M01033
OPTIMASI METODE PREPARASI DAN EKSTRAKSI SAMPEL
Stevia rebaudiana (Bert.) DALAM PROSES KRISTALISASI
STEVIOSIDA
Yohanes Martono, Yohan, Lusiawati Dewi
Prodi Kimia Fakultas Sains dan Matematika
Universitas Kristen Satya Wacana
Jl. Diponegoro 52 – 60 Salatiga
e-mail: yohanes_mart@yahoo.co.id
ABSTRAK
Stevia rebaudiana Bert. merupakan tanaman herbal yang mengandung senyawa glikosida alami
dimana kemanisannya mencapai 300 kali sukrosa dan aman dikonsumsi. Senyawa glikosida alami
yang dominan dalam Stevia rebaudiana (Bert.) adalah steviosida yang dapat dikristalkan dan
dijadikan alternatif pengganti gula. Tujuan penelitian ini adalah melakukan optimasi preparasi
sampel yang meliputi defatisasi dan non defatisasi untuk tiap metode ekstraksi (maserasi dan
berkesinambungan) dalam proses kristalisasi steviosida. Sebagai parameter megoptimasi preparasi
dan metode ekstraksi sampel adalah efektifitas deklorofilasi dan kadar steviosida. Efektifitas
deklorofilasi ditentukan secara spektrofotometri sedangkan penetapan kadar steviosida digunakan
metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
metode preparasi dan ekstraksi sampel yang paling efisien dan aplikatif adalah nondefatisasimaserasi, dengan efektifitas deklorofilasi dan kadar steviosida secara berturut-turut sebesar
98,80% dan 9,17%.
Keywords: optimasi, Stevia rebaudiana (Bert.), steviosida
PENDAHULUAN
Kebutuhan pemanis semakin meningkat seiring dengan peningkatan produksi pangan
dunia. Saat ini, pemenuhan kebutuhan pemanis di masyarakat dipenuhi dengan kehadiran gula
sukrosa. Bila dilihat dari sisi kesehatan, gula sukrosa memiliki efek samping seperti obesitas,
bahkan dapat memicu timbulnya penyakit diabetes. Dari efek samping tersebut, berbagai macam
solusi dihadirkan seperti penggunaan pemanis sintetis yang rendah kalori seperti sakarin dan
siklamat. Sebenarnya, pemanis sintetis ini hanya ditujukan untuk penderita diabetes atau
konsumen dengan diet rendah kalori. Berdasarkan beberapa penelitian, ternyata pemanis ini
bersifat karsinogenik apabila digunakan secara berlebihan dan berkesinambungan dalam jangka
waktu yang lama (Mudjajanto, 2005).
Dewasa ini, masyarakat cenderung mencari alternatif pemanis alami pengganti gula
sukrosa maupun pemanis sintetis yang tidak hanya aman dikonsumsi tetapi juga rendah kalori.
Salah satu alternatif pemanis alami tersebut adalah steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.)
dengan tingkat kemanisan 200 hingga 300 kali sukrosa (Philip, 1987). Beberapa penelitian
menyebutkan bahwa steviosida mengandung kalori yang rendah sampai dengan nol kalori
(Moraes dkk, 2001) sehingga aman bagi penderita diabetes atau konsumen yang sedang
melakukan diet. Berdasarkan hasil penelitian, steviosida aman dikonsumsi oleh masyarakat
umum karena tidak mempunyai efek teratogenik (Yodyingguard dan Bunyawong, 1991),
mutagenik (Suttajit dkk., 1993), atau karsinogenik (Xili dkk., 1992). Oleh sebab itu, penelitian
untuk mengekstrak daun stevia menjadi kristal yang mengandung steviosida yang tinggi dan
mempunyai visualisasi kristal yang dapat diterima masyarakat akan memiliki potensi ekonomi
yang besar.
Salah satu cara untuk mendapatkan kristal dari steviosida adalah dengan metoda
ekstraksi. Ekstraksi yang dikembangkan adalah ekstraksi pelarut yang dikombinasi dengan
langkah-langkah yang lain seperti klarifikasi, penyesuaian pH dan kristalisasi (Moraes dkk, 2001;
Philips, 1987). Keuntungan dari penggunanan metoda ini adalah mudah digunakan. Pelitian ini
bertujuan mengoptimasi preparasi sampel yang meliputi defatisasi dan non defatisasi untuk tiap
metode ekstraksi (maserasi dan berkesinambungan) dalam proses kristalisasi steviosida.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Sampel yang digunakan adalah daun Stevia rebaudiana (Bert.) yang diperoleh dari
Tawangmangu, Kabupaten Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan diantaranya
adalah aquades, eter, etanol, heksan, kaolin, CaO (Merck), asam sitrat, asetonitril (J.T. Baker
9017-03), metanol (Merck 1.06009.2500).
