B1J009155 10.
II. METODE PENELITIAN
1. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
1.1. Materi
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel, cawan petri,
tabung reaksi, labu Erlenmeyer, beaker glass, object glass, pipet tetes, batang
Drugalsky, rak tabung reaksi, sprayer alkohol, pembakar spirtus, jarum ose, cool
box, tabung eppendorf, baki, hot plate and stirer, timbangan analitik, autoklaf,
Laminar Air Flow, microcentrifuge, mikropipet, tip, alat elektroforesis, water bath,
pH meter, oven, inkubator, UV transiluminator, dan perangkat PCR (Polymerase
Chain Reaction).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuades steril, sampel tanah
dari lahan penambangan timah di Belitung, alumunium foil, spirtus, kapas, kassa,
label, alkohol 70%, medium NA (beef extract 3 g, peptone 5 g, agar 15 g, dan
akuades s.d 1000 ml), Medium cair (Dunger and Fielder, 1989) untuk
menumbuhkan bakteri pengoksidasi besi dan sulfur (KH2PO4 0,05 g, (NH4)2SO4 0,15
g, Ca(NO3) 0,01 g, MgSO4.7H2O 0,50 g, KCl 0,05 g, FeSO4.7H2O 1 g, dan akuades s.d
1000 ml), Medium padat 9K ((NH4)2SO4 3 g, KCl 0,1 g, KH2PO4 0,5 g, MgSO4.7H2O 0,5
g, Ca(NO3) 0,01 g, akuades 700 ml, H2SO4 (10N) 1 ml, FeSO4.7H2O 1 g dan agar 15
ml), wrapper, crystal violet, lugol s iodin, alkohol 96 %, safranin, buffer Tris EDTA
(TE), lisozym, SDS (Sodium Dedocyl Sulfate), es batu, kloroform, alkohol absolut,
alkohol 70%, isopropanol, TE 1x, agarosa, loading dye, Tris Asam asetat glasial EDTA
(TAE),
Fluorosafe
DNA
staining,
primer
universal
27F
(5'
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3') dan 1540R (5 AAGGAGGTGATCCAACCGCA 3 )
(Ohnishi et al., 2009), dH20, ddH2O, DNA genom, dan KAPA 2G Fast Ready Mix.
1.2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Sampel diambil di tiga lokasi lahan tambang di Belitung yaitu Meranteh, Pasir
Tebu dan Batu Penyu. Isolasi dan Identifikasi dilaksanakan di Laboratorium
Mikrobiologi, Laboratorium Genetika dan Molekuler Fakultas Biologi Universitas
Jenderal Soedirman Purwokerto, dan Laboratorium Riset Universitas Jenderal
Soedirman selama bulan Juli 2013 Februari 2014.
6
2. Metode Penelitian
2.1. Metode Percobaan
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan tahapan
isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur, seleksi, karakterisasi morfologi, dan
identifikasi berdasarkan urutan basa gen 16S rRNA.
2.2. Cara Kerja
2.2.1 Preparasi Sampel Tanah
Sampel tanah diambil dari lahan penambangan timah di Belitung.
Sampel tanah diambil dengan teknik random sampling di tiga lokasi
berbeda. Sebelum pengambilan tanah, pH tanah diukur terlebih dahulu
dengan menggunakan pH meter. Sampel tanah diambil pada kedalaman 1015 cm dari permukaan tanah. Sampling di setiap lokasi dilakukan pada 2
titik yang berbeda, yaitu di tanah kering dan tanah basah (tergenang).
Sampel tanah kemudian dimasukan ke dalam plastik dan disimpan dalam
cool box.
2.2.2. Isolasi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur (Dara, 2000)
Sampel tanah dari lokasi penambangan timah di Belitung di timbang
sebanyak 1 g kemudian dimasukan ke dalam 9 ml akuades steril. Setelah itu
dilakukan pengenceran bertingkat hingga 10-4. Sebanyak 0,1 ml di tiga seri
pengenceran terakhir (10-2, 10-3, dan 10-4) diinokulasikan ke media media
cair (Leathen et al., 1956) secara duplo. Selanjutnya diinkubasi selama
14x24 jam pada suhu 300C.
