IDENTIFIKASI SENYAWA ANTIOKSIDAN DALAM SPONS CALLYSPONGIA SP DARI KEPULAUAN SERIBU
Endang Hanani, Abdul M un’im, Ryany Sekar ini Depar temen Far masi, FM IPA-UI, Kampus UI Depok 1 6 4 2 4 PEN D A HULUA N
ISSN : 1693-9883
ABSTRACT
A khir-akhir ini p eng g unaan senyaw a antio ksid an berkembang dengan pesat baik untuk makanan maupun pengo batan. Penggunaan sebag ai o bat makin berkembang seiring dengan makin bertambahnya pengetahuan tentang aktifitas radikal bebas terhadap beberapa penyakit degeneratif seperti penyakit jantung dan kanker (Boer, 2000) . Antioksidan diketahui dapat menghambat kerja rad ikal bebas. Sebagai salah satu upaya untuk mengo ptimalkan pe- manfaatan bahan alam laut Indone- sia, d ilakukan p enelitian d engan tujuan aw al menguji aktifitas anti-
(A mir dan Budiyanto, 1996) .
Isolat dari spons ini dilaporkan me- miliki aktiv itas antikanker, anti- mikroba dan antiparasit
Satari, 1999) .
sebagai bahan o bat (
A ntiox idant activity and identification of antiox idative compounds of
Callyspongia sponge from Seribu Island (Kepulauan Seribu) were investigated. The
sponge was extracted with acetone and the extract was concentrated using rotary
vacuum evaporator. DPPH and tiocyanate methods were used to examine the anti-
oxidant activity of the extract. The extract exhibited strong antioxidant activity in
D PPH method with IC 50 of 41.21 µg/ml. Chemical analysis indicated that the antioxidative compound in the sponge was alkaloid group.Key words : A ntioxidative activity, Callyspongia sp., Sponges, alkaloid.
IDEN TIFIKASI SEN YAW A AN TIO KSIDAN DALAM SPO N S CALLYSPO N GIA SP DARI KEPULAUAN SERIBU Majalah Ilmu Kefarmasian, Vol. II, No.3, Desember 2005, 127 - 133
Samp ai saat ini p emanfaatan biota laut di Indonesia masih belum optimal terutama di bidang farmasi. Beberapa senyaw a yang memiliki aktifitas farmakologi sudah berhasil d iiso lasi d ari sp o ns. Did emnin B merupakan senyawa hasil isolasi dari
. merupakan salah satu jenis spons yang banyak tumbuh di perairan wilayah Indonesia. Spons ini ad alah salah satu bio ta laut yang mengandung berbagai metabolit se- kund er yang d apat d imanfaatkan
Callyspongia sp
riello lid a y ang berkhasiat anti- inflamasi (D avid and O scar, 1993) .
variabilis terd apat senyaw a Luffa-
mempunyai aktivitas antitumor dan antivirus. Dalam spo ns Luffariella
Trididemnum solidum d ilap o rkan
Corresponding author : E-mail : hanani@farmasi.ui.ac.id. o ksid an d an mengid entifikasi se- nyaw a berkhasiat sebagai antio k- sidan dalam spons Callyspongia sp. yang berasal dari Kepulauan Seribu. Pad a perco baan pend ahuluan d i- ketahui bahwa spons Callyspongia sp. mempunyai aktivitas antio ksid an yang terkuat dibandingkan
Geliodes fibulata, Clatharia australiensis, Agelas sp
rotary evapo- rator sampai diperoleh ekstrak kental
Oceanapia sp (Hanani, et al, 2005) .
M ETO D O LO G I Bahan:
Bahan uji yang diguna- kan ad alah spo ns Cally spongia sp . yang d ipero leh d ari perairan Ke- pulauan Seribu, dan sudah dideter- minasi d i Lembag a O seano lo g i Nasional, Jakarta.
Bahan kimia yang d igunakan antara lain 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH ), 2,2’ az o bis (2-am id ino - p ro p an) d ihid ro klo rid a (A A PH), ammonium tiosianat, asam linoleat, vitamin C, BHT, larutan dapar fosfat, besi (II) klorida, pereaksi Lieberman- Buchard, Dragendo rff, Mayer dan Bouchardat.