Piranti
Piranti yang digunakan antara lain almunium, buchner , cabinet drying , cawan petri, kolf
(Schott duran, made in German), corong pisah (Schott duran, made in German), erlenmeyer, gelas
ukur (Pyrex), grinder (AIRLUX), kertas saring, labu ukur (Pyrex), mortar, neraca analitik
(Mettler H80), penangas air (Memmert), pH meter (Hanna Hl9812, made in Romania), plat
almunium (3 × 15 cm), power supply (Goldstar), rotary evaporator (Buchi R114), sentrifuge
(Swing Type centrifuge Model C-40N Tomy seiko co, ltd), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) (Smart Line, Knauer Advanced Scientific Instruments), spektrofotometer (Shimadzu,
UVmini 1240), dan sokhlet.
Metode
Preparasi Sampel
Sampel dibersihkan dari tanah, kemudian dikeringkan dengan cabinet drying selama 24
jam dan dihaluskan menggunakan grinder .
Defatisasi Sampel
100 gram sampel didefatisasi menggunakan sokhlet dengan pelarut heksan sebanyak 1 L
untuk masing-masing langkah optimasi. Defatisasi dilakukan hingga warna larutan menjadi
bening. Residu hasil defatisasi selanjutnya digunakan untuk optimasi ekstraksi.
Ekstraksi Sampel dengan Metode Berkesinambungan (Sokhletasi)
Masing-masing 100 gram sampel defat dan non defat diekstraksi menggunakan metode
ekstraksi berkesinambungan dengan sokhlet. Sejumlah masing-masing 2 L etanol ditambahkan
untuk mengekstrak steviosida. Ekstraksi dilakukan hingga warna larutan menjadi bening.
Ektraksi Sampel Dengan Metoda Maserasi
Masing-masing 100 gram sampel defat dan non defat dimaserasi dengan 2 L etanol
secara bertingkat (4×500 mL masing-masing 1 jam). Kemudian residu dan filtrat dipisahkan
melalui penyaringan.
Deklorofilasi
Filtrat hasil metoda maserasi dan ekstraksi berkesinambungan dipekatkan dengan rotary
evaporator hingga volume menjadi setengah dari volume awal. Selanjutnya, hasil dari pemekatan
ditambahkan aquades dengan perbandingan 1:1 dan penambahan 1% garam (NaCl) dari total
volumenya. Elektrolisis dilakukan selama 2,5 jam dengan menggunakan plat alumunium (ukuran
3×15 cm) sebagai elektrode. Arus dan tegangan digunakan power supply adalah 0,9 A dan 16,931,6 V secara berurutan. Filtratnya disaring dan siap untuk perlakuan selanjutnya
Redefatisasi
Larutan hasil deklorofilasi dipisahkan dari pengotornya dengan corong pisah
menggunakan pelarut eter. Langkah ini digunakan untuk memisahkan fase air yang mengandung
steviosida dan fase organik sebagai pengotornya. Partisi dilakukan secara bertingkat dengan
penambahan eter 2×100 mL.
Klarifikasi
Fase air hasil defatisasi diatur pH-nya menggunakan asam sitrat 50% hingga pH 3.
Kristalisasi
Larutan sampel yang telah diklarifikasi diatur kembali pH-nya menjadi pH 10,5
menggunakan larutan CaO 50%. Filtrat hasil penyaringan diatur kembali pH-nya menjadi pH 7
dengan menggunakan asam sitrat 50%. Untuk menghilangkan sisa-sisa lemak, larutan didefatisasi
kembali dengan pelarut eter (1×100 mL), kemudian dipartisi dengan pelarut etil asetat secara
bertingkat (5×100 mL). Fase organik diambil dan dipekatkan dengan rotary evaporator . Setelah
dipekatkan maka akan terbentuk kristal putih. Untuk memaksimalkan pembentukan kristal, maka
larutan disimpan dalam lemari es semalam (0-5 °C).
Analisis Sampel
Analisis Ekstrak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Identifikasi steviosida dilakukan dengan menggunakan KCKT. Sebagai fase diam KCKT
adalah RP C18 dan fase geraknya adalah asetonitril, metanol, dan air dengan flow rate
1,5mL/menit.
Elusi
fase
gerak
dilakukan
secara
isokratik
menggunakan
(aquades:methanol=70:20):(acetonitril)=76:24, dan volume sampel yang diinjeksikan adalah
20μL. Deteksi pemisahan menggunakan Detektor UV Smart Line Knauer pada panjang
gelombang 217nm.
Analisis Spektra Steviosida dari Ektraksi Secara Spektroskopi
Kristal steviosida dilarutkan dalam metanol. Larutan steviosida kemudian dilihat pola
serapan cahayanya pada panjang gelombang 200-400 nm.