2.2.3. Pengujian Kemampuan Tumbuh Isolat Bakteri pada Medium yang
Mengandung Fe dan S (Nurseha dan Djajakirana, 2004)
Isolat yang mampu tumbuh pada medium cair (Dunger dan Fielder,
1989), kemudian ditumbuhkan pada medium padat 9K secara SP (spread
plate) dan diinkubasi selama 14x24 jam pada suhu 300C. Pengamatan
dilakukan setiap hari dengan melihat adanya pembentukan koloni karat,
dan perubahan pada media agar di sekitar koloni dari bening menjadi
kuning sebagai akibat teroksidasinya besi ferro (Fe2+) menjadi besi ferri
(Fe3+) oleh isolat bakteri.
7
2.2.4. Perhitungan Jumlah Bakteri pada Media 9K
Koloni yang tumbuh pada medium 9K diamati dan dihitung jumlah
koloninya, kemudian ditentukan jumlah total bakteri dengan metode TPC
(Total Plate Count).
2.2.5. Karakterisasi Morfologi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur (Ambarwati,
2002)
Karakterisasi dilakukan terhadap jenis bakteri yang mampu
mengoksidasi besi dan sulfur. Karakter yang diamati yaitu morfologi sel dan
morfologi koloni, meliputi bentuk koloni, ukuran, warna, tepi, permukaan,
elevasi, pigmentasi serta sifat Gram.
2.2.6. Pewarnaan Gram (Cappuccino dan Sherman, 1987)
Setiap koloni yang memiliki morfologi berbeda, di uji pewarnaan
Gram. Sebanyak satu ose isolat diulaskan pada object glass, kemudian
difiksasi dengan melewatkan object glass pada pembakar spirtus. Ulasan
diteteskan dengan Gram A atau cristal violet selama 1 menit, setelah itu
dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Ulasan diteteskan lugol s
iodine yang berfungsi sebagai mordant selama 1 menit. Kemudian ulasan
dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Tahap selanjutnya adalah
proses dekolorisasi dengan etanol sampai tetesan yang jatuh dari ulasan
jernih. Ulasan dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Terakhir,
safranin yang berfungsi sebagai warna pembanding diteteskan selama 1
menit, dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Setelah itu, ulasan
diamati dengan mikroskop.
2.2.7. Seleksi Isolat Bakteri Berdasarkan Kemampuan Tumbuh pada Medium
yang Mengandung Fe dan S
Seleksi isolat bakteri yang mempunyai kemampuan tumbuh terbaik
pada medium yang mengandung Fe dan S dilakukan dengan inokulasi
koloni bakteri sebanyak satu ose dan dicampurkan ke dalam medium cair
(Leathen et al., 1956). Media yang telah diinokulasi selanjutnya diinkubasi
pada suhu ruang selama 7 hari sambil dilakukan pengocokan secara terusmenerus dengan menggunakan shaker incubator dengan kecepatan 125
rpm. Pada akhir inkubasi, dilakukan pengukuran OD (Optical Density)
dengan menggunakan UV -Spektrofotometer pada panjang gelombang 432
8
nm. Isolat dengan nilai OD tertinggi merupakan
isolat yang memiliki
kemampuan tumbuh terbaik pada medium cair yang mengandung Fe dan S.
2.2.8. Identifikasi Berdasarkan Urutan Basa 16S rRNA
2.2.8.a. Ekstraksi DNA Bakteri Isolat Terpilih
Ekstraksi DNA bakteri dilakukan dengan menggunakan 3 ml kultur
cair sel bakteri dalam eppendorf steril (1,5 ml), dan disentrifugasi
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu ruang.
Supernatan dibuang dan ditambahkan dengan 1 ml TE 1x, setelah itu
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Sel
bakteri yang mengendap dilarutkan dalam 50
l tenderizer 30%
kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. SDS 10%
ditambahkan ke eppendorf sebanyak 50 l dan diinkubasi pada suhu
37°C selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke eppendorf
steril baru dan ditambahkan alkohol absolut sebanyak setengah dari
volume supernatant yang dipindahkan dan di bolak balik dengan hatihati agar terbentuk benang-benang DNA, kemudian disentrifugasi pada
suhu 4°C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan
dibuang,
kemudian
ditambahkan
100
l
etanol
dingin
dan
disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15
menit. Supernatan dibuang, setelah itu DNA yang telah mengendap
dikering anginkan selama ± 10 menit dan selanjutnya dilarutkan dalam
100 µl TE 1x.
2.2.8.b. Pengukuran Kemurnian DNA dengan Spektrofotometer (Sambrook et
al., 1989)
Kemurnian DNA dilihat dari hasil spektrofotometer dengan rasio
absorbansi DNA (A260 : A280). DNA dengan nilai rasio A260/280
antara 1,8-2,0 kemudian diamplifikasi dengan metode PCR.
