (1980) dan Ding (1994)
Untuk mendapatkan 5 x 107 – 2 x 108 sel/ mencit
Alat :
1. Pemanas alkohol
2. Beaker glass volume 50 – 75 ml
3. Gunting
4. Pinset
5. Petri dishes plastik
6. Refrigerated centrifuge
7. Pipet Pasteur
8. Laminar flow hood
9. Spuit disposable 5 cc
Bahan :
1. Sodium pentobarbitol, 50 mg/ml
2. Ethanol, 70% (v/v)
3. Free Hank’s balanced salt solution (CMF-HBSS), mengandung Ca2+ dan
Mg2+ (GIBCO)
4. Lysing buffer (NH4Cl 0,17 M)
5. Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 (GIBCO)
55
6. Fetal Bovine Serum, FBS
7. Glutamin (GIBCO)
8. Penicillin-Streptomycin (GIBCO)
Prosedur :
1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher atau inhalasi dengan sodium
pentobarbital, dibaringkan telentang dan seluruh permukaan ventral
disiram ethanol 70%.
2. Buat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen.
Robek kulit menggunakan 2 pinset kearah kepala dan ekor mencit,
sehingga kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Basahi peritoneum
dengan ethanol 70% untuk menyingkirkan bulu- bulu yang rontok.
3. Rendam gunting dan pinset dalam ethanol 95%. Gunting peritoneum
dengan irisan berbentuk huruf U mengelilingi limpa. Peritoneum dilipat ke
atas, angkat limpa dengan menggunakan pinset. Pisahkan limpa dari
pembuluh darah dan jaringan sekitarnya menggunakan gunting. Letakkan
limpa pada petri dish berisi 1,5 ml HBSS.
4. Semprotkan media menggunakan spuit ke dalam limpa sampai semua sel
keluar.
5. Dengan menggunakan pipet Pasteur, pindahkan suspense sel tabung
pemusing. Biarkan sel- sel yang menggumpal mengendap selama 5 atau 6
menit.
56
6. Pindahkan suspense sel ke tabung yang lain dan pusingkan sel pada
kecepatan 200 xg selama 10 menit pada suhu 4oC. Pellet yang didapat
diresuspensikan dalam 2 ml lysing buffer pada suhu ruang (25oC) dikocokkocok untuk melisiskan eritrosit, lalu pusingkan pada kecepatan 200 xg
selama 10 menit pada suhu 4oC.
7. Buang supernatant dan pellet dicuci 2x dengan RPMI dengan cara dipipet
berulang- ulang dan dipusingkan pada kecepatan 200 xg selama 10 menit
pada suhu 4oC.
8. Hitung sel- sel menggunakan hematocytometer.
9. Untuk keperluan pemeriksaan sitokin (mis : IFN–γ), kultur sel dengan
kepadatan 3 x 106 sel/ml dalam medium komplit yang terdiri dari RPMI
1640 mengandung penisilin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml),
glutamine (1 mM) dan 10 % FBS selama 72 jam dalam CO2 inkubator
pada suhu 37oC.
57
Lampiran 4. Prosedur Pemeriksaan TNF-
PROSEDUR PEMERIKSAAN TNF-
Reagen (kit) yang tersedia :
1. Microwell plate berlapis Ab monoklonal spesifik terhadap TNF- mencit
2. Biotin-Conjugate
3. Streptavidin-HRP
4. Mouse TNF- standard lyophilized
5. Calibrator diluent
6. Sample diluent
7. Assay buffer
8. Wash buffer
9. Substrate Solution
10. Stop Solution
11. Adhesive films
Alat dan bahan tambahan yang dibutuhkan :
1. Micropipet
2. Distilled water
3. ELISA reader
4. Tube eppendorf
Persipan reagen :
1. Pembuatan standard dilution :
58
-
Siapkan tube 7 buah (S1-S7).
-
Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam masing-masing tube.
-
Tambahkan 100 μl mouse TNF- standard ke dalam tube S1.
-
Lakukan pengenceran bertingkat.
2. Pengenceran wash buffer : 50 ml wash buffer diencerkan dalam 950 ml
distilled water.
3. Pengenceran Assay buffer : 5 ml assay buffer diencerkan dalam 95 ml
distilled water.
