Identifikasi Gen Halogenase Dari Alteromonas luteoviolaceus Penghasil Antibiotik Pentabrompseudilin Secara Hibridisasi.
Identifikasi Gen Halogenase Dari Alteromonas luteoviolaceus
Penghasil Antibiotik Pentabrompseudilin Secara Hibridisasi
Sri Mulyani, Okid Parama Astirin
Tujuan jangka panjang dari penelitian ini adalah membuktikan adanya
kemiripan jalur biosintesis teresterial antibiotic pentaklorpseudilin dari
Actinoplanes sp. ATCC 33002 dan marine antibiotic pentabrompseudilin dari
Alteromonas luteoviolaceus . Pembuktian tersebut dilakukan secara analisis
genetic dengan terlebih dahulu dilakukan isolasi biosintetic gene cluster dari
pentabrompseudilin tersebut. Sementara ini petensial biosintetic gen cluster
dari pentaklorpseudilin sudah diidentifikasi oleh grup penelitian Prof. Dr. K.-H.
van Pee di TU Dresden, akan tetapi belum dipublikasikan (Mann, 2005).
Pentaklorpseudilin dan pentabrompseudilin mempunyai struktur yang mirip
dan hanya berbeda pada atom-atom halogen yang diikatnya. Hasil
pembuktian ini akan memberikan tambahan informasi dan memperkaya
khasanah ilmu pengetahun tentang metabolism antibiotic khususnya yang
mengandung senyawa halogen, dapat sebagai acuan mekanisme obat dalam
eksplorasi obat baru untuk menghadapai masalah resistensi yang akhir-akhir
menjadi masalah dunia. Target khusus yang akan dicapai dalam penelitian ini
adalah mengidentifikasi adanya gen halogenase dalam DNA kromosom A.
luteoviolaceus pengahasil pentabrompseudilin secara hibridisasi dengan
menggunakan probe DNA gen halA/B dari Actinoplanes sp. ATCC. Selanjutnya
gen halogenase yang teridentifikasi diisolasi dengan menggunakan vector
untuk sequencing (pBluescript SK dan pUC19).
Untuk mencapai tujuan di atas, maka penelitian akan dilakukan mengikuti
pendekatan dan metode yang lazim digunakan dalam penelitian molecular
biologi. Tahap awal penelitian ini adalah isolasi total DNA A. luteoviolaceus
dengan 2xKirby mix (Hopwood et al, 1985) dan DNA plasmid pEThalB yang
mengandung gen halA/B dari Actinoplanes sp. ATCC dengan metode lisis
alkali (Sambrook et al, 2001). Tahap selanjutnya adalah suothern blotting
DNA kromosom yang sudah dipotong dengan enzim BamHI, Eco RI, HindIII,
PstI,dan SacI ke dalam membran nitroselulosa dan dihibridisasi dengan probe
DNA (halB) yang dilabel dengan DIG. Prosedur analisis Southem, pelabelan
probe dengan DIG, hybridisasi, dan deteksinya dilakukan berdasarkan
rekomendasi dari Roche. Untuk deteksi gen tersebut juga dilakukan dengan
metode PCR. Fragment-fragment DNA A. luteoviolaceus yang memberikan
signal tunggal positif selanjutnya diisolasi dan dikloning ke dalam plasmid
untuk sekuensing (pBluescript SK). Penelitian ini dilakukan secara bertahap
dalam dua tahun.
Hasil yang sudah diperoleh dalam penelitian untuk tahun ke 2 ini adalah:
(1) hibridisasi dengan menggunakan probe gen hal B dari Actinoplane sp
pada suhu stringensi 65oC, 60oC, 55oC, dan 50oC signal positif hanya
dideteksi pada kontrol positif sedangkan pada DNA kromosom A.
luteoviolaceus tidak. Hasil analisis reference antara gen hal B itu dan DNA
kromosom A. luteoviolaceus mempunyai perbedaan %G+C yang besar
sehingga dengan metode hibridisasi akan kecil kemungkinannya untuk
diperoleh signal positif, (2) PCR pada suhu enealing 52 – 72 oC dan suhu
elongasi 68 oC dengan degenerate primer 1-for: 5’- ATC ATC GGY GGC GGC
CCG GCC GG -3’ dan 4-rev: 5’- GGA GAA GAT CGG GTC GAC GAA -3’
memberikan signal pita pada ukuran sekitar 600 pb dan 1200 pb, (3) Hasil
sekuensing fragmen PCR yang diklon dalam plasmid pBluescript SK belum
memberikan homologi yang signifikan dengan gen halogenase, fragmen
1200 bp memberikan kemiripan 48% dengan FAD-binding 9 siderophoreinteracting domain containing protein dari Shewanella baltica OS223
(YP_002356062.1) dan dari Shewanella sp. MR-7 (YP_36154.1). Mungkinkah
ada harapan akan adanya FADH2 dependent halogenase. Untuk ini perlu ada
penelitian lanjutan dengan design primer yang berbeda pada daerah
konservnya.
Penghasil Antibiotik Pentabrompseudilin Secara Hibridisasi
Sri Mulyani, Okid Parama Astirin
Tujuan jangka panjang dari penelitian ini adalah membuktikan adanya
kemiripan jalur biosintesis teresterial antibiotic pentaklorpseudilin dari
Actinoplanes sp. ATCC 33002 dan marine antibiotic pentabrompseudilin dari
Alteromonas luteoviolaceus . Pembuktian tersebut dilakukan secara analisis
genetic dengan terlebih dahulu dilakukan isolasi biosintetic gene cluster dari
pentabrompseudilin tersebut. Sementara ini petensial biosintetic gen cluster
dari pentaklorpseudilin sudah diidentifikasi oleh grup penelitian Prof. Dr. K.-H.
van Pee di TU Dresden, akan tetapi belum dipublikasikan (Mann, 2005).
Pentaklorpseudilin dan pentabrompseudilin mempunyai struktur yang mirip
dan hanya berbeda pada atom-atom halogen yang diikatnya. Hasil
pembuktian ini akan memberikan tambahan informasi dan memperkaya
khasanah ilmu pengetahun tentang metabolism antibiotic khususnya yang
mengandung senyawa halogen, dapat sebagai acuan mekanisme obat dalam
eksplorasi obat baru untuk menghadapai masalah resistensi yang akhir-akhir
menjadi masalah dunia. Target khusus yang akan dicapai dalam penelitian ini
adalah mengidentifikasi adanya gen halogenase dalam DNA kromosom A.
luteoviolaceus pengahasil pentabrompseudilin secara hibridisasi dengan
menggunakan probe DNA gen halA/B dari Actinoplanes sp. ATCC. Selanjutnya
gen halogenase yang teridentifikasi diisolasi dengan menggunakan vector
untuk sequencing (pBluescript SK dan pUC19).
Untuk mencapai tujuan di atas, maka penelitian akan dilakukan mengikuti
pendekatan dan metode yang lazim digunakan dalam penelitian molecular
biologi. Tahap awal penelitian ini adalah isolasi total DNA A. luteoviolaceus
dengan 2xKirby mix (Hopwood et al, 1985) dan DNA plasmid pEThalB yang
mengandung gen halA/B dari Actinoplanes sp. ATCC dengan metode lisis
alkali (Sambrook et al, 2001). Tahap selanjutnya adalah suothern blotting
DNA kromosom yang sudah dipotong dengan enzim BamHI, Eco RI, HindIII,
PstI,dan SacI ke dalam membran nitroselulosa dan dihibridisasi dengan probe
DNA (halB) yang dilabel dengan DIG. Prosedur analisis Southem, pelabelan
probe dengan DIG, hybridisasi, dan deteksinya dilakukan berdasarkan
rekomendasi dari Roche. Untuk deteksi gen tersebut juga dilakukan dengan
metode PCR. Fragment-fragment DNA A. luteoviolaceus yang memberikan
signal tunggal positif selanjutnya diisolasi dan dikloning ke dalam plasmid
untuk sekuensing (pBluescript SK). Penelitian ini dilakukan secara bertahap
dalam dua tahun.
Hasil yang sudah diperoleh dalam penelitian untuk tahun ke 2 ini adalah:
(1) hibridisasi dengan menggunakan probe gen hal B dari Actinoplane sp
pada suhu stringensi 65oC, 60oC, 55oC, dan 50oC signal positif hanya
dideteksi pada kontrol positif sedangkan pada DNA kromosom A.
luteoviolaceus tidak. Hasil analisis reference antara gen hal B itu dan DNA
kromosom A. luteoviolaceus mempunyai perbedaan %G+C yang besar
sehingga dengan metode hibridisasi akan kecil kemungkinannya untuk
diperoleh signal positif, (2) PCR pada suhu enealing 52 – 72 oC dan suhu
elongasi 68 oC dengan degenerate primer 1-for: 5’- ATC ATC GGY GGC GGC
CCG GCC GG -3’ dan 4-rev: 5’- GGA GAA GAT CGG GTC GAC GAA -3’
memberikan signal pita pada ukuran sekitar 600 pb dan 1200 pb, (3) Hasil
sekuensing fragmen PCR yang diklon dalam plasmid pBluescript SK belum
memberikan homologi yang signifikan dengan gen halogenase, fragmen
1200 bp memberikan kemiripan 48% dengan FAD-binding 9 siderophoreinteracting domain containing protein dari Shewanella baltica OS223
(YP_002356062.1) dan dari Shewanella sp. MR-7 (YP_36154.1). Mungkinkah
ada harapan akan adanya FADH2 dependent halogenase. Untuk ini perlu ada
penelitian lanjutan dengan design primer yang berbeda pada daerah
konservnya.