MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L) TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS (Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)

  

DISERTASI

MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L)

TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA

  

MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI

EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS

(Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)

  

SRI HERNAWATI

PROGRAM STUDI S3 ILMU KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS AIRLANGGA

SURABAYA

2012

  Diterbitkan untuk Ujian Tahap II (Terbuka)

  DISERTASI MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L) TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS (Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel) SRI HERNAWATI PROGRAM STUDI S-3 ILMU KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA SURABAYA 2012 PRASYARAT GELAR DOKTOR

  MEKANISME KERJA EKSTRAK BUAH DELIMA (Punica granatum L) TERSTANDAR TERHADAP DEGRADASI SEL MUKOSA RONGGA MULUT MENCIT YANG MENGALAMI TRANSFORMASI MELALUI EKSPRESI BCL-2, VEGF, Wild p53 DAN APOPTOSIS (Studi Eksperimental Pada Hewan Model Transformasi Sel)

  DISERTASI Untuk Memperoleh Gelar Doktor

  Dalam Program Studi S3 Ilmu Kedokteran Pada Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

  Dan Dipertahankan Di hadapan Panitia Ujian Doktor Tahap II (Terbuka) Oleh :

  SRI HERNAWATI 090970133

  LEMBAR PENGESAHAN

  Telah Disetujui Untuk Ujian Doktor Tahap II (Terbuka) pada tanggal 21 September 2012 Oleh

  Promotor : Nip. 19591003 198701 1 001

  Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh

  Ko Promotor I Nip : 19550705 198003 1 005

  Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si

  Ko Promotor II Nip. 19591114 198603 2 002

  Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg,M.Si

  Mengetahui Ketua Program Studi Ilmu Kedokteran

  Program Pasca Sarjana Universitas Airlangga Nip. 19501216 197703 1 002

  Prof. Dr. Teddy Ontoseno,dr.SpA(k)Spjp.,AKK

  Disertasi ini telah diuji dan dinilai oleh panitia penguji pada ujian Tertutup (Tahap I) Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Pada Tanggal 17 September 2012

  Panitia Penguji : Ketua : Prof. M.Coen Pramono D.,drg.,S.U.,Sp.BM Anggota :

  1. Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, drh

  2. Dr. I Ketut Sudiana, MS

  3. Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg.,M.Kes

  4. Dr. Hari Basuki Notobroto, M.Kes.,dr

  5. Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM

  6. Prof. Dr. Aulanni’am, Drh., DES Ditetapkan dengan Surat Keputusan

  Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

  Nomor : 182/H3.1.1/KD/2012 Tanggal : 11 September 2012 Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat dan hidayah-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan disertasi dengan judul

  “Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2, VEGF, Wild p53 dan Apoptosis”

  Penelitian Disertasi ini menjadi salah satu persyaratan yang harus ditempuh oleh mahasiswa Program Pendidikan S-3 Ilmu Kedokteran di Universitas Airlangga.

  Disertasi ini dapat diselesaikan berkat dorongan, bimbingan, arahan, saran dan perbaikan dari banyak pihak. Oleh karena itu, dengan segala kerendahan hati, perkenankan saya menghaturkan terimakasih yang tulus serta penghargaan yang setinggi-tingginya kepada yang terhormat :

  Prof. Dr. Fedik Abdul Rantam, Drh. selaku promotor yang dengan penuh perhatian telah meluangkan waktu, memberikan dorongan semangat dengan penuh kesabaran, memberikan bimbingan dan saran sehingga ujian disertasi ini dapat diselesaikan.

  Dr. I Ketut Sudiana, Drs. M.Si, selaku Ko-Promotor I yang dengan penuh perhatian dan kesabaran, telah memberikan dorongan, bimbingan dan saran, sehingga ujian Disertasi ini dapat diselesaikan.

  Dr. A. Retno Pudji Rahayu, drg, M.Si. selaku Ko-Promotor II yang dengan penuh perhatian dan kesabaran, telah memberikan dorongan, bimbingan dan saran, sehingga ujian disertasi ini dapat diselesaikan.

  Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga saya haturkan kepada : Rektor Universitas Airlangga, Prof. Dr. H. Fasich, Apt. yang telah memberi kesempatan kepada saya untuk mengikuti pendidikan Program Doktor pada

  Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga Surabaya.

  Prof. Dr. Agung Pranoto, dr., M.Kes., SpPD.,KEM.,FINASIN Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga yang telah memberi kesempatan kepada saya untuk mengikuti Pendidikan Program Doktor pada Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya. Direktur Program Pascasarjana, Prof .Dr.Hj.Sri Hajati,SH.,MS., beserta seluruh pimpinan dan staf Program Pascasarjana Universitas Airlangga atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada saya untuk menjadi mahasiswa Program Doktor pada Program Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga.

  Prof. Dr. Teddy Ontoseno, dr. SpA(k)Spjp.,AKK, selaku Ketua Program Studi Program Doktor Ilmu Kedokteran Pascasarjana Universitas Airlangga yang telah banyak membantu dalam kelancaran proses pelaksanaan ujian disertasi ini.

  Rektor Universitas Jember dan Dekan Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Jember yang telah banyak membantu saya dalam menempuh Program Doktor pada Program Pascasarjana Universitas Airlangga.

  Prof. M. Coen Pramono D., drg., SU., Sp. BM, Dr. Hari Basuki Notobroto, Mkes, dr, Dr. Iwan Hernawan, drg.,M.Kes.,Sp.PM, Prof. Dr. Aulanni’am, Drh., DES, Prof. Dr. Sukardiman., Drs., M.S yang telah banyak memberikan saran dan bimbingan yang sangat berharga mulai penyusunan pra usulan penelitian hingga penyusunan disertasi ini.

  Para dosen pengajar S-3 Kedokteran dan karyawan di laboratorium biokimia, laboratorium mikroskop elektron Gramik Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

  Terima kasih kepada Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi Kementerian Pendidikan Nasional yang telah memberikan Beasiswa Pendidikan Pascasarjana demi kelancaran studi saya.

  Teman-teman angkatan 2009/2010 pendidikan Program Doktor Bidang Ilmu Kedokteran pada Program Pascasarjana Universitas Airlangga. Selama ini kita telah saling menemani, memotivasi, mengingatkan dan memberi masukan yang semuanya memberi nilai tambah dalam rangkaian penyusunan disertasi ini.

  Pada kesempatan ini saya menyampaikan terimakasih ,rasa hormat dan penuh kasih kepada : Orangtua saya, ayahanda tercinta Samiruddin (Alm) dan ibunda Sunaryati, tidak lupa kepada seluruh saudara dan keluarga besar saya ucapkan terimakasih yang tak terhingga. Terimakasih atas semua kebaikan dan doa yang telah diberikan.

  Suami saya, Rahardja Putranto,drg.,M.Mkes tercinta, yang hingga saat ini mendampingi saya menjalani kehidupan, memberikan dorongan. Kepada anak- anakku tercinta Amelia Clarissa Putranto dan Safira Rahmaningtyas Putranto, terima kasih banyak atas cinta dan pengorbanan yang telah kalian berikan selama ini.Mama mohon maaf atas berkurangnya waktu kebersamaan selama Mama menyelesaikan pendidikan.

  Saya ucapkan terima kasih pada semua pihak yang telah membantu dalam terselesaikannya disertasi ini. Saya berharap disertasi ini akan dapat memberikan manfaat bagi masyarakat, khususnya bagi pengembangan dunia pendidikan dan kesehatan. Semoga Allah SWT melimpahkan taufik dan hidayah-Nya kepada semua pihak yang telah membantu penyelesaian disertasi ini. Amien Ya Rabbal Allamin.

  Surabaya, September 2012 Penulis

  RINGKASAN Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga

  Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2,

  VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis

  Karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah kanker urutan keenam di dunia, setiap tahun angka kejadiannya semakin meningkat. Di negara berkembang, kejadian ini mempunyai angka yang tinggi. Kemajuan di bidang bedah, radiasi dan kemoterapi telah berkembang dengan pesat, tetapi hasilnya masih relatif belum menggembirakan. Pasien yang mempunyai umur panjang kurang dari 50%. Terjadinya kanker bisa disebabkan karena hambatan apoptosis.

  Apoptosis merupakan suatu mekanisme yang efisien untuk mengeliminasi sel

  yang tidak diperlukan dan mungkin berbahaya sehingga dapat menyelamatkan organisme. Delima (PGL) salah satu tanaman obat yang memiliki aktivitas sebagai antikanker. Fakta ini mempunyai harapan bahwa ekstrak buah delima (PGL) dapat membunuh sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui penurunan ekspresi BCL-2,VEGF dan peningkatan ekspresi wild p53, apoptosis. Tujuan penelitian ini adalah untuk menguji secara eksperimental mekanisme kerja ekstrak buah Delima (Punica

  granatum L) terstandar terhadap sel mukosa rongga mulut mencit yang mengalami transformasi melalui ekspresi BCL-2,VEGF, Wild p53 dan Apoptosis.

  Metode penelitian ini adalah eksperimental laboratories. Hewan coba yang digunakan adalah mencit Strain Swiss Webster (Balb/c), 30 ekor mencit jantan umur 5 bulan, dibagi 5 kelompok. Kelompok kontrol (K0/K-, K1/K+) dan 3 kelompok perlakuan (P1, P2, P3). Paparan benzopirene diberikan untuk hewan coba pada kelompok (K1, P1, P2, P3) dengan dosis 0,04 mg benzopirene / 0,04 ml

  olium olivarum diberikan 3 kali seminggu selama 4 minggu. Pemberian ellagic acid , PGL, mahkota dewa pada kelompok (P1, P2, P3 ) dengan dosis 75 mg/kg

  bb mencit, diberikan tiap hari selama 4 minggu per oral. Teknik pemeriksaan dengan teknik imunohistokimia dan tunnel assay analisis data menggunakan uji MANOVA, LSD, uji korelasi dan regresi.

  Hasil pemeriksaan dengan teknik imunohistokimia dan pemberian ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat menurunkan ekspresi Bcl-2, dan tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K1. Ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat menurunkan ekspresi VEGF, dan tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K1. Ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat meningkatkan ekspresi wild p53, tidak berbeda secara signifikan bila dibandingkan dengan kelompok K0, P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K1. Pemeriksaan preparat dengan teknik tunnel

  assay menunjukkan pemberian ekstrak buah delima (PGL)/P2 terstandar dapat

  meningkatkan apoptosis, dan tidak berbeda secara signifikan dengan kelompok

  P1, P3, tetapi berbeda secara signifikan dengan kelompok K0 dan K1. Hasil uji korelasi menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan penurunan ekspresi VEGF, tetapi ada korelasi negatif antara penurunan ekspresi Bcl-2 dengan peningkatan ekspresi wild p53, dan ada korelasi positif antara peningkatan wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis.

  Kesimpulan penelitian ini adalah bahwa ada mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.

  SUMMARY Mechanism of Action of Standardized Pomegranate Extracts (Punica Granatum L) on Degradation of Mice Oral Cavity Mucosal Cells Transforming through Expression of Bcl-2, VEGF, p53 Wild and Apoptosis

  Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the world, every year the number of events increases. In developing countries, these events have a high number. The developments in the field of surgery, radiation and chemotherapy have improved dramatically, but the results are still relatively encouraging. In facts, patients who have a long life are still less than 50%. The occurrence of cancer could be due to apoptosis resistance. Apoptosis is an efficient mechanism to eliminate cells that are unnecessary and potentially dangerous so as to save the organism. Pomegranate (PGL) is one of medicinal plants that have anticancer activity. This fact has the expectation that pomegranate extract (PGL) can kill cells undergoing transformation into squamous cell carcinoma of the oral cavity of mice with decreased expression of BCL-2, VEGF and increased expression of p53 wild, apoptosis. The purpose of the research was to experimentally test the mechanism of action of Pomegranate extract (Punica granatum L) standardized to oral mucosal cells of mice undergoing a transformation through the expression of BCL-2, VEGF, p53 and Apoptosis Wild. The research method was experimental laboratories. Experimental animals used were Swiss Webster mice strains (Balb / c), 30 male mice aged 5 months, divided 5 groups. The control group (K0/K-, K1 / K +) and 3 treatment groups (P1, P2, P3). Exposure benzopirene was given to experimental animals in the group (K1, P1, P2, P3) at a dose of 0.04 mg benzopirene / 0.04 ml olium olivarum given 3 times a week for 4 weeks. Usage of ellagic acid, PGL, mahkota dewa on the groups (P1, P2, P3) at a dose of 75 mg / kg bb mice, given daily for 4 weeks per oral. Examination techniques with imunohistokimia technique and tunnel assay data analysis using MANOVA test, LSD, correlation and regression testing.

  The results of the examinations with imunohistokimia technique and pomegranate extract (PGL) / P2 standardized could reduce the expression of Bcl-2, and did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but significantly different when compared with group K1. Pomegranate Extract (PGL) / P2 standardized could reduce the expression of VEGF, and did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but significantly different when compared with group K1. Pomegranate Extract (PGL) / P2 standardized could increase the expression of p53 wild, did not differ significantly when compared to the K0, P1, P3, but differs significantly with the K1. Examination preparations tunnel assay techniques showed the extract of pomegranate (PGL) / P2 standardized to enhance apoptosis, and did not differ significantly by group P1, P3, but differed significantly with the K0 and K1. Correlation test results showed that there was a positive correlation between the decreased expression of Bcl-2 with decreased

  VEGF expression, but there is a negative correlation between the decreased expression of Bcl-2 with increased expression of p53 wild, and there is a positive correlation between the increase in p53 wild with increased expression of apoptosis.

  The conclusion of the research was that there was a mechanism of action of pomegranate extract (PGL) to apoptosis through the intrinsic pathway, and there was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and VEGF expression.

  ABSTRAK Mekanisme Kerja Ekstrak Buah Delima (Punica granatum L) Terstandar Terhadap Degradasi Sel Mukosa Rongga

  Mulut Mencit Yang Mengalami Transformasi Melalui Ekspresi BCL-2,

  VEGF, Wild p53 Dan Apoptosis

  Karsinoma sel skuamosa rongga mulut adalah merupakan kanker urutan keenam di dunia. Perkembangan kemajuan di bidang bedah, radiasi dan kemoterapi belum memberikan hasil yang signifikan. Pasien karsinoma sel skuamosa rongga mulut yang berumur panjang kurang dari 50%. Terjadinya kanker salah satu disebabkan oleh karena hambatan apoptosis sel dan mutasi. Delima (PGL) merupakan alternatif dan salah satu tanaman obat yang memiliki aktivitasnya sebagai antikanker. Fakta ini mempunyai harapan bahwa ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat membunuh sel yang mengalami transformasi ke karsinoma sel skuamosa rongga mulut mencit melalui penurunan ekspresi

  BCL-2,VEGF dan peningkatan ekspresi wild p53, apoptosis. Tujuan penelitian ini

  adalah untuk menguji secara eksperimental mekanisme kerja ekstrak buah Delima

  (Punica granatum L) terstandar terhadap sel mukosa rongga mulut mencit yang

  mengalami transformasi melalui ekspresi BCL-2,VEGF, Wild p53 dan Apoptosis.

