B1J010019 11.
III. METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian
1. Materi
1.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mortar dan pestle,
kompor gas, autoklaf, gelas ukur, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, oven,
Laminar Air Flow (LAF), cawan petri, gelas ukur, rak tabung, beaker
glass, Hot Plate Stirer, bor gabus, sprayer, jarum ose, shaker orbital,
kertas saring Whatman No. 41, corong Buchner; pompa vakum,
Chamber, timbangan analitik dan UV cabinet.
1.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah isolat L. edodes
Yogyakarta, isolat W4, LW26 dan Jambo, Potato Dextrose Agar (PDA),
ekstrak yeast, agar, kloroform, etil asetat, pelat KLT silica gel, akuades,
ekstrak malt, ekstrak yeast, glukosa, alkohol 70%, akuabides, CaSO4,
bekatul, alkohol, alummunium foil, tissue, pereaksi AlCl3, vanillin asam
sulfat dan Dragendorff.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikologi-Fitopatologi,
Fakultas Biologi dan Laboratorium Kimia Organik, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA), Universitas Jenderal Soedirman,
Purwokerto. Penelitian dilaksanakan selama 5 bulan, dimulai pada bulan
Juni-Oktober 2014.
B. Metode Penelitian
1. Metode dan Rancangan Percobaan
Metode penelitian pertama yang digunakan yaitu eksperimental dengan
bio.unsoed.ac.id
menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan 4 perlakuan yang
terdiri atas :
t1 : Isolat Yogya
t2 : Isolat LW26
t3 : Isolat W4
t4 : Isolat Jambo
6
Masing-masing perlakuan ditumbuhkan pada medium Yeast Extract,
Malt Extract, Rice Bran (YEMR) dan diulang sebanyak 3 kali, sehingga
terdiri atas 12 unit percobaan.
2. Variabel penelitian
Variabel yang digunakan dalam penelitian ini ada dua macam yaitu
variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalah empat isolat L.
edodes, sedangkan variabel tergantung yaitu bobot miselium kering dan
golongan senyawa metabolit sekunder.
3. Parameter penelitian
Parameter utama yang diukur berupa bobot biomassa miselium kering
dan golongan senyawa terpenoid, flavonoid dan alkaloid. Parameter
pendukung berupa pH awal dan akhir medium fermentasi cair.
4. Cara kerja
4.1 Sterilisasi alat (Adji et al., 2007)
Alat yang digunakan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C
selama 20 menit.
4.2 Pembuatan medium Potato Dextrose Agar (PDA) (Hagemur, 2009)
Kentang sebanyak 200 g dikupas dan dipotong kecil-kecil
kemudian direbus dalam beaker glass berisi akuades sebanyak 500 ml
hingga lunak dan ekstraknya diambil. Agar batang dipotong kecil-kecil,
kemudian dilarutkan dalam akuades dengan cara dipanaskan dan diaduk.
Ekstrak kentang dan agar dicampur menjadi satu kemudian ditambahkan
dekstrose 20 g lalu diaduk hingga larut. Medium dimasukkan ke dalam
labu Erlenmeyer untuk di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu
1210C, tekanan 2 atm selama 15 menit.
4.3 Peremajaan biakan murni L. edodes (Aminuddin, 2013)
Biakan murni dari keempat isolat L. edodes diinokulasikan pada
bio.unsoed.ac.id
medium PDA di dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu ruang
selama 2 minggu sampai miselium memenuhi cawan.
4.4 Pembuatan medium fermentasi cair YEMR (Quimio, 1978)
Bahan-bahan berupa ekstrak malt 10 g, ekstrak yeast 2 g, dekstrosa
10 g, CaSO4 1 g dan bekatul 5 g dilarutkan dengan akuades sebanyak
1000 ml dan dihomogenkan dengan hot plate dan stirrer. Medium
dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, kemudian medium disterilisasi
7
menggunakan autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 2 atm selama 20
menit.
4.5 Kultivasi miselium L. edodes (Thongklang et al., 2010)
Kultivasi miselium menggunakan medium YEMR yang sudah
dibuat sebelumnya, diinokulasikan dengan keempat isolat koloni L.
edodes sebanyak 5 plug dengan diameter 5 mm ke dalam masing-masing
labu Erlenmeyer berukuran 250 ml dengan volume 100ml. Medium yang
sudah diinokulasi, kemudian diinkubasi pada shaker orbital dengan
kecepatan pengocokan 150 rpm selama 40 hari pada suhu ruang.
