LAPORAN PRAK TIKUM KIMIA ORGANIK
Paraf Asisten
LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ORGANIK
EKSTRAKSI DAN ANALISA PIGMEN DAUN BAYAM
Tujuan Percobaan
:
1. Mempelajari teknik pemisahan senyawa pigmen (karotenoid) dari sampel padatan
2. Mempelajari teknik analisa Thin Layer Chromatografi (TLC)
Pendahuluan
Pigmen tumbuhan ditemukan dlaam plastida dan vakuola. Pigmen tumbuhan memiliki
macam-macam, misalnya klorofil (pigmen hijau) di dalam kloroplas dan karotenoid (pigmen
kuning-merah) di dalam kromoplas yang tidak mempunya klorofil atau hanya mengandung
sedikit kloorfil. Kelompok pigmen lain adalah flavonoid (antosiasin dan flavon atau flavonol)
yang biasanya terdapat di dalam vakuola, khususnya pada bunga dan bua dengan berbagai
warna (Mulyani, 2005).
Karotenoid merupakan salah satu kelompok pigmen yang utama selain klorofil dan
memiliki warna kuning, jingga serta merah. Karotenoid diproduksi oleh berbagai jenis
organisme, mulai dari non-fototropik prokariotik sampai tumbuhan tangkat tinggi. Struktur
karotenoid yang teridentifikasi berjumlah 700 struktur (Stafsnes, 2010).
Karotenoid dibagi atas 4 golongan, yaitu karotenoid hidrokarbon dan xantofil. Karotenoid
hidrokarbon (C40H55OH) seperti
karoten dan likopen. Xantofil dan derivate
karoten yang mengandung oksigen dan hidroksil antara lain kriptosantin, C40H55OH dan lutein
(C40H54(OH)2). Asam karotenoid yang mengandung yang mengandung gugus karboksil dan
ester xantofil asam lemak, misalnya zeasantin (Mayer, 1996).
Karotenoid merupakan senyawa lipida yang tidak tersabunkan, larut dengan baik dalam
pelarut organik, tetapi tidak larut dalam air. Sifat fisika dank imia karotenoid adalah larut
dalam minyak dan tidak larut dalam air. Larut dalam kloroform, benzene, karbon disulfide
dan petroleum eter, tidak larut dalam etanol dan methanol dingin. Tahan terhadap panas
apabila dalam keadaan vakum, peka terhadap oksidasi, autooksidasi dan cahaya, dan
mempunyai ciri khas absorpsi cahaya (Mayer, 1996).
Kromatografi yaitu pemisahan campuran senyawa dalam sesuatu sampel berdasarkan
perbedaan interaksi sampel dengan fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat berupa padatan
atau cairan yang diletakkan pada permukaan fasa pendukung. Fasa gerak dapat berupa gas
atau cairan, maka dikembangkan beberapa teknik kromatografi (Leba, 2017).
Jenis interaksi yang ada dalam proses kromatografi bermacam-macam tergantung pada
kombinasi fasa diam dan fasa geraknya. Gaya yang mungkin timbul dalam kromatografi yaitu
gaya atau ikatan van der waals, ikatan hidrogen, gas elektrostatik seperti interaksi ion-dipol,
dipol-dipol, interaksi hidrofilik-hidrofilik dan sebagainya. Gaya atau ikatan tersebut
memberikan efek yang berbeda dan spesifik antara satu komponen dengan lainnya terhadap
fasa gerak dan diam (Leba, 2017).
Kromatografi lapis tipis, KLT (thin layer chromatography, TLC) adalah suatu metode
analisis yang digunakan untuk memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan
sederhana. Metode ini termasuk dalam kromatografi cair-padat. Prinsip KLT didasarkan atau
adsorpsi senyawa-senyawa oleh fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan dapat terjadi akibat
perbedaan kepolaran antara senyawa-senyawa dalam campuran dengan fasa diam dan fasa
gerak. Perbedaan kepolaran inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan yang diamati
melalui tampaknya bercak atau noda dibawa dan dielusi oleh fasa gerak melalui fasa diam
yang berada dalam kolom (Leba, 2017). Kromatografi lapis tipis berprinsip suatu analit
bergerak melintasi lapisan fase diam, di bawah pengaruh fase gerak, yang bergerak melalui
fase diam oleh kerja kapiler. Semakin polar suatu senyawa fase gerak, semakin besar
mengadsorpsi (partisi ke dalam) fase diam gel silica. Waktu semakin sedikit yang dibutuhkan
fase gerak untuk menaiki pelat sehingga semakin pendek jarak tempuh senyawa tersebut
menaiki pelat dalam waktu tertentu (Watson, 2000).
