STUDI IN VITRO DAN IN SILICO CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D SKRIPSI

STUDI

  

IN VITRO DAN IN SILICO CITRULLINE

SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D SKRIPSI

  Untuk memenuhi sebagian persyaratan Mencapai Derajat Sarjana S-1

  Diajukan oleh:

  Siti Komerawati 1008010048 FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH PURWOKERTO PURWOKERTO 2014 ii

iii

iv

  

INTISARI

  SITI KOMERAWATI. Studi in vitro dan in silico Citrulline Sebagai Agen Kokemoterapi Doxorubicin Pada Sel Kanker Payudara T47D Di Bawah Bimbingan Nunuk Aries Nurulita Dan Asmiyenti Djaliasrin Djalil.

  

Latar Belakang: Kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang

  mempunyai prevalensi cukup tinggi. Terapi kanker payudara menggunakan agen kemoterapi seperti doxorubicin masih banyak digunakan. Tetapi doxorubicin memiliki efek samping yang serius seperti kardiotoksik. Pemilihan kemoterapi kombinasi mempunyai pengaruh yang penting pada luaran terapi pada pasien kanker payudara. Citrulline berpotensi sebagai agen kemopreventif kanker. NO (Nitric Oxide) dapat mengaktivasi soluble Guanylyl Cyclase yang kemudian menyebabkan vasodilatasi.

  

Tujuan penelitian: Penelitian ini bertujuan untuk menentukan efek sitotoksik

  dari citrulline tunggal maupun yang di kombinasikan dengan doxorubicin, mengetahui potensi antikanker citrulline dalam menginduksi kematian sel secara apoptosis, serta memberikan gambaran interaksi antara citrulline dengan protein soluble Guanylyl Cyclase secara in silico.

  

Metode Penelitian: Uji sitotoksik tunggal menggunakan metode MTT.

  Konsentrasi larutan citrulline yang sebesar 100 µM, 75 µM, 50 µM, 25 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, dan 1000 nM, 750 nM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM. Sedangkan konsentrasi uji sitotoksik kombinasi sebesar 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM untuk doxorubicin, dan 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM untuk

citrulline . Pengamatan apoptosis dilakukan dengan metode double staining.

  Sedangkan uji docking dilakukan dengan metode PLANTS.

  

Hasil: Citrulline tidak memiliki efek sitotoksik pada masa inkubasi 24 jam. Nilai

  IC

  

50 tidak dapat dihitung. Uji apoptosis menunjukkan adanya mekanisme

  kematian sel secara apoptosis. Uji docking dilakukan dengan metode PLANTS dan diperoleh hasil berupa best score. Best score menyatakan energi interaksi. Energi interaksi protein soluble Guanylyl Cyclase dengan ligannya adalah -171,808. Sedangkan energi interaksi protein soluble Guanylyl Cyclase dengan citrulline adalah -71,1463.

  

Kesimpulan: Citrulline tidak mempunyai potensi sitotoksik terhadap sel kanker

  payudara T47D. Ikatan citrulline dengan protein soluble Guanylyl Cyclase tidak lebih kuat dibandingkan dengan ligannya.

  

Kata kunci : citrulline, doxorubicin, soluble Guanylyl Cyclase, kanker payudara,

  kokemoterapi, sel T47D, docking, PLANTS v

  

ABSTRACT

Background: Breast cancer is one type of cancer that has a high enough prevalence. Breast cancer therapy using chemotherapeutic agents such as doxorubicin are still widely used. However doxorubicin has serious side effects such as cardiotoxic. Selection of combination chemotherapy has an important influence on the outcome of therapy in patients with breast cancer. Citrulline has a potential cancer chemopreventive agent. NO (Nitric Oxide) can activates soluble Guanylyl Cyclase which can cause vasodilatation.

  Objective: To determine the cytotoxic effects of a single citrulline and combination with doxorubicin, to determine the potential anticancer citrulline in inducing apoptotic cell death, to determine of the interaction between the protein soluble Guanylyl Cyclase by in silico.

