ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila Isolat AIR DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN (gyr B).
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR
KOLAM DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Program Studi Biologi
Departemen Pendidikan Biologi
Oleh:
Fitri Rohmasari
1006348
PROGRAM STUDI BIOLOGI
DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
2015
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
ANALISIS FILOGENETIKA BAKTERI
Aeromonas hydrophila ISOLAT
AIR KOLAM DARI BEBERAPA
KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN
gyr B
Oleh
Fitri Rohmasari
Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
© Fitri Rohmasari 2015
Universitas Pendidikan Indonesia
Januari 2015
Hak Cipta dilindungi undang-undang.
Skripsi ini tidak boleh diperbanyak seluruhya atau sebagian,
dengan dicetak ulang, difoto kopi, atau cara lainnya tanpa ijin dari penulis.
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
LEMBAR PENGESAHAN
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR
DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Oleh
Fitri Rohmasari
1006348
DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH:
Pembimbing I
Dr. Topik Hidayat, M.Si
NIP. 197004101997021001
Pembimbing II
Diah Kusumawaty, M.Si
NIP.19708112001122001
Mengetahui,
Ketua Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI
Dr. Riandi, M.Si
NIP. 196305011988031002
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Analisis Filogenetik
Bakteri Aeromonas hydrophila Isolat Air Kolam dari Beberapa Kota Berdasarkan
Sikuen Gen gyr B” ini beserta seluruh isinya adalah benar-benar karya sendiri, dan saya
tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai
dengan etika keilmuan yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan ini,
saya siap menanggung sanksi yang dijatuhkan kepada saya apabila kemudian ditemukan
adanya pelanggaran terhadap etika keilmuan dalam karya saya ini atau klaim dari pihak
lain terhadap keaslian karya saya ini.
Bandung, November 2014
Yang membuat pernyataan,
Fitri Rohmasari
1006348
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila Isolat AIR
DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN (gyr B)
ABSTRAK
Air merupakan pelarut universal, sehingga tidak semua air dapat dikatakan murni
Air dapat menjadi perantara bakteri patogen untuk menginfeksi penyakit. Salah satunya
adalah bakteri Aeromonas spp. Bakteri Aeromonas hydrophila umum ditemukan di
perairan. Aeromonas memiliki taksonomi yang kompleks dengan karakter yang berbedabeda, bahkan di level intraspesies. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui
karakteristik Aeromonas hydrophila isolat air beberapa kota secara biokimia dan
molekular dan mengetahui hubungan kekerabatan Aeromonas hydrophila yang didapat
dari beberapa kota berdasarkan sikuen gen gyr B.. Pada penelitian ini dilakukan pengujian
morfologi dan biokimia untuk menskrining sampel bakteri yang diisolasi dari beberapa
kota. Selain itu, dilakukan pengujian molekuler yaitu pendeteksian gen lip sebagai gen
spesifik Aeromonas hydrophila dan pengujian secara literarur dengan perbandingan hasil
penelitian sebelumnya. Hasil skrining dengan pengujian morfologi, biokimia, dan
molekuler, dari 9 isolat bakteri yang diuji, hanya 6 isolat bakteri yang dapat disekuensing
dengan baik menggunakan gen gyr B, dan isolat tersebut kemungkinan besar merupakan
Aeromonas, keenam isolat tersebut merupakan bakteri gram negatif dengan bentuk basil,
positif terhadap uji oksidase, merupakan bakteri fakultatif anaerob, bersifat motil dan
memiliki kemampuan β hemolisis. Hasil dari pendeteksian gen lip pada seluruh isolat
Aeromonas, 50% isolat menunjukkan amplikon pada ukuran 760 pb. Sedangkan hasil dari
analisis bioinformatika menggunakan sikuen gen gyr B menunjukan lima isolat bakteri
tersebut berkerabat dekat satu dengan yang lainnya.
Kata kunci : Aeromonas hydrophila, gen gyr B, filogenetika,
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
ANALYSIS PHYLOGENETIC OF Aeromonas hydrophila WATER POND
ISOLATES FROM SOME CITIES BASED ON gyr B GENE SEQUENCE
ABSTRACT
Water can be an intermediary factor for pathogenic bacteria to infect the
disease, one of which is Aeromonas. This bacterium is pathogenic to either
humans or animals especially fish. Phylogenetic relationship between Aeromonas
spp. need to describe to know the diversity and distribution of strains in water, so
it can be used to test water quality accurately and quickly. This study aimed to
determine the characteristics, and phylogenetic relationships of Aeromonasspp.