Wujud fasa diam yang terdapat di dalam kolom, kromatografi gas dibagi menjadi dua
jenis yaitu kromatografi gas-padat dan kromatografi gas-cair. Kromatografi gas dengan fasa
diam suatu padatan disebut kromatografi gas-padat dan kromatografi gas dengan fasa diam
berupa cairan disebut kromatografi gas-cair (Rubiyanto, 2017).
Kromatografi gas-padat, partisi analit didasarkan atas fenomena absorpsi (penyerapan)
pada permukaan fasa diam. Jenis kromatografi ini penggunannya sangat terbatas karena
kurva elusi yang dihasilkan umumnya tidak simetris. Kromatografi gas-cair, fasa diam cair
dilapiskan dengan ketebalan tertentu pada suatu media padat yang disebut zat padat
pendukung. Partisi analit didasarkan pada kelarutan uap analit pada fasa diam. Distribusinya
bergantung pada akesetimbangan gas-cair yang terjadi di dalam kolom. Metode kromatografi
ini merupakan salah satu cara kromatografi kolom yang penggunaannya sangat luas
(Rubiyanto, 2017).
Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang menggunakan zat penyerap
(fase diam) dalam bumbung kaca yang berbentuk buret. Fase gerak dituangkan di atas dan
menetes di bawah. Fase diam ditempatkan dalam kolom yang dilewati fase gerak yang
dipengaruhi oleh adanya tekanan gravitasi (Harvey, 2000).
Prinsip Kerja
Suatu analit bergerak melintasi lapisan fase diam, di bawah pengaruh fase gerak, yang
bergerak melalui fase diam oleh kerja kapiler. Semakin polar suatu senyawa fase gerak,
semakin besar mengadsorpsi (partisi ke dalam) fase diam gel silica, semakin sedikit waktu
yang dibutuhkan fase gerak untuk menaiki pelat sehingga semakin pendek jarak tempuh
senyawa tersebut menaiki pelat dalam waktu tertentu.
Alat
Mortar, pestle, tabung, chamber TLC, gelas ukur, pipet tetes, pinset, penggaris, lampu UV,
neraca analitik, batang pengaduk
Bahan
Lempeng silika, pelarut aseton:heksana, kertas saring, daun bayam.
Prosedur Kerja
Preparasi sampel dilakukan dengan memotong-motong kecil 5 gram sampel (daun, buah atau
umbi) yang sudah bersih dan kering (dengan jumlah air minimum). Sampel digerus
menggunakan mortar dan pestle dengan menambahkan aseton 5 mL. Larutan didekantasi
ekstrak sambil peras padatan yang tersisa menggunakan spatula (pada dinding mortar) hingga
ekstrak aseton maksimum yang diperoleh atau gunakan bantuan kertas saring untuk memeras
pasta tersebut. Ekstrak dimasukkan dalam tabung reaksi (sampel 1). Chamber TLC disiapkan
dan ditempatkan pelarut aseton:heksana (3:7) kira-kira setinggi 0.5 cm. Lempeng silika
ukuran tertentu ditempatkan, yang sebelumnya telah ditotolkan sedikit sampel ekstrak:
sampel 1 (± 1 cm dari batas bawah kertas), pada TLC chamber. Chamber ditutup dan
ditunggu pergerakan pelarut hingga sampai batas atas (± 0.5 cm dari batas atas kertas).
Lempeng diambil dengan menggunakan pinset dan dikeringkan. Jika sudah kering, diamati
pemisahan pigmen yang terjadi pada lempeng menggunakan sinar UV. Jjarak yang ditempuh
senyawa dan pelarut tersebut diukur. Faktor retensi (Rf) untuk masing-masing komponen
dihitung.