  Methods: Cytotoxic effect by using MTT method. Solution concentration of citrulline by 100 µM, 75 µM, 50 µM, 25 µM, 20 µM, 10 µM, 5 µM, and 1000 nM, 750 nM, 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM. While the solution concentration to combination by 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM for doxorubicin, and 500 nM, 250 nM, 100 nM, 50 nM for citrulline. Apoptosis effect by using double staining method. While docking test was conducted using PLANTS.

  Results: Citrulline has nothing cytotoxic effect in the incubation period of 24 hours. IC50 value could not be calculated. Apoptosis experiment showed induction of apoptotic cell death. Docking experiment was conducted using PLANTS and resulted in the best score obtained. Best score is interaction energy. Interaction energy of soluble Guanylyl Cyclase protein with the ligand is - 171,808. While the energy of of soluble Guanylyl Cyclase protein with citrulline is -71,146.

  

Conclusion: Citrulline has nothing the potential cytotoxic effect to T47D breast

cancer cells. Citrulline binding with soluble Guanylyl Cyclase protein is not

stronger than the ligand .

  Key word : citrulline, doxorubicin, soluble Guanylyl Cyclase, breast cancer, T47D cells, co-chemotherapy, docking, PLANTS

  vi MOTTO Hidup adalah perjuangan.

  Menjalani hidup berarti mensyukuri nikmat yang telah Allah SWT berikan kepada kita.

  Pilihannya adalah berjuanglah sekarang atau tidak sama sekali.

  Berani mencoba itu lebih baik daripada tidak pernah berbuat. Dan jika takut akan membuat kesalahan, maka jangan pernah melakukan apa-apa.

  vii PERSEMBAHAN Bismillahirrahmanirahim............

  Dengan mengucapkan syukur Alhamdulillah, Maha suci Allah yang telah melimpahkan rahmat dan ridha-Nya kepada setiap hamba-hambanya yang slalu bersyukur. Kupersembahkan karya ku ini untuk kalian semua, orang-orang yang aku sayang:

   Bapak dan mamahku tercinta, kalian adalah motivator terbesar dalam hidupku yang tak

  pernah jemu mendo’akan dan menyayangiku, atas semua pengorbanan, nasehat dan kesabarannya mengantarkanku sampai di ujung perjuanganku ini. Tak pernah cukup aku membalas sayang dan cinta kalian, Adikku tersayang, Sri Rahayu Astuti yang slalu mendo’akan kakakmu ini untuk menjadi orang yang sukses dengan terus memberikanku semangat, dan slalu mengingatkanku untuk segera menyelesaikan skripsiku ini,

   Teruntuk sahabat-sahabatku : Agustina Olivia, Vinie Triana, Rulfita Oka, Ari

  Ardiansyah, Adi Wibowo, dan Helmy yang selalu menghibur dan memberikan dukungan untuk terus berjuang sampai saat ini. Terimakasih karena kalian telah memberiku banyak arti tentang kehidupan,

   Teruntuk mba lusi dan mba rista, terimakasih telah memberiku arahan dan nasehat, Teruntuk Alembana Latera L, terimakasih karena telah mendukungku dalam meraih apa

  yang aku impikan,

   Teman-teman kosku, Linda, maya dan okta yang telah mendukungku untuk terus

  berjuang. Tetap semangat untuk kalian, Almamaterku Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

  

PRAKATA

  viii Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat, hidayah serta inayahNya, sehingga dapat menyelesaikan penelitian skripsi yang berjudul “STUDI IN VITRO DAN IN SILICO CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA T47D

  ”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat dalam memperoleh gelar S1 di Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

  Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak, penulis tidak dapat menyelesaikan tugas ini dengan baik. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima kasih kepada :