2.2.8.c. Amplifikasi Gen 16S rRNA
Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Proses amplifikasi dimulai dengan membuat campuran
17,5 µl ddH2O, 25 µl KAPA 2G Fast Ready Mix, 1,25 µl forward primer
50pM, 1,25 µl reverse primer 50 pM dan 5 µl templat DNA 5 ng.
9
Campuran tersebut diamplifikasi menggunakan mesin PCR. PCR
dilakukan dengan tahapan pre PCR 950C selama 5 menit, denaturasi
940C selama 1 menit, annealing 500C selama 1 menit dan ekstensi 720C
selama 2 menit. Running PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dan post
PCR 720C selama 10 menit. Suhu kemudian diturunkan 40C selama 5
menit.
2.2.8.d. Running dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Riffiani, 2010)
DNA hasil amplifikasi PCR di elektroforesis pada gel agarosa. Hasil
amplifikasi dapat diketahui dari fraksinasi pita DNA pada gel agarose
1,5% dalam buffer TAE (Tris Asam asetat glasial EDTA) yang
ditambahkan Fluorosafe DNA staining sebanyak 4µl/40ml agarosa.
DNA hasil amplifikasi PCR kemudian dimasukkan ke dalam sumuran gel
agarose. Running elektroforesis dilakukan selama 50 menit pada 100 V
dan 400 mA. Hasil pemisahan divisualisasi menggunakan UV
transluminator dengan menggunakan standar 1 kb DNA ladder untuk
mengetahui hasil dan ukuran pita DNA hasil amplifikasi.
2.2.8.e. Sekuensing
Proses sekuensing dilakukan dengan mengirimkan sampel DNA ke
1stBase Pte Ltd Singapura untuk mengetahui urutan basa dari DNA
sampel.
3. Metode Analisis
Urutan basa hasil sekuensing dianalisis menggunakan software Bioedit, Blast,
Clustal X dan rekonstruksi dendogram menggunakan program Mega 5.05 untuk
mengetahui kekerabatan bakteri pengoksidasi Fe dan S dengan bakteri lain yang
diunduh dari GenBank NCBI.
10
1. Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian
1.1. Materi
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah botol sampel, cawan petri,
tabung reaksi, labu Erlenmeyer, beaker glass, object glass, pipet tetes, batang
Drugalsky, rak tabung reaksi, sprayer alkohol, pembakar spirtus, jarum ose, cool
box, tabung eppendorf, baki, hot plate and stirer, timbangan analitik, autoklaf,
Laminar Air Flow, microcentrifuge, mikropipet, tip, alat elektroforesis, water bath,
pH meter, oven, inkubator, UV transiluminator, dan perangkat PCR (Polymerase
Chain Reaction).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah akuades steril, sampel tanah
dari lahan penambangan timah di Belitung, alumunium foil, spirtus, kapas, kassa,
label, alkohol 70%, medium NA (beef extract 3 g, peptone 5 g, agar 15 g, dan
akuades s.d 1000 ml), Medium cair (Dunger and Fielder, 1989) untuk
menumbuhkan bakteri pengoksidasi besi dan sulfur (KH2PO4 0,05 g, (NH4)2SO4 0,15
g, Ca(NO3) 0,01 g, MgSO4.7H2O 0,50 g, KCl 0,05 g, FeSO4.7H2O 1 g, dan akuades s.d
1000 ml), Medium padat 9K ((NH4)2SO4 3 g, KCl 0,1 g, KH2PO4 0,5 g, MgSO4.7H2O 0,5
g, Ca(NO3) 0,01 g, akuades 700 ml, H2SO4 (10N) 1 ml, FeSO4.7H2O 1 g dan agar 15
ml), wrapper, crystal violet, lugol s iodin, alkohol 96 %, safranin, buffer Tris EDTA
(TE), lisozym, SDS (Sodium Dedocyl Sulfate), es batu, kloroform, alkohol absolut,
alkohol 70%, isopropanol, TE 1x, agarosa, loading dye, Tris Asam asetat glasial EDTA
(TAE),
Fluorosafe
DNA
staining,
primer
universal
27F
(5'
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 3') dan 1540R (5 AAGGAGGTGATCCAACCGCA 3 )
(Ohnishi et al., 2009), dH20, ddH2O, DNA genom, dan KAPA 2G Fast Ready Mix.
1.2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Sampel diambil di tiga lokasi lahan tambang di Belitung yaitu Meranteh, Pasir
Tebu dan Batu Penyu. Isolasi dan Identifikasi dilaksanakan di Laboratorium
Mikrobiologi, Laboratorium Genetika dan Molekuler Fakultas Biologi Universitas
Jenderal Soedirman Purwokerto, dan Laboratorium Riset Universitas Jenderal
Soedirman selama bulan Juli 2013 Februari 2014.
6
2. Metode Penelitian
2.1. Metode Percobaan
Metode penelitian yang digunakan adalah metode deskriptif dengan tahapan
isolasi bakteri pengoksidasi besi dan sulfur, seleksi, karakterisasi morfologi, dan
identifikasi berdasarkan urutan basa gen 16S rRNA.
2.2. Cara Kerja
2.2.1 Preparasi Sampel Tanah
Sampel tanah diambil dari lahan penambangan timah di Belitung.
Sampel tanah diambil dengan teknik random sampling di tiga lokasi
berbeda. Sebelum pengambilan tanah, pH tanah diukur terlebih dahulu
dengan menggunakan pH meter. Sampel tanah diambil pada kedalaman 1015 cm dari permukaan tanah. Sampling di setiap lokasi dilakukan pada 2
titik yang berbeda, yaitu di tanah kering dan tanah basah (tergenang).
Sampel tanah kemudian dimasukan ke dalam plastik dan disimpan dalam
cool box.
2.2.2. Isolasi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur (Dara, 2000)
Sampel tanah dari lokasi penambangan timah di Belitung di timbang
sebanyak 1 g kemudian dimasukan ke dalam 9 ml akuades steril. Setelah itu
dilakukan pengenceran bertingkat hingga 10-4. Sebanyak 0,1 ml di tiga seri
pengenceran terakhir (10-2, 10-3, dan 10-4) diinokulasikan ke media media
cair (Leathen et al., 1956) secara duplo. Selanjutnya diinkubasi selama
14x24 jam pada suhu 300C.
2.2.3. Pengujian Kemampuan Tumbuh Isolat Bakteri pada Medium yang
Mengandung Fe dan S (Nurseha dan Djajakirana, 2004)
Isolat yang mampu tumbuh pada medium cair (Dunger dan Fielder,
1989), kemudian ditumbuhkan pada medium padat 9K secara SP (spread
plate) dan diinkubasi selama 14x24 jam pada suhu 300C. Pengamatan
dilakukan setiap hari dengan melihat adanya pembentukan koloni karat,
dan perubahan pada media agar di sekitar koloni dari bening menjadi
kuning sebagai akibat teroksidasinya besi ferro (Fe2+) menjadi besi ferri
(Fe3+) oleh isolat bakteri.
7
2.2.4. Perhitungan Jumlah Bakteri pada Media 9K
Koloni yang tumbuh pada medium 9K diamati dan dihitung jumlah
koloninya, kemudian ditentukan jumlah total bakteri dengan metode TPC
(Total Plate Count).
2.2.5. Karakterisasi Morfologi Bakteri Pengoksidasi Besi dan Sulfur (Ambarwati,
2002)
Karakterisasi dilakukan terhadap jenis bakteri yang mampu
mengoksidasi besi dan sulfur. Karakter yang diamati yaitu morfologi sel dan
morfologi koloni, meliputi bentuk koloni, ukuran, warna, tepi, permukaan,
elevasi, pigmentasi serta sifat Gram.
2.2.6. Pewarnaan Gram (Cappuccino dan Sherman, 1987)
Setiap koloni yang memiliki morfologi berbeda, di uji pewarnaan
Gram. Sebanyak satu ose isolat diulaskan pada object glass, kemudian
difiksasi dengan melewatkan object glass pada pembakar spirtus. Ulasan
diteteskan dengan Gram A atau cristal violet selama 1 menit, setelah itu
dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Ulasan diteteskan lugol s
iodine yang berfungsi sebagai mordant selama 1 menit. Kemudian ulasan
dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Tahap selanjutnya adalah
proses dekolorisasi dengan etanol sampai tetesan yang jatuh dari ulasan
jernih. Ulasan dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Terakhir,
safranin yang berfungsi sebagai warna pembanding diteteskan selama 1
menit, dicuci dengan akuades dan dikering anginkan. Setelah itu, ulasan
diamati dengan mikroskop.