HASIL DAN DISKUSI
Ekstraksi steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.) telah melalui beberapa tahap antara
lain ekstraksi sampel, defatisasi sampel, dan kristalisasi sampel. Ekstraksi sampel dilakukan
dengan menggunakan variasi empat metode yaitu metode defatisasi-berkesinambungan (A),
defatisasi-maserasi (B), nondefatisasi-berkesinambungan (C), dan nondefatisasi-maserasi (D).
Keempat metode ini menggunakan pelarut etanol. Hasil penelitian Moraes dan Machado (2001)
menunjukkan bahwa penggunaan pelarut etanol memberikan hasil yang lebih jernih bila
dibandingkan dengan menggunakan air dan metanol, dan relatif aman bagi konsumsi masyarakat.
Dalam penelitian ini tahap penghilangan pengotor juga dilakukan agar tidak menghambat
pembentukan kristal. Proses penjernihan larutan steviosida menggunakan kaolin karena kaolin
mudah didapatkan, murah, dan sangat cepat dalam mengikat pengotor yang menghambat
pembentukan kristal steviosida. Selain pengotor, lemak dalam ekstrak steviosida dapat
dihilangkan dengan defatisasi sampel menggunakan pelarut dietil eter secara ekstraksi cair-cair.
Hasil yang didapat menunjukkan bahwa komponen-komponen non polar seperti lemak dapat
terangkat dan dipisahkan.
Langkah penting lain dalam penelitian ini adalah menghilangkan pengaruh warna hijau
pigmen daun dengan cara deklorofilasi menggunakan metode elektrokoagulasi selama 2,5 jam
(Jumpaton dkk., 2006). Hal ini dimaksudkan supaya warna hijau dari pigmen nantinya tidak
mempengaruhi visualisasi kristal saat pemisahan (Moraes dan Machado, 2001). Efektifitas
deklorofilasi masing-masing metode dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Data Efektifitas Deklorofilasi Pada Tiap Sampel.
Absorbansi
A664
Sampel
Efektifitas(%)
Sebelum deklorofilasi
Setelah deklorofilasi
A
28,6
0,16
99,44
B
52,9
2,27
94,76
C
18,2
2,12
88,35
D
39,1
0,47
98,80
Pada Tabel 1. dapat dilihat bahwa, langkah deklorofilasi memiliki efektifitas penyusutan
warna lebih dari 85%. Penyusutan intensitas warna diakibatkan dari pemecahan klorofil menjadi
turunannya yaitu feofitin yang dikarenakan kehilangan atom Mg. Hasil ini sesuai dengan hasil
penelitian Jumpatong dkk (2006) dan Martono dkk (2007) yang menyatakan bahwa deklorofilasi
menghilangkan pigmen yang memperbaiki visualisasi kristal.
Setelah deklorofilasi, proses klarifikasi dilakukan dengan penambahan kaolin untuk
menghilangkan sisa klorofil. Klarifikasi merupakan langkah penting karena akan memberikan
kualitas visual produk yang lebih baik (Moraes dan Machado, 2001).
Pembentukan kristal juga dipengaruhi oleh perubahan pH larutan secara ekstrim (Dubois,
2005). Oleh karena itu, pada penelitian ini, pH larutan steviosida dirubah secara ekstrim dari pH 3
menjadi pH 10,5. Pada penelitian ini, pH larutan disesuaikan ke lingkungan asam dengan
menggunakan asam sitrat 50%. Penggunaan asam sitrat ini berfungsi untuk mengikat logam,
protein, dan warna sebagai pengotor agar diperoleh kristal yang lebih baik (Kumar dan Sampath,
1986).
Tabel 2. Data Kadar Steviosida (%) Dalam Kristal.
Metoda
Kadar Steviosida
Defatisasi – Berkesinambungan (A)
5,42
Defatisasi – Maserasi (B)
10,30
Nondefatisasi – Berkesinambungan (C)
Nondefatisasi – Maserasi (D)
9,17
Pada Tabel 2. dapat dilihat data kadar steviosida dalam kristal pada berbagai metode
preparasi ekstraksi sampel yang dilakukan. Perbedaan utama antara metode A, B, C, dan D adalah
pada proses ekstraksinya. Metode A dan C menggunakan suhu yang lebih tinggi (70 oC) dalam
waktu yang lama secara berkesinambungan. Penggunaan suhu tinggi dalam waktu yang lama
secara berkesinambungan ternyata dapat menyebabkan senyawa steviosida terdegradasi dan atau
berubah bentuk (Kroyer, 2010). Hal ini terlihat dari hasil penelitian yaitu pada metode A dan C
memiliki kadar steviosida yang lebih rendah dibanding metode B dan D.
Salah satu faktor yang harus dipertimbangkan secara aplikatif adalah efisiensi. Walaupun
metode B mengandung steviosida lebih tinggi dibanding metode D, tetapi metode D lebih efisien
dibanding metode B. Kadar steviosida metode D (9,17%) tidak berbeda jauh dengan metode B
(10,30%). Oleh karena itu, metode D menjadi metode yang selanjutnya dioptimalkan untuk
proses kristalisasi steviosida.
