B1J010034 11.
III. METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
1. Materi Penelitian
Materi yang diteliti adalah ikan nilem (Osteochilus hasselti C. V.), pada
tahap perkembangan juvenil berumur 13 minggu dengan panjang tubuh 45-65 mm
(hasil pemijahan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan) sebanyak
144 ekor.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian telah dilakukan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan
Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. Penelitian
dilaksanakan mulai bulan Mei 2014 sampai dengan bulan Oktober 2014.
B. Rancangan Percobaan
Penelitian dilaksanakan secara eksperimental dengan Rancangan Acak
Lengkap pola Faktorial. Faktor pertama posisi amputasi terdiri atas empat taraf
N1: kontrol, N2: pangkal, N3: pertengahan antara cagak dan pangkal, N4: cagak.
Faktor kedua adalah pakan berkadar protein berbeda terdiri atas tiga taraf yaitu
P1: 33%, P2: 35%, dan P3: 42%. Jumlah kombinasi perlakuan sebanyak 12, pada
setiap perlakuan disediakan 3 unit ulangan.
Variabel yang diamati terdiri dari variabel bebas dan variabel tergantung.
Variabel bebas adalah posisi amputasi dan kadar protein pakan. Variabel
tergantung berupa regenerasi sirip juvenil ikan nilem pasca amputasi dengan
parameter pertambahan panjang dan luas sirip pada daerah amputasi dan data
kualitatif berupa struktur histologis jaringan sirip yang baru.
Tabel 3.1. Kombinasi Perlakuan antara Posisi Pemotongan dengan Kadar
Protein dalam Pakan
bio.unsoed.ac.id
Posisi amputasi
(N)
Protein
Pakan ( P )
N1
N2
N3
N4
P1
P2
P3
P1N1
P2N1
P3N1
P1N2
P2N2
P3N2
P1N3
P2N3
P3N3
P1N4
P2N4
P3N4
C. Cara Kerja
1 . Pemijahan dan Penyediaan Ikan Uji
Induk ikan Nilem jantan dan betina yang matang gonad disiapkan,
keduanya diinduksi menggunakan ovaprim 0,5 ml/kg berat badan. Induk betina
dan jantan diletakkan pada bak pemeliharaan berukuran 50 cm x 45 cm x 35 cm
selama 6-8 jam, kemudian induk jantan dan betina dipisahkan. Selanjutnya induk
jantan distripping untuk mengeluarkan milt, sedangkan induk betina distripping
untuk mengeluarkan sel telur. Fertilisasi dilakukan dengan cara mencampurkan
milt dan sel telur kedua induk di dalam piring cawan kecil dengan akuades untuk
aktivasi spermatozoa. Setelah terjadi kontak antara milt dan sel telur kemudian
campuran ini dimasukkan ke dalam bak pemeliharaan berukuran 50 cm x 45 cm x
35 cm. Larva hasil fertilisasi kemudian dipelihara selama 12 minggu di bak
pemeliharaan sampai tahap juvenil dengan diberi pakan dua kali sehari pukul
09.00 dan 15.00 menggunakan pakan ikan komersil dengan kandungan protein
41% dan lemak 6%.
2. Persiapan Bak Pemeliharaan
Bak pemeliharaan berukuran 20 l, dibersihkan terlebih dahulu dengan air,
kemudian diisi air sebanyak 18 l dan diberi aerasi untuk mempertahankan
kandungan oksigen terlarut dalam air. Disiapkan 36 buah bak pemeliharaan
berukuran 35 cm x 25 cm x 20 cm yang masing-masing diisi larva 12 minggu
sebanyak 4 ekor.
3. Pengukuran Panjang dan Penimbangan Bobot Ikan Uji
Panjang tubuh diukur menggunakan kertas millimeter blok dengan
ketelitian 1 mm dan bobot tubuh ikan uji ditimbang menggunakan timbangan
analitik dengan ketelitian 0,01 g. Bobot ikan uji setiap bak pemeliharaan diukur
bio.unsoed.ac.id
untuk menentukan jumlah pakan yang diberikan.
