PEMURNIAN PARSIAL LAKASE DARI ISOLAT KAPANG TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT DAN UJI AKTIVITASNYA TERHADAP SUBSTRAT ALAM SKRIPSI RADITA YUNIAR ARIZANDY
PEMURNIAN PARSIAL LAKASE DARI ISOLAT KAPANG TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT DAN UJI AKTIVITASNYA TERHADAP SUBSTRAT ALAM SKRIPSI RADITA YUNIAR ARIZANDY
PEMURNIAN PARSIAL LAKASE DARI ISOLAT KAPANG TANDAN KOSONG KELAPA SAWIT DAN UJI AKTIVITASNYA TERHADAP SUBSTRAT ALAM SKRIPSI Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Sarjana Sains Bidang Kimia pada Fakultas Sains dan Teknologi OLEH RADITA YUNIAR ARIZANDY NIM: 080810050 Tanggal lulus:
7 Agustus 2012 Disetujui Oleh Pembimbing I, Pembimbing II,
Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih Dr. Ni’matuzahroh
NIP: 19630515 198701 2 001 NIP: 19680105 199203 2 003LEMBAR PENGESAHAN NASKAH SKRIPSI Judul : Pemurnian Parsial Lakase Dari Isolat Kapang Tandan Kosong Kelapa Sawit Dan Uji Aktivitasnya Terhadap Substrat Alam Penyusun : Radita Yuniar Arizandy NIM : 080810050 Tanggal Ujian : 7 Agustus 2012 Disetujui oleh : Pembimbing I, Pembimbing II, Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih Dr. Ni’matuzahroh NIP: 19630515 198701 2 001 NIP: 19680105 199203 2 003
Mengetahui : Ketua Departemen Kimia
Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga
Dr. Alfinda Novi Kristanti, DEA NIP. 19671115 199102 2 001
PEDOMAN PENGGUNAAN SKRIPSI
Skripsi ini tidak dipublikasikan, namun tersedia di perpustakaan dalam lingkungan Universitas Airlangga, diperkenankan untuk dipakai sebagai referensi kepustakaan, tetapi pengutipan harus seizin penyusun dan harus menyebutkan sumbernya sesuai kebiasaan ilmiah.
Dokumen skripsi ini merupakan hak milik Universitas Airlangga
KATA PENGANTAR
Segala puji syukur kepada Allah SWT atas segala limpahan berkat dan rahmat-Nya sehingga penyusun dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Pemurnian Parsial Lakase dengan Isolat Kapang Tandan Kosong Kelapa
Sawit dan Uji Aktivitasnya Terhadap Substrat Alam”. Skripsi ini dibuat
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana sains dalam bidang kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga.
Dalam kesempatan ini penyusun mengucapkan terima kasih yang sebesar- besarnya kepada semua pihak yang memberikan bantuan dan dukungan terutama kepada :
1. Prof.Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si selaku dosen pembimbing I yang selalu memberikan masukan dan meluangkan waktu bagi penulis untuk berkonsultasi.
2. Dr. Ni’matuzahroh selaku dosen pembimbing II yang selalu memberikan masukan dan meluangkan waktu bagi penulis untuk berkonsultasi.
3. Dr. Afaf Baktir M.S selaku dosen wali yang selalu memberikan kelancaran dalam proses penyusunan skripsi.
4. Seluruh dosen Departemen Kimia Universitas Airlangga atas ilmu yang telah diberikan.
5. Orang tua, seluruh keluarga, dan orang terkasih yang telah memberikan dukungan dan motivasi serta kasih sayang selama ini.
6. Teman – teman biokimia, Nadya Aisya’ dan Siska Winda Aryani atas dukungan, motivasi, dan bantuan dalam penyusunan skripsi.
7. Teman-teman angkatan 2008 Departemen Kimia Universitas Airlangga dan semua pihak yang telah membantu penulis.
Dalam penyusunan skripsi ini, penyusun menyadari bahwa masih terdapat banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, oleh karena itu penyusun sangat mengharapkan kritik dan saran yang bersifat membangun untuk kesempurnaan penulisan skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.
Surabaya, 28 Juli 2012 Penyusun,
Radita Yuniar Arizandy Ucapan terima kasih diberikan kepada:
1. Allah SWT, atas rahmat dan hidayah yang diberikan selama proses pembuatan skripsi hingga akhir.
2. Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si, selaku dosen pembimbing I yang senantiasa sabar dan meluangkan waktu untuk berkonsultasi dan membimbing serta memberi masukan bagi penulis .
3. Dr. Ni’matuzahroh, selaku dosen pembimbing II yang senantiasa sabar dan meluangkan waktu untuk berkonsultasi, membimbing, dan memotivasi penulis hingga naskah skripsi terselesaikan.
4. Dr. Afaf Baktir M.S, selaku dosen wali yang selalu memberikan kelancaran dalam proses penyusunan skripsi.
5. Seluruh dosen Departemen Kimia Universitas Airlangga, atas ilmu yang telah diberikan.
6. Mbak Anita, atas bantuan, saran, dan semangat yang diberikan kepada penulis ketika penulis dilanda galau skripsi
4. Mama, papa, dan adik, atas doa, dukungan, kasih sayang, motivasi, dan cinta yang selalu mengalir di saat penulis merasa jenuh. Kalian merupakan inspirasi dan motivasi utama dalam penyelesaian naskah skripsi.
5. Keluarga besar H. M. Djamhari, terima kasih atas dukungan dan doa serta semangat yang selalu diberikan kepada penulis.