• Drs. H. Syamsuhadi Irsyad, S.H., M.H. Rektor Universitas Muhammadiyah Purwokerto • Dr. Nunuk Aries Nurulita, M.Si, Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi dan dosen pembimbing I yang telah memberikan arahan, masukan dan bimbingan dalam penyusunan skripsi.
• Dr. Asmiyenti Djaliasrin Djalil, M.Si. selaku dosen pembimbing II yang telah memberikan arahan, masukan dan bimbingan dalam penyusunan skripsi.
• Seluruh dosen Fakultas Farmasi UMP yang telah memberikan ilmunya sehingga dapat membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan skripsi.
• Prof. dr. H. Supargiyono, DTMH. S.U., Ph.D., Sp.ParK. yang telah memberikan perkuliahan mengenai kultur sel kepada penulis sehingga penulis dapat memahami tentang penelitian ini.
• Ibu Rumbiwati yang telah membimbing dan membantu jalannya penelitian.
• Kedua orang tua dan adikku yang telah memberikan dukungan moral, material dan spiritual.
• Agustina Olivia Nezar dan Latifah yang telah berjuang bersama, terimakasih atas kerjasama, kesabaran serta suka dukanya selama penelitian berlangsung.
• Semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu.

  ix Penulis menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masih jauh dari kata sempurna, untuk itu penulis sangat mengharapkan kritik dan saran yang membangun demi perbaikan penelitian di masa mendatang.

  Semoga Allah SWT senantiasa membalas amal baik yang telah Bapak/Ibu/Saudara berikan, dan harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi penulis sendiri pada khususnya dan bagi semua pihak yang membutuhkan..

  Purwokerto, 21 Maret 2013 Penulis

  SITI KOMERAWATI x Nama : Siti Komerawati Tempat, Tanggal Lahir : Indramayu, 01 Mei 1991 Nama Orang Tua:

  a. Ayah : Talim

  b. Ibu : Rasminah Riwayat Pendidikan : a.

   TK

  : TK Jangkar Emas tahun 1996 - 1997 b.

   Sekolah Dasar

  : SD Negeri Bulak 1 tahun 1997 - 2003 c.

  

Sekolah Menengah Pertama : SMP Negeri 1 Kandanghaur tahun 2003 – 2006

d.

• – 2009 e.

   Sekolah Menengah Atas

  : SMK Farmasi Yasinda Indramayu tahun 2006

  : Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto xi

Perguruan Tinggi

  

DAFTAR ISI

  HALAMAN JUDUL ....................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN ........................................................................ ii HALAMAN PENGESAHAN ......................................................................... iii SURAT PERNYATAAN ................................................................................ iv

  INTISARI ........................................................................................................ v ABSTRAK ...................................................................................................... vi MOTTO .......................................................................................................... vii PERSEMBAHAN ........................................................................................... viii PRAKATA ...................................................................................................... ix RIWAYAT HIDUP ......................................................................................... x DAFTAR ISI ................................................................................................... xii DAFTAR TABEL ........................................................................................... xv DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xvi DAFTAR SINGKATAN ................................................................................ xvii DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... xviii

  BAB I. PENDAHULUAN A. Latar Belakang Permasalahan ........................................................ 1 B. Rumusan Masalah .......................................................................... 2 C. Tujuan Penelitian ........................................................................... 3 D. Manfaat Penelitian ......................................................................... 3 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA A. Kanker Payudara ............................................................................ 4 B. Sel T47D ........................................................................................ 5 C. Kokemoterapi ................................................................................. 6 D. Doxorubicin ................................................................................... 8 E. Citrulline ......................................................................................... 10 F. soluble Guanylyl Cyclase ................................................................ 12 G. Metode Docking ............................................................................. 14 xii

  BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian ..................................................... 15 B. Variabel Penelitian ......................................................................... 15 C. Definisi Variabel Operasional ........................................................ 15 D. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................ 16 E. Bahan dan Alat ............................................................................... 16

  2. Uji Sitotoksisitas Tunggal ........................................................ 18

  d. Analisis Docking ...................................................................... 21

  c. Analisis Apoptosis .................................................................... 21

  b. Uji Sitotoksisitas Kombinasi .................................................... 20

  a. Uji Sitotoksisitas Tunggal ........................................................ 20

  G. Analisis Hasil .................................................................................. 20

  5. Uji Docking .............................................................................. 20

  4. Uji Apoptosis ............................................................................ 19

  3. Uji Sitotoksisitas Kombinasi .................................................... 19

  1. Pembuatan Larutan Uji ............................................................. 18

  1. Bahan ........................................................................................ 16

  F. Cara Penelitian ................................................................................ 18

  2. Alat ........................................................................................... 18

  f. Bahan Docking Molekuler .................................................. 17

  e. Bahan Uji Apoptosis ........................................................... 17

  d. Bahan Uji Sitotoksisitas ...................................................... 16

  c. Sel T47D cell line ............................................................... 16

  b. Agen Kemoterapi ................................................................ 16

  a. Bahan Utama ....................................................................... 16

  BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Uji Sitotoksik Tunggal Citrulline dan Doxorubicin terhadap Sel Kanker Payudara T47D ........................................... 22 B. Hasil Uji Sitotoksik Kombinasi Citrulline dan Doxorubicin terhadap Sel Kanker Payudara T47D ........................................... 29 xiii

  C. Hasil Uji Apoptosis Citrulline dan Doxorubicin terhadap Sel Kanker Payudara T47D ................................................................ 32

  D. Hasil Uji Docking Molekular Citrulline dengan Protein Soluble Guanylyl Cyclase ......................................................................... 34

  BAB V PENUTUP A. Kesimpulan .................................................................................... 37 B. Saran ............................................................................................... 37 DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 38 LAMPIRAN .................................................................................................... 43 xiv

  

DAFTAR TABEL

  Tabel 1. Struktur protein untuk docking ....................................................... 17 Tabel 2. Persen viabilitas sel pada perlakuan citrulline tunggal .................. 27 Tabel 3. Persen viabilitas sel pada perlakuan doxorubicin tunggal .............. 27 Tabel 4. Persen viabilitas sel pada perlakuan Kombinasi citrulline dan

  doxorubicin ..................................................................................... 30

  Tabel 5 Score docking terhadap soluble guanylyl cyclase .......................... 36 xv

  

DAFTAR GAMBAR

  Gambar 1. Siklus Sel .......................................................................................... 4 Gambar 2. Morfologi sel T47D yang di peroleh dari situs ATCC .................... 6 Gambar 3. Struktur Doxorubicin ....................................................................... 8 Gambar 4. Struktur Citruline ........................................................................... 10 Gambar 5. Jalur NO dalam menstimulasi soluble Guanylyl Cyclase ............. 11 Gambar 6. Mekanisme NO dalam soluble Guanylyl Cyclase smooth muscle relaxation ............................................................... 13 Gambar 7. Usulan mekanisme peran siklus L-Citrulline/L-Arginine dalam regulasi fungsi saluran pernafasan ...................................... 13 Gambar 8. Morfologi sel T47D yang digunakan pada laboratorium parasitologi FK UGM ...................................... 23 Gambar 9. Morfologi sel pada perlakuan citrulline dan doxorubicin pada konsentrasi rendah dan tinggi

  ……………………………............ 25 Gambar 10. Reduksi MTT di dalam sel hidup oleh enzim reduktase di dalam mitokondria menghasilkan kristal formazan ................... 26 Gambar 11. Hubungan persen viabilitas doxorubicin dengan

  citrulline tunggal ........................................................................... 28

  Gambar 12. Morfologi sel pada perlakuan kombinasi dan citrulline

  doxorubicin

  ……..…………………………............ 30 Gambar 13. Hubungan persen viabilitas doxorubicin dengan

  citrulline kombinasi ....................................................................... 31

  Gambar 14. Seri Konsentrasi Doxorubicin dan Kombinasi

  Doxorubicin dan Citrulline untuk uji t............................................. 33

  Gambar 15. Foto Apoptosis ………………………............................................ 35

  Gambar 16. Protein soluble Guanylyl Cyclase ……........................................... 36 xvi

  FBS (Fetal Bovine Serum) ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) DMSO (Dimethyl Sulfoxide) MTT {(3-(4,5-dimethylthyazoyl-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide) PBS (Phosphate Buffered Saline) DMEM (

Dulbecco’s Modified Ecgle Medium)

  SDS (Sodium Duodecyl Sulphate) xvii