Deteksi FcyRIIA Pada Stem Cell Yang Diisolasi Dari Umbilical Cord Blood.

ABSTRAK

DETEKSI FcγRIIA PADA STEM CELL YANG DIISOLASI DARI UMBILICAL CORD BLOOD

Lucia Leonie L. S,Hp, 2009. Pembimbing 1 : Caroline Tan Sardjono,dr,Ph.D Pembimbing 2 : Rimonta F Gunanegara,dr,SpOG

Stem cell saat ini telah menjadi salah satu kandidat cell based therapy dalam dunia medis terutama dalam terapi pengobatan penyakit autoimun yang melibatkan baik autoantibody maupun antibody terhadap jaringan. Interaksi antara antibodi dengan reseptor nya selama ini belum pernah dilaporkan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendeteksi ekspresi FcγRIIA pada Hematopoietic Stem Cell yang diisolasi dari umbilical cord blood. Penelitian ini menggunakan metode laboratory experimental. Setelah diisolasi dan diamplifikasi dengan RT-PCR pada gel agarosa 2,5% hasil yang ada menunjukkan band yang diharapkan yaitu antara 300-600 bp. Kesimpulannya, Hematopoietic Stem Cell yang disolasi dari umbilical cord blood mengekspresikan FcγRIIA

Kata kunci : Hematopoietic Stem Cell, umbilical cord blood, ekspresi FcγRIIA, RT-PCR

ABSTRACT

DETECTION FcγRIIA in STEM CELL ISOLATED FROM UMBILICAL CORD BLOOD

Lucia Leonie Levita S,Hp, 2009. First Tutor : Caroline Tan Sardjono,dr,Ph.D Second Tutor : Rimonta F Gunanegara,dr,SpOG

Stem cell has being a candidate of cell based therapies especially the therapy for autoimmune diseases including autoantibody and its receptor has never been reported yet so far. The aim of this research is detecting FcγRIIA expression to the Hematopoietic Stem Cell which isolated from umbilical cord blood. This research was laboratory experimental. After being isolated and amplificated with RT- PCR to the agarose gel 2,5 %, the result showed the band between 300 and 600 bp ,it means electrophoresis gel agarose showed the expected band. The conclusion is FcγRIIA expression to the Hematopoietic Stem Cell which isolated from umbilical cord blood.

Key words : Hematopoietic Stem Cell, umbilical cord blood, FcγRIIA expression, RT- PCR

DAFTAR ISI

Halaman LEMBAR PERSETUJUAN………...ii LEMBAR PERNYATAAN………....iii ABSTRAK………..iv ABSTRACT……….…...v KATA PENGANTAR………....vi DAFTAR ISI………...viii DAFTAR TABEL….………..xi DAFTAR GAMBAR………..………...xii DAFTAR LAMPIRAN……….xiv

BAB I PENDAHULUAN………1

1.1Latar Belakang……….……….….1

1.2Identifikasi Masalah………..……….……2

1.3Maksud dan Tujuan………..…..2

1.4Manfaat Penelitian……….………2

1.5Kerangka Penelitian dan Hipotesis Penelitian………...………3

1.6Metode penelitian………...4

1.7Lokasi dan waktu penelitian………...………4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA………..5

2.1 Stem Cell………5

2.1.1 Sejarah Pemanfaatan Stem Cell……….….………5

2.1.2 Definisi dan Pembagian Stem Cell….………6

2.1.3 Fungsi Stem Cell……….………...9

2.2.1 Embryonic Stem Cell Markers………..………...10

2.2.2 Hematopoietic Stem cell markers………...11

2.3 Umbilical Cord Blood…….……….13

2.3.1 Karakteristik dari cord blood cells………14

2.4 Polymerase Chain Reaction ( PCR )...15

2.4.1 Tahapan dari PCR………...16

2.4.2 RT-PCR……….………21

2.5Fc Receptor………..21

2.5.1 Fungsi dari Fc receptor……….……...23

2.5.2 Fc gamma receptor ( Fc γ receptor )………24

2.5.3 Mekanisme sinyal dari Fc receptor...29

2.6Isolasi Mononuclear Cell ( MNC ) dengan Ficoll Paque ™ PLUS….33 2.7. Flowcytometry………...34