Pengujian aktivitas antioksidan d ilakukan d eng an 2 cara, y aitu metode DPPH dan tiosianat.
Uji aktivitas antioksidan
sejumlah 90,25 g.
dan
1. M etode DPPH (Blois, 1958)
sp. yang dikumpulkan dari daerah Kepulauan Seribu segera direndam dalam metanol dan baru d ikeluarkan w aktu p enelitian d i- mulai. Sp o ns sejumlah 650 g d i- potong-potong sampai halus, kemu- dian dimaserasi selama 6 jam dalam 800 ml aseto n, sambil sekali-kali dikocok. Lapisan aseton dipisahkan, kemudian maserasi diulang 4 kali (tiap kali meng g unakan 400 ml aseto n) d eng an cara y ang sama sampai filtrat aseton tidak berwarna. Resid u d imaserasi lebih lanjut menggunakan metanol 450 ml dengan cara yang sama, ulangi 3 kali, sampai lap isan metano l tid ak berw arna. Filtrat yang d ip ero leh d isatukan, diuapkan menggunakan
Cara kerja: Pembuatan ekstrak. Sp o ns meng g unakan rumus p ersamaan regresi.
antara lain alat gelas untuk ekstraksi, KLT d an sp ektro fo to meter UV Shimadzu 265.
A lat: A lat-alat yang digunakan
Ekstrak Callyspongia sp. dilarut- kan dalam metanol dan dibuat dalam berbagai konsentrasi ( 10, 30, 50 dan 70 ppm). Masing-masing dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ke dalam tiap tabung reaksi ditambahkan 500 µl larutan DPPH 1mM dalam meta- nol. Volume dicukupkan sampai 5,0 ml, kemudian diinkubasi pada suhu
37 o C selama 30 menit, selanjutnya serap annya d iukur p ad a p anjang gelombang 515 nm. Sebagai kontrol p o sitif, d an untuk p emband ing digunakan vitamin C (konsentrasi 2, 3, 4 dan 5 ppm) dan BHT (konsentrasi 2, 4, 6 dan 8 ppm). Nilai IC 50 dihitung masing -masing d ihitung d eng an
Callyspongia
2. M etode tiosianat (Mun’ im et al ,
2003) Sebanyak 500 µl larutan ekstrak
Callyspongia sp dengan konsentrasi
100 p p m d imasukkan ke d alam tabung reaksi d an d itambahkan berturut-turut 2,5 ml larutan buffer fosfat 0,2 M (pH=7), 2,5 ml larutan asam linoleat (1,3% w/ v), 1,0 ml air suling, dan 0,25 ml larutan A A PH 46,6 mM dalam etanol 40%. Selanjut- nya diinkubasi dalam keadaan gelap, pada suhu 50 o
C. Pengambilan sampel dilakukan setiap satu jam selama 4 jam.
Larutan uji sebany ak 0,1 m l ditambah dengan 0,1 ml larutan besi (II) klorida 20mM dalam HCl 3,5%, 0,1 ml larutan ammonium tiosianat 10% d an d icukup kan v o lumenya dengan etanol 75% menjadi 10 ml. Homogenkan dengan vortex, setelah 3 menit serap annya d iukur p ad a p anjang g elo mbang 500 nm. Kemampuan aktivitas antio ksidan dilihat dari rendahnya resapan yang terbentuk terhadap kontrol.
Pemeriksaan kandungan kimia menggunakan pereaksi kimia (A nonim, 1989)
Id entifikasi kand ungan kimia dalam ekstrak dilakukan terhadap senyaw a-senyaw a:
1. Steroid/ triterpenoid Sebanyak 1 ml larutan ekstrak diuapkan sampai kering, kemudian ditambah dengan pereaksi Lieber- man-Burchard . W arna biru-ungu yang timbul menunjukkan adanya senyawa terpenoid atau steroid.
2. A lkaloid Larutan ekstrak sebanyak 3 ml ditambah dengan 1 ml HCl 2 N, dan
6 ml air suling, kemudian panaskan selama 2 menit, dinginkan kemudian d isaring. Filtrat d iperiksa ad anya senyaw a alkaloid dengan pereaksi Drag end o rff, Bo uchard at d an Mayer.
