Pemeriksaan Penunjang Imunologi (immunoassay)

  

Pemeriksaan Penunjang Imunologi

(immunoassay)

  

Definisi I mmunoassay

• I mmunoassay adalah tes atau uji yang digunakan

  untuk mengukur adanya antigen atau antibodi pada sampel (spesimen bilogikal)

• • I mmunoassay dapat digunakan mendeteksi analyte

  yang ingin diukur Analyte  • sesuatu yg diukur dengan tes

   laboratorium dapat berupa Ag atau Ab dalam serum

• • T ujuan immunoassay ini adalah untuk mendiagnosa

  suatu penyakit, mengukur aktivitas komponen imun dalam tubuh (komplemen, fagositosis, dst)

  

Prinsip I mmunoassay

• Prinsip immunoassay  reaksi ikatan spesifik

  Ab-Ag  membentuk kompleks Ag-Ab

• Utk deteksi Antigen : digunakan Antibodi ( monoklonal ataupun polikonal ) sehingga membentuk kompleks I mun (Ag-Ab)  kompleks imun dapat diukur secara kualitatif atau

  kuantitatif

• Serology : metode utk mendeteksi dan mengukur

  titer antibodi dalam serum darah dengan

  menambahkan Ag spesifiknya

• 2 tipe Antibodi yang digunakan dlm

  immunoassay: poliklonal dan monoklonal

  Pembuatan Antibodi monoklonal Sel B ^spesifik

  Antibodi Poliklonal J ika hewan coba diimunisasi dengan pr ot ein X (Ag) yg memiliki banyak epit op t er hadap ant ibodi  klon sel B mempr oduksi ant ibodi t hd pr ot ein X Ant ibodi mungkin akan membent uk sej umlah par at op pr ot ein yang ber beda

  Campur an Ab yg dipr oduksi oleh r espon t er hadap ant igen mer upakan ant ibodi poliklonal

• Sampel yang diuji dapat berasal dari :
• – Antigen sample
• Cairan tubuh yang mengandung mikroba

  penginfeksi dan toksin mikroba (mengandung Ag) Cth : Urine, feces, blood, skin, pus, swab, cairan amnion, mucous, etc.

• – Blood antiserum sample

  Antiserum/ antisera darah mengandung Ab

• terhadap infeksi tertentu  jika pasien terinfeksi oleh patogen yang dicurigai maka pada serumnya

  akan mengandung Ab terhadap patogen tsb.

  Pengujian Ab pada darah setidaknya terdeteksi 2
• minggu seteah imfeksi awal

  T iter

• T iter : sejumlah Ab yang terdapat pada antiserum 

  Dapat digunakan untuk menentukan sejauh mana suatu penyakit mengalami peningkatan pada infeksinya

• T es Aglutinasi Direct dapat digunakan untuk

  mendeteksi titer Ab pada seseorang

• Kondisi dimana seseorang tidak memiliki Ab sama

  

  sekali lalu Ab meningkat “seroconversion” Komponen Penting Dalam I mmunoassay

  a. Spesifisitas Antibodi

  b. Valensi Antibodi

  c. Aviditas Antibodi

  d. Ukuran Kuantitas reaksi Ag-Ab

a. Spesifisitas Antibodi

   

• I katan Ag-Ab spesifik key-lock
• Namun terkadang terjadi reaksi silang  Ab

  berikatan dengan Ag lain yg memiliki struktur mirip

   terjadi jika kemurnian Ag rendah 

  Ab yang sangat spesifik : yang memiliki binding site yang hanya dimiliki oleh Ag dg struktur molekul yang unik

  

  Spesifisitas Ag-Ab dipengaruhi :

1. Spesifisitas Ab yang ditambahkan pd sampel

  2. Kemurnian Ag (tidak ada Ag lain yg mengkontaminasi)

b. Valensi Antibodi

• Jumlah binding site yang potensial dari Ab terhadap Ag yg spesifik
• Valensi Ab minimal 2  umumnya

c. Aviditas Antibodi

• Ukuran kekuatan Ab untuk mengikat Ag
• Ab dg Aviditas besar  kecenderungan mengikat Ag yang banyak Aviditas  refleksi afinitas (besarnya daya ikat)
• dan jumlah binding site (valensi)

d. Ukuran Kuantitas Reaksi Ag-Ab

• Derajat imunitas, kadar Antibodi atau bahan tertentu dalam serum harus dapat diukur  dinyatakan dalam suatu satuan/ unit tertentu
• Beberapa cara penentuan :

  1. Kualitatif : ada atau tidak adanya suatu bahan, baik Ab atau Ag dalam serum (uji + atau - ) cth : presipitasi pada uji VDRL, perubahan warna pada penentuan H bs Ag

  2. Semikuantitatif : kadar Ab atau Ag pada serum  dengan cara pengenceran serum secara progresif

• Kuantitas Ab dinyatakan dalam titer
• Cth : uji W idal

  3. Kuantitatif : kadar Ab ditentukan dengan membuat kurva baku standar terlebih dahulu terhadap kekeruhan (OD)  didapat nilai korelasi Contoh : ELI SA

  

Macam I mmunoassay

• T erdapat beberapa metode yang digunakan utk mendeteksi Ag-Ab, antara lain :
• I mmunoassay tak berlabel :

  a. Uji Presipitasi

  b. Uji Aglutinasi

  c. Uji H emaglutinasi

  d. Lisis I mun

  e. Uji Netralisasi

• I mmunoassay berlabel :

  a. Berlabel Flouresens

  b. Berlabel Radioisotop

c. Luminescent Assay (LI A)

  d. Berlabel Enzim

  

I mmunoasay tak berlabel

a. Uji presipitasi

  Bila suatu Ag terlarut bereaksi dg Abnya   Beberapa macam cara/ uji presipitas yg sering dipakai :

  1. Uji presipitasi lempeng/ slide cth : uji VDRL mikro

  2. Uji presipitasi tabung

  3. Uji presipitasi tabung kapiler cth : uji CRP

  4. Uji presipitasi cincin  terbentuk cincin presipitasi (uji +)

  5. I munoelektroforesis prinsip sama dengan elektroforesis 

  Liquid Precipitat ion

b. Uji Aglutinasi

• Reaksi antara Ab-Ag seluler atau Ag permukaan sel
• M acam-macam uji Aglutinasi :

  1. Uji Aglutinasi lempeng

cth : uji W idal Lempeng  deteksi Ab thd S.

  Paratyphi

  2. Uji Aglutinasi tabung

• Dipakai jika aglutinasi berlangsung lambat

  3. Uji H ambatan Aglutinasi  utk menentukan Ag larut yg tdk diketahui identitasnya cth : uji konfirmasi RPH A (Reverse Passive H emagglutination T est) utk penentuan H Bs Ag Uji aglut inasi : keberadaan Staphylococcus (ant igen) direaksikan dengan IgG t hd Staphylococcus Reaksi + jika ada kompleks imun

c. Uji H emaglutinasi

• Merupakan Uji Aglutinasi dari sel darah merah
• Sel darah diaglutinasikan karena antigen yang ada

  pada darah

• Mendeteksi Ab thd antigen sel darah merah
• Sel darah merah yag diuji merupakan Ag pada tes

  agutinasi Cth : uji penentuan golongan darah

• Jika darah memiliki Ag bergolongan A 

  aglutinasi jika dengan keberadaan Ab thd Ag gol A

d. Lisis imun dan Fiksasi Komponen

   Kompleks imun tidak selalu terjadi antara Abx terhadap Ag pada permukaan sel

  

 Kompleks imun baru terbentuk jika ditambahkan anti-

imunoglobulin/ Ab thd Abx

   

  

Sebagai ganti anti-imunoglobulin yaitu komplemen

lisis sel

   Macam uji lisis imun : Uji Fiksasi Komplemen cth : deteksi Ab thd Virus, bakteri, fungi, parasit I nterpretasi : + jika tidak hemolisis

  

I mmunoassay berlabel

1. Berlabel flourescent

• Uji immunoflourescent (I FA)  ikatan/ kompleks

  Ag-Ab divisualisasikan dg adanya perpendaran flouresen dibawah mikroskop

• I mmunoflourecent :

  1. Direct immunoflourescent :

• Ab dilabel dg marker flourescent  Ab secara

  langsung diberikan pada jaringan yg diinginkan

  2. I n-direct immunoflourescent

• M enggunakan Ab yg tdk berlabel thd Ag yg diuji dengan Ab sekunder yang berlabel (yang berikatan spesifik dg Ab pertama)
• Semakin banyak ikatan Ab sekunder 

  sinyal floresen semakin meningkat

• Immunocyt ochemist ry/ Immunofluorescence - Ant i-alpha

  

smoot h muscle Act in ant ibody [1A4] (ab7817) st aining alpha smoot h muscle Act in (green) in M ouse primary colon ant igen Frozen t issue sect ion

  Fluorescent marker ant ibody Direct Immunoflourescent Indirect immunofluorescece

  2 nd ant ibody w it h label

  1 st ant ibody ant igen

2. Berlabel radioisotop

• uji laboratoris yg sensitif  utk penentuan kadar beberapa bahan (hormon)
• Diperlukan sampel dg bahan yg sedikit

   sudah dpt terdeteksi

• Cth : Uji RI A (Radioimmunoassay)
• Pelabelan dengan Radioisotop yg dipakai

  3

  14

  57 75 125 131

  pada uji RI A : H ,

  C, Co, Se, I ,

  I

• Keberadaan ik Ag-Ab yang berlabel  diukur dengan gamma counter

  3. Berlabel luminescent

  

  uji immunoluminescent (LI A) prinsip sama dg

RI A dan I FA, hanya pada LI A label pada reaksi

Ag-Ab menggunakan luminescent

   luminescent : a. bioluminescent : kunang2

  b. chemiluninescent

  4. Berlabel enzim

   pemberian label enzim pada Ag (ELI SA)

• Menggunakan enzim (ligan) yang membuat produk

  reaksi berwarna (chromogen) – intensitas warna menunjukkan jumlah Ag yang ada dalam sampel Enzyme : horseradish peroxidase, phosphatase

  ELISA Enzyme Linked I mmunosorbent Assay

• Prinsip menggunakan reaksi perubahan warna
• (Colorimetric assay)

  

• Enzim yg ditambahkan akan bereaksi dengan substrat

  memproduksi produk yg berubah warna

• Direct
• cth. Pada test kehamilan / test pack (hormon hCG)

  I ndirect

• – T est H I V (rapid test)

  ELISA Micro-plate reader

  96-well micro-plate ^{Positive result} iM ark M icroplate Absorbance Reader

  

I munohistokimia

• I mmunohistochemistry (I H C) mengkombinasikan

  teknik histologi, imunologi dan biokimia 

identifikasi komponen jaringan tertentu dg reaksi

spesifik Ag atau Ab yang dapat divisualisasikan dg penempelan label

• Label : flourescent, enzym, hapten, radioaktif
• Ab mengikat Ag secara spesifik
• Menunjukkan lokasi tertentu sel atau protein pada

  jaringan/ organ di preparat/ slide

• Dapat digunakan untuk mengidentifikasi proses2

  selular dalam jaringan/ organ, cth : apoptosis Human ovarian Tumor, HE staining _{Sediaan t umor ovarium} pada obyek glass _{dilihat sel yg apopt osis t rdpt prot ein Fas L} Pada sediaan, ingin Pada sel yg apopt osis _{(sebagai Ag) Di inkubasi dengan ant i} label prot ein FasL (sebagai Ab)

  Label akan t ervisualisasi _{jika ada kompleks Ag-Ab} Apoptotic cell

  Aplikasi immunoassay

  1. Det eksi hormon polipept ida ; ct h : insulin and glucagon, hCG

  2. Det eksi hormon st eroid

  3. Det eksi agen t herapeut ic pada pemant auan  t erapi obat ; dan penyalahgunaan obat

  4. Pengukuran enzim , prot ein dan komponen t erlarut dalam darah lainnya; ct h : pengukuran prot ein plasma, komplemen

  5. Penggunaan penanda penyakit (disease marker) ₃₄ Keunt ungan menggunakan imunoasay :

• sensit if unt uk jumlah sampel yg rendah (ug/ L (ppb)
• pemeriksaan cepat
• pemeriksaan relat if mudah dilakukan
>

Pemeriksaan dapat dilakukan dimana saja (dg alat

penunjang) Kelemahan menggunakan imunoasay :
• reaksi silang / cross react ion – Ab mungkin dapat berikat an silang dg st rukt ur Ag yg serupa Relat if susah unt uk menganalisa larut an yang • bermacam-macam

  Vaksinasi

• Vaksinasi adalah aplikasi dari pirinsip imunoassay yang

  populer mengandung ant igen dari suat u

   mikroorganism (pat ogen) ^st

• Adanya paparan 1 Ag  menginduksi sel B dan Sel T :

  respon adapt if _nd
• Paparan 2 Ag  menimbulkan respon yg lebih efekt if

  dan cepat dibanding respon primer

• Pada beberapa infeksi, respon primer t erlalu lambat ut k

  merespon

• Jika indvidu belum pernah t erpapar Ag dari

  pat ogen X lalu diberikan vaksin (X) t erjadi

   ekspansi sel memory dan peningkat an Ab spesifik t hd pat ogen X  mampu melindungi dari bahaya Ag serupa (X) pada paparan berikut nya

• Vaksin : berisi organisme hidup/ organisme yg t elah mat i sama2 bersifat ant igenik

  

• Ant igen pd vaksin dapat dibuat secara sint et ik at au kloning gen dr organisme t erkait
• Imunit as t hs penyakit infeksi dapat dicapai dg imunisasi/ imunot erapi

  

Imunoterapi Treatment of the disease by Inducing, Enhancing or Suppressing the Immune System. Passive Immunotherapy: - Active Immunotherapy: - It does not rely on the body to It stimulates the body’s attack the disease, instead they own immune system to use the immune system fight the disease. components ( such as antibodies) created outside the body. imunit as Imunit as Adapt if

  Nat ural Art ificial / buat an Imunit as innat e

  Pasif (mat ernal) Akt if (infeksi)

  Pasif (ant ibodi t ransfer) Akt if

  (imunisasi) Pustaka

• Baratawijaya, 2 9, I munologi dasar, edisi 9, UI

   Press.

• Bush, RK., Diagnostic T est and Allergy-

  Chapter 1

• H andojo, I ., 2003, Pengantar I munoasai Dasar, Airlangga University Press, Surabaya
• Zabriskie, JB., 2009, Essential Clinical : I mmunological T echniques, Cambridge University Press