Kromatogram dari standar steviosida dan kristal hasil ekstraksi dapat dilihat pada
Gambar 1.
[A]
[B]
[C]
[D]
Gambar 1. Kromatogram [A].standar steviosida (tR=14,317), [B] Metode Defatisasi – Maserasi
(tR=14,000), [C].Metode Defatisasi – Berkesinambungan (tR=14,067), [D]. Metode
Nondefatisasi – Maserasi (tR=13,667)
Analisis Spektra dan Kadar Kandungan Steviosida dari Ekstrak Secara Spektroskopi
Analisis kuantitatif secara spektrofotometri juga dapat dilakukan dengan melihat pola
spektranya. Steviosida tidak menunjukan adanya serapan warna, oleh sebab itu pola spectra dari
ekstrak hanya dilihat pada daerah serapan UV 200-400 nm yang ditunjukan pada Gambar 2.
dibawah. Dari pola spektra yang diperoleh, diketahui bahwa ektrak steviosida mempunyai
serapan maksimum pada panjang gelombang 215 nm. Hasil penelitian Pasquel dkk. (2000),
memberikan hasil serapan maksimum steviosida pada panjang gelombang 210 nm. Hal ini
memperkuat hasil bahwa kristal yang diperoleh dalam penelitian ini telah mengandung steviosida.
[A]
[B]
[C]
[D]
Gambar 2. [A]Spektra standar steviosida [B]Spektra Defatisasi – Maserasi [C]Spektra Defatisasi –
Berkesinambungan [D]Spektra Nondefatisasi – Maserasi.
KESIMPULAN
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa metode preparasi dan ekstraksi sampel yang
paling efisien dan aplikatif adalah nondefatisasi-maserasi, dengan efektifitas deklorofilasi dan
kadar steviosida secara berturut-turut sebesar 98,80% dan 9,17%.
Daftar Pustaka
Du Bois, G. E. 2005. SteviolmonosideAnalogs. http://www.freepatentsonline.com/4402990.html
Jumpatong, K.,Weerachai Phutdhawong, and Duang Buddhasukh. 2006 Dechlorophyllation by
Electrocoagulation.
http://www.mdpi.org
Kim KK, Sawa Y, dan Shibata H. 1996. Hydroxylation of ent-kaurenoic acid to steviol in Stevia
rebaudiana Bertoni-purification and partial characterization of enzyme. Arch
Biochem Biophys; 332(2):223-230
Kumar dan Sampath, 1986. Method For Recovery of Stevioside. United States Patent 4599403
Kroyer Gerhard, 2010, Stevioside and Stevia-sweetener in food: application, stability and
interaction with food ingredients. Switzerland 2010
Moraes, Ĕlida de Paula., Machado, Nádia Regina Camargo Fernandes. 2001.Clarification of
Stevia Rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in modified zeolites.
Maringáv.23, n. 6, p. 1375-1380
Mudjajanto, E.S. 2005. Keamanan Jajanan Tradisional. http://www.kompas.com/kompascetak/0502/17/ilpeng/1563189.htm.
Martono, Yohanes., Hari Kristopo, Lydia Ruth Sihasale. 2007. Recovery Produk Ekstrak
Steviosida sebagai Alternatif Pengganti Gula dari Stevia rebaudiana (Bert.). Salatiga,
Program Penelitian Pemula (dibiayai oleh DIKNAS Propinsi Jawa Tengah).
Philips, K.C. 1987. Stevia: step in developing a new sweetener. In:T.H.Grenby (Ed.),
Development in Sweeteners 3, Elsevier, New York, p.1.
Pasquel, A., Meireles, M.A.A., Marques, M.O.M., dan A.J. Petenate. (2000). Extraction Of
Stevia Glycosides With CO 2 + Water, CO 2 + Ethanol, AND CO 2 + Water+ Ethanol,
Braz. J. Chem. Eng. São Paulo, vol.17 n.3: 438-448
Suttajit, M., Vinitketaumnuem, U., Meevatee, U. dan Buddhasukh, D. 1993Mutagenicity and
Human Chromosomal Effect of Stevioside, a Sweetener From Stevia rebaudiana
Bertoni. Environmental Health Perspective, 101 (Suppl.3), 53-56
Xili, L., Chengjiany, B.,Eryi X., Reiming, S., Yuenming, W., Haodong, S., dan Zhiyian, H. 1992
Chronic Oral Toxicity and Carcinogenicity Study of Stevioside in Rats. Food and
Chemical Toxiology, 30, 957-965.
Yodyinguard, V. dan Bunyawong, S. 1991. Effect of Stevioside on Growth and Reproduction.
Human Reproduction,6 158-165.
Stevia rebaudiana (Bert.) DALAM PROSES KRISTALISASI
STEVIOSIDA
Yohanes Martono, Yohan, Lusiawati Dewi
Prodi Kimia Fakultas Sains dan Matematika
Universitas Kristen Satya Wacana
Jl. Diponegoro 52 – 60 Salatiga
e-mail: yohanes_mart@yahoo.co.id
ABSTRAK
Stevia rebaudiana Bert. merupakan tanaman herbal yang mengandung senyawa glikosida alami
dimana kemanisannya mencapai 300 kali sukrosa dan aman dikonsumsi. Senyawa glikosida alami
yang dominan dalam Stevia rebaudiana (Bert.) adalah steviosida yang dapat dikristalkan dan
dijadikan alternatif pengganti gula. Tujuan penelitian ini adalah melakukan optimasi preparasi
sampel yang meliputi defatisasi dan non defatisasi untuk tiap metode ekstraksi (maserasi dan
berkesinambungan) dalam proses kristalisasi steviosida. Sebagai parameter megoptimasi preparasi
dan metode ekstraksi sampel adalah efektifitas deklorofilasi dan kadar steviosida. Efektifitas
deklorofilasi ditentukan secara spektrofotometri sedangkan penetapan kadar steviosida digunakan
metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa
metode preparasi dan ekstraksi sampel yang paling efisien dan aplikatif adalah nondefatisasimaserasi, dengan efektifitas deklorofilasi dan kadar steviosida secara berturut-turut sebesar
98,80% dan 9,17%.
Keywords: optimasi, Stevia rebaudiana (Bert.), steviosida
PENDAHULUAN
Kebutuhan pemanis semakin meningkat seiring dengan peningkatan produksi pangan
dunia. Saat ini, pemenuhan kebutuhan pemanis di masyarakat dipenuhi dengan kehadiran gula
sukrosa. Bila dilihat dari sisi kesehatan, gula sukrosa memiliki efek samping seperti obesitas,
bahkan dapat memicu timbulnya penyakit diabetes. Dari efek samping tersebut, berbagai macam
solusi dihadirkan seperti penggunaan pemanis sintetis yang rendah kalori seperti sakarin dan
siklamat. Sebenarnya, pemanis sintetis ini hanya ditujukan untuk penderita diabetes atau
konsumen dengan diet rendah kalori. Berdasarkan beberapa penelitian, ternyata pemanis ini
bersifat karsinogenik apabila digunakan secara berlebihan dan berkesinambungan dalam jangka
waktu yang lama (Mudjajanto, 2005).
Dewasa ini, masyarakat cenderung mencari alternatif pemanis alami pengganti gula
sukrosa maupun pemanis sintetis yang tidak hanya aman dikonsumsi tetapi juga rendah kalori.
Salah satu alternatif pemanis alami tersebut adalah steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.)
dengan tingkat kemanisan 200 hingga 300 kali sukrosa (Philip, 1987). Beberapa penelitian
menyebutkan bahwa steviosida mengandung kalori yang rendah sampai dengan nol kalori
(Moraes dkk, 2001) sehingga aman bagi penderita diabetes atau konsumen yang sedang
melakukan diet. Berdasarkan hasil penelitian, steviosida aman dikonsumsi oleh masyarakat
umum karena tidak mempunyai efek teratogenik (Yodyingguard dan Bunyawong, 1991),
mutagenik (Suttajit dkk., 1993), atau karsinogenik (Xili dkk., 1992). Oleh sebab itu, penelitian
untuk mengekstrak daun stevia menjadi kristal yang mengandung steviosida yang tinggi dan
mempunyai visualisasi kristal yang dapat diterima masyarakat akan memiliki potensi ekonomi
yang besar.
Salah satu cara untuk mendapatkan kristal dari steviosida adalah dengan metoda
ekstraksi. Ekstraksi yang dikembangkan adalah ekstraksi pelarut yang dikombinasi dengan
langkah-langkah yang lain seperti klarifikasi, penyesuaian pH dan kristalisasi (Moraes dkk, 2001;
Philips, 1987). Keuntungan dari penggunanan metoda ini adalah mudah digunakan. Pelitian ini
bertujuan mengoptimasi preparasi sampel yang meliputi defatisasi dan non defatisasi untuk tiap
metode ekstraksi (maserasi dan berkesinambungan) dalam proses kristalisasi steviosida.
BAHAN DAN METODE
Bahan
Sampel yang digunakan adalah daun Stevia rebaudiana (Bert.) yang diperoleh dari
Tawangmangu, Kabupaten Karanganyar, Jawa Tengah. Bahan kimia yang digunakan diantaranya
adalah aquades, eter, etanol, heksan, kaolin, CaO (Merck), asam sitrat, asetonitril (J.T. Baker
9017-03), metanol (Merck 1.06009.2500).
Piranti
Piranti yang digunakan antara lain almunium, buchner , cabinet drying , cawan petri, kolf
(Schott duran, made in German), corong pisah (Schott duran, made in German), erlenmeyer, gelas
ukur (Pyrex), grinder (AIRLUX), kertas saring, labu ukur (Pyrex), mortar, neraca analitik
(Mettler H80), penangas air (Memmert), pH meter (Hanna Hl9812, made in Romania), plat
almunium (3 × 15 cm), power supply (Goldstar), rotary evaporator (Buchi R114), sentrifuge
(Swing Type centrifuge Model C-40N Tomy seiko co, ltd), Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT) (Smart Line, Knauer Advanced Scientific Instruments), spektrofotometer (Shimadzu,
UVmini 1240), dan sokhlet.
Metode
Preparasi Sampel
Sampel dibersihkan dari tanah, kemudian dikeringkan dengan cabinet drying selama 24
jam dan dihaluskan menggunakan grinder .
Defatisasi Sampel
100 gram sampel didefatisasi menggunakan sokhlet dengan pelarut heksan sebanyak 1 L
untuk masing-masing langkah optimasi. Defatisasi dilakukan hingga warna larutan menjadi
bening. Residu hasil defatisasi selanjutnya digunakan untuk optimasi ekstraksi.
Ekstraksi Sampel dengan Metode Berkesinambungan (Sokhletasi)
Masing-masing 100 gram sampel defat dan non defat diekstraksi menggunakan metode
ekstraksi berkesinambungan dengan sokhlet. Sejumlah masing-masing 2 L etanol ditambahkan
untuk mengekstrak steviosida. Ekstraksi dilakukan hingga warna larutan menjadi bening.
Ektraksi Sampel Dengan Metoda Maserasi
Masing-masing 100 gram sampel defat dan non defat dimaserasi dengan 2 L etanol
secara bertingkat (4×500 mL masing-masing 1 jam). Kemudian residu dan filtrat dipisahkan
melalui penyaringan.
Deklorofilasi
Filtrat hasil metoda maserasi dan ekstraksi berkesinambungan dipekatkan dengan rotary
evaporator hingga volume menjadi setengah dari volume awal. Selanjutnya, hasil dari pemekatan
ditambahkan aquades dengan perbandingan 1:1 dan penambahan 1% garam (NaCl) dari total
volumenya. Elektrolisis dilakukan selama 2,5 jam dengan menggunakan plat alumunium (ukuran
3×15 cm) sebagai elektrode. Arus dan tegangan digunakan power supply adalah 0,9 A dan 16,931,6 V secara berurutan. Filtratnya disaring dan siap untuk perlakuan selanjutnya
Redefatisasi
Larutan hasil deklorofilasi dipisahkan dari pengotornya dengan corong pisah
menggunakan pelarut eter. Langkah ini digunakan untuk memisahkan fase air yang mengandung
steviosida dan fase organik sebagai pengotornya. Partisi dilakukan secara bertingkat dengan
penambahan eter 2×100 mL.
Klarifikasi
Fase air hasil defatisasi diatur pH-nya menggunakan asam sitrat 50% hingga pH 3.
Kristalisasi
Larutan sampel yang telah diklarifikasi diatur kembali pH-nya menjadi pH 10,5
menggunakan larutan CaO 50%. Filtrat hasil penyaringan diatur kembali pH-nya menjadi pH 7
dengan menggunakan asam sitrat 50%. Untuk menghilangkan sisa-sisa lemak, larutan didefatisasi
kembali dengan pelarut eter (1×100 mL), kemudian dipartisi dengan pelarut etil asetat secara
bertingkat (5×100 mL). Fase organik diambil dan dipekatkan dengan rotary evaporator . Setelah
dipekatkan maka akan terbentuk kristal putih. Untuk memaksimalkan pembentukan kristal, maka
larutan disimpan dalam lemari es semalam (0-5 °C).
Analisis Sampel
Analisis Ekstrak Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Identifikasi steviosida dilakukan dengan menggunakan KCKT. Sebagai fase diam KCKT
adalah RP C18 dan fase geraknya adalah asetonitril, metanol, dan air dengan flow rate
1,5mL/menit.
Elusi
fase
gerak
dilakukan
secara
isokratik
menggunakan
(aquades:methanol=70:20):(acetonitril)=76:24, dan volume sampel yang diinjeksikan adalah
20μL. Deteksi pemisahan menggunakan Detektor UV Smart Line Knauer pada panjang
gelombang 217nm.
Analisis Spektra Steviosida dari Ektraksi Secara Spektroskopi
Kristal steviosida dilarutkan dalam metanol. Larutan steviosida kemudian dilihat pola
serapan cahayanya pada panjang gelombang 200-400 nm.
HASIL DAN DISKUSI
Ekstraksi steviosida dari Stevia rebaudiana (Bert.) telah melalui beberapa tahap antara
lain ekstraksi sampel, defatisasi sampel, dan kristalisasi sampel. Ekstraksi sampel dilakukan
dengan menggunakan variasi empat metode yaitu metode defatisasi-berkesinambungan (A),
defatisasi-maserasi (B), nondefatisasi-berkesinambungan (C), dan nondefatisasi-maserasi (D).
Keempat metode ini menggunakan pelarut etanol. Hasil penelitian Moraes dan Machado (2001)
menunjukkan bahwa penggunaan pelarut etanol memberikan hasil yang lebih jernih bila
dibandingkan dengan menggunakan air dan metanol, dan relatif aman bagi konsumsi masyarakat.
Dalam penelitian ini tahap penghilangan pengotor juga dilakukan agar tidak menghambat
pembentukan kristal. Proses penjernihan larutan steviosida menggunakan kaolin karena kaolin
mudah didapatkan, murah, dan sangat cepat dalam mengikat pengotor yang menghambat
pembentukan kristal steviosida. Selain pengotor, lemak dalam ekstrak steviosida dapat
dihilangkan dengan defatisasi sampel menggunakan pelarut dietil eter secara ekstraksi cair-cair.
Hasil yang didapat menunjukkan bahwa komponen-komponen non polar seperti lemak dapat
terangkat dan dipisahkan.
Langkah penting lain dalam penelitian ini adalah menghilangkan pengaruh warna hijau
pigmen daun dengan cara deklorofilasi menggunakan metode elektrokoagulasi selama 2,5 jam
(Jumpaton dkk., 2006). Hal ini dimaksudkan supaya warna hijau dari pigmen nantinya tidak
mempengaruhi visualisasi kristal saat pemisahan (Moraes dan Machado, 2001). Efektifitas
deklorofilasi masing-masing metode dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Data Efektifitas Deklorofilasi Pada Tiap Sampel.
Absorbansi
A664
Sampel
Efektifitas(%)
Sebelum deklorofilasi
Setelah deklorofilasi
A
28,6
0,16
99,44
B
52,9
2,27
94,76
C
18,2
2,12
88,35
D
39,1
0,47
98,80
Pada Tabel 1. dapat dilihat bahwa, langkah deklorofilasi memiliki efektifitas penyusutan
warna lebih dari 85%. Penyusutan intensitas warna diakibatkan dari pemecahan klorofil menjadi
turunannya yaitu feofitin yang dikarenakan kehilangan atom Mg. Hasil ini sesuai dengan hasil
penelitian Jumpatong dkk (2006) dan Martono dkk (2007) yang menyatakan bahwa deklorofilasi
menghilangkan pigmen yang memperbaiki visualisasi kristal.
Setelah deklorofilasi, proses klarifikasi dilakukan dengan penambahan kaolin untuk
menghilangkan sisa klorofil. Klarifikasi merupakan langkah penting karena akan memberikan
kualitas visual produk yang lebih baik (Moraes dan Machado, 2001).
Pembentukan kristal juga dipengaruhi oleh perubahan pH larutan secara ekstrim (Dubois,
2005). Oleh karena itu, pada penelitian ini, pH larutan steviosida dirubah secara ekstrim dari pH 3
menjadi pH 10,5. Pada penelitian ini, pH larutan disesuaikan ke lingkungan asam dengan
menggunakan asam sitrat 50%. Penggunaan asam sitrat ini berfungsi untuk mengikat logam,
protein, dan warna sebagai pengotor agar diperoleh kristal yang lebih baik (Kumar dan Sampath,
1986).
Tabel 2. Data Kadar Steviosida (%) Dalam Kristal.
Metoda
Kadar Steviosida
Defatisasi – Berkesinambungan (A)
5,42
Defatisasi – Maserasi (B)
10,30
Nondefatisasi – Berkesinambungan (C)
Nondefatisasi – Maserasi (D)
9,17
Pada Tabel 2. dapat dilihat data kadar steviosida dalam kristal pada berbagai metode
preparasi ekstraksi sampel yang dilakukan. Perbedaan utama antara metode A, B, C, dan D adalah
pada proses ekstraksinya. Metode A dan C menggunakan suhu yang lebih tinggi (70 oC) dalam
waktu yang lama secara berkesinambungan. Penggunaan suhu tinggi dalam waktu yang lama
secara berkesinambungan ternyata dapat menyebabkan senyawa steviosida terdegradasi dan atau
berubah bentuk (Kroyer, 2010). Hal ini terlihat dari hasil penelitian yaitu pada metode A dan C
memiliki kadar steviosida yang lebih rendah dibanding metode B dan D.
Salah satu faktor yang harus dipertimbangkan secara aplikatif adalah efisiensi. Walaupun
metode B mengandung steviosida lebih tinggi dibanding metode D, tetapi metode D lebih efisien
dibanding metode B. Kadar steviosida metode D (9,17%) tidak berbeda jauh dengan metode B
(10,30%). Oleh karena itu, metode D menjadi metode yang selanjutnya dioptimalkan untuk
proses kristalisasi steviosida.