2.2.7. Seleksi Isolat Bakteri Berdasarkan Kemampuan Tumbuh pada Medium
yang Mengandung Fe dan S
Seleksi isolat bakteri yang mempunyai kemampuan tumbuh terbaik
pada medium yang mengandung Fe dan S dilakukan dengan inokulasi
koloni bakteri sebanyak satu ose dan dicampurkan ke dalam medium cair
(Leathen et al., 1956). Media yang telah diinokulasi selanjutnya diinkubasi
pada suhu ruang selama 7 hari sambil dilakukan pengocokan secara terusmenerus dengan menggunakan shaker incubator dengan kecepatan 125
rpm. Pada akhir inkubasi, dilakukan pengukuran OD (Optical Density)
dengan menggunakan UV -Spektrofotometer pada panjang gelombang 432
8
nm. Isolat dengan nilai OD tertinggi merupakan
isolat yang memiliki
kemampuan tumbuh terbaik pada medium cair yang mengandung Fe dan S.
2.2.8. Identifikasi Berdasarkan Urutan Basa 16S rRNA
2.2.8.a. Ekstraksi DNA Bakteri Isolat Terpilih
Ekstraksi DNA bakteri dilakukan dengan menggunakan 3 ml kultur
cair sel bakteri dalam eppendorf steril (1,5 ml), dan disentrifugasi
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit pada suhu ruang.
Supernatan dibuang dan ditambahkan dengan 1 ml TE 1x, setelah itu
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Sel
bakteri yang mengendap dilarutkan dalam 50
l tenderizer 30%
kemudian diinkubasi pada suhu 37°C selama 60 menit. SDS 10%
ditambahkan ke eppendorf sebanyak 50 l dan diinkubasi pada suhu
37°C selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan
10.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipindahkan ke eppendorf
steril baru dan ditambahkan alkohol absolut sebanyak setengah dari
volume supernatant yang dipindahkan dan di bolak balik dengan hatihati agar terbentuk benang-benang DNA, kemudian disentrifugasi pada
suhu 4°C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan
dibuang,
kemudian
ditambahkan
100
l
etanol
dingin
dan
disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15
menit. Supernatan dibuang, setelah itu DNA yang telah mengendap
dikering anginkan selama ± 10 menit dan selanjutnya dilarutkan dalam
100 µl TE 1x.
2.2.8.b. Pengukuran Kemurnian DNA dengan Spektrofotometer (Sambrook et
al., 1989)
Kemurnian DNA dilihat dari hasil spektrofotometer dengan rasio
absorbansi DNA (A260 : A280). DNA dengan nilai rasio A260/280
antara 1,8-2,0 kemudian diamplifikasi dengan metode PCR.
2.2.8.c. Amplifikasi Gen 16S rRNA
Amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan Polymerase Chain
Reaction (PCR). Proses amplifikasi dimulai dengan membuat campuran
17,5 µl ddH2O, 25 µl KAPA 2G Fast Ready Mix, 1,25 µl forward primer
50pM, 1,25 µl reverse primer 50 pM dan 5 µl templat DNA 5 ng.
9
Campuran tersebut diamplifikasi menggunakan mesin PCR. PCR
dilakukan dengan tahapan pre PCR 950C selama 5 menit, denaturasi
940C selama 1 menit, annealing 500C selama 1 menit dan ekstensi 720C
selama 2 menit. Running PCR dilakukan sebanyak 30 siklus dan post
PCR 720C selama 10 menit. Suhu kemudian diturunkan 40C selama 5
menit.
2.2.8.d. Running dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Riffiani, 2010)
DNA hasil amplifikasi PCR di elektroforesis pada gel agarosa. Hasil
amplifikasi dapat diketahui dari fraksinasi pita DNA pada gel agarose
1,5% dalam buffer TAE (Tris Asam asetat glasial EDTA) yang
ditambahkan Fluorosafe DNA staining sebanyak 4µl/40ml agarosa.
DNA hasil amplifikasi PCR kemudian dimasukkan ke dalam sumuran gel
agarose. Running elektroforesis dilakukan selama 50 menit pada 100 V
dan 400 mA. Hasil pemisahan divisualisasi menggunakan UV
transluminator dengan menggunakan standar 1 kb DNA ladder untuk
mengetahui hasil dan ukuran pita DNA hasil amplifikasi.
2.2.8.e. Sekuensing
Proses sekuensing dilakukan dengan mengirimkan sampel DNA ke
1stBase Pte Ltd Singapura untuk mengetahui urutan basa dari DNA
sampel.
3. Metode Analisis
Urutan basa hasil sekuensing dianalisis menggunakan software Bioedit, Blast,
Clustal X dan rekonstruksi dendogram menggunakan program Mega 5.05 untuk
mengetahui kekerabatan bakteri pengoksidasi Fe dan S dengan bakteri lain yang
diunduh dari GenBank NCBI.
10