Morphology test (Gram staining); biochemical tests include RS+Novobiocin,
motility, oxidation, OF, indole, VP, citrate, lactose fermentation, hemolysis
detection; and detection of lipase gene were determined from 9 isolates. Then 5
selected isolates and 1 control isolates were sequenced based on gyr B gene.
Phylogenetic trees obtained using Clustal X and MEGA 5. The results of the
screening test morphological, biochemical, and molecular, from isolates tested,
are likely to be Aeromonas is a gram-negative bacteria in the form of bacillus ,
positive for oxidase test, a facultative anaerobic bacteria, are motile and have the
ability to β hemolysis. Results of detection of gene lip on all isolates of
Aeromonas, 50% of isolates showed 760 bp amplicon in size. While the results of
bioinformatics analysis using gene sequence Gyr B shows the five isolates closely
related to one another.
Keywords: Aeromonas spp., phylogenetic, gyr B gene
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ..............................................................................................i
ABSTRAK ............................................................................................................. iii
DAFTAR ISI ............................................................................................................v
DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................x
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................1
A. Latar Belakang .............................................................................................1
B. Rumusan Masalah ........................................................................................4
C. Pertanyaan Penelitian ...................................................................................4
D. Batasan Masalah...........................................................................................5
E. Tujuan Penelitian .........................................................................................5
F. Manfaat Penelitian .......................................................................................5
BAB II KARAKTERISTIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DAN STUDI
ANALISIS FILOGENETIKA MENGGUNAKAN SIKUEN GEN
Gyr B .........................................................................................................6
A. Deskripsi Bakteri A. hydrophila ...................................................................6
B. Aeromonas spp. dan Air ...............................................................................7
C. Patogenitas Aeromonas hydrophila .............................................................8
D. Karakterisasi dan Identifikasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Aeromonas
hydrophila ....................................................................................................9
E. Identifikasi Molekular .................................................................................... 18
F. Gen Lipase........................................................................................................ 19
G. Gen Housekeeping (gyr B) ............................................................................. 20
H. Sequencing ....................................................................................................... 21
I. Filognetika Molekuler ..................................................................................... 22
J. Tahapan Dalam Analisis Filogenetika Molekuler......................................24
BAB III METODE PENELITIAN ........................................................................27
A. Jenis Penelitian ........................................................................................27
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
B. Populasi dan Sampel ...............................................................................27
C. Waktu dan Tempat Penelitian .................................................................27
D. Alat dan Bahan .......................................................................................27
E. Prosedur Penelitian ..................................................................................27
1. Persiapan Penelitian dan Pra Penelitian ...............................................27
2. Subkultur A. hydrophila Pada Medium RS ..........................................28
3. Pemurnian Koloni Bakteri Biokimia .....................................................28
4. Uji Morfologi dan Biokimia Bakteri ....................................................28
5. Pembuatan Cryo Bakteri .......................................................................31
6. Identifikasi Aeromonas hydrophila Secara Molekular .........................32
F. Pra Sikuensing ...........................................................................................33
1. Identifikasi Gen gyrB dengan Metode PCR ..........................................33
2. Mengukur Kemurnian dan Konsentrasi DNA Hasil Amplikon .............34
G. Elektroforesis Hasil PCR Gen Lipase dan Gen gyr B ................................35
H. Sikuensing .................................................................................................35
I. Analisis Data Bioinformatika ..................................................................36
J. Alur Penelitian .........................................................................................37
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ......................................38
A. Karakterisasi dan Sub Kultur Bakteri A. hydrophila ................................39
B. Karakterisasi Morfologi dan Biokimia A. hydrophila (SNI 7303) ............42
C. Karakterisasi Morfologi dan Biokimia Tambahan .....................................51
D. Karakterisasi Molekular Bakteri A. hydrophila ........................................63
E. Pra Sekuensing ...........................................................................................67
F. Analisa Hasil Sikuensing ...........................................................................69
G. Analisa Filogenetik Gen gyr B ...................................................................80
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................................91
A. Kesimpulan ................................................................................................91