Kromatogram dari standar steviosida dan kristal hasil ekstraksi dapat dilihat pada
Gambar 1.
[A]
[B]
[C]
[D]
Gambar 1. Kromatogram [A].standar steviosida (tR=14,317), [B] Metode Defatisasi – Maserasi
(tR=14,000), [C].Metode Defatisasi – Berkesinambungan (tR=14,067), [D]. Metode
Nondefatisasi – Maserasi (tR=13,667)
Analisis Spektra dan Kadar Kandungan Steviosida dari Ekstrak Secara Spektroskopi
Analisis kuantitatif secara spektrofotometri juga dapat dilakukan dengan melihat pola
spektranya. Steviosida tidak menunjukan adanya serapan warna, oleh sebab itu pola spectra dari
ekstrak hanya dilihat pada daerah serapan UV 200-400 nm yang ditunjukan pada Gambar 2.
dibawah. Dari pola spektra yang diperoleh, diketahui bahwa ektrak steviosida mempunyai
serapan maksimum pada panjang gelombang 215 nm. Hasil penelitian Pasquel dkk. (2000),
memberikan hasil serapan maksimum steviosida pada panjang gelombang 210 nm. Hal ini
memperkuat hasil bahwa kristal yang diperoleh dalam penelitian ini telah mengandung steviosida.
[A]
[B]
[C]
[D]
Gambar 2. [A]Spektra standar steviosida [B]Spektra Defatisasi – Maserasi [C]Spektra Defatisasi –
Berkesinambungan [D]Spektra Nondefatisasi – Maserasi.
KESIMPULAN
Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa metode preparasi dan ekstraksi sampel yang
paling efisien dan aplikatif adalah nondefatisasi-maserasi, dengan efektifitas deklorofilasi dan
kadar steviosida secara berturut-turut sebesar 98,80% dan 9,17%.
Daftar Pustaka
Du Bois, G. E. 2005. SteviolmonosideAnalogs. http://www.freepatentsonline.com/4402990.html
Jumpatong, K.,Weerachai Phutdhawong, and Duang Buddhasukh. 2006 Dechlorophyllation by
Electrocoagulation.
http://www.mdpi.org
Kim KK, Sawa Y, dan Shibata H. 1996. Hydroxylation of ent-kaurenoic acid to steviol in Stevia
rebaudiana Bertoni-purification and partial characterization of enzyme. Arch
Biochem Biophys; 332(2):223-230
Kumar dan Sampath, 1986. Method For Recovery of Stevioside. United States Patent 4599403
Kroyer Gerhard, 2010, Stevioside and Stevia-sweetener in food: application, stability and
interaction with food ingredients. Switzerland 2010
Moraes, Ĕlida de Paula., Machado, Nádia Regina Camargo Fernandes. 2001.Clarification of
Stevia Rebaudiana (Bert.) Bertoni extract by adsorption in modified zeolites.
Maringáv.23, n. 6, p. 1375-1380
Mudjajanto, E.S. 2005. Keamanan Jajanan Tradisional. http://www.kompas.com/kompascetak/0502/17/ilpeng/1563189.htm.
Martono, Yohanes., Hari Kristopo, Lydia Ruth Sihasale. 2007. Recovery Produk Ekstrak
Steviosida sebagai Alternatif Pengganti Gula dari Stevia rebaudiana (Bert.). Salatiga,
Program Penelitian Pemula (dibiayai oleh DIKNAS Propinsi Jawa Tengah).
Philips, K.C. 1987. Stevia: step in developing a new sweetener. In:T.H.Grenby (Ed.),
Development in Sweeteners 3, Elsevier, New York, p.1.
Pasquel, A., Meireles, M.A.A., Marques, M.O.M., dan A.J. Petenate. (2000). Extraction Of
Stevia Glycosides With CO 2 + Water, CO 2 + Ethanol, AND CO 2 + Water+ Ethanol,
Braz. J. Chem. Eng. São Paulo, vol.17 n.3: 438-448
Suttajit, M., Vinitketaumnuem, U., Meevatee, U. dan Buddhasukh, D. 1993Mutagenicity and
Human Chromosomal Effect of Stevioside, a Sweetener From Stevia rebaudiana
Bertoni. Environmental Health Perspective, 101 (Suppl.3), 53-56
Xili, L., Chengjiany, B.,Eryi X., Reiming, S., Yuenming, W., Haodong, S., dan Zhiyian, H. 1992
Chronic Oral Toxicity and Carcinogenicity Study of Stevioside in Rats. Food and
Chemical Toxiology, 30, 957-965.
Yodyinguard, V. dan Bunyawong, S. 1991. Effect of Stevioside on Growth and Reproduction.
Human Reproduction,6 158-165.