2.7.1 Definisi Flowcytometry………...….34

2.7.2 Gating……….…...37

2.7.3 Analisis Data……….………..…..38

2.8.Magnetic Activated Cell Sorting ( MACS )… ………...38

BAB III BAHAN,ALAT, DAN METODE………...40

3.1 Objek Penelitian………...40

3.2 Metode penelitian……….40

3.3. Alat dan Bahan………41

3.3.1 Bahan……….41

3.3.2 Alat………45

3.4 Cara Kerja………46

3.4.1 Thawing Hematopoietic Stem Cell ………...46

3.4.2. Separasi MACS………47

3.4.3 Isolasi mRNA………...48

3.4.4.Flowcytometry Assay...49

3.4.5 RT-PCR………....………...49

4.1 Isolasi MNC……….52

4.2 Stem cell selection………53

4.3 Isolasi mRNA………...54

4.4 One step RT PCR………...55

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN……….60

5.1 Kesimpulan………..60

5.2 Saran……….60

DAFTAR PUSTAKA………....61

LAMPIRAN………...64

RIWAYAT HIDUP………....67

DAFTAR TABEL

Halaman Tabel 2.1 Pembagian Fcγ Receptor ………..………..25 Tabel 2.2 Karakteristik FcγR II………..27 Tabel 3.1 Primer yang digunakan………..43 Tabel 3.2 Master Mix one step RT-PCR dengan primer βactin dan FcγRIIA...…50 Tabel 3.3 Program one step RT-PCR βactin dan FcγRIIA………50

DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Embryonic Stem Cell………7

Gambar 2.2 Adult Stem cell…………..………8

Gambar 2.3 Embryonic Stem Cell Markers………...…11

Gambar 2.4 Hematopoietic Stem Cell Markers……...………..12

Gambar 2.5 Umbilical cord………..………..14

Gambar 2.6 Tahapan dari PCR……….……….18

Gambar 2.7 Amplifikasi gen pada sekuensing………...…19

Gambar 2.8 Pemisahan molekul dengan elektroforesis……….……20

Gambar 2.9 Fc receptor………..…..……….23

Gambar 2.10 Struktur immunoglobulin……….…….24

Gambar 2.11 Mekanisme sinyal Fc receptor………...………..31

Gambar 2.12 Activating and Inhibitory Fc Receptors……….……..32

Gambar 2.13 Isolasi mononuclear cell…………...………33

Gambar 2.14 Flowcytometry………..…………..………..34

Gambar 2.15 Fluidics System………….………35

Gambar 2.16 Optical System………..36

Gambar 2.18 Magnetic Activated Cell Sorting………..………39 Gambar 4.1 Isolasi MNC………...…52 Gambar 4.2 Presentase sel CD 34+ sebelum dan sesudah MACS…………...…..53 Gambar 4.3 Visualisasi hasil RT PCR pada gel agarosa 2,5 %……….55 Gambar 4.4 Cek kontaminan mRNA dengan PCR………...……….56 Gambar 4.5 struktur β aktin ………...………58

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Elektroforesis……….………....64

Thermal cycle Eppendorf………...64

Mikropipet BioRad………...64

Timbangan Precisa XT 1200C………...65

Gel documentation tools G-Box ( Syngene ) dengan software Genesnap……….65

Vortexer BioRad BR 2000………...65

LAMPIRAN

Elektroforesis

THERMAL CYCLE EPPENDORF

TIMBANGAN PRECISA XT 1200C

Gel documentation tools G-Box ( Syngene ) dengan software Genesnap

RIWAYAT HIDUP PENULIS

Nama : Lucia Leonie Levita Stephanie Hadiprodjo Tempat dan Tanggal Lahir : Bandung, 11 Desember 1986

Alamat : Jl. Jenderal Soedirman no. 271 Pemalang Riwayat Pendidikan :

- 1993 Lulus TK Pius Pemalang

- 1999 Lulus SD Pius Pemalang

- 2002 Lulus SLTP Pius Pemalang

- 2005 Lulus SMU Pius Tegal

- 2005 Mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha Bandung

1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1Latar Belakang

Stem cell ( atau secara umum disebut juga sel punca ) saat ini mendapat banyak perhatian dalam dunia medis sebagai alternatif pengobatan berbagai penyakit. Saat ini stem cell terutama Hematopoietic Stem Cell ( HSC ) menjadi kandidat dalam cell based therapy.

Namun, informasi mengenai stem cell masih belum dikarakterisasi secara luas. Penggunaan stem cell dalam dunia medis meliputi penggunaannya dalam terapi penyakit autoimun dan pencegahan terhadap terjadinya graft versus host reaction dalam transplantasi. Kelainan yang terjadi dalam kedua macam keadaan ini seringkali melibatkan adanya pembentukan antibodi ( imunoglobulin ) baik berupa autoantibodi ataupun antibodi terhadap sel / jaringan yang ditransplantasikan ( pada graft versus host reaction ). Interaksi yang terjadi antara antibodi dengan reseptornya ( reseptor imunoglobulin atau reseptor Fc ) pada stem cell belum pernah dilaporkan sebelumnya. Terapi autoimun dengan menggunakan hematopoietic stem cell sendiri menyebabkan adanya penurunan dari autoantibodi. Karya tulis ini dilakukan untuk mendeteksi adanya reseptor FcγRIIa pada stem cell yang bersumber dari umbilical cord blood ( darah tali pusat ) dengan menggunakan metode reverse-transcriptase Polymerase Chain Reaction ( RT-PCR ).

2

1.2Identifikasi masalah

Apakah Fcγ RIIa diekspresikan pada hematopoietic stem cell yang diisolasi dari umbilical cord blood ?

1.3Maksud dan Tujuan

Maksud dan tujuan dari penelitian ini adalah untuk mempelajari immunogenocity Hematopoietic Stem Cell ( HSC ) melalui adanya interaksi antara imunoglobulin G dengan stem cell yang diisolasi dari umbilical cord blood dan untuk mendeteksi ekspresi FcγRIIa pada Hematopoietic Stem Cell ( HSC ) yang diisolasi dari umbilical cord blood.

1.4Manfaat penelitian

Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan pendahuluan bagi para peneliti selanjutnya dalam melakukan penelitian lebih lanjut mengenai immnogenecity Hematopoietic Stem Cell ( HSC ) yang diisolasi dari umbilical cord blood dan diharapkan penelitian ini dapat membantu dalam penyusunan strategi cell based therapy.

3

1.5Kerangka Penelitian dan Hipotesis Penelitian

Kerangka Penelitian

Hematopoietic stem cell ( HSC ) saat ini telah berkembang secara pesat dalam terapi penyakit autoimun dan pencegahan terhadap terjadinya graft versus host reaction dalam transplantasi karena sifat immunomodulatory yang dimilikinya. Umbilical cord blood merupakan sumber dari hematopoietic stem cell dan progenitor cell yang berisi lebih banyak naive T cells dibandingkan dengan bone marrow yang memungkinkan tingkat kecocokan yang tinggi tanpa meningkatkan graft versus host disease ( E.A de Wynter et al, 2001 ).

FcγRIIa merupakan Fcγ reseptor yang paling banyak dalam tubuh manusia dan merupakan aktivator inflamasi yang poten. FcγRIIa memiliki sifat low affinity terhadap IgG monomer tetapi high avidity terhadap kompleks imun. FcγRIIa banyak terdapat pada sel-sel inflamasi seperti neutrofil, eosinofil, limfosit B, platelet, sel mast, sel langerhans, dan sel dendritik. Lebih lanjut, FcγRIIa memegang peranan penting dalam mekanisme terjadinya penyakit autoimun secara spontan dimana inflamasi yang diinduksi oleh antibodi merupakan komponen penting dalam penyakit autoimun ( Caroline Tan Sardjono et al, 2003 ).

Peneliti meneliti lebih lanjut apakah umbilical cord blood mengekpresikan FcγRIIa yang merupakan reseptor IgG dalam bentuk kompleks imun karena hal ini penting dalam penerapan terapi.

Hipotesis penelitian

Hematopoietic stem cell ( HSC ) yang diisolasi dari umbilical cord blood mengekspresikan FcγRIIa.

4

1.6Metode penelitian

Penelitian eksperimen laboratorik ini merupakan suatu cara untuk mendeteksi apakah Hematopoietic Stem Cell ( HSC ) yang diisolasi dari umbilical cord blood mengekspresikan FcγRIIa.

1.7Lokasi dan waktu penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Stem cell and Cancer Institute ( SCI ) Jakarta pada bulan Maret 2008 – Januari 2009

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

FcγRIIa diekspresikan oleh Hematopoietic Stem cell ( HSC ) yang diisolasi dari umbilical cord blood

5.2 Saran

Diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai

• Immunogenicity stem cell khususnya yang diisolasi dari umbilical cord blood

• Ikatan Hematopoietic Stem Cell ( HSC ) dengan kompleks imun melalui Fc γRIIa dan bagaimana proses downstream signal yang terjadi.

• Ekspresi FcγRIIA pada stem cell yang diisolasi dari umbilical cord blood dengan menggunakan lebih banyak sampel.

DAFTAR PUSTAKA

Belvedere, Ornella, et al. 1999. Phenotypic Characterization of Immunomagnetically Purifie Umbilical Cord Blood CD 34 + Cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases.p.141-146

Brown, T.A.1995. Gene cloning, an introduction, 3 rd ed. Chapman & Hall. p228-238

Broxmeyer, E. Hal, et.al.2006. Cord Blood Stem and Progenitor Cells. Methods in Enzymology, 419 : 439-473

Bioscience, B.D. 2002. Introduction to Flow cytometry: a learning guide.

Committee on the biological and biomedical applications of stem cell research council, neuroscience and behavioral health institute of medicine. 2002. Stem cell and the future of regenerative medicine. Washington DC: National Academy Press.

Li Lu, Shen Nian Rong, Hal E. Broxmeyer. 1996. Stem cells from bone marrow, umbilical cord blood and pheripheral blood for clinical application, current status and future application. Critical reviews in Oncology/ Hematology, 22: 61-78

Miltenyi Biotec.2006. CD 34 MicroBead Kit human.

Nayar. B, et al. 2002. Hematopoietic stem /progenitor cell harvesting from umbilical cord blood. International Journal of Gynecology and obstetrics.p 31-32

Rogers,Ian, Robert F Caspers. 2004. Umbilical cord blood stem cells. Best Practice

&

Research Clinical Obstetrics and Gynecology Vol 18 p 893-908.

Sardjono, Caroline, Mottram P.L, Van de velden, Powell M , Power.D, Slocombe R,F et al. 2005. Development of spontaneous multisystem autoimmune disease and hypersensitivity to antibody induced inflammation in Fc

γ

RIIA transgenic mice, arthritis and rheumatology, 52 : 3302-09

Sardjono, Caroline, Mottram P.L, Hogarths P.M. 2003. The role of Fc γ RIIA as inflammatory mediator in rheumatoid arthritis and systemic lupus eythematosus. Immunology and cell biology. 81:374-81

Sell, Stewart.2004. Stem Cell Handbook. New Jersey:Humana Press.

Van de Winkel,J.G.J, Hogarth Mark,P.1998. The immunoglobulin Receptors and their Physiological and Pathological Roles in Immunity. Netherlands:Kluwer Academic Publisher.

Wikipedia,2008.Fcreceptor.,(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thu

mb/2/25/Fc_receptor_schematic_big.png/220px-Fc_receptor_schematic_big.png),

Januari 25st, 2008

Wikipedia, 2008. Flowcytometry.,( http: // en.wikipedia.org/wiki/Flow_cytometry ), Januari 25st 2008

Wikipedia, 2008. Magnetic-activated cell sorting., (http: //

en.wikipedia.org/wiki/magnetic_activated cell sorting ), Januari 25 st 2008

Wikipedia, 2008. Stem cell. (http: // en.wikipedia.org/wiki/Stem_cell ), Januari 25st2008-12-28

Wikipedia, 2008. Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction. ( http:// en.wikipedia.org/wiki/ Reverse_Transcription_Polimerase_Chain_Reaction) Wynter, E.A , N.G Tesla. 2001. Interest of cord blood stem cells. Biomed

Pharmacother 2001 ,55 : 195-200

http://www.brown.edu/courses/B 10032/web_projects.html

http: // www.biolegend.commedia_assetspfeaturedESC%20markers http://www.biolegend.commedia_assetspfeaturedHSC%20Markers http://www.penhealth.com/health_info/pregnancy/images/en/19176.jpg http://users.ugent.be / ̴avierstr/principles/pcrsteps.gif

http: // www.affimed.comimagesdiag1

http: // www.idac.tohoku.ac.jpdepexpimuSignal,

http: //www.nature.comnrijournalv8n1imagesnri2206-f2

3

1.5 Kerangka Penelitian dan Hipotesis Penelitian

Kerangka Penelitian

Hematopoietic stem cell ( HSC ) saat ini telah berkembang secara pesat dalam terapi penyakit autoimun dan pencegahan terhadap terjadinya graft versus host reaction dalam transplantasi karena sifat immunomodulatory yang dimilikinya. Umbilical cord blood merupakan sumber dari hematopoietic stem cell dan progenitor cell yang berisi lebih banyak naive T cells dibandingkan dengan bone marrow yang memungkinkan tingkat kecocokan yang tinggi tanpa meningkatkan graft versus host disease ( E.A de Wynter et al, 2001 ).

FcγRIIa merupakan Fcγ reseptor yang paling banyak dalam tubuh manusia dan merupakan aktivator inflamasi yang poten. FcγRIIa memiliki sifat low affinity terhadap IgG monomer tetapi high avidity terhadap kompleks imun. FcγRIIa banyak terdapat pada sel-sel inflamasi seperti neutrofil, eosinofil, limfosit B, platelet, sel mast, sel langerhans, dan sel dendritik. Lebih lanjut, FcγRIIa memegang peranan penting dalam mekanisme terjadinya penyakit autoimun secara spontan dimana inflamasi yang diinduksi oleh antibodi merupakan komponen penting dalam penyakit autoimun ( Caroline Tan Sardjono et al, 2003 ).

Peneliti meneliti lebih lanjut apakah umbilical cord blood mengekpresikan FcγRIIa yang merupakan reseptor IgG dalam bentuk kompleks imun karena hal ini penting dalam penerapan terapi.

Hipotesis penelitian

Hematopoietic stem cell ( HSC ) yang diisolasi dari umbilical cord blood mengekspresikan FcγRIIa.

4

1.6 Metode penelitian

Penelitian eksperimen laboratorik ini merupakan suatu cara untuk mendeteksi apakah Hematopoietic Stem Cell ( HSC ) yang diisolasi dari umbilical cord blood mengekspresikan FcγRIIa.

1.7 Lokasi dan waktu penelitian

Penelitian ini dilaksanakan di Stem cell and Cancer Institute ( SCI ) Jakarta pada bulan Maret 2008 – Januari 2009

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

FcγRIIa diekspresikan oleh Hematopoietic Stem cell ( HSC ) yang diisolasi dari umbilical cord blood

5.2 Saran

Diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai

• Immunogenicity stem cell khususnya yang diisolasi dari umbilical cord blood

• Ikatan Hematopoietic Stem Cell ( HSC ) dengan kompleks imun melalui Fc γRIIa dan bagaimana proses downstream signal yang terjadi.

• Ekspresi FcγRIIA pada stem cell yang diisolasi dari umbilical cord blood dengan menggunakan lebih banyak sampel.

DAFTAR PUSTAKA

Belvedere, Ornella, et al. 1999. Phenotypic Characterization of Immunomagnetically Purifie Umbilical Cord Blood CD 34 + Cells. Blood Cells, Molecules, and Diseases.p.141-146

Brown, T.A.1995. Gene cloning, an introduction, 3 rd ed. Chapman & Hall. p228-238

Broxmeyer, E. Hal, et.al.2006. Cord Blood Stem and Progenitor Cells. Methods in Enzymology, 419 : 439-473

Bioscience, B.D. 2002. Introduction to Flow cytometry: a learning guide.

Committee on the biological and biomedical applications of stem cell research council, neuroscience and behavioral health institute of medicine. 2002. Stem cell and the future of regenerative medicine. Washington DC: National Academy Press.

Li Lu, Shen Nian Rong, Hal E. Broxmeyer. 1996. Stem cells from bone marrow, umbilical cord blood and pheripheral blood for clinical application, current status and future application. Critical reviews in Oncology/ Hematology, 22: 61-78

Miltenyi Biotec.2006. CD 34 MicroBead Kit human.

Nayar. B, et al. 2002. Hematopoietic stem /progenitor cell harvesting from umbilical cord blood. International Journal of Gynecology and obstetrics.p 31-32

Rogers,Ian, Robert F Caspers. 2004. Umbilical cord blood stem cells. Best Practice

&

Research Clinical Obstetrics and Gynecology Vol 18 p 893-908.

Sardjono, Caroline, Mottram P.L, Van de velden, Powell M , Power.D, Slocombe R,F et al. 2005. Development of spontaneous multisystem autoimmune disease and hypersensitivity to antibody induced inflammation in Fc

γ

RIIA transgenic mice, arthritis and rheumatology, 52 : 3302-09

Sardjono, Caroline, Mottram P.L, Hogarths P.M. 2003. The role of Fc

γ

RIIA as inflammatory mediator in rheumatoid arthritis and systemic lupus eythematosus. Immunology and cell biology. 81:374-81

Sell, Stewart.2004. Stem Cell Handbook. New Jersey:Humana Press.

Van de Winkel,J.G.J, Hogarth Mark,P.1998. The immunoglobulin Receptors and their Physiological and Pathological Roles in Immunity. Netherlands:Kluwer Academic Publisher.

Wikipedia,2008.Fcreceptor.,(http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thu mb/2/25/Fc_receptor_schematic_big.png/220px-Fc_receptor_schematic_big.png), Januari 25st, 2008

Wikipedia, 2008. Flowcytometry.,( http: // en.wikipedia.org/wiki/Flow_cytometry ), Januari 25st 2008

Wikipedia, 2008. Magnetic-activated cell sorting., (http: //

en.wikipedia.org/wiki/magnetic_activated cell sorting ), Januari 25 st 2008

Wikipedia, 2008. Stem cell. (http: // en.wikipedia.org/wiki/Stem_cell ), Januari 25st2008-12-28

Wikipedia, 2008. Reverse Transcription Polimerase Chain Reaction. ( http:// en.wikipedia.org/wiki/ Reverse_Transcription_Polimerase_Chain_Reaction) Wynter, E.A , N.G Tesla. 2001. Interest of cord blood stem cells. Biomed

Pharmacother 2001 ,55 : 195-200

http://www.brown.edu/courses/B 10032/web_projects.html

http: // www.biolegend.commedia_assetspfeaturedESC%20markers http://www.biolegend.commedia_assetspfeaturedHSC%20Markers http://www.penhealth.com/health_info/pregnancy/images/en/19176.jpg http://users.ugent.be / ̴avierstr/principles/pcrsteps.gif

http: // www.affimed.comimagesdiag1

http: // www.idac.tohoku.ac.jpdepexpimuSignal,

http: //www.nature.comnrijournalv8n1imagesnri2206-f2