6. M. Nasrul Aziz, atas dukungan, doa, saran, motivasi, dan bantuan yang tidak pernah berhenti kepada penulis sampai naskah skripsi terselesaikan.
7. Biokimblast, terutama Siska dan Nadya yang selalu kompak dan saling menghibur saat penulis merasa jenuh dan galau.
8. Luki, Oox, Julie, Aci, Adel, Aya, Bela, yang selalu bisa menjadi tempat curhat, gosip, dan galau ketika penulis berada di titik jenuh.
Kalian adalah keluarga terindah.
9. Keluarga besar kimia 2008, atas berbagai bantuan dan informasi yang dibagikan kepada penulis.
10. Keluarga besar philadevil, pipit, amel, sintia, yuni, mbak tria, mbak retty, mbak indah, mbak ima, mbak tika atas dukungan dan doa bagi penulis.
11. Pak damam dan mbak yuli, atas bantuan yang diberikan bagi penulis dalam proses penyelesaian naskah skripsi.
12. Seluruh pihak yang membantu terselesainya naskah skripsi penulis yang belum disebutkan satu per satu, terima kasih atas doa, bantuan, dan dukungan yang telah diberikan. Terima kasih atas dukungan, doa, motivasi, dan bantuan yang selalu diberikan kepada penulis hingga naskah skripsi terselesaikan. Tak henti – hentinya ucapan terima kasih diberikan kepada semua pihak yang terkait.
Penulis, Radita Yuniar Arizandy
Radita Yuniar Arizandy, 2012, Pemurnian Parsial Lakase dari Isolat Kapang Tandan Kosong Kelapa Sawit dan Uji Aktivitasnya Terhadap Substrat Alam. Skripsi dibawah bimbingan Prof. Dr. Ni Nyoman Tri Puspaningsih, M.Si dan Dr. Ni’matuzahroh. Departemen Kimia Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Airlangga. ABSTRAK Enzim lakase merupakan enzim yang mengkatalis pendegradasi lignin.
Degradasi lignin dapat dilakukan secara optimum apabila enzim lakase memiliki aktivitas tinggi. Penelitian terdahulu telah berhasil mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim lakase dari kapang A, B, C, dan D. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan uji aktivitas enzim lakase dari kapang A, B, C, dan D, melakukan pemurnian parsial dengan garam ammonium sulfat untuk mengetahui tingkat kemurnian enzim lakase apabila dibandingkan dengan ekstrak kasar, dan mengamati profil permukaan substrat alam akibat perlakuan enzim dengan aktivitas tertinggi dengan menggunakan SEM (Scanning Microscope Electron). Penelitian ini diawali dengan menguji aktivitas enzim lakase dari kapang A, B, C, dan D didapatkan aktivitas sebesar 1,4 U/mL, 1,54 U/mL, 1,33 U/mL, dan 1,26 U/mL. Hasil pemurnian parsial enzim lakase dari masing – masing isolat dengan garam ammonium sulfat melalui proses dialisis untuk penghilangan garam yang terendapkan. Tingkat kemurnian enzim lakase dari kapang A, B, C, dan D masing
- – masing adalah sebesar 1,547 kali, 1,769 kali, 1,996 kali, dan 3,044 kali dari aktivitas ekstrak kasar. Profil permukaan substrat alam setelah diberi perlakuan enzim menjadi rusak, berongga, dan pecah akibat enzim lakase yang mengkatalis degradasi lignin. Kata kunci: enzim lakase, lignin, pemurnian parsial, dialisis, Scanning Microscope Elektron
Radita Yuniar Arizandy, 2012, Partial Purification of Laccase from Empty Palm Fruit Bunches Isolate and Determination of Natural Substrates Activity. The Script is Under Guidance of Prof. Dr. Ni Nyoman Tri P, M.Si and Dr. Ni’matuzahroh, Department Of Chemistry, Faculty of Sciences and Technology. Airlangga University, Surabaya. ABSTRACT
Laccase is enzyme which catalyze the degradation of lignin. Degradation of lignin can be done optimally when the laccase has high activity. Previous research has succeeded isolated and characterize the laccase of the fungus A, B,
C, and D. This study aimed to determine the activity of laccase from fungus A, B,
C, and D, also the partial purification with ammonium sulfate salts to determine the purity levels of the laccase when compared with the crude extract, and observe the natural substrate surface profile due the activity of highest enzyme treatment by using SEM (Scanning Electron Microscope). This study begins by examining the activity of the enzyme laccase from fungus A, B, C, and D obtained by the activity of 1.4 U/mL, 1.54 U/mL, 1.33 U/mL, and 1.26 U/mL. The results of partial purification of laccase from each of isolates with ammonium sulfate salt through the dialysis process for removal precipitated salt. The purity level of the laccase from fungus A, B, C, and D respectively are 1.547 times, 1.769 times, 1.996 times and 3.044 times compared to the activity of crude extract. Surface profile of natural substrate that has been treated by enzyme is damaged, hollow, and broken by laccase that catalyze the degradation of lignin. Keyword: laccase enzyme, lignin, partial purrification, dialisys, Scanning
Microscope Electron
DAFTAR ISI Halaman KATA PENGANTAR .................................................................................... i
ABSTRAK ....................................................................................................... iv ABSTRACT ..................................................................................................... v DAFTAR ISI .................................................................................................... vi DAFTAR TABEL ........................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xi BAB I PENDAHULUAN .............................................................................. 1
1.1 Latar Belakang Masalah .................................................................... 1
1.2 Rumusan Masalah ............................................................................. 5
1.3 Tujuan Penelitian .............................................................................. 6
1.4 Manfaat Penelitian ............................................................................ 6
BAB II TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 7
2.1 Kapang (Fungi) ................................................................................. 7
2.1.1 White Rot Fungi ....................................................................... 7
2.2 Enzim............................................................................................. ... 8
2.2.1 Struktur enzim ........................................................................... 9