3. Flavonoid Larutan ekstrak sebanyak 2 ml ditambah dengan sedikit serbuk seng atau magnesium dan 2 ml HCl 2N. Senyawa flavonoid akan menimbul- kan warna jingga sampai merah.
4. A ntrakuinon Larutan ekstrak sebanyak 2 ml d ip anaskan d eng an 5 m l H 2 SO 4 selama 1 menit. Setelah d ing in dikocok dengan 10 ml bensen. Warna kuning pada lapisan bensen menun- jukkan adanya senyawa antrakuinon. Identifikasi dapat diperjelas dengan menambahkan larutan natrium hidroksida 2N, akan terjadi w arna merah pada lapisan air.
Pemeriksaan kandungan kimia menggunakan KLT
Pem eriksaan KLT d ilakukan terhad ap ad any a seny aw a y ang memberikan hasil p o sitif p ad a pemeriksaan menggunakan pereaksi kima. Larutan p engembang yang digunakan adalah campuran meta- nol-NH 4 OH (200:3), dengan larutan deteksi Dragendorff dan DPPH.
HA SIL DA N PEM BA HA SA N
Uji aktivitas antioksidan meng- g unakan m eto d e DPPH m enun- jukkan bahw a ekstrak
Callyspongia sp .mempunyai IC 50
sebesar 41,21 µg/ ml. Hal ini menunjukkan bahw a ektrak tersebut mempunyai aktifitas aktio ksid an y ang kuat, karena mempunyai IC 50 kurang dari 200 µg/ ml (Blo is, 1958). Hasil p engujian dapat dilihat pada Tabel 1 . Apabila d iband ing kan d eng an aktiv itas antioksidan vitamin C dan BHT yang masing-masing mempunyai nilai IC 50 sebesar 3,45 dan 3,81 mg/ ml, akti- vitas antioksidan ekstrak Callyspongia sp. masih lebih rendah. Tetapi pada penelitian ini yang diuji masih berupa ekstrak kasar, sehingga masih ada kemungkinan senyaw a murni yang dikandung memiliki aktivitas pere- d aman rad ikal bebas lebih kuat dibandingkan ekstraknya. Meto de DPPH d ip ilih karena sed erhana, mudah, cepat dan peka serta hanya memerlukan sedikit sampel. Senyawa antio ksidan akan bereaksi dengan radikal DPPH melalui mekanisme donasi atom hydrogen dan menye- babkan terjadinya peluruhan warna
Tabel 1. Aktivitas antioksidan ekstrak Callyspongia sp., vitamin C dan BHT
menggunakan metode DPPH
Spons/pembanding Konsentrasi Aktivitas
IC 50 (µ µ µ µ µ g/ml) (µ µ µ µ µ g/ml) Peredaman (%) Callyspongia sp
10 10,23 30 29,30 50 56,69 70 72,14 41,21
Vitamin C 2 24,41 3 42,87 4 54,48 5 70,28 3,45 BHT 2 29,63 4 51,61 6 64,43 8 73,25 3,81 DPPH d ari ungu ke kuning yang diukur pada panjang gelombang 517 nm (Blois, 1958).
Hasil uji aktivitas antio ksidan ekstrak Callyspongia sp . menggunakan metode tiosianat menunjukkan tidak ad anya p erbed aan aktivitas yang bermakna (A nav a searah d engan tingkat kepercayaan 95%) d engan pemband ing vitamin C d an BHT, seperti terlihat pada
Gambar 1 .
Pada meto de tio sianat pengu- kuran aktiv itas antio ksid an ber- dasarkan daya penghambatan ter- bentuknya senyawa-senyawa radikal yang bersifat reaktif. Oksidasi asam linoleat dipercepat oleh AAPH yang merupakan senyaw a pengind uksi pembentukan radikal bebas, yang umumnya berupa peroksida lipid. Dekomposisi A A PH menghasilkan mo lekul nitro gen dan dua radikal karbo n yang d apat menghasilkan p ro d uk yang stabil atau bereaksi d eng an m o lekul o ksig en m eng - hasilkan rad ikal p ero ksil. Pro ses oksidasi lemak menghasilkan produk p rimer p ero ksid a. ( M un’ im, et al
2003)
. Bilangan peroksida dinyatakan sebag ai seny aw a y ang mamp u mengoksidasi Fe 2+ menjadi Fe 3+ , dan selanjutnya Fe 3+ d engan io n CN S menghasilkan w arna merah yang d iukur p ad a p anjang gelo mbang 500 nm.
Pad a p eng am atan jam ke-4, ko ntro l neg atif m enunjukkan serapan sebesar 0,415, sed angkan ekstrak
Callyspongia sp
mempunyai serapan 0,133, vitamin C dan BHT masing-masing 0,132 dan 0,146. Hal ini berarti bahwa ekstrak Callyspongia
sp . mampu menghambat hasil oksi-
dasi asam linoleat maupun mereduksi
Gambar 1. Aktivitas antioksidan ekstrak Callyspongia sp., vitamin C dan BHT
menggunakan metode tiosianat
Tabel 2. Hasil identifikasi golongan senyawa ekstrak Callyspongia sp
Pereaksi Golongan Hasil
- 1. Lieberman-Buchard Terpenoid, steroid
- 2. Mayer Alkaloid
Dragendorf Alkaloid +
Bouchardat Alkaloid +
3. Zn/ HCl
- Flavonoid - Mg/ HCl Flavonoid -
4. Benzen-NaOH Antrakinon
- 5. Molisch Gula rad ikal bebas. Hasil uji statistik nyawa golongan alkaloid.
(anava searah dengan nilai α 0,05) Penelitian lanjutan sedang di- menunjukkan bahwa ketiga larutan kerjakan untuk mengisolasi senyawa yang d iuji tid ak memp erlihatkan d an menentukan struktur kimia perbedaan aktivitas antioksidan yang senyawa alkaloid tersebut. bermakna.
Hasil identifikasi kimia menun-
KESIM PULA N jukkan bahwa ekstrak Callyspongia sp . Tabel
mengandung senyawa alkaloid Dari hasil penelitian ini dapat
2 . Identifikasi lanjutan menggunakan Cally-
disimpulkan bahw a ekstrak KLT silica gel GF dengan larutan spongia sp . memp uny ai aktiv itas 254 pengembang campuran methano l- antio ksid an, d an seny aw a y ang NH OH (200 : 3) memperlihatkan berkhasiat sebag ai antio ksid an 4 adanya bercak dengan Rf 0,33, yang termasuk golongan alkaloid. pada pengamatan sinar UV mem- berikan warna kuning hijau. Bercak
DA FTA R A CUA N
ini memberikan warna jingga dengan pereaksi Dragendorff, berarti bahwa bercak tersebut merupakan senyawa A mir, I. Dan Bud iyanto , A . 1996. golongan alkaloid. Pada uji dengan
Mengenal Spo ns Laut (Demo - p ereaksi DPPH, bercak ini mem- spongiae) Secara Umum, Oceana,
21, berikan aktivitas peredaman radikal (2), 15-31.
bebas, berarti senyaw a yang mem- Anonim. 1989. M ateria M edika Indone- punyai aktivitas antioksidan dalam sia Jilid V , Departemen Kesehatan ekstrak Callyspongia sp . adalah se- Republik Indonesia, 549-553.
Blo is, MS, A ntio xidant determina- tions by the use of a stable free radical, Nature 181, 1958, 1199- 1200. Bo er, Y. 2000. Uji A ktivitas A nti- oksidan Ekstrak Kulit Buah Kan- dis ( Garcinia parvifolia Miq ), Jurnal
M atematika dan IPA 1 , (1), 26-33.
David HA and Oskar, RZ . Marine Bio techno lo gy, vo l 1, Plenum Press, New York, 1993, 12-13.
Hanani, E, Mun’ im A , Sekarini, R, dan Wiryow idagdo, S. Uji akti- v itas antio ksid ant beberap a spons laut dari kepulauan Seribu,
Jurnal Bahan A lam Indo nesia, vol 5, no.1 Jan 2006 (
in Press ).
Mun’im, A, Negishi, O and Ozawa, T. 2003. A ntio xid ativ e co m - pounds from Crotalaria sessiliflora ,
Biosci . Biotechnol . Biochem . 67 , (2), 410-414.
Satari, RR, Penelitian Produk alam laut d i Ind o nesia, arah d an prospek, Seminar Nasional Kimia Bahan Alam, Jakarta 1999, 29-37.