4. Pengenceran Biotin-conjugate : 0,06 ml biotin-conjugate diencerkan dalam
5,94 ml assay buffer.
5. Pengenceran Streptavidin-HRP : 0,06 ml Streptavidin-HRP dalam 5,94 ml
Assay buffer.
Persiapan sampel :
Sampel berupa supernatant yang berasal dari kultur splenosit selama 72 jam.
Prosedur pemeriksaan :
1. Tentukan jumlah microwell strips yang dibutuhkan.
2. Cuci microwell strips 2 kali dengan wash buffer.
3. Tambahkan 100 μl standard dilution ke dalam standard well.
4. Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam blank well.
5. Tambahkan 50 μl sample diluent ke dalam sample well.
6. Tambahkan 50 μl sample A, B, C ke dalam sample well.
7. Siapkan biotin-conjugate.
59
8. Tambahkan 50 μl biotin-conjugate ke semua well.
9. Tutup microwell strips dan inkubasi 2 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
10. Siapkan Streptavidin-HRP.
11. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
12. Tambahkan 100 μl streptavidin-HRP ke semua well.
13. Tutup microwell strips dan inkubasi 1 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
14. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
15. Tambahkan 100 μl substrate solution ke semua well.
16. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan (18-25o C).
17. Tambahkan 100 μl stop solution ke semua well.
18. Baca dengan ELISA reader pada 450 nm.
60
Lampiran 4. Prosedur Pemeriksaan IFN-γ
PROSEDUR PEMERIKSAAN IFN-γ
Reagen (kit) yang tersedia :
12. Microwell plate berlapis Ab monoklonal spesifik terhadap IFN- γ mencit
13. Biotin-Conjugate
14. Streptavidin-HRP
15. Mouse IFN- γ standard lyophilized
16. Sample diluent
17. Assay buffer
18. Wash buffer
19. Substrate Solution
20. Stop Solution
21. Pewarna (blue-dye, green-dye, red-dye)
22. Adhesive films
Alat dan bahan tambahan yang dibutuhkan :
5. Micropipet
6. Distilled water
7. ELISA reader
8. Tube eppendorf
Persipan reagen :
6. Pembuatan standard dilution :
61
-
Siapkan tube 7 buah (S1-S7).
-
Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam masing-masing tube.
-
Tambahkan 100 μl mouse IFN- γ standard ke dalam tube S1.
-
Lakukan pengenceran bertingkat.
7. Pengenceran wash buffer : 50 ml wash buffer diencerkan dalam 950 ml
distilled water.
8. Pengenceran Assay buffer : 5 ml assay buffer diencerkan dalam 95 ml
distilled water.
9. Pengenceran Biotin-conjugate : 0,06 ml biotin-conjugate diencerkan dalam
5,94 ml assay buffer.
10. Pengenceran Streptavidin-HRP : 0,06 ml Streptavidin-HRP dalam 5,94 ml
Assay buffer.
Persiapan sampel :
Sampel berupa supernatant yang berasal dari kultur splenosit selama 72 jam.
Prosedur pemeriksaan :
19. Tentukan jumlah microwell strips yang dibutuhkan.
20. Cuci microwell strips 2 kali dengan wash buffer.
21. Tambahkan 100 μl standard dilution ke dalam standard well.
22. Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam blank well.
23. Tambahkan 50 μl sample diluent ke dalam sample well.
24. Tambahkan 50 μl sample A, B, C ke dalam sample well.
25. Siapkan biotin-conjugate.
62
26. Tambahkan 50 μl biotin-conjugate ke semua well.
27. Tutup microwell strips dan inkubasi 2 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
28. Siapkan Streptavidin-HRP.
29. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
30. Tambahkan 100 μl streptavidin-HRP ke semua well.
31. Tutup microwell strips dan inkubasi 1 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
32. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
33. Tambahkan 100 μl substrate solution ke semua well.
34. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan (18-25o C).
35. Tambahkan 100 μl stop solution ke semua well.
36. Baca dengan ELISA reader pada 450 nm.
63
64
HASIL OUTPUT ANALISIS DATA
Explore
IFN-
Kelompok
Case Summaries
IFN-gamma
Kelompok
P1
P2
P3
Total
N
6
6
6
18
Mean
368.9276
214.3011
46.9091
210.0460
Std. Deviation
399.11185
141.75122
53.66405
268.17118
Median
202.6730
196.2375
25.2300
95.0863
Tests of Normality
IFN-gamm a
Kelompok
P1
P2
P3
Statistic
.845
.912
.781
a. Lilliefors Significance Correction
Shapiro-Wilk
df
6
6
6
Sig.
.144
.450
.040
Minimum
7.46
52.10
8.14
7.46
Maximum
948.92
389.74
148.51
948.92
65
IFN-gamma
Tests of Normality
Log10IFN_gamma
Kelompok
P1
P2
P3
Statistic
.923
.925
.958
Shapiro-Wilk
df
6
6
6
a. Lilliefors Significance Correction
Test of Homogeneity of Variances
IFN-gamma
Levene
Statistic
12.074
df1
df2
2
15
Sig.
.001
Test of Homogeneity of Variances
Log10IFN_gamma
Levene
Statistic
1.781
df1
df2
2
15
Sig.
.202
Sig.
.528
.541
.807
66
Oneway
ANOVA
Log10IFN_gamma
Sum of
Squares
2.294
4.813
7.108
Between Groups
Within Groups
Total
df
2
15
17
Mean Square
1.147
.321
F
3.575
Sig.
.054
Explore
TNF-
Kelompok
Case Summaries
TNF-alfa
Kelompok
P1
P2
P3
Total
N
5
5
5
15
Mean
17.2586
258.9940
1828.8900
701.7142
Std. Deviation
11.37048
90.72331
213.13784
840.50073
Median
16.3340
230.1100
1864.2000
230.1100
Tests of Normality
TNF-alfa
Kelompok
P1
P2
P3
Statistic
.915
.766
.825
a. Lilliefors Significance Correction
Shapiro-Wilk
df
5
5
5
Sig.
.501
.041
.127
Minimum
.62
186.65
1467.00
.62
Maximum
28.33
417.01
2007.60
2007.60
67
TNF-alfa
Tests of Normality
Log10TNF_alfa
Kelompok
P1
P2
P3
Statistic
.722
.838
.798
Shapiro-Wilk
df
5
5
5
a. Lilliefors Significance Correction
Test of Homogeneity of Variances
TNF-alfa
Levene
Statistic
3.133
df1
df2
2
12
Sig.
.080
Sig.
.016
.160
.078
68
NPar Tests
Kruskal-Wallis Test
Ranks
TNF-alfa
Kelompok
P1
P2
P3
Total
N
5
5
5
15
Test Statisticsa,b
Chi-Square
df
Asymp. Sig.
TNF-alfa
12.500
2
.002
a. Kruskal Wallis Test
b. Grouping Variable: Kelompok
Mean Rank
3.00
8.00
13.00
69
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
TNF-alfa
Kelompok
P1
P2
Total
N
5
5
10
Mean Rank
3.00
8.00
Sum of Ranks
15.00
40.00
Mean Rank
3.00
8.00
Sum of Ranks
15.00
40.00
Test Statisticsb
Mann-Whitney U
Wilcoxon W
Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
Exact Sig. [2*(1-tailed
Sig.)]
TNF-alfa
.000
15.000
-2.611
.009
a
.008
a. Not corrected for ties.
b. Grouping Variable: Kelompok
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
TNF-alfa
Kelompok
P1
P3
Total
N
5
5
10
70
Test Statisticsb
Mann-Whitney U
Wilcoxon W
Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
Exact Sig. [2*(1-tailed
Sig.)]
TNF-alfa
.000
15.000
-2.611
.009
a
.008
a. Not corrected for ties.
b. Grouping Variable: Kelompok
NPar Tests
Mann-Whitney Test
Ranks
TNF-alfa
Kelompok
P2
P3
Total
N
5
5
10
Test Statisticsb
Mann-Whitney U
Wilcoxon W
Z
Asymp. Sig. (2-tailed)
Exact Sig. [2*(1-tailed
Sig.)]
TNF-alfa
.000
15.000
-2.611
.009
a
.008
a. Not corrected for ties.
b. Grouping Variable: Kelompok
Mean Rank
3.00
8.00
Sum of Ranks
15.00
40.00
71
Foto Hasil Penelitian
72
73
Foto Kegiatan Penelitian
74