2.2.2 Klasifikasi enzim ...................................................................... 10
2.2.3 Kekhususan enzim .................................................................... 11
2.2.4 Mekanisme kerja enzim ............................................................ 11
2.2.5 Aktivitas enzim ......................................................................... 14
2.2.5.1 Konsentrasi enzim .............................................................. 15
2.2.5.2 Konsentrasi substrat ........................................................... 15
2.2.5.3 Pengaruh temperatur .......................................................... 16
2.2.5.4 Pengaruh pH ....................................................................... 16
2.3 Enzim Lakase .................................................................................... 17
2.4 Lignin ................................................................................................ 18
2.5 Substrat Alam .................................................................................... 19
2.6 Pemurnian Enzim .............................................................................. 20
2.6.1 Pemekatan enzim ..................................................................... 21
BAB III METODE PENELITIAN ................................................................. 24
3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ........................................................... 24
3.2 Sampel, Bahan, dan Alat Penelitian .................................................. 24
3.2.1 Sampel penelitian ..................................................................... 24
3.2.2 Bahan penelitian ....................................................................... 24
3.2.3 Alat penelitian .......................................................................... 25
3.3 Prosedur Kerja ................................................................................... 26
3.3.1 Diagram alir penelitian ............................................................. 26
3.3.2 Pembuatan media ..................................................................... 27
3.3.2.1 Media padat ........................................................................ 27
3.3.2.1.1 Media PDA .................................................................. 27
3.3.2.1.2 Media PDA agar miring ............................................... 27
4.2 Hasil Produksi Enzim Lakase ........................................................... 38
3.10 Hidrolisis Jerami Padi dan Tongkol Jagung dengan Enzim Lakase
35
3.11 Analisis Perubahan Struktur Lignin Jerami Padi
dan Tongkol Jagung dengan Menggunakan SEM ............................ 36
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 37
4.1 Peremajaan Isolat Kapang Tandan Kosong Kelapa Sawit ................ 37
4.3 Hasil Uji Aktivitas Enzim Lakase Terhadap Substrat ABTS ........... 39
3.9.1 Pengendapan enzim lakase dengan amonium sulfat ................ 34
4.4 Hasil Uji Kadar Protein ..................................................................... 42
4.5 Hasil Pemurnian Enzim Lakase dari Keempat Isolat Tandan
Kosong Kelapa Sawit ........................................................................ 424.5.1 Hasil pengendapan enzim lakase dengan amonium sulfat ....... 42
4.5.2 Hasil dialisis enzim lakase ....................................................... 46
4.6 Analisis Profil Permukaan Jerami Padi dan Tongkol Jagung
Dengan Menggunakan SEM ............................................................. 49 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ........................................................... 555.1 Kesimpulan ....................................................................................... 55
3.9.2 Dialisis lakase .......................................................................... 35
3.9 Pemurnian Enzim Lakase .................................................................. 33
3.3.2.1.3 Persiapan substrat alam ................................................ 27
3.3.5.2.1 Pembuatan larutan asam asetat (CH
3.3.2.2 Media cair ........................................................................... 28
3.3.3 Persiapan tabung selofan .......................................................... 28
3.3.4 Peremajaan kapang ................................................................... 28
3.3.5 Pembuatan larutan .................................................................... 29
3.3.5.1 Larutan buffer universal ..................................................... 29
3.3.5.2 Pembuatan larutan substrat ABTS ..................................... 30
3 COOH) 0,2 M .... 30
3.8 Penentuan Kadar Protein Lakase ...................................................... 32
3.3.5.2.2 Pembuatan larutan natrium asetat
(CH
3 COONa) 0,2 M .................................................... 30
3.3.5.2.3 Pembuatan buffer sodium asetat pH 4,5 ...................... 30
3.3.5.2.4 Pembuatan larutan substrat ABTS 0,4 mM .................. 30
3.6 Produksi Enzim Lakase ..................................................................... 31
3.7 Uji Aktivitas Enzim Lakase .............................................................. 31
5.2 Saran .................................................................................................. 55 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 56
DAFTAR TABEL Nomor Judul Tabel Halaman
3 Komposisi buffer universal .................................................................. 29
4 Pemurnian parsial enzim lakase ........................................................... 48
DAFTAR GAMBAR Nomor Judul Gambar Halaman
2.13 Struktur lignin ...................................................................................... 19
4.7 Kurva kejenuhan amonium sulfat terhadap aktivitas enzim lakase
4.6 Kurva hubungan perubahan absorbansi radikal kation dengan waktu kapang D .................................................................................... 41
4.5 Kurva hubungan perubahan absorbansi radikal kation dengan waktu kapang C .................................................................................... 41