4. Pemotongan Sirip dan Pemeliharaan Ikan Uji
Proses pemotongan sirip diawali dengan pengukuran panjang total ikan
menggunakan milimeter blok, kemudian dilakukan pemotongan sirip pada bagian
sirip ekor dengan tiga posisi pemotongan yang berbeda dimulai dari bagian
11
pangkal, pertengahan antara pangkal dan cagak, cagak (Gambar 3.1.-3.3.), dan
pengukuran panjang sirip yang dipotong.
Gambar 3.1. Posisi Amputasi pada Pangkal Sirip Ekor
Gambar 3.2. Posisi Amputasi pada Pertengahan Pangkal dan Cagak
Sirip Ekor
Gambar 3.3. Posisi Amputasi pada Batas Cagak Sirip Ekor
bio.unsoed.ac.id
Setelah proses pemotongan sirip, ikan dipelihara selama 5 minggu dengan
diberi pakan dua kali sehari pukul 09.00 dan 15.00 yang berkadar protein berbeda,
yaitu 33%, 35%, 42% sebanyak 5% dari berat biomassa ikan (Melianawati dan
Suwirya, 2010).
12
5. Pengambilan data dan Evaluasi Pertumbuhan Sirip Regeneratif Secara
Makroskopis
Data penelitian berupa perkembangan sirip ekor pada juvenile ikan nilem
paska amputasi yang diukur setiap 7 hari sekali. Pengukuran pertambahan panjang
dan luas pada bagian sirip ekor dilakukan menggunakan mikroskop stereo dengan
bantuan eye piece micrometer yang telah dikalibrasi dan bentuk sirip hasil
regenerasi didokumentasikan melalui foto. Disamping pengukuran panjang sirip
juga diamati struktur histologis sirip yang beregenerasi dan struktur histologis
didokumentasikan dalam bentuk foto.
6. Evaluasi Pertumbuhan Sirip Regeneratif Secara Mikroskopis
Evaluasi pertumbuhan sirip regeneratif pada ikan uji secara mikroskopis
dilakukan dengan dua metode, seperti dijelaskan dibawah ini.
6.1. Pembuatan Sediaan Histologis Sirip dengan Metode Parafin (Suntoro,
1983; yang telah dimodifikasi oleh Laboratorium Struktur dan
Perkembangan Hewan, Fakultas Biologi Unsoed).
Sirip yang telah difiksasi dalam Normal Buffered Formalin (NBF)
kemudian didehidrasi dalam larutan alkohol bertingkat dari alkohol 70%
hingga alkohol absolut, didealkoholisasi dalam larutan alkohol:xylol dan
xylol, diinfiltrasi dalam larutan xylol:parafin dan parafin murni, serta ditanam
dalam
parafin.
Pengirisan
jaringan
dalam
blok
parafin
dilakukan
menggunakan rotary microtome dengan ketebalan 4 µm. Irisan jaringan
ditempel pada object glass yang sudah dilapisi gelatin 1% akuosa dan
dikeringkan pada suhu ruang. Irisan dideparafinisasi kemudian diwarnai
dengan pewarna Carrazzi’s Hematoxylin-Eosin dan Alizarin Red. Cara kerja
pembuatan sediaan histologis secara rinci dijelaskan pada Lampiran 2.
6.2. Evaluasi Sediaan Histologis
bio.unsoed.ac.id
Tahapan regenerasi sirip diawali dengan proses penutupan luka oleh
lapisan epitel, kemudian blastema terbentuk melalui proses dedifferentiation
dan bergerak ke bagian epitel untuk menutup luka. Fase berikutnya dari
regenerasi ditandai dengan deposisi tulang (Atta et al., 2013). Struktur
histologis pada proses regenerasi sirip setelah amputasi dievaluasi
berdasarkan terbentuknya lapisan epidermal berlapis banyak, migrasi sel
mesenchym distal ke bagian yang diamputasi, proliferasi sel mesenchym
13
untuk membentuk blastema, diferensiasi blastema pada bagian distal untuk
membentuk sirip baru (Böckelmann dan Bechara, 2009).
D. Metode Analisis
Data pertambahan panjang dan luas sirip hasil regenerasi ditabulasi
kemudian dianalisis menggunakan Anova dua arah. Hasil Anova menunjukkan
berbeda nyata pada p
A. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
1. Materi Penelitian
Materi yang diteliti adalah ikan nilem (Osteochilus hasselti C. V.), pada
tahap perkembangan juvenil berumur 13 minggu dengan panjang tubuh 45-65 mm
(hasil pemijahan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Hewan) sebanyak
144 ekor.
2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian telah dilakukan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan
Hewan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. Penelitian
dilaksanakan mulai bulan Mei 2014 sampai dengan bulan Oktober 2014.
B. Rancangan Percobaan
Penelitian dilaksanakan secara eksperimental dengan Rancangan Acak
Lengkap pola Faktorial. Faktor pertama posisi amputasi terdiri atas empat taraf
N1: kontrol, N2: pangkal, N3: pertengahan antara cagak dan pangkal, N4: cagak.
Faktor kedua adalah pakan berkadar protein berbeda terdiri atas tiga taraf yaitu
P1: 33%, P2: 35%, dan P3: 42%. Jumlah kombinasi perlakuan sebanyak 12, pada
setiap perlakuan disediakan 3 unit ulangan.
Variabel yang diamati terdiri dari variabel bebas dan variabel tergantung.
Variabel bebas adalah posisi amputasi dan kadar protein pakan. Variabel
tergantung berupa regenerasi sirip juvenil ikan nilem pasca amputasi dengan
parameter pertambahan panjang dan luas sirip pada daerah amputasi dan data
kualitatif berupa struktur histologis jaringan sirip yang baru.
Tabel 3.1. Kombinasi Perlakuan antara Posisi Pemotongan dengan Kadar
Protein dalam Pakan
bio.unsoed.ac.id
Posisi amputasi
(N)
Protein
Pakan ( P )
N1
N2
N3
N4
P1
P2
P3
P1N1
P2N1
P3N1
P1N2
P2N2
P3N2
P1N3
P2N3
P3N3
P1N4
P2N4
P3N4
C. Cara Kerja
1 . Pemijahan dan Penyediaan Ikan Uji
Induk ikan Nilem jantan dan betina yang matang gonad disiapkan,
keduanya diinduksi menggunakan ovaprim 0,5 ml/kg berat badan. Induk betina
dan jantan diletakkan pada bak pemeliharaan berukuran 50 cm x 45 cm x 35 cm
selama 6-8 jam, kemudian induk jantan dan betina dipisahkan. Selanjutnya induk
jantan distripping untuk mengeluarkan milt, sedangkan induk betina distripping
untuk mengeluarkan sel telur. Fertilisasi dilakukan dengan cara mencampurkan
milt dan sel telur kedua induk di dalam piring cawan kecil dengan akuades untuk
aktivasi spermatozoa. Setelah terjadi kontak antara milt dan sel telur kemudian
campuran ini dimasukkan ke dalam bak pemeliharaan berukuran 50 cm x 45 cm x
35 cm. Larva hasil fertilisasi kemudian dipelihara selama 12 minggu di bak
pemeliharaan sampai tahap juvenil dengan diberi pakan dua kali sehari pukul
09.00 dan 15.00 menggunakan pakan ikan komersil dengan kandungan protein
41% dan lemak 6%.
2. Persiapan Bak Pemeliharaan
Bak pemeliharaan berukuran 20 l, dibersihkan terlebih dahulu dengan air,
kemudian diisi air sebanyak 18 l dan diberi aerasi untuk mempertahankan
kandungan oksigen terlarut dalam air. Disiapkan 36 buah bak pemeliharaan
berukuran 35 cm x 25 cm x 20 cm yang masing-masing diisi larva 12 minggu
sebanyak 4 ekor.
3. Pengukuran Panjang dan Penimbangan Bobot Ikan Uji
Panjang tubuh diukur menggunakan kertas millimeter blok dengan
ketelitian 1 mm dan bobot tubuh ikan uji ditimbang menggunakan timbangan
analitik dengan ketelitian 0,01 g. Bobot ikan uji setiap bak pemeliharaan diukur
bio.unsoed.ac.id
untuk menentukan jumlah pakan yang diberikan.