4.6 Pembuatan ekstrak miselium L. edodes (Ekowati et al., 2011)
Kultur miselium empat isolat L. edodes yang sudah berumur 40
hari disaring menggunakan kertas saring Whatman No. 41, kemudian
dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 500C, kemudian miselium
yang sudah kering dihaluskan, dan ditimbang bobotnya menggunakan
timbangan analitik. Miselium yang sudah ditimbang diekstraksi dengan
metode maserasi menggunakan 25 ml kloroform dan 25 ml etil asetat
selama 24 jam. Maserasi dilakukan sebanyak dua kali beruturut-turut.
Hasil ekstrak kloroform dan etil asetat pertama dan ke dua dipindahkan
ke dalam masing-masing labu Erlenmeyer kemudian diuapkan dengan
hot plate.
4.7 Pembuatan ekstrak filtrat kultur L. edodes (Ekowati et al., 2011)
Filtrat kultur miselium empat isolat L. edodes diekstraksi empat
kali dengan masing-masing dua kali berurut-turut dengan kloroform dan
etil asetat. Pada tahap ekstrak yang pertama, filtrat kultur sebanyak 50 ml
dimasukkan kedalam corong pemisah dan ditambah 25 ml kloroform
kemudian digojog dengan kedua tangan selama 10 menit kemudian
corong pemisah dipasang dengan statif dan didiamkan selama 5 menit
bio.unsoed.ac.id
sampai terjadi pemisahan antara kloroform dengan filtrat, kemudian hasil
ekstraksi dipisahkan dan ditampung dengan labu Erlenmeyer, demikian
juga pada etil asetat. Kloroform akan berada pada lapisan bawah
sedangkan etil asetat akan berada pada lapisan atas, kemudian etil asetat
dan kloroform diuapkan dengan hot plate.
8
4.8 Identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder empat isolat L.
edodes (Wagner et al., 1984)
Identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder dari biomassa
miselium dan filtrat medium terlampir pada Lampiran 3.
4.9 Pembuatan pereaksi golongan senyawa metabolit sekunder empat
isolat L. edodes (Harborne, 1987)
Pembuatan pereaksi golongan senyawa metabolit sekunder untuk
penyemprotan golongan senyawa pada lempeng KLT terlampir pada
Lampiran 4.
4.10 Metode analisis
Data bobot biomassa miselium kering yang diperoleh dianalisis
menggunakan analisis ragam (ANOVA) pada taraf kepercayaan 95% dan
99%.
bio.unsoed.ac.id
9
A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian
1. Materi
1.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mortar dan pestle,
kompor gas, autoklaf, gelas ukur, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, oven,
Laminar Air Flow (LAF), cawan petri, gelas ukur, rak tabung, beaker
glass, Hot Plate Stirer, bor gabus, sprayer, jarum ose, shaker orbital,
kertas saring Whatman No. 41, corong Buchner; pompa vakum,
Chamber, timbangan analitik dan UV cabinet.
1.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah isolat L. edodes
Yogyakarta, isolat W4, LW26 dan Jambo, Potato Dextrose Agar (PDA),
ekstrak yeast, agar, kloroform, etil asetat, pelat KLT silica gel, akuades,
ekstrak malt, ekstrak yeast, glukosa, alkohol 70%, akuabides, CaSO4,
bekatul, alkohol, alummunium foil, tissue, pereaksi AlCl3, vanillin asam
sulfat dan Dragendorff.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikologi-Fitopatologi,
Fakultas Biologi dan Laboratorium Kimia Organik, Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA), Universitas Jenderal Soedirman,
Purwokerto. Penelitian dilaksanakan selama 5 bulan, dimulai pada bulan
Juni-Oktober 2014.
B. Metode Penelitian
1. Metode dan Rancangan Percobaan
Metode penelitian pertama yang digunakan yaitu eksperimental dengan
bio.unsoed.ac.id
menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan 4 perlakuan yang
terdiri atas :
t1 : Isolat Yogya
t2 : Isolat LW26
t3 : Isolat W4
t4 : Isolat Jambo
6
Masing-masing perlakuan ditumbuhkan pada medium Yeast Extract,
Malt Extract, Rice Bran (YEMR) dan diulang sebanyak 3 kali, sehingga
terdiri atas 12 unit percobaan.
2. Variabel penelitian
Variabel yang digunakan dalam penelitian ini ada dua macam yaitu
variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalah empat isolat L.
edodes, sedangkan variabel tergantung yaitu bobot miselium kering dan
golongan senyawa metabolit sekunder.
3. Parameter penelitian
Parameter utama yang diukur berupa bobot biomassa miselium kering
dan golongan senyawa terpenoid, flavonoid dan alkaloid. Parameter
pendukung berupa pH awal dan akhir medium fermentasi cair.
4. Cara kerja
4.1 Sterilisasi alat (Adji et al., 2007)
Alat yang digunakan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C
selama 20 menit.
4.2 Pembuatan medium Potato Dextrose Agar (PDA) (Hagemur, 2009)
Kentang sebanyak 200 g dikupas dan dipotong kecil-kecil
kemudian direbus dalam beaker glass berisi akuades sebanyak 500 ml
hingga lunak dan ekstraknya diambil. Agar batang dipotong kecil-kecil,
kemudian dilarutkan dalam akuades dengan cara dipanaskan dan diaduk.
Ekstrak kentang dan agar dicampur menjadi satu kemudian ditambahkan
dekstrose 20 g lalu diaduk hingga larut. Medium dimasukkan ke dalam
labu Erlenmeyer untuk di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu
1210C, tekanan 2 atm selama 15 menit.
4.3 Peremajaan biakan murni L. edodes (Aminuddin, 2013)
Biakan murni dari keempat isolat L. edodes diinokulasikan pada
bio.unsoed.ac.id
medium PDA di dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu ruang
selama 2 minggu sampai miselium memenuhi cawan.
4.4 Pembuatan medium fermentasi cair YEMR (Quimio, 1978)
Bahan-bahan berupa ekstrak malt 10 g, ekstrak yeast 2 g, dekstrosa
10 g, CaSO4 1 g dan bekatul 5 g dilarutkan dengan akuades sebanyak
1000 ml dan dihomogenkan dengan hot plate dan stirrer. Medium
dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, kemudian medium disterilisasi
7
menggunakan autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 2 atm selama 20
menit.
4.5 Kultivasi miselium L. edodes (Thongklang et al., 2010)
Kultivasi miselium menggunakan medium YEMR yang sudah
dibuat sebelumnya, diinokulasikan dengan keempat isolat koloni L.
edodes sebanyak 5 plug dengan diameter 5 mm ke dalam masing-masing
labu Erlenmeyer berukuran 250 ml dengan volume 100ml. Medium yang
sudah diinokulasi, kemudian diinkubasi pada shaker orbital dengan
kecepatan pengocokan 150 rpm selama 40 hari pada suhu ruang.
4.6 Pembuatan ekstrak miselium L. edodes (Ekowati et al., 2011)
Kultur miselium empat isolat L. edodes yang sudah berumur 40
hari disaring menggunakan kertas saring Whatman No. 41, kemudian
dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 500C, kemudian miselium
yang sudah kering dihaluskan, dan ditimbang bobotnya menggunakan
timbangan analitik. Miselium yang sudah ditimbang diekstraksi dengan
metode maserasi menggunakan 25 ml kloroform dan 25 ml etil asetat
selama 24 jam. Maserasi dilakukan sebanyak dua kali beruturut-turut.
Hasil ekstrak kloroform dan etil asetat pertama dan ke dua dipindahkan
ke dalam masing-masing labu Erlenmeyer kemudian diuapkan dengan
hot plate.
4.7 Pembuatan ekstrak filtrat kultur L. edodes (Ekowati et al., 2011)
Filtrat kultur miselium empat isolat L. edodes diekstraksi empat
kali dengan masing-masing dua kali berurut-turut dengan kloroform dan
etil asetat. Pada tahap ekstrak yang pertama, filtrat kultur sebanyak 50 ml
dimasukkan kedalam corong pemisah dan ditambah 25 ml kloroform
kemudian digojog dengan kedua tangan selama 10 menit kemudian
corong pemisah dipasang dengan statif dan didiamkan selama 5 menit
bio.unsoed.ac.id
sampai terjadi pemisahan antara kloroform dengan filtrat, kemudian hasil
ekstraksi dipisahkan dan ditampung dengan labu Erlenmeyer, demikian
juga pada etil asetat. Kloroform akan berada pada lapisan bawah
sedangkan etil asetat akan berada pada lapisan atas, kemudian etil asetat
dan kloroform diuapkan dengan hot plate.
8
4.8 Identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder empat isolat L.
edodes (Wagner et al., 1984)
Identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder dari biomassa
miselium dan filtrat medium terlampir pada Lampiran 3.
4.9 Pembuatan pereaksi golongan senyawa metabolit sekunder empat
isolat L. edodes (Harborne, 1987)
Pembuatan pereaksi golongan senyawa metabolit sekunder untuk
penyemprotan golongan senyawa pada lempeng KLT terlampir pada
Lampiran 4.
4.10 Metode analisis
Data bobot biomassa miselium kering yang diperoleh dianalisis
menggunakan analisis ragam (ANOVA) pada taraf kepercayaan 95% dan
99%.
bio.unsoed.ac.id
9