4.4 Kurva hubungan perubahan absorbansi radikal kation dengan waktu kapang B .................................................................................... 40
4.3 Kurva hubungan perubahan absorbansi radikal kation dengan waktu kapang A .................................................................................... 40
4.2 Reaksi Asam 2,2’-azinobis-di-(3-ethylbenzthiazolinesulphonat) (ABTS) ................................................................................................. 39
4.1 Keempat isolat kapang tandan kosong kelapa sawit hasil peremajaan 37
2.15 Proses dialisis ....................................................................................... 23
2.14 Tabel kemurnian protein ...................................................................... 21
2.12 Struktur 3D lignin ................................................................................. 19
2.1 Fungi pelapuk putih .............................................................................. 8
2.11 Prekursor penyusun lignin .................................................................... 18
2.10 Lignin, selulase, dan hemiselulase pada jaringan tumbuhan ............... 18
2.9 Representasi pita sinar-X dari struktur kristal lakase III dari Trametes versicolor (PDB code 1KYA) ...................................... 17
2.8 Pengaruh pH terhadap laju reaksi ......................................................... 17
2.7 Pengaruh temperatur terhadap laju reaksi ............................................ 16
2.6 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi .............................. 15
2.5 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi ................................ 15
2.4 Interaksi substrat dan enzim model induced fit .................................... 14
2.3 Interaksi substrat dan enzim model Lock and Key ............................... 14
2.2 Reaksi enzimatis ................................................................................... 12
dari kapang A ....................................................................................... 44
4.8 Kurva kejenuhan amonium sulfat terhadap aktivitas enzim lakase
dari kapang B ....................................................................................... 44
4.9 Kurva kejenuhan amonium sulfat terhadap aktivitas enzim lakase
dari kapang C ....................................................................................... 45
4.10 Kurva kejenuhan amonium sulfat terhadap aktivitas enzim lakase
dari kapang D ....................................................................................... 45
4.11 Penampang atas jerami padi perbesaran 500x ...................................... 50
4.12 Penampang atas jerami padi perbesaran 1000x .................................... 51
4.13 Penampang melintang jerami padi perbesaran 2000x .......................... 52
4.14 Penampang atas tongkol jagung perbesaran 1000x .............................. 52
4.15 Penampang atas tongkol jagung perbesaran 2000x .............................. 53
4.16 Penampang melintang tongkol jagung perbesaran 2000x .................... 54
DAFTAR LAMPIRAN
Nomor Judul Lampiran
1 Gambar hasil penelitian
2 Penentuan aktivitas enzim lakase dengan substrat ABTS
3 Pembuatan kurva standar BSA
4 Penentuan kadar protein enzim
5 Data optimasi kejenuhan pengendapan ammonium sulfat
6 Perhitungan tabel kemurnian
7 Gambar sampel SEM
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Masalah
Lakase merupakanerbagai senyawa aromatik dan non- aromatik (Thurston, C.F, 1994). Enzim lakase merupakan enzim yang dapat mendegradasi lignin pada tumbuhan berserat. Enzim pendegradasi lignin sering dihasilkan oleh jamur pelapuk putih (white rot fungi). Kemampuan jamur pelapuk putih dalam mendegradasi lignin disebabkan oleh aktivitas ekstraselular . ligninolitik Dalam bidang industri, enzim lakase sangat diperlukan peranannya, seperti pada industri pemutihan pulp dan industri bioetanol. Industri bioetanol ini memanfaatkan selulosa dan hemiselulosa dalam produksi etanol. Pemanfaatan ini sering terhambat karena adanya kompleks lignin yang berasosiasi dengan selulosa dan hemiselulosa, sehingga diperlukan proses delignifikasi agar selulosa dan hemiselulosa terlepas dari komplek lignin, dan depolimerisasi untuk mendapatkan gula bebas dan fermentasi gula heksosa dan pentosa untuk mendapatkan produksi bioetanol (Trisanti, 2009).
Kelapa sawit (Elaeis quineensis Jaco) dari famili Arecaceae merupakan salah satu sumber minyak nabati, dan merupakan primadona bagi komoditi perkebunan. Pengembangan perkebunan kelapa sawit di Indonesia berjalan sangat pesat. Pada tahun 1968, luas areal baru 120.000 ha dan menjadi 5,16 juta ha pada tahun 2005 dan pada tahun 2006 diproyeksikan mencapai 6,046 juta ha.
2
Pengelolaan produksi kelapa sawit yang sebelumnya hanya perkebunan besar, saat ini telah mencakup perkebunan rakyat (PR) dan perkebunan besar swasta (PBS). Pada tahun 2005, luas areal PR sekitar 2,202 juta ha (40,44%), PBN 630.000 ha (11,58%) dan PBS 2,61 juta ha (47,98%). Sumatera mendominasi ketiga jenis perkebunan, sedangkan Kalimantan dan Sulawesi menjadi lokasi pengembangan perkebunan swasta dan perkebunan rakyat (Warta Penelitian, 2007) . Di propinsi Bengkulu, sampai dengan tahun 2005 memiliki luas tanaman perkebunan rakyat kelapa sawit sebesar 90,898 ha, dengan rincian yaitu tanaman muda 40,475 ha, tanaman produktif 50,192 ha dan tanaman tua atau rusak 231 ha (Anonim, 2006). Saat ini, peningkatan perkebunan besar maupun rakyat semakin bertambah luas. Menurut Dinas Perkebunan Propinsi Bengkulu (2007) di Propinsi Bengkulu terdapat 11 pabrik pengolahan kelapa sawit dengan kapasitas produksi 30 – 60 ton/jam sehingga berpotensi menghasilkan limbah yang dapat dipergunakan sebagai bahan baku pembuatan pulp dan kertas dari tandan kosong .
Tandan kosong kelapa sawit merupakan limbah yang cukup melimpah keberadaannya. Komponen utama limbah pada kelapa sawit adalah selulosa, hemiselulosa dan lignin, sehingga limbah ini disebut sebagai limbah lignoselulosa (Darnoko, 1993). Beberapa kapang yang tumbuh pada tanaman berkayu dilaporkan mampu mendegradasi lignin dalam kayu. Kapang – kapang tersebut terbukti memiliki aktivitas enzim lakase (Arora, D.S et al., 2000).