4. Pemotongan Sirip dan Pemeliharaan Ikan Uji
Proses pemotongan sirip diawali dengan pengukuran panjang total ikan
menggunakan milimeter blok, kemudian dilakukan pemotongan sirip pada bagian
sirip ekor dengan tiga posisi pemotongan yang berbeda dimulai dari bagian
11
pangkal, pertengahan antara pangkal dan cagak, cagak (Gambar 3.1.-3.3.), dan
pengukuran panjang sirip yang dipotong.
Gambar 3.1. Posisi Amputasi pada Pangkal Sirip Ekor
Gambar 3.2. Posisi Amputasi pada Pertengahan Pangkal dan Cagak
Sirip Ekor
Gambar 3.3. Posisi Amputasi pada Batas Cagak Sirip Ekor
bio.unsoed.ac.id
Setelah proses pemotongan sirip, ikan dipelihara selama 5 minggu dengan
diberi pakan dua kali sehari pukul 09.00 dan 15.00 yang berkadar protein berbeda,
yaitu 33%, 35%, 42% sebanyak 5% dari berat biomassa ikan (Melianawati dan
Suwirya, 2010).
12
5. Pengambilan data dan Evaluasi Pertumbuhan Sirip Regeneratif Secara
Makroskopis
Data penelitian berupa perkembangan sirip ekor pada juvenile ikan nilem
paska amputasi yang diukur setiap 7 hari sekali. Pengukuran pertambahan panjang
dan luas pada bagian sirip ekor dilakukan menggunakan mikroskop stereo dengan
bantuan eye piece micrometer yang telah dikalibrasi dan bentuk sirip hasil
regenerasi didokumentasikan melalui foto. Disamping pengukuran panjang sirip
juga diamati struktur histologis sirip yang beregenerasi dan struktur histologis
didokumentasikan dalam bentuk foto.
6. Evaluasi Pertumbuhan Sirip Regeneratif Secara Mikroskopis
Evaluasi pertumbuhan sirip regeneratif pada ikan uji secara mikroskopis
dilakukan dengan dua metode, seperti dijelaskan dibawah ini.
6.1. Pembuatan Sediaan Histologis Sirip dengan Metode Parafin (Suntoro,
1983; yang telah dimodifikasi oleh Laboratorium Struktur dan
Perkembangan Hewan, Fakultas Biologi Unsoed).
Sirip yang telah difiksasi dalam Normal Buffered Formalin (NBF)
kemudian didehidrasi dalam larutan alkohol bertingkat dari alkohol 70%
hingga alkohol absolut, didealkoholisasi dalam larutan alkohol:xylol dan
xylol, diinfiltrasi dalam larutan xylol:parafin dan parafin murni, serta ditanam
dalam
parafin.
Pengirisan
jaringan
dalam
blok
parafin
dilakukan
menggunakan rotary microtome dengan ketebalan 4 µm. Irisan jaringan
ditempel pada object glass yang sudah dilapisi gelatin 1% akuosa dan
dikeringkan pada suhu ruang. Irisan dideparafinisasi kemudian diwarnai
dengan pewarna Carrazzi’s Hematoxylin-Eosin dan Alizarin Red. Cara kerja
pembuatan sediaan histologis secara rinci dijelaskan pada Lampiran 2.
6.2. Evaluasi Sediaan Histologis
bio.unsoed.ac.id
Tahapan regenerasi sirip diawali dengan proses penutupan luka oleh
lapisan epitel, kemudian blastema terbentuk melalui proses dedifferentiation
dan bergerak ke bagian epitel untuk menutup luka. Fase berikutnya dari
regenerasi ditandai dengan deposisi tulang (Atta et al., 2013). Struktur
histologis pada proses regenerasi sirip setelah amputasi dievaluasi
berdasarkan terbentuknya lapisan epidermal berlapis banyak, migrasi sel
mesenchym distal ke bagian yang diamputasi, proliferasi sel mesenchym
13
untuk membentuk blastema, diferensiasi blastema pada bagian distal untuk
membentuk sirip baru (Böckelmann dan Bechara, 2009).
D. Metode Analisis
Data pertambahan panjang dan luas sirip hasil regenerasi ditabulasi
kemudian dianalisis menggunakan Anova dua arah. Hasil Anova menunjukkan
berbeda nyata pada p