Waktu yang Diperlukan
Perlakuan
Preparasi alat dan bahan
Waktu
10 menit
Memasukkan sampel pada kolom dan menampung isolat 60 menit
pigmen
Pengamatan ekstrak pada chamber TLC
15 menit
Pengamatan sport menggunakan sinar UV
15 menit
Data
Massa awal daun bayam = 5 gram
Spot 1 = 1,9 cm
Spot 2 = 2,8 cm
Spot 3 = 4,5 cm
Spot 4 = 4,8 cm
Perhitungan
Rf =
Spot 1 =
= 0,32
Spot 2 =
= 0,48
Spot 3 =
= 0,76
Spot 4 =
= 0,81
Hasil
No
1.
Perlakuan
penggerusan daun bayam dan
penambahan 5 mL aseton
Gambar
2.
Dekantasi
3.
Larutan aseton : heksana (2:3)
4.
Pelat dimasukkan dalam chamber
TLC
5.
Hasil kromatografi kolom
Pembahasan
Praktikum ini berjudul ekstraksi dan analisa daun bayam. Tujuan dari praktikum ini yaitu
mengetahui teknik pemisahan senyawa pigmen (karotenoid) dari daun bayam dan
mempelajari teknik analisa Thin Layer Chromatografi (TLC). Perlakuan praktikum ini yaitu
dengan menggunakan larutan daun bayam dengan pelarut aseton, yang ditotolkan pada
kolom, kemudian dilarutkan dalam chamber TLC yang berisi larutan aseton dan heksana.
Percobaan pertama yaitu dengan menggerus daun bayam dan menambahkan dengan
aseton. Penambahan aseton berfungsi sebagai fasa diam. Fasa diam didekantasi dan diperas
menggunakan kertas saring untuk memperoleh ekstrak aseton secara maksimal. Pembuatan
eluen dilakukan dengan mencampurkan aseton dan heksana. Eluen ini berfungsi sebagai fasa
gerak dan digunakan untuk memisahkan campuran. Larutan yang digunakan heksana karena
merupakan larutan non-polar.
Gambar 1. Struktur molekul n-heksana
Aseton dipilih karena merupakan pelarut organik yang bersifat non-polar. Aseton memiliki
gugus karboksil dimana gugus karboksil bersifat non-polar dengan elektron-elektron dalam
ikatan sigma dan terutama elektron-elektron dalam ikatan pi yang tertarik ke oksigen yang
lebih elektronegatif.
Gambar 2. Struktur molekul aseton
Karotenoid merupakan pigmen yang bersifat non-polar, sehingga menurut prinsip like
dissolve like karotenoid dapat larut dalam eluen aseton-heksana yang juga bersifat non-polar.
H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
Gambar 3. Karotenoid
Nilai viskositas juga mempengaruhi pergerakan eluen dalam fasa diam. Aseton dan nheksana memiliki nilai viskositas yang kecil dibandingkan dengan larutan diam lainnya,
sehingga mudah terserap dalam fasa diam. Pelat diberi tanda berupa garis menggunakan
pensil dengan tinggi bawah 1 cm dan tinggi atas 0,5 cm. Penggunaan pensil dilakukan karena
pensil tidak mengandung pigmen warna, sehingga warnanya tidak akan ikut naik jika
ditambahkan dengan fasa diam, jika menggunakan pulpen maka warna pada pulpen akan ikut
naik, karena pulpen mengandung pigmen. Fasa diam ditotolkan pada pelat di bagian garis
bawah. Penotolan dilakukan berulang kali, supaya lebih tebal sehingga hasil sport lebih
akurat dan lebih jelas. Penotolan dilakukan pada 1 titik. Eluen kemudian dimasukkan ke
dalam chamber TLC setinggi 0,5 cm. Eluen yang dimasukkan tidak lebih tinggi dari garis
bawah pelat agar warna fasa gerak tidak larut ke bawah. Pelat kemudian dimasukkan ke
dalam eluen dan ditunggu eluen bergerak ke atas sampai mencapai garis atas pada pelat. Pelat
kemudian diuji dengan sinar UV untuk mengetahui warna yang dihasilkan dengan jelas.
Sinar UV memiliki panjang gelombang 450 nm. Karotenoid menyerap pada daerah biru pada
panjang gelombang 430 – 470 nm. Ikatan rangkap terkonjugasi pada molekul karotenoid
menandakan adanya gugus kromofor yang menyebabkan terbentuknya warna pada
karotenoid, semakin banyak ikatan rangkap terkonjugasi maka semakin pekat warna
karotenoid tersebut, yaitu semakin mengarah ke warna merah atau oranye.
Hasil yang didapatkan yaitu terdapat 4 sport dengan tinggi 1,9 cm dengan warna hijau
biru; 2,8 cm dengan warna hijau kuning; 4,5 cm dengan warna coklat ke abu-abuan; dan 4,8
cm dengan warna kuning. Perbedaan ini dikarenakan terdapat tingkat kereaktifan dan
polaritas yang berbeda-beda pada tiap fasanya. Warna hijau biru menunjukkan bahwa pigmen
tersebut merupakan klorofil a, sedangkan warna hijau kuning menunjukkan bahwa pigmen
tersebut merupakan klorofil b. Warna coklat menunjukkan bahwa pigmen tersebut merupak
feofitin dan warna kuning menunjukkan bahwa pigmen tersebut merupakan karoten. Nilai Rf
yang dihasilkan pada percobaan ini yaitu 0,38; 0,42; 0,76 dan 0,81.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kisaran nilai Rf pada klorofil a (hijau biru) yaitu
0,57 – 0,64. Rf pada klorofil b (hijau kuning) yaitu 0,48 – 0,56. Rf feofitin a (abu-abu) yaitu
0,74 – 0,82. Rf karoten (orange) 0,87 – 0,93 (Heriyanto, 2006). Hal ini menunjukkan bahwa
bayam memiliki komposisi klorofil a dan b, feofitin dan karoten. Feofitin dan karoten
merupakan pigmen yang bersifat non-polar.
Kesimpulan
Kesimpulan pada percobaan ini yaitu teknik pemisahan pigmen karotenoid dilakukan
dengan ekstraksi kromatografi lapis tipis. Teknik menganalisa thin layer chomatography
yaitu dengan menggunakan warna dan nilai Rf yang dihasilkan. Nilai Rf yang dihasilkan
yaitu 0,32; 0,48; 0,76; dan 0,81. Komposisi yang dikandung dalam bayam yaitu klorofil a dan
b, feofitin dan karoten.
Referensi
Mulyani. 2005. Anatomi Tumbuhan. Yogyakarta: Kanisius
Stafsnes. 2010. Isolation and Characterization of Marine Pigmented Bacteria from
Norwegian Coastal Waters and Screening for Carotenoids with UVA- Blue Light
Absorbing Properties. J.microbiol, Vol 48 No 1
Mayer. 1996. Chemistry. New York: Reinhold Publishing Corporation
Leba. 2017. Ekstraksi dan Real Kromatografi. Yogyakarta: CV Budi Utama
Watson. 2000. Analisis Farmasi. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC
Rubiyanto. 2017. Teknik Dasar Kromatografi. Yogyakarta: CV Budi Utama
Harvey. 2000. Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw Hill Companies
Gandjar. 2007. Kimia Farmasi. Yogyakarta: Pustaka Belajar
Heriyanto. 2006. Komposisi Dan Kandungan Pigmen Utama Tumbuhan Taliputri Cuscuta
Australis R.Br. dan Cassytha Filiformis L. Sains. Vol 10 No 2
Saran
Saran yang disampaikan untuk percobaan ekstraksi dan analisa pigmen daun bayam yaitu,
saat penotolan digunakan pipet mikro, sehingga larutan tidak menyebar. Peletakan pelat pada
Chamber TLC menggunakan pinset. Aseton-heksana dicampur pada saat praktikum.
Nama Praktikan
Eka Oktavia Larasati Sudirman (161810301047)
LAPORAN PRAKTIKUM KIMIA ORGANIK
EKSTRAKSI DAN ANALISA PIGMEN DAUN BAYAM
Tujuan Percobaan
:
1. Mempelajari teknik pemisahan senyawa pigmen (karotenoid) dari sampel padatan
2. Mempelajari teknik analisa Thin Layer Chromatografi (TLC)
Pendahuluan
Pigmen tumbuhan ditemukan dlaam plastida dan vakuola. Pigmen tumbuhan memiliki
macam-macam, misalnya klorofil (pigmen hijau) di dalam kloroplas dan karotenoid (pigmen
kuning-merah) di dalam kromoplas yang tidak mempunya klorofil atau hanya mengandung
sedikit kloorfil. Kelompok pigmen lain adalah flavonoid (antosiasin dan flavon atau flavonol)
yang biasanya terdapat di dalam vakuola, khususnya pada bunga dan bua dengan berbagai
warna (Mulyani, 2005).
Karotenoid merupakan salah satu kelompok pigmen yang utama selain klorofil dan
memiliki warna kuning, jingga serta merah. Karotenoid diproduksi oleh berbagai jenis
organisme, mulai dari non-fototropik prokariotik sampai tumbuhan tangkat tinggi. Struktur
karotenoid yang teridentifikasi berjumlah 700 struktur (Stafsnes, 2010).
Karotenoid dibagi atas 4 golongan, yaitu karotenoid hidrokarbon dan xantofil. Karotenoid
hidrokarbon (C40H55OH) seperti
karoten dan likopen. Xantofil dan derivate
karoten yang mengandung oksigen dan hidroksil antara lain kriptosantin, C40H55OH dan lutein
(C40H54(OH)2). Asam karotenoid yang mengandung yang mengandung gugus karboksil dan
ester xantofil asam lemak, misalnya zeasantin (Mayer, 1996).
Karotenoid merupakan senyawa lipida yang tidak tersabunkan, larut dengan baik dalam
pelarut organik, tetapi tidak larut dalam air. Sifat fisika dank imia karotenoid adalah larut
dalam minyak dan tidak larut dalam air. Larut dalam kloroform, benzene, karbon disulfide
dan petroleum eter, tidak larut dalam etanol dan methanol dingin. Tahan terhadap panas
apabila dalam keadaan vakum, peka terhadap oksidasi, autooksidasi dan cahaya, dan
mempunyai ciri khas absorpsi cahaya (Mayer, 1996).
Kromatografi yaitu pemisahan campuran senyawa dalam sesuatu sampel berdasarkan
perbedaan interaksi sampel dengan fasa diam dan fasa gerak. Fasa diam dapat berupa padatan
atau cairan yang diletakkan pada permukaan fasa pendukung. Fasa gerak dapat berupa gas
atau cairan, maka dikembangkan beberapa teknik kromatografi (Leba, 2017).
Jenis interaksi yang ada dalam proses kromatografi bermacam-macam tergantung pada
kombinasi fasa diam dan fasa geraknya. Gaya yang mungkin timbul dalam kromatografi yaitu
gaya atau ikatan van der waals, ikatan hidrogen, gas elektrostatik seperti interaksi ion-dipol,
dipol-dipol, interaksi hidrofilik-hidrofilik dan sebagainya. Gaya atau ikatan tersebut
memberikan efek yang berbeda dan spesifik antara satu komponen dengan lainnya terhadap
fasa gerak dan diam (Leba, 2017).
Kromatografi lapis tipis, KLT (thin layer chromatography, TLC) adalah suatu metode
analisis yang digunakan untuk memisahkan suatu campuran senyawa secara cepat dan
sederhana. Metode ini termasuk dalam kromatografi cair-padat. Prinsip KLT didasarkan atau
adsorpsi senyawa-senyawa oleh fasa diam dan fasa gerak. Pemisahan dapat terjadi akibat
perbedaan kepolaran antara senyawa-senyawa dalam campuran dengan fasa diam dan fasa
gerak. Perbedaan kepolaran inilah yang menyebabkan terjadinya pemisahan yang diamati
melalui tampaknya bercak atau noda dibawa dan dielusi oleh fasa gerak melalui fasa diam
yang berada dalam kolom (Leba, 2017). Kromatografi lapis tipis berprinsip suatu analit
bergerak melintasi lapisan fase diam, di bawah pengaruh fase gerak, yang bergerak melalui
fase diam oleh kerja kapiler. Semakin polar suatu senyawa fase gerak, semakin besar
mengadsorpsi (partisi ke dalam) fase diam gel silica. Waktu semakin sedikit yang dibutuhkan
fase gerak untuk menaiki pelat sehingga semakin pendek jarak tempuh senyawa tersebut
menaiki pelat dalam waktu tertentu (Watson, 2000).
Wujud fasa diam yang terdapat di dalam kolom, kromatografi gas dibagi menjadi dua
jenis yaitu kromatografi gas-padat dan kromatografi gas-cair. Kromatografi gas dengan fasa
diam suatu padatan disebut kromatografi gas-padat dan kromatografi gas dengan fasa diam
berupa cairan disebut kromatografi gas-cair (Rubiyanto, 2017).
Kromatografi gas-padat, partisi analit didasarkan atas fenomena absorpsi (penyerapan)
pada permukaan fasa diam. Jenis kromatografi ini penggunannya sangat terbatas karena
kurva elusi yang dihasilkan umumnya tidak simetris. Kromatografi gas-cair, fasa diam cair
dilapiskan dengan ketebalan tertentu pada suatu media padat yang disebut zat padat
pendukung. Partisi analit didasarkan pada kelarutan uap analit pada fasa diam. Distribusinya
bergantung pada akesetimbangan gas-cair yang terjadi di dalam kolom. Metode kromatografi
ini merupakan salah satu cara kromatografi kolom yang penggunaannya sangat luas
(Rubiyanto, 2017).
Kromatografi kolom merupakan teknik kromatografi yang menggunakan zat penyerap
(fase diam) dalam bumbung kaca yang berbentuk buret. Fase gerak dituangkan di atas dan
menetes di bawah. Fase diam ditempatkan dalam kolom yang dilewati fase gerak yang
dipengaruhi oleh adanya tekanan gravitasi (Harvey, 2000).
Prinsip Kerja
Suatu analit bergerak melintasi lapisan fase diam, di bawah pengaruh fase gerak, yang
bergerak melalui fase diam oleh kerja kapiler. Semakin polar suatu senyawa fase gerak,
semakin besar mengadsorpsi (partisi ke dalam) fase diam gel silica, semakin sedikit waktu
yang dibutuhkan fase gerak untuk menaiki pelat sehingga semakin pendek jarak tempuh
senyawa tersebut menaiki pelat dalam waktu tertentu.
Alat
Mortar, pestle, tabung, chamber TLC, gelas ukur, pipet tetes, pinset, penggaris, lampu UV,
neraca analitik, batang pengaduk
Bahan
Lempeng silika, pelarut aseton:heksana, kertas saring, daun bayam.
Prosedur Kerja
Preparasi sampel dilakukan dengan memotong-motong kecil 5 gram sampel (daun, buah atau
umbi) yang sudah bersih dan kering (dengan jumlah air minimum). Sampel digerus
menggunakan mortar dan pestle dengan menambahkan aseton 5 mL. Larutan didekantasi
ekstrak sambil peras padatan yang tersisa menggunakan spatula (pada dinding mortar) hingga
ekstrak aseton maksimum yang diperoleh atau gunakan bantuan kertas saring untuk memeras
pasta tersebut. Ekstrak dimasukkan dalam tabung reaksi (sampel 1). Chamber TLC disiapkan
dan ditempatkan pelarut aseton:heksana (3:7) kira-kira setinggi 0.5 cm. Lempeng silika
ukuran tertentu ditempatkan, yang sebelumnya telah ditotolkan sedikit sampel ekstrak:
sampel 1 (± 1 cm dari batas bawah kertas), pada TLC chamber. Chamber ditutup dan
ditunggu pergerakan pelarut hingga sampai batas atas (± 0.5 cm dari batas atas kertas).
Lempeng diambil dengan menggunakan pinset dan dikeringkan. Jika sudah kering, diamati
pemisahan pigmen yang terjadi pada lempeng menggunakan sinar UV. Jjarak yang ditempuh
senyawa dan pelarut tersebut diukur. Faktor retensi (Rf) untuk masing-masing komponen
dihitung.
Waktu yang Diperlukan
Perlakuan
Preparasi alat dan bahan
Waktu
10 menit
Memasukkan sampel pada kolom dan menampung isolat 60 menit
pigmen
Pengamatan ekstrak pada chamber TLC
15 menit
Pengamatan sport menggunakan sinar UV
15 menit
Data
Massa awal daun bayam = 5 gram
Spot 1 = 1,9 cm
Spot 2 = 2,8 cm
Spot 3 = 4,5 cm
Spot 4 = 4,8 cm
Perhitungan
Rf =
Spot 1 =
= 0,32
Spot 2 =
= 0,48
Spot 3 =
= 0,76
Spot 4 =
= 0,81
Hasil
No
1.
Perlakuan
penggerusan daun bayam dan
penambahan 5 mL aseton
Gambar
2.
Dekantasi
3.
Larutan aseton : heksana (2:3)
4.
Pelat dimasukkan dalam chamber
TLC
5.
Hasil kromatografi kolom
Pembahasan
Praktikum ini berjudul ekstraksi dan analisa daun bayam. Tujuan dari praktikum ini yaitu
mengetahui teknik pemisahan senyawa pigmen (karotenoid) dari daun bayam dan
mempelajari teknik analisa Thin Layer Chromatografi (TLC). Perlakuan praktikum ini yaitu
dengan menggunakan larutan daun bayam dengan pelarut aseton, yang ditotolkan pada
kolom, kemudian dilarutkan dalam chamber TLC yang berisi larutan aseton dan heksana.
Percobaan pertama yaitu dengan menggerus daun bayam dan menambahkan dengan
aseton. Penambahan aseton berfungsi sebagai fasa diam. Fasa diam didekantasi dan diperas
menggunakan kertas saring untuk memperoleh ekstrak aseton secara maksimal. Pembuatan
eluen dilakukan dengan mencampurkan aseton dan heksana. Eluen ini berfungsi sebagai fasa
gerak dan digunakan untuk memisahkan campuran. Larutan yang digunakan heksana karena
merupakan larutan non-polar.
Gambar 1. Struktur molekul n-heksana
Aseton dipilih karena merupakan pelarut organik yang bersifat non-polar. Aseton memiliki
gugus karboksil dimana gugus karboksil bersifat non-polar dengan elektron-elektron dalam
ikatan sigma dan terutama elektron-elektron dalam ikatan pi yang tertarik ke oksigen yang
lebih elektronegatif.
Gambar 2. Struktur molekul aseton
Karotenoid merupakan pigmen yang bersifat non-polar, sehingga menurut prinsip like
dissolve like karotenoid dapat larut dalam eluen aseton-heksana yang juga bersifat non-polar.
H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
CH3
CH3
H3C
CH3
Gambar 3. Karotenoid
Nilai viskositas juga mempengaruhi pergerakan eluen dalam fasa diam. Aseton dan nheksana memiliki nilai viskositas yang kecil dibandingkan dengan larutan diam lainnya,
sehingga mudah terserap dalam fasa diam. Pelat diberi tanda berupa garis menggunakan
pensil dengan tinggi bawah 1 cm dan tinggi atas 0,5 cm. Penggunaan pensil dilakukan karena
pensil tidak mengandung pigmen warna, sehingga warnanya tidak akan ikut naik jika
ditambahkan dengan fasa diam, jika menggunakan pulpen maka warna pada pulpen akan ikut
naik, karena pulpen mengandung pigmen. Fasa diam ditotolkan pada pelat di bagian garis
bawah. Penotolan dilakukan berulang kali, supaya lebih tebal sehingga hasil sport lebih
akurat dan lebih jelas. Penotolan dilakukan pada 1 titik. Eluen kemudian dimasukkan ke
dalam chamber TLC setinggi 0,5 cm. Eluen yang dimasukkan tidak lebih tinggi dari garis
bawah pelat agar warna fasa gerak tidak larut ke bawah. Pelat kemudian dimasukkan ke
dalam eluen dan ditunggu eluen bergerak ke atas sampai mencapai garis atas pada pelat. Pelat
kemudian diuji dengan sinar UV untuk mengetahui warna yang dihasilkan dengan jelas.
Sinar UV memiliki panjang gelombang 450 nm. Karotenoid menyerap pada daerah biru pada
panjang gelombang 430 – 470 nm. Ikatan rangkap terkonjugasi pada molekul karotenoid
menandakan adanya gugus kromofor yang menyebabkan terbentuknya warna pada
karotenoid, semakin banyak ikatan rangkap terkonjugasi maka semakin pekat warna
karotenoid tersebut, yaitu semakin mengarah ke warna merah atau oranye.
Hasil yang didapatkan yaitu terdapat 4 sport dengan tinggi 1,9 cm dengan warna hijau
biru; 2,8 cm dengan warna hijau kuning; 4,5 cm dengan warna coklat ke abu-abuan; dan 4,8
cm dengan warna kuning. Perbedaan ini dikarenakan terdapat tingkat kereaktifan dan
polaritas yang berbeda-beda pada tiap fasanya. Warna hijau biru menunjukkan bahwa pigmen
tersebut merupakan klorofil a, sedangkan warna hijau kuning menunjukkan bahwa pigmen
tersebut merupakan klorofil b. Warna coklat menunjukkan bahwa pigmen tersebut merupak
feofitin dan warna kuning menunjukkan bahwa pigmen tersebut merupakan karoten. Nilai Rf
yang dihasilkan pada percobaan ini yaitu 0,38; 0,42; 0,76 dan 0,81.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa kisaran nilai Rf pada klorofil a (hijau biru) yaitu
0,57 – 0,64. Rf pada klorofil b (hijau kuning) yaitu 0,48 – 0,56. Rf feofitin a (abu-abu) yaitu
0,74 – 0,82. Rf karoten (orange) 0,87 – 0,93 (Heriyanto, 2006). Hal ini menunjukkan bahwa
bayam memiliki komposisi klorofil a dan b, feofitin dan karoten. Feofitin dan karoten
merupakan pigmen yang bersifat non-polar.
Kesimpulan
Kesimpulan pada percobaan ini yaitu teknik pemisahan pigmen karotenoid dilakukan
dengan ekstraksi kromatografi lapis tipis. Teknik menganalisa thin layer chomatography
yaitu dengan menggunakan warna dan nilai Rf yang dihasilkan. Nilai Rf yang dihasilkan
yaitu 0,32; 0,48; 0,76; dan 0,81. Komposisi yang dikandung dalam bayam yaitu klorofil a dan
b, feofitin dan karoten.
Referensi
Mulyani. 2005. Anatomi Tumbuhan. Yogyakarta: Kanisius
Stafsnes. 2010. Isolation and Characterization of Marine Pigmented Bacteria from
Norwegian Coastal Waters and Screening for Carotenoids with UVA- Blue Light
Absorbing Properties. J.microbiol, Vol 48 No 1
Mayer. 1996. Chemistry. New York: Reinhold Publishing Corporation
Leba. 2017. Ekstraksi dan Real Kromatografi. Yogyakarta: CV Budi Utama
Watson. 2000. Analisis Farmasi. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC
Rubiyanto. 2017. Teknik Dasar Kromatografi. Yogyakarta: CV Budi Utama
Harvey. 2000. Modern Analytical Chemistry. USA: The McGraw Hill Companies
Gandjar. 2007. Kimia Farmasi. Yogyakarta: Pustaka Belajar
Heriyanto. 2006. Komposisi Dan Kandungan Pigmen Utama Tumbuhan Taliputri Cuscuta
Australis R.Br. dan Cassytha Filiformis L. Sains. Vol 10 No 2
Saran
Saran yang disampaikan untuk percobaan ekstraksi dan analisa pigmen daun bayam yaitu,
saat penotolan digunakan pipet mikro, sehingga larutan tidak menyebar. Peletakan pelat pada
Chamber TLC menggunakan pinset. Aseton-heksana dicampur pada saat praktikum.
Nama Praktikan
Eka Oktavia Larasati Sudirman (161810301047)