Indonesia menghasilkan limbah lignoselulosa dari pertanian (tongkol jagung, kulit pisang dan jerami padi) yang sangat melimpah yaitu sekitar 200 juta ton per tahun (Berita Resmi Statistik, 2006). Komponen utama lignoselulosa yang
3
terdiri atas selulosa, hemiselulosa dan lignin. Dengan tingginya kadar lignin yang terkandung dalam limbah tersebut, diharapkan keberadaan enzim lakase mampu mendegradasi kompleks lignin yang terkandung dalam limbah tersebut. Substrat limbah pertanian yang akan digunakan pada penelitian ini adalah tongkol jagung dan jerami padi.
Penggunaan enzim untuk proses pengolahan limbah lignoselulosa masih belum banyak dilakukan. Kebanyakan industri – industri lebih memilih untuk melakukan pengolahan limbah dengan menggunakan zat kimia yang harganya jauh lebih murah, namun hasilnya kebanyakan masih kurang memenuhi standar.
Hal ini akan lebih efektif apabila enzim lakase diproduksi untuk mendegradasi lignin, yang kemudian dapat dimanfaatkan untuk keperluan penting lainnya.
Tingginya harga substrat mempengaruhi produksi enzim lakase. Enzim lakase dapat diproduksi melalui limbah – limbah yang memiliki serat, limbah – limbah berkayu, dan juga limbah lignoselulosa lainnya. Substrat dari enzim lakase ini dapat menggunakan salah satu limbah lignoselulosa yang ada di Indonesia.
Pemanfaatan produk pertanian yang tidak berguna diharapkan dapat menekan biaya produksi enzim lakase. Diharapkan limbah pertanian di Indonesia dapat dioptimalkan pemanfaatannya.
Kapang merupakan organisme multiseluler yang dapat hidup melekat pada substrat yang sesuai. Substrat yang baik, mampu mengembangbiakkan kapang dalam jumlah yang besar. Jamur basidiomisetes merupakan kelompok utama pendegradasi lignoselulosa. Walaupun beberapa bakteri diketahui dapat mendegradasi lignin, tetapi bakteri yang mampu mendegradasi lignin secara kompleks belum pernah dilaporkan. Jamur pelapuk kayu menghasilkan enzim -
4
enzim pendegradasi lignoselulosa seperti golongan selulase, ligninase, dan hemiselulase. Jamur pelapuk kayu digolongkan ke dalam jamur pelapuk putih dan jamur pelapuk cokelat, yang masing - masing memiliki metabolisme degradatif yang berbeda. Jamur pelapuk putih mampu mendegradasi seluruh komponen material lignoselulosa termasuk lignin, sedang jamur pelapuk cokelat lebih cenderung mendegradasi bagian selulosa dan hemiselulosa tetapi tidak lignin (Munir, 2006). Penelitian ini menggunakan tandan kosong kelapa sawit untuk mengisolasi kapang penghasil enzim lakase berdasarkan penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Dewi (2010), yang berhasil mengisolasi empat kapang Aspergillus sp. yang dapat menghasilkan enzim lakase.
Pada penelitian yang dilakukan oleh Dewi (2010) telah berhasil mengisolasi empat kapang yang belum diketahui spesiesnya pada tandan kosong kelapa sawit yang dapat menghasilkan enzim lakase. Keempat isolat kapang tersebut telah dikarakteristik dan uji aktivitasnya. Dapat disimpulkan bahwa keempat isolat kapang tandan kosong kelapa sawit tersebut memiliki aktivitas enzim lakase yang hampir sama. Penelitian lanjutan akan dilakukan dengan tahapan pemekatan dan pemurnian parsial enzim lakase dengan menggunakan amonium sulfat. Pada proses ini enzim akan beragregat dan mengendap, sehingga kompleks enzim yang murni akan mengendap bersama garam amonium sulfat, proses ini dinamakan ‘salting out’. Tahapan selanjutnya adalah melakukan proses dialisis untuk menghilangkan garam amonium sulfat. Tingkat kemurnian suatu enzim diketahui dari aktivitas spesifik enzim tersebut, semakin tinggi aktivitas spesifik suatu enzim maka enzim akan semakin murni. Selain itu juga dapat diketahui berdasarkan kelipatan pemurnian enzim yang diperoleh. Hal ini dapat
5
diketahui dengan cara membagi aktivitas spesifik enzim hasil pemurnian dengan aktivitas spesifik awal ekstrak kasar enzim (Minch, 1989).
Pada penelitian yang dilakukan sebelumnya oleh Aminah (2011) tentang isolasi dan karakterisasi enzim selulase dari kapang Aspergillus sp.(1), disebutkan bahwa salah satu isolat kapang penghasil enzim selulase memiliki aktivitas terhadap substrat alam (tongkol jagung dan jerami padi). Namun, aktivitasnya masih rendah, sehingga dalam penelitian akan digunakan enzim lakase untuk mendegradasi lignin pada substrat tongkol jagung dan jerami padi yang merupakan limbah pertanian terbanyak di Indonesia. Diharapkan enzim lakase dari isolat kapang tandan kosong kelapa sawit mampu mengurangi kandungan lignin dalam substrat alam, dan memudahkan proses hidrolisis substrat alam oleh selulase.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang masalah yang telah diuraikan di atas, dapat dirumuskan suatu masalah penelitian sebagai berikut:
1. Berapakah aktivitas ekstrak kasar enzim lakase dari keempat isolat tandan kosong kelapa sawit terhadap ABTS?
2. Berapakah tingkat kemurnian enzim lakase dari keempat spesies isolat kapang tandan kosong kelapa sawit hasil presipitasi garam amonium sulfat apabila dibandingkan dengan ekstrak kasarnya?
3. Bagaimanakah profil permukaan dari substrat alam yang telah diberi perlakuan enzim lakase dengan aktivitas tertinggi menggunakan analisis SEM?
6
1.3 Tujuan Penelitian
1. Menentukan aktivitas ekstrak kasar enzim lakase dari keempat isolat kapang tandan kosong kelapa sawit penelitian Dewi (2010) terhadap substrat ABTS.
2. Menentukan tingkat kemurnian enzim lakase dari keempat spesies isolat kapang tandan kosong kelapa sawit hasil presipitasi garam amonium sulfat apabila dibandingkan dengan ekstrak kasarnya.
3. Mengetahui profil permukaan dari substrat alam (tongkol jagung dan jerami padi) yang telah diberi perlakuan enzim lakase dengan aktivitas tertinggi menggunakan analisis SEM.
1.4 Manfaat Penelitian
Penelitian ini bermanfaat dalam industri pengolahan limbah tongkol jagung dan jerami padi serta limbah lignoselulosa yang lain agar dapat digunakan kembali sebagai bahan baku atau produk lain.
BAB II TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Kapang (Fungi)
Kapang merupakan cendawan eukariotik, bersifat multiseluler, dapat bereproduksi secara aseksual dan seksual, berbentuk filamen (seperti benang), merupakan mikroorganisme aerob dan bersifat heterotrof. Kapang dapat berkembang biak secara aseksual dan seksual. Berkembang biak secara aseksual dengan cara pembelahan sel, penguncupan, atau pembentukan spora. Sedangkan berkembangbiak secara seksual dapat dengan cara peleburan nucleus dari dua sel induknya. Kapang dapat bertahan dengan keadaan alam yang tidak menguntungkan dengan cara membentuk spora yang berdinding tebal (Pelczar dan Chan, 2005). Kapang tidak dapat melakukan fotosintesis sehingga untuk memenuhi kebutuhan energinya, kapang memproduksi enzim ekstraseluler (Wainwright, 1992). Beberapa kapang yang dapat hidup pada bahan yang mengandung lignoselulosa yang tinggi akan mengeluarkan enzim yang dapat mendegradasi bahan tersebut sebagai nutrisinya (Herliyana et al., 2008).
2.1.1 White Rot Fungi
Fungi pelapuk putih merupakan kelompok fungi yang memiliki kemampuan pendegradasi lignin paling tinggi. Degradasi lignin dalam kayu menyebabkan terbentuknya kantung – kantung yang berwarna putih, sehingga fungi ini disebut sebagai fungi pelapuk putih. Fungi ini melakukan dekomposisi lignin sehingga dapat mencapai selulosa dan hemiselulosa (Pérez, 2002).
8
Gambar 2.1 Fungi pelapuk putih2.2 Enzim
Enzim merupakan suatu biokatalis dalam sistem biologi yang bekerja secara spesifik. Bekerja dengan urut – urutan yang teratur, enzim mengkatalisis ratusan reaksi bertahap yang menguraikan molekul nutrien, reaksi yang meyimpan dan mengubah energi kimiawi, dan yang membuat makromolekul sel dari prekursor sederhana (Lehninger, 2007). Fungsi dari enzim adalah meningkatkan kecepatan reaksi dengan cara menyediakan suatu jalur reaksi yang baru melalui transisinya. Enzim bekerja untuk menurunkan energi aktivasi, sehingga reaksi lebih mudah dicapai daripada reaksi tanpa katalis. Enzim dapat mempercepat reaksi 103 sampai 106 kali lebih cepat dibandingkan tanpa menggunakan katalis. Reaksi enzimatis hanya bekerja pada pH dan suhu tertentu serta dapat menunjukkan kekhususan stereoisomerik. Keunggulan enzim sebagai biokatalisator antara lain daya katalitiknya yang tinggi, spesifitas tinggi, dapat bekerja pada kondisi suhu da pH yang tidak ekstrim, aktivitas katalitik beberapa
9
enzim dapat dikendalikan dan diproduksi, sehingga memudahkan penyediaannya (Stryer, 2002).
Reaksi katalitik oleh enzim pada umumnya bersifat cepat membentuk reaksi kesetimbangan tanpa disertai reaksi samping, bekerja dalam larutan encer, berlangsung pada suhu rendah dan kondisi netral (Ottaway et al., 1984).
Berdasarkan biosintesisnya, ada dua macam enzim yaitu enzim konstitutif dan enzim induktif. Enzim konstitutif adalah enzim yang selalu tersedia di dalam sel mikroba dalam jumlah yang relatif konstan. Sedangkan enzim induktif adalah enzim yang berada di dalam sel dengan jumlah yang tidak tetap, tergantung pada keberadaan induser. Jumlah enzim dapat bertambah sampai ribuan kali bahkan lebih apabila di dalam medium terdapat substrat yang berperan sebagai induser, terutama apabila substrat penginduksi merupakan satu – satunya sumber karbon (Stryer, 2002).
2.2.1 Struktur enzim Struktur enzim terdiri dari struktur primer, sekunder, tersier, dan kuartener.
Struktur primer terdiri dari urutan asam amino dari protein. Urutan, macam, dan jumlah asam amino yang membentuk rantai polipeptida adalah struktur primer protein. Struktur sekunder adalah tingkat struktur organisasi pada protein yang menjelaskan pelipatan rantai polipeptida menjadi motif struktural alfa-helix dan beta sheet yang disebabkan adanya ikatan hidrogen pada tulang punggung polipeptida (Kendrew, 1994).
Struktur tersier protein merupakan bentuk yang paling stabil, karena ditunjang oleh berbagai jenis ikatan yang menstabilkan struktur tersier protein.
Jenis ikatan tersebut antara lain : ikatan hidrogen yang terdapat di antara gugus R
10
residu asam amino rantai samping yang berdekatan, ikatan ion di antara gugus R yang berlawanan, interaksi hidrofobik dari gugus R asam amino hidrofobik dan ikatan kovalen berupa ikatan disulfida dari residu sistein (Ottoway et al., 1984). Struktur tersier disebabkan oleh interaksi rantai samping polipeptida, membentuk konformasi tiga dimensi protein secara keseluruhan (Kendrew, 1994).
Struktur kuartener terbentuk karena adanya interaksi beberapa rantai polipeptida membentuk oligomer. Oligomer berinteraksi kembali melalui ikatan ionik, ikatan van der waals, dan ikatan hidrofobik (Bodanzky, 1998).
2.2.2 Klasifikasi Enzim
Berdasarkan Nelson dan Michael, 2003, enzim diklasifikasikan menjadi enam kelas berdasarkan tipe reaksi yang dikatalisnya yaitu sebagai berikut.
1. Oksidoreduktase merupakan golongan enzim yang dapat mengkatalis pemisahan dan penambahkan elektron atau hidrogen.
2. Transferase merupakan golongan enzim yang mengkatalis pemindahan gugus senyawa kimia.
3. Hidrolase merupakan golongan enzim yang dapat memutus ikatan kimia dengan penambahan air.
4. Liase merupakan golongan enzim yang membentuk ikatan rangkap dengan melepas satu gugus kimia. Golongan enzim ini memutuskan berbagai ikatan kimia selain melalui hidrolisis dan oksidasi.
5. Isomerase merupakan golongan enzim yang mengkatalis perubahan pada isomer.
6. Ligase merupakan golongan enzim yang menggabungkan dua molekul yang disertai dengan hidrolisis ATP.
11
2.2.3 Kekhususan Enzim
Substrat harus memiliki hubungan tertentu terhadap bentuk dan sifat kimia sisi aktif enzim agar bisa terjadi suatu ikatan. Enzim bersifat spesifik terhadap suatu reaksi. Menurut Price dan Lewis (2006), kekhususan enzim terhadap reaksi dapat bersifat :
1. Kekhususan sterik merupakan kekhususan absolut, dimana golongan enzim bekerja berdasarkan stereokimia struktur molekul dari substratnya. Dari dua senyawa yang enansiomer, enzim hanya bereaksi dengan salah satunya.
2. Kekhususan reaksi dimana terdapat dua golongan enzim yang bekerja berdasarkan substrat-substrat yang memiliki gugus fungsional sejenis yang bekerja berdasarkan jenis reaksinya yaitu :
1) Kekhususan relatif, apabila suatu enzim bekerja terhadap substrat yang memiliki gugus fungsional sejenis.
2) Kekhususan absolut, apabila suatu enzim bekerja terhadap satu substrat saja.
2.2.4 Mekanisme kerja enzim
Mekanisme katalisis enzim merupakan reaksi yang melibatkan gugus fungsi residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif enzim. Sebagai katalis biologi, enzim mempercepat reaksi dengan cara menciptakan suatu keadaan transisi terstabilisasi melalui pembentukan kompleks enzim-substrat yang mempunyai energi aktivasi lebih rendah. Energi aktivasi merupakan energi tertinggi yang harus dicapai agar suatu reaksi dapat terjadi. Dengan lebih rendahnya energi aktivasi maka berarti lebih banyak molekul yang dapat mencapainya sehingga reaksi berjalan lebih cepat.
12
Sebelum melakukan fungsi katalitiknya, enzim terlebih dahulu membentuk ikatan dengan substrat, digambarkan dengan persamaan sebagai berikut :
Gambar 2.2 Reaksi enzimatisLangkah pertama dalam proses katalisis adalah pembentukan kompleks enzim substrat. Substrat diikat pada daerah yang dinamakan sisi aktif enzim. Reaksi kimia yang terjadi dalam kompleks enzim substrat tersebut dapat dilanjutkan dengan pelepasan produk dan enzim.
Mekanisme katalisis enzim merupakan reaksi-reaksi yang melibatkan gugus-gugus fungsi dari residu asam amino yang terdapat pada sisi aktif enzim.
Sisi aktif enzim adalah tempat pengikatan substrat yang mengandung residu asam amino sebagai gugus katalitiknya. Dan secara langsung terlibat dalam pembuatan serta pemutusan ikatan selama proses katalisis. Ciri – ciri umum sisi aktif enzim yaitu lokasi sisi aktif enzim merupakan bagian kecil dari keseluruhan molekul enzim, hanya residu yang ada pada sisi aktif enzim yang terlibat pada proses katalisis dan melakukan kontak dengan substratnya; Sisi aktif enzim memiliki struktur tiga dimensi yang dibentuk oleh gugus – gugus asam amino yang berbeda; Pengikatan substrat dengan enzim dipengaruhi oleh adanya gaya tarik – menarik yang lemah. Interaksi reversible biomolekul dapat berlangsung karena adanya ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya van der waals, dan interaksi hidrofobik; Sisi aktif enzim berbentuk kantung atau celah. Hal ini mempengaruhi perlindungan terhadap sisi aktif tersebut; Proses pengikatan substrat pada enzim
13
membentuk kompleks enzim-substrat merupakan tahap awal berlangsungnya katalis enzimatik (Puspaningsih, 2004).
Ikatan yang terjadi antara enzim dan substrat merupakan ikatan yang lemah, seperti ikatan elektrostatik, ikatan hidrogen, gaya – gaya van der waals, ataupun interaksi hidrofobik. Interaksi yang terjadi antara molekul enzim dan substrat melibatkan gugusan reaktif atau gugus pengikat ( binding group ) dari enzim maupun substrat, dan enzim hanya dapat mengikat substrat yang memiliki gugusan – gugusan reaktif yang sama. Proses katalitik melibatkan sejumlah gugusan – gugusan reaktif lain yang disebut gugusan katalitik ( catalytic group ). Enzim hanya dapat mengikat substrat yang memiliki gugus reaktif yang sama (Stryer et al., 2002). Model interaksi enzim substrat dibedakan menjadi :
1. Model Lock and Key (lubang dan anak kunci) : dikemukakan oleh Emil Fischer pada tahun 1890. Dalam model Fischer, tempat katalitik dianggap terbentuk terlebih dahulu agar sesuai dengan substratnya (Stryer et al., 2002).
Pada model ini, spesifitas pengikatan tergantung pada ketepatan pengaturan atom-atom pada sisi aktif. Substrat dapat terikat pada enzim bila mempunyai ukuran atau bentuk yang sesuai dengan sisi aktif enzim (Gambar 2.5). Dapat disimpulkan bahwa satu enzim hanya dapat berikatan pada satu model substrat yang memiliki sisi aktif yang sesuai dengan enzim. Meskipun dalam model ini termasuk dalam model cetakan yang kaku, namun dapat dipakai untuk memahami sifat – sifat tertentu dari enzim.
14
Gambar 2.3 Interaksi substrat dan enzim model Lock and Key (Stryer et al., 2002) 2. Model Induced Fit : dikemukakan oleh Daniel G. Koshland pada tahun 1958.Koshland mengemukakan bahwa ukuran atau bentuk sisi aktif enzim dapat mengalami modifikasi oleh adanya pengikatan substrat (Gambar 2.6). Pada model ini, sisi aktif enzim diasumsikan cocok dengan substratnya sesaat setelah enzim mengikat substrat. Jadi substrat dianggap mampu menginduksi perubahan bentuk dalam sisi aktif enzim. Perubahan ini menempatkan residu asam amino pada sisi aktif enzim yang memungkinkan terjadinya pengikatan substrat selama proses katalisis. Enzim menunjukkan fleksibilitasnya dalam berikatan dengan substrat (Stryer et al., 2002).
Gambar 2.4 Interaksi substrat dan enzim model induced fit (Stryer et al., 2002)2.2.5 Aktivitas enzim
Faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah : konsentrasi enzim, konsentrasi substrat, temperatur dan pH.
15
2.2.5.1 Konsentrasi enzim Kecepatan reaksi suatu enzim dipengaruhi oleh konsentrasi enzim.
Banyaknya substrat yang diubah menjadi produk sebanding dengan tinggi konsentrasi enzim yang digunakan (Gambar 2.5). Semakin tinggi konsentrasi enzim maka laju reaksi berjalan lebih cepat selama konsentrasi enzim jauh lebih sedikit dibanding substrat (Stryer et al., 2002). Laju reaks i
Konsentrasi enzim
Gambar 2.5 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap laju reaksi2.2.5.2 Konsentrasi substrat
Apabila konsentrasi substrat semakin tinggi maka laju reaksi akan semakin cepat. Namun bila konsentrasi diperbesar lagi maka tidak terjadi penambahan laju reaksi. (Gambar 2.6). Hal tersebut disebabkan karena enzim telah jenuh dengan substrat. Pada konsentrasi substrat yang menghasilkan laju reaksi maksimal, penambahan konsentrasi substrat lebih lanjut tidak akan merubah laju reaksi (Stryer et al., 2002). Laj u reaksi
Konsentrasi substrat
Gambar 2.6 Pengaruh konsentrasi substrat terhadap laju reaksi16
2.2.5.3 Pengaruh temperatur
Semakin tinggi temperatur maka laju reaksi berjalan makin cepat. Hal tersebut disebabkan karena atom – atom yang terdapat dalam molekul enzim memiliki energi yang tinggi, sehingga energi pengaktifan akan tercapai. Akan tetapi apabila temperatur dinaikkan lebih tinggi maka laju reaksi akan menurun, dapat dilihat gambar 2.7. Hal tersebut dikarenakan enzim mengalami denaturasi sehingga enzim kehilangan aktivitasnya (Stryer et al., 2002). Laj u reaksi
Temperatur
Gambar 2.7 Pengaruh temperatur terhadap laju reaksi2.2.5.4 Pengaruh pH
Enzim memiliki muatan positif atau negatif pada suatu pH tertentu. Hal ini dikarenakan enzim dapat bersifat basa, netral, atau asam tergantung rantai samping susunan proteinnya. Pada pH tertentu enzim dapat beraktivitas maksimum (pH optimum). pH optimum tergantung pada masing-masing enzim karena setiap enzim memiliki pH optimum yang spesifik yang bergantung pada konsentrasi substrat. Apabila pH semakin jauh dari titik pH optimum maka laju reaksi dari enzim akan rendah. Pada gambar ditunjukkan kurva pH optimum (Gambar 2.8) (Stryer et al., 2002).