  Metode penelitian yang digunakan adalah eksperimental laboratories, tiga puluh ekor mencit jantan umur 5 bulan dibagi secara random menjadi 5 kelompok; 2 kelompok control (K0, K1), 3 kelompok perlakuan (P1,P2,P3). Paparan

  benzopirene dengan dosis 0,04 mg benzopirene/0,04 ml olium olivarum

  selama 4 minggu, 3 kali seminggu. Pemberian

  ellagic acid, PGL, mahkota dewa

  dengan dosis 75 mg/kg bb mencit setiap hari selama 4 minggu. Pemeriksaan dilakukan dengan menggunakan teknik

  imunohistokimia dan tunnel assay.

  Hasil penelitian berdasarkan teknik

  imunohistokimia menujukkan bahwa

  pemberian ekstrak buah delima (PGL) terstandar dapat menurunkan ekspresi

  Bcl-

  2,

  VEGF, dapat meningkatkan ekspresi wild p53 dengan teknik pemeriksaan tunnel assay, dan meningkatkan ekspresi apoptosis. Hasil uji korelasi

  menunjukkan, ada korelasi positif antara penurunan ekspresi

  Bcl-2 dengan

  penurunan ekspresi

  VEGF, ada korelasi negatif antara penurunan ekspresi Bcl-2

  dengan peningkatan ekspresi

  wild p53, dan ada korelasi positif antara peningkatan

  ekspresi wild p53 dengan peningkatan ekspresi apoptosis.

  Kesimpulan penelitian ini adalah ada mekanisme kerja ekstrak buah delima (PGL) terhadap

  apoptosis melalui jalur intrinsik dan ada korelasi positif dua arah

  antara ekspresi Bcl-2 dengan ekspresi VEGF.

  Kata Kunci : Delima, transformasi sel, apoptosis.

  ABSTRACT Mechanism of Action of Standardized Pomegranate Extracts (Punica Granatum L) on Degradation of Mice Oral Cavity Mucosal Cells

  Transforming through Expression of Bcl-2, VEGF, p53 wild and Apoptosis

  Squamous cell carcinoma of the oral cavity is the sixth cancer in the world. The developments in the field of surgery, radiation and chemotherapy have not yielded significant results. Patients with squamous cell carcinoma of the oral cavity that have a long life is still less than 50%. One occurrence of cancer was caused by cell apoptosis and mutation. Pomegranate (PGL) is an alternative and one that has the medicinal plants as anticancer activity. This fact has the expectation that pomegranate extract (PGL) standardized to kill the cells undergoing transformation into squamous cell carcinoma of the oral cavity of mice with decreased expression of BCL-2, VEGF and increased expression of p53 wild, apoptosis. The purpose of this study was to experimentally test the mechanism of action of Pomegranate extract (Punica granatum L) standardized to oral mucosal cells of mice undergoing a transformation through the expression of BCL-2,

  VEGF, p53 and Apoptosis Wild.

  The research method used was experimental laboratories, thirty male mice aged 5 months were randomly divided into 5 groups: 2 groups of control (K0, K1), 3 treatment groups (P1, P2, P3). Exposure of benzopirene with a dose of 0.04 mg benzopirene/ 0.04 ml olium olivarum for 4 weeks, 3 times a week. Usage of ellagic acid, PGL,

  mahkota dewa with a dose of 75 mg / kg bb mice every day for

  4 weeks. Examinations were done by using

  imunohistokimia and tunnel as say techniques.

  The results based on the technique of

  imunohistokimia showed that

  pomegranate extract (PGL) standardized could reduce the expression of Bcl-2,

  VEGF, p53, could increase the expression of wild-

  tunnel as say examination

  techniques, and could increase expression of apoptosis. Correlation test results showed that there was a positive correlation between the decreased expression of Bcl-2 and decreased expression of VEGF, there was a negative correlation between the decreased expression of Bcl-2 and increased expression of p53 wild, and there was a positive correlation between the increased expression of p53 and increased expression of wild apoptosis.

  The conclusion of this study was that there was mechanism of pomegranate extract (PGL) on apoptosis through the intrinsic pathway, and there was a positive correlation in both directions between the expression of Bcl-2 and VEGF expression.