B. Saran...........................................................................................................91
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................92
LAMPIRAN-LAMPIRAN...................................................................................101
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
3.1
Komposisi Reaksi Amplifikasi Gen Lipase pada A. hydrophila ................32
3.2
Primer yang Digunakan Dalam PCR Sekuen Gen gyr B ..........................33
3.3
Komposisi Reaksi Amplifikasi Gen gyr Penelitian ...................................34
4.1
Hasil Sub Kultur Bakteri pada Medium RS ...............................................41
4.2
Hasil Uji Morfologi dan Biokimia (SNI 7303) Isolat Bakteri ...................43
4.3
Hasil Uji Morfologi dan Biokimia Tambahan Isolat Bakteri .....................51
4.4
Tabel Rekapan Hasil Identifikasi Biokimia Isolat Bakteri ........................62
4.5
Hasil Spektrofotometer DNA Isolat A. hydrophila ....................................64
4.6
Hasil Spektrofotometer Amplifikasi Gen gyr B Isolat A. hydrophila ........68
4.7
Hasil Sikuensing Pada Aeromonas Isolat Air Kolam ...............................71
4.8
Hasil Blast Sikuen Isolat Aeromonas Isolat ATCC 7966 .........................73
4.9
Hasil Blast Parsial Sikuen Isolat Aeromonas ATCC 7966 .......................74
4.10 Hasil Blast Parsial Sikuen Isolat Aeromonas Air Kolam ..........................76
4.11 Hasil Uji Biokimia dan Molekular Isolat Aeromonas Air Kolam .............79
4.12 Karakteristik Aeromonas Isolat Air Beberapa Kota Secara Biokimia
Maupun Molekuler .....................................................................................88
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
2.1
Bakteri Aeromonas hydrophila ....................................................................7
2.2
Infeksi Bakteri Aeromonas spp. pada kulit Ikan ..........................................8
2.3
Beberapa Hasil Uji pada Bakteri Aeromonas ............................................10
2.4
Hasil Isolasi Bakteri Aeromonas pada Medium RS ...................................11
2.5
Penampakan Koloni Bakteri Pada Medium .............................................11
2.6
Penentuan Bakteri Gram Negatif Pada Aeromonas Spp ...........................12
2.7
Produksi ß-Hemolysis Oleh A. Hydrophila Pada Tryptone Soy Agar ......13
2.8
Uji Motilitas Dan Produksi H2S Pada Bakteri Aeromonas Spp ................14
2.9
Uji Oksidasi Pada Aeromonas Spp ...........................................................15
2.10 Reaksi Positif Isolat Bakteri Aeromonas Spp. Pada Uji OksidatifFermentatif .................................................................................................15
2.11 Reaksi Fermentasi Lakosa Pada Medium Mac Conkey ............................16
2.12 Hasil Uji Sitrat pada isolat Aeromonas spp ...............................................17
2.13 Hasil uji indol terhadap isolat bakteri Aeromonas ....................................17
2.14 Hasil pengujian V-P pada isolat bakteri Aeromonas .................................18
2.15 Rekonstruksi Pohon filogenetika ..............................................................24
3.1
Program PCR Gen Lipase .........................................................................33
3.2
Program PCR Geng gyr B .........................................................................34
3.3
Rumus Perhitungan Konsentrasi DNA ......................................................35
3.4
Bagan Alur Penelitian ................................................................................37
4.1
Koloni Isolat Aeromonas Pada Mediu RS ................................................39
4.2
Penampakan Morfologi Aeromonas sp diatas Medium RS ......................40
4.3
Hasil Pewarnaan Gram Isolat Bakteri Aeromonas ....................................44
4.4
Indikator lengket yang ditunjukan oleh bakteri Aeromonas (gram negatif)
dalam KOH string test ...............................................................................44
4.5
Uji Motilitas Dan Produksi H2S Isolat Bakteri .........................................46
4.6
Produksi H2S Pada Isolat Bakteri Aeromonas spp ....................................46
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
4.7
Hasil Uji Oksidatif Isolat Bakteri Dalam Penelitian .................................48
4.8
Reaksi Positif Isolat Bakteri Pada Uji Oksidatif-Fermentatif ....................49
4.9
Hasil uji OF ...............................................................................................49
4.10 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila ................................52
4.11 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila ...............................53
4.12 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila dari Isolat Air ........53
4.13 Hasil Uji Vouges-Praukover A. hydrophila ...............................................55
4.14 Hasil Uji VP Isolat Bakteri A. hydrophila .................................................55
4.15 Hasil uji fermentasi Lactosa isolat Aeromonas Air Kolam pada medium
Mac konkey ...............................................................................................57
4.16 Hasil Uji Positif Fermentasi Laktosa ........................................................57
4.17 Hasil Uji negatif Fermentasi Laktosa ........................................................57
4.18 Hasil Uji Indole .........................................................................................59
4.19 Hasil Uji Indol ...........................................................................................59
4.20 Hasil Uji Simons Sitrat ..............................................................................60
4.21 Elektroforesis Gen Lipase Isolat Aeromonas ............................................64
4.22 Elektroforesis Hasil Amplifikasi Gen gyr B...............................................67
4.23 Elektrogram (Peak) Sikuen Isolat Aeromonas ATCC ..............................70
4.24 Elektrogram (Peak) Sikuen Isolat Aeromonas AKC ................................70
4.25 Aligmnent sikuens gen gyr B .....................................................................77
4.26 Urutan Aligment sikuen gen gyr B Isolat Aeromonas ...............................77
4.27 Rekonstruksi Pohon Filogentika ................................................................85
DAFTAR LAMPIRAN
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
Lampiran
Halaman
1.
Daftar Alat Penelitian ...................................................................101
2.
Daftar Bahan Penelitian ...............................................................103
3.
Protokol Pembuatan Medium.......................................................105
4.
Hasil Sikuensing Gen gyr B Bakteri Aeromonas Isolat Air ......110
5.
Pohon Filogenetik 16s rRNA ......................................................118
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
KOLAM DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Sebagian dari Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains
Program Studi Biologi
Departemen Pendidikan Biologi
Oleh:
Fitri Rohmasari
1006348
PROGRAM STUDI BIOLOGI
DEPARTEMEN PENDIDIKAN BIOLOGI
FAKULTAS PENDIDIKAN MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA
2015
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
ANALISIS FILOGENETIKA BAKTERI
Aeromonas hydrophila ISOLAT
AIR KOLAM DARI BEBERAPA
KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN
gyr B
Oleh
Fitri Rohmasari
Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
© Fitri Rohmasari 2015
Universitas Pendidikan Indonesia
Januari 2015
Hak Cipta dilindungi undang-undang.
Skripsi ini tidak boleh diperbanyak seluruhya atau sebagian,
dengan dicetak ulang, difoto kopi, atau cara lainnya tanpa ijin dari penulis.
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
LEMBAR PENGESAHAN
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR
DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Oleh
Fitri Rohmasari
1006348
DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH:
Pembimbing I
Dr. Topik Hidayat, M.Si
NIP. 197004101997021001
Pembimbing II
Diah Kusumawaty, M.Si
NIP.19708112001122001
Mengetahui,
Ketua Jurusan Pendidikan Biologi FPMIPA UPI
Dr. Riandi, M.Si
NIP. 196305011988031002
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
PERNYATAAN
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi dengan judul “Analisis Filogenetik
Bakteri Aeromonas hydrophila Isolat Air Kolam dari Beberapa Kota Berdasarkan
Sikuen Gen gyr B” ini beserta seluruh isinya adalah benar-benar karya sendiri, dan saya
tidak melakukan penjiplakan atau pengutipan dengan cara-cara yang tidak sesuai
dengan etika keilmuan yang berlaku dalam masyarakat keilmuan. Atas pernyataan ini,
saya siap menanggung sanksi yang dijatuhkan kepada saya apabila kemudian ditemukan
adanya pelanggaran terhadap etika keilmuan dalam karya saya ini atau klaim dari pihak
lain terhadap keaslian karya saya ini.
Bandung, November 2014
Yang membuat pernyataan,
Fitri Rohmasari
1006348
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila Isolat AIR
DARI BEBERAPA KOTA BERDASARKAN SIKUEN GEN (gyr B)
ABSTRAK
Air merupakan pelarut universal, sehingga tidak semua air dapat dikatakan murni
Air dapat menjadi perantara bakteri patogen untuk menginfeksi penyakit. Salah satunya
adalah bakteri Aeromonas spp. Bakteri Aeromonas hydrophila umum ditemukan di
perairan. Aeromonas memiliki taksonomi yang kompleks dengan karakter yang berbedabeda, bahkan di level intraspesies. Tujuan penelitian ini yaitu untuk mengetahui
karakteristik Aeromonas hydrophila isolat air beberapa kota secara biokimia dan
molekular dan mengetahui hubungan kekerabatan Aeromonas hydrophila yang didapat
dari beberapa kota berdasarkan sikuen gen gyr B.. Pada penelitian ini dilakukan pengujian
morfologi dan biokimia untuk menskrining sampel bakteri yang diisolasi dari beberapa
kota. Selain itu, dilakukan pengujian molekuler yaitu pendeteksian gen lip sebagai gen
spesifik Aeromonas hydrophila dan pengujian secara literarur dengan perbandingan hasil
penelitian sebelumnya. Hasil skrining dengan pengujian morfologi, biokimia, dan
molekuler, dari 9 isolat bakteri yang diuji, hanya 6 isolat bakteri yang dapat disekuensing
dengan baik menggunakan gen gyr B, dan isolat tersebut kemungkinan besar merupakan
Aeromonas, keenam isolat tersebut merupakan bakteri gram negatif dengan bentuk basil,
positif terhadap uji oksidase, merupakan bakteri fakultatif anaerob, bersifat motil dan
memiliki kemampuan β hemolisis. Hasil dari pendeteksian gen lip pada seluruh isolat
Aeromonas, 50% isolat menunjukkan amplikon pada ukuran 760 pb. Sedangkan hasil dari
analisis bioinformatika menggunakan sikuen gen gyr B menunjukan lima isolat bakteri
tersebut berkerabat dekat satu dengan yang lainnya.
Kata kunci : Aeromonas hydrophila, gen gyr B, filogenetika,
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
ANALYSIS PHYLOGENETIC OF Aeromonas hydrophila WATER POND
ISOLATES FROM SOME CITIES BASED ON gyr B GENE SEQUENCE
ABSTRACT
Water can be an intermediary factor for pathogenic bacteria to infect the
disease, one of which is Aeromonas. This bacterium is pathogenic to either
humans or animals especially fish. Phylogenetic relationship between Aeromonas
spp. need to describe to know the diversity and distribution of strains in water, so
it can be used to test water quality accurately and quickly. This study aimed to
determine the characteristics, and phylogenetic relationships of Aeromonasspp.
Morphology test (Gram staining); biochemical tests include RS+Novobiocin,
motility, oxidation, OF, indole, VP, citrate, lactose fermentation, hemolysis
detection; and detection of lipase gene were determined from 9 isolates. Then 5
selected isolates and 1 control isolates were sequenced based on gyr B gene.
Phylogenetic trees obtained using Clustal X and MEGA 5. The results of the
screening test morphological, biochemical, and molecular, from isolates tested,
are likely to be Aeromonas is a gram-negative bacteria in the form of bacillus ,
positive for oxidase test, a facultative anaerobic bacteria, are motile and have the
ability to β hemolysis. Results of detection of gene lip on all isolates of
Aeromonas, 50% of isolates showed 760 bp amplicon in size. While the results of
bioinformatics analysis using gene sequence Gyr B shows the five isolates closely
related to one another.
Keywords: Aeromonas spp., phylogenetic, gyr B gene
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
DAFTAR ISI
KATA PENGANTAR ..............................................................................................i
ABSTRAK ............................................................................................................. iii
DAFTAR ISI ............................................................................................................v
DAFTAR TABEL ................................................................................................. vii
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................... viii
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................x
BAB I PENDAHULUAN ........................................................................................1
A. Latar Belakang .............................................................................................1
B. Rumusan Masalah ........................................................................................4
C. Pertanyaan Penelitian ...................................................................................4
D. Batasan Masalah...........................................................................................5
E. Tujuan Penelitian .........................................................................................5
F. Manfaat Penelitian .......................................................................................5
BAB II KARAKTERISTIK BAKTERI Aeromonas hydrophila DAN STUDI
ANALISIS FILOGENETIKA MENGGUNAKAN SIKUEN GEN
Gyr B .........................................................................................................6
A. Deskripsi Bakteri A. hydrophila ...................................................................6
B. Aeromonas spp. dan Air ...............................................................................7
C. Patogenitas Aeromonas hydrophila .............................................................8
D. Karakterisasi dan Identifikasi Morfologi dan Biokimia Bakteri Aeromonas
hydrophila ....................................................................................................9
E. Identifikasi Molekular .................................................................................... 18
F. Gen Lipase........................................................................................................ 19
G. Gen Housekeeping (gyr B) ............................................................................. 20
H. Sequencing ....................................................................................................... 21
I. Filognetika Molekuler ..................................................................................... 22
J. Tahapan Dalam Analisis Filogenetika Molekuler......................................24
BAB III METODE PENELITIAN ........................................................................27
A. Jenis Penelitian ........................................................................................27
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
B. Populasi dan Sampel ...............................................................................27
C. Waktu dan Tempat Penelitian .................................................................27
D. Alat dan Bahan .......................................................................................27
E. Prosedur Penelitian ..................................................................................27
1. Persiapan Penelitian dan Pra Penelitian ...............................................27
2. Subkultur A. hydrophila Pada Medium RS ..........................................28
3. Pemurnian Koloni Bakteri Biokimia .....................................................28
4. Uji Morfologi dan Biokimia Bakteri ....................................................28
5. Pembuatan Cryo Bakteri .......................................................................31
6. Identifikasi Aeromonas hydrophila Secara Molekular .........................32
F. Pra Sikuensing ...........................................................................................33
1. Identifikasi Gen gyrB dengan Metode PCR ..........................................33
2. Mengukur Kemurnian dan Konsentrasi DNA Hasil Amplikon .............34
G. Elektroforesis Hasil PCR Gen Lipase dan Gen gyr B ................................35
H. Sikuensing .................................................................................................35
I. Analisis Data Bioinformatika ..................................................................36
J. Alur Penelitian .........................................................................................37
BAB IV HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN ......................................38
A. Karakterisasi dan Sub Kultur Bakteri A. hydrophila ................................39
B. Karakterisasi Morfologi dan Biokimia A. hydrophila (SNI 7303) ............42
C. Karakterisasi Morfologi dan Biokimia Tambahan .....................................51
D. Karakterisasi Molekular Bakteri A. hydrophila ........................................63
E. Pra Sekuensing ...........................................................................................67
F. Analisa Hasil Sikuensing ...........................................................................69
G. Analisa Filogenetik Gen gyr B ...................................................................80
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.................................................................91
A. Kesimpulan ................................................................................................91
B. Saran...........................................................................................................91
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................92
LAMPIRAN-LAMPIRAN...................................................................................101
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
DAFTAR TABEL
Tabel
Halaman
3.1
Komposisi Reaksi Amplifikasi Gen Lipase pada A. hydrophila ................32
3.2
Primer yang Digunakan Dalam PCR Sekuen Gen gyr B ..........................33
3.3
Komposisi Reaksi Amplifikasi Gen gyr Penelitian ...................................34
4.1
Hasil Sub Kultur Bakteri pada Medium RS ...............................................41
4.2
Hasil Uji Morfologi dan Biokimia (SNI 7303) Isolat Bakteri ...................43
4.3
Hasil Uji Morfologi dan Biokimia Tambahan Isolat Bakteri .....................51
4.4
Tabel Rekapan Hasil Identifikasi Biokimia Isolat Bakteri ........................62
4.5
Hasil Spektrofotometer DNA Isolat A. hydrophila ....................................64
4.6
Hasil Spektrofotometer Amplifikasi Gen gyr B Isolat A. hydrophila ........68
4.7
Hasil Sikuensing Pada Aeromonas Isolat Air Kolam ...............................71
4.8
Hasil Blast Sikuen Isolat Aeromonas Isolat ATCC 7966 .........................73
4.9
Hasil Blast Parsial Sikuen Isolat Aeromonas ATCC 7966 .......................74
4.10 Hasil Blast Parsial Sikuen Isolat Aeromonas Air Kolam ..........................76
4.11 Hasil Uji Biokimia dan Molekular Isolat Aeromonas Air Kolam .............79
4.12 Karakteristik Aeromonas Isolat Air Beberapa Kota Secara Biokimia
Maupun Molekuler .....................................................................................88
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
DAFTAR GAMBAR
Gambar
Halaman
2.1
Bakteri Aeromonas hydrophila ....................................................................7
2.2
Infeksi Bakteri Aeromonas spp. pada kulit Ikan ..........................................8
2.3
Beberapa Hasil Uji pada Bakteri Aeromonas ............................................10
2.4
Hasil Isolasi Bakteri Aeromonas pada Medium RS ...................................11
2.5
Penampakan Koloni Bakteri Pada Medium .............................................11
2.6
Penentuan Bakteri Gram Negatif Pada Aeromonas Spp ...........................12
2.7
Produksi ß-Hemolysis Oleh A. Hydrophila Pada Tryptone Soy Agar ......13
2.8
Uji Motilitas Dan Produksi H2S Pada Bakteri Aeromonas Spp ................14
2.9
Uji Oksidasi Pada Aeromonas Spp ...........................................................15
2.10 Reaksi Positif Isolat Bakteri Aeromonas Spp. Pada Uji OksidatifFermentatif .................................................................................................15
2.11 Reaksi Fermentasi Lakosa Pada Medium Mac Conkey ............................16
2.12 Hasil Uji Sitrat pada isolat Aeromonas spp ...............................................17
2.13 Hasil uji indol terhadap isolat bakteri Aeromonas ....................................17
2.14 Hasil pengujian V-P pada isolat bakteri Aeromonas .................................18
2.15 Rekonstruksi Pohon filogenetika ..............................................................24
3.1
Program PCR Gen Lipase .........................................................................33
3.2
Program PCR Geng gyr B .........................................................................34
3.3
Rumus Perhitungan Konsentrasi DNA ......................................................35
3.4
Bagan Alur Penelitian ................................................................................37
4.1
Koloni Isolat Aeromonas Pada Mediu RS ................................................39
4.2
Penampakan Morfologi Aeromonas sp diatas Medium RS ......................40
4.3
Hasil Pewarnaan Gram Isolat Bakteri Aeromonas ....................................44
4.4
Indikator lengket yang ditunjukan oleh bakteri Aeromonas (gram negatif)
dalam KOH string test ...............................................................................44
4.5
Uji Motilitas Dan Produksi H2S Isolat Bakteri .........................................46
4.6
Produksi H2S Pada Isolat Bakteri Aeromonas spp ....................................46
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
4.7
Hasil Uji Oksidatif Isolat Bakteri Dalam Penelitian .................................48
4.8
Reaksi Positif Isolat Bakteri Pada Uji Oksidatif-Fermentatif ....................49
4.9
Hasil uji OF ...............................................................................................49
4.10 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila ................................52
4.11 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila ...............................53
4.12 Kemampuan Hemolisis Isolat Bakteri A. hydrophila dari Isolat Air ........53
4.13 Hasil Uji Vouges-Praukover A. hydrophila ...............................................55
4.14 Hasil Uji VP Isolat Bakteri A. hydrophila .................................................55
4.15 Hasil uji fermentasi Lactosa isolat Aeromonas Air Kolam pada medium
Mac konkey ...............................................................................................57
4.16 Hasil Uji Positif Fermentasi Laktosa ........................................................57
4.17 Hasil Uji negatif Fermentasi Laktosa ........................................................57
4.18 Hasil Uji Indole .........................................................................................59
4.19 Hasil Uji Indol ...........................................................................................59
4.20 Hasil Uji Simons Sitrat ..............................................................................60
4.21 Elektroforesis Gen Lipase Isolat Aeromonas ............................................64
4.22 Elektroforesis Hasil Amplifikasi Gen gyr B...............................................67
4.23 Elektrogram (Peak) Sikuen Isolat Aeromonas ATCC ..............................70
4.24 Elektrogram (Peak) Sikuen Isolat Aeromonas AKC ................................70
4.25 Aligmnent sikuens gen gyr B .....................................................................77
4.26 Urutan Aligment sikuen gen gyr B Isolat Aeromonas ...............................77
4.27 Rekonstruksi Pohon Filogentika ................................................................85
DAFTAR LAMPIRAN
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu
Lampiran
Halaman
1.
Daftar Alat Penelitian ...................................................................101
2.
Daftar Bahan Penelitian ...............................................................103
3.
Protokol Pembuatan Medium.......................................................105
4.
Hasil Sikuensing Gen gyr B Bakteri Aeromonas Isolat Air ......110
5.
Pohon Filogenetik 16s rRNA ......................................................118
Fitri Rohmasari, 2015
ANALISIS FILOGENETIK BAKTERI Aeromonas hydrophila ISOLAT AIR KOLAM DARI BEBERAPA KOTA
BERDASARKAN SIKUEN